一種生物轉(zhuǎn)化降解黃芪甲苷制備環(huán)黃芪醇的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種生物轉(zhuǎn)化降解黃芪甲苷制備環(huán)黃芪醇的方法，其特征在于：以黃芪甲苷為底物，通過(guò)菌種犁頭霉Absidia sp.CGMCC 3.2834發(fā)酵，制得環(huán)黃芪醇。本發(fā)明以微生物發(fā)酵技術(shù)降解黃芪甲苷得到高純度的環(huán)黃芪醇，工藝簡(jiǎn)單易行、成本低，最終環(huán)黃芪醇的轉(zhuǎn)化率達(dá)到60％以上、純度高達(dá)95％以上，轉(zhuǎn)化專一性較高；整個(gè)工藝過(guò)程在常溫、常壓下進(jìn)行，所要求的設(shè)備條件低，適用于大批量生產(chǎn)。
【專利說(shuō)明】
一種生物轉(zhuǎn)化降解黃芪甲苷制備環(huán)黃芪醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明公開了一種生物轉(zhuǎn)化降解黃芪甲苷制備環(huán)黃芪醇的方法，屬于醫(yī)藥化工領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根。它始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，至今已有400多年的藥用歷史，目前仍為中醫(yī)臨床治療最常用的藥物之一。皂苷類化合物是黃芪屬植物中最重要的一種活性成分，其中所含有的皂苷類化合物從結(jié)構(gòu)上主要為環(huán)阿屯烷型的四環(huán)三萜類皂苷。環(huán)黃芪醇是黃芪皂苷的苷元部分，分子式為C3qH5qO5、相對(duì)分子量為490.71ο其在植株中含量極少，約占干重的0.1 %，是黃芪甲苷在腸道內(nèi)代謝的主要產(chǎn)物，雖然含量很低但是具有很好的生物學(xué)活性:促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞增值，促進(jìn)傷口愈合，抗衰老等。尤其是環(huán)黃芪醇作為已知的唯一天然端粒酶激活劑在抗衰老，增強(qiáng)機(jī)體免疫力等方面具有不可替代的作用，具有廣闊的市場(chǎng)前景。
[0003]傳統(tǒng)的方法是直接從黃芪中提取環(huán)黃芪醇，但受制于黃芪中較低的含量，產(chǎn)率較低且成本較高，因此選擇與環(huán)黃芪醇結(jié)構(gòu)相似且含量較高的黃芪甲苷轉(zhuǎn)化生產(chǎn)是一種可行的生產(chǎn)工藝。由于兩者的差別只在于是否存在糖基修飾，目前國(guó)內(nèi)的生產(chǎn)工藝均是利用各種方法打開糖苷鍵轉(zhuǎn)化生產(chǎn)環(huán)黃芪醇。由于結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性，一般的水解反應(yīng)會(huì)產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物黃芪醇，其破壞原有的環(huán)結(jié)構(gòu)，造成分離的困難。
[0004]目前國(guó)內(nèi)關(guān)于環(huán)黃芪醇相關(guān)生產(chǎn)方法報(bào)道很少，中國(guó)發(fā)明專利CN104817610A和中國(guó)發(fā)明專利CN103880910A依據(jù)化學(xué)原理直接酸水解糖苷鍵或者經(jīng)過(guò)氧化還原破壞糖環(huán)結(jié)構(gòu)再水解糖苷鍵，通過(guò)一系列步驟可以得到環(huán)黃芪醇，但是反應(yīng)過(guò)程要求條件較高，工藝較為繁瑣，這限制了大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用。
[0005]犁頭霉Absidia sp.CGMCC 3.2834，屬于真菌門、接合菌亞門、接合菌綱、毛霉目、毛霉科。廣泛分布于土壤、酒曲和糞便中，空氣中常有它們的孢子存在，易污染其他微生物的純培養(yǎng)物。犁頭霉屬被廣泛的用于生物轉(zhuǎn)化的研究，例如藍(lán)色犁頭霉Absdia orchidis由于具有C11P-羥基化作用已用于氫化可的松的生產(chǎn)。
[0006]以微生物發(fā)酵技術(shù)制備環(huán)黃芪醇的方法尚未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明是為避免上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的不足之處，提供一種高效、低成本、簡(jiǎn)單且產(chǎn)品純度高的環(huán)黃芪醇制備方法，所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)生物轉(zhuǎn)化降解黃芪甲苷制備環(huán)黃芪醇。
[0008]本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題，采用如下技術(shù)方案:
[0009]本發(fā)明生物轉(zhuǎn)化降解黃芪甲苷制備環(huán)黃芪醇的方法，其特點(diǎn)在于:以黃芪甲苷為底物，通過(guò)菌種犁頭霉Absidia sp.CGMCC 3.2834發(fā)酵，制得環(huán)黃芪醇。具體包括如下步驟:
[0010](I)種子培養(yǎng)
[0011]在錐形瓶中配制PDB培養(yǎng)基，然后接入菌種犁頭霉Absidia sp.CGMCC 3.2834發(fā)酵，在搖床溫度25?35°C、搖床轉(zhuǎn)速150?200r/min的條件下培養(yǎng)3天，獲得種子一級(jí)培養(yǎng)基;
[0012](2)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)
[0013]將步驟(I)所獲得的種子一級(jí)培養(yǎng)基按1%的接種量接入15OmL改良PDB培養(yǎng)基中，在搖床溫度25?35°C、搖床轉(zhuǎn)速150?200r/min的條件下培養(yǎng)3天，然后加入25?50mg黃芪甲苷底物，繼續(xù)培養(yǎng)6天，獲得發(fā)酵液；
[0014](3)純化
[0015]將步驟(2)所得發(fā)酵液與萃取劑乙酸乙酯等體積混合后在室溫下萃取三次、每次1min，所得萃取液真空濃縮至干，獲得萃取物；
[0016]將萃取物溶解至甲醇中，再按照與萃取物質(zhì)量比1:1的用量加入還原劑NaBH4,常溫反應(yīng)I Omin，所得反應(yīng)液分離、提純，即獲得目標(biāo)產(chǎn)物環(huán)黃芪醇。
[0017]其中，所述改良PDB培養(yǎng)基的組成為:土豆浸出液300g/L，KH2P04 3g/L,MgSO4.H2Ol.5g/L，Vb lmg/L。PDB培養(yǎng)基的組成為:土豆浸出液200g/L，葡萄糖20g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4.H2O 1.5g/L，Vb lmg/L ο
[0018]所述黃芪甲苷底物的純度為50%?100%。
[0019]步驟(3)中分離、提純的步驟為:在反應(yīng)液中加入體積不少于反應(yīng)液體積的水，40°(:減壓濃縮去甲醇，然后加入等體積的乙酸乙酯，靜置分層;取有機(jī)相濃縮至干后以甲醇溶解，通過(guò)硅膠層析柱純化，干燥，即獲得目標(biāo)產(chǎn)物。柱層析使用硅膠正相柱。
[0020]本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0021]該方法以微生物發(fā)酵技術(shù)降解黃芪甲苷得到高純度的環(huán)黃芪醇。該制備工藝簡(jiǎn)單易行、成本低，整個(gè)操作過(guò)程在常溫、常壓下進(jìn)行，適用于大批量生產(chǎn)。
[0022]與已有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在:
[0023]1、本發(fā)明以微生物發(fā)酵技術(shù)降解黃芪甲苷得到高純度的環(huán)黃芪醇，工藝簡(jiǎn)單易行、成本低，最終環(huán)黃芪醇的轉(zhuǎn)化率達(dá)到60 %以上、純度高達(dá)95 %以上，轉(zhuǎn)化專一性較高；
[0024]2、本發(fā)明的整個(gè)工藝過(guò)程在常溫、常壓下進(jìn)行，所要求的設(shè)備條件低，適用于大批量生產(chǎn)，有效解決了目前生產(chǎn)中原材料限制、提取率低等問(wèn)題。
【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1為實(shí)施例1所得產(chǎn)物的色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026]實(shí)施例1
[0027]本實(shí)施例按如下步驟制備環(huán)黃芪醇:
[0028](I)種子培養(yǎng)
[0029]在錐形瓶中配制PDB培養(yǎng)基，然后接入菌種犁頭霉Absidia sp.CGMCC 3.2834，在搖床溫度30°C、搖床轉(zhuǎn)速180r/min的條件下培養(yǎng)3天，獲得種子一級(jí)培養(yǎng)基；
[0030](2)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)
[0031]將步驟(I)所獲得的種子一級(jí)培養(yǎng)基按10%的接種量接入150mL改良PDB培養(yǎng)基中，在搖床溫度30°C、搖床轉(zhuǎn)速180r/min的條件下培養(yǎng)3天，然后加入50mg黃苗甲苷底物(黃芪甲苷含34.5mg)，繼續(xù)培養(yǎng)6天，獲得發(fā)酵液；
[0032]將步驟(2)所得發(fā)酵液與萃取劑乙酸乙酯等體積混合后在室溫下萃取三次、每次1min，所得萃取液真空濃縮至干，獲得萃取物；
[0033]將萃取物按10mg/mL的質(zhì)量體積比溶解至甲醇中，再按照與萃取物質(zhì)量比1:1的用量加入還原劑NaBH4,常溫反應(yīng)1min，獲得反應(yīng)液；
[0034]在反應(yīng)液中加入等體積的水，40°C濃縮去甲醇，然后加入等體積的乙酸乙酯，靜置分層;取有機(jī)相濃縮至干后以甲醇溶解，通過(guò)硅膠層析柱純化，干燥，即獲得目標(biāo)產(chǎn)物環(huán)黃芪醇。
[0035]經(jīng)檢測(cè)，產(chǎn)物純度為95.5%、反應(yīng)轉(zhuǎn)化率61.5%。
[0036]純度鑒定:將本實(shí)施例得到的環(huán)黃芪醇樣品用高效液相色譜儀檢測(cè)純度，色譜條件:色譜柱為分析柱Hypersil GOLD column(4.6mmX 150mm，5ym，Thermo Scientific);柱溫30°C ;流動(dòng)相:Omin?13min甲醇:水=75: 25，13min?20min甲醇:水= 85:15，20min?30min甲醇100 % ;流速:lmL/min ；上樣量為1yL，ELSD漂移管溫度120 °C，ELSD氣流量2.1L/min。檢測(cè)出此樣品的環(huán)黃芪醇純度為95.5%，色譜圖如圖1所示。
[0037]實(shí)施例2
[0038]本實(shí)施例按如下步驟制備環(huán)黃芪醇:
[0039](I)種子培養(yǎng)
[0040]在錐形瓶中配制PDB培養(yǎng)基，然后接入菌種犁頭霉Absidia sp.CGMCC 3.2834發(fā)酵，在搖床溫度30°C、搖床轉(zhuǎn)速180r/min的條件下培養(yǎng)3天，獲得種子一級(jí)培養(yǎng)基；
[0041 ] (2)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)
[0042]將步驟(I)所獲得的種子一級(jí)培養(yǎng)基按5%的接種量接入150mL改良PDB培養(yǎng)基中，在搖床溫度30°C、搖床轉(zhuǎn)速180r/min的條件下培養(yǎng)3天，然后加入50mg黃苗甲苷底物(黃苗甲苷含34.5mg)，繼續(xù)培養(yǎng)6天，獲得發(fā)酵液；
[0043]⑶純化
[0044]將步驟(2)所得發(fā)酵液與萃取劑乙酸乙酯等體積混合后在室溫下萃取三次、每次1min，所得萃取液真空濃縮至干，獲得萃取物；
[0045]將萃取物按10mg/mL的質(zhì)量體積比溶解至甲醇中，再按照與萃取物質(zhì)量1:1的用量加入還原劑NaBH4,常溫反應(yīng)1min，獲得反應(yīng)液；
[0046]在反應(yīng)液中加入等體積的水，40°C濃縮去甲醇，然后加入等體積的乙酸乙酯，靜置分層;取有機(jī)相濃縮至干后以甲醇溶解，通過(guò)硅膠層析柱純化，干燥，即獲得目標(biāo)產(chǎn)物環(huán)黃芪醇。
[0047]經(jīng)檢測(cè)，產(chǎn)物純度為95.1 %、反應(yīng)轉(zhuǎn)化率27 J %。
[0048]實(shí)施例3
[0049]本實(shí)施例按如下步驟制備環(huán)黃芪醇:
[0050](I)種子培養(yǎng)
[0051 ] 在錐形瓶中配制PDB培養(yǎng)基，然后接入菌種犁頭霉Absidia sp.CGMCC 3.2834，在搖床溫度30°C、搖床轉(zhuǎn)速180r/min的條件下培養(yǎng)3天，獲得種子一級(jí)培養(yǎng)基；
[0052](2)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)[0053 ]將步驟(I)所獲得的種子一級(jí)培養(yǎng)基按1 %的接種量接入15OmL普通PDB培養(yǎng)基中，在搖床溫度30°C、搖床轉(zhuǎn)速180r/min的條件下培養(yǎng)3天，然后加入50mg黃苗甲苷底物(黃芪甲苷含34.5mg)，繼續(xù)培養(yǎng)6天，獲得發(fā)酵液；
[0054](3)純化
[0055]將步驟(2)所得發(fā)酵液與萃取劑乙酸乙酯等體積混合后在室溫下萃取三次、每次1min，所得萃取液真空濃縮至干，獲得萃取物；
[0056]將萃取物按10mg/mL的質(zhì)量體積比溶解至甲醇中，再按照與萃取物質(zhì)量比1:1的用量加入還原劑NaBH4，常溫反應(yīng)I Omin，獲得反應(yīng)液；
[0057]在反應(yīng)液中加入等體積的水，40°C濃縮去甲醇，然后加入等體積的乙酸乙酯，靜置分層;取有機(jī)相濃縮至干后以甲醇溶解，通過(guò)硅膠層析柱純化，干燥，即獲得目標(biāo)產(chǎn)物環(huán)黃芪醇。
[0058]經(jīng)檢測(cè)，產(chǎn)物純度為95.1 %、反應(yīng)轉(zhuǎn)化率44.8%。
[0059]實(shí)施例4
[0060]本實(shí)施例按如下步驟制備環(huán)黃芪醇:
[0061 ] (I)種子培養(yǎng)
[0062]在錐形瓶中配制PDB培養(yǎng)基，然后接入菌種犁頭霉Absidia sp.CGMCC 3.2834，在搖床溫度30°C、搖床轉(zhuǎn)速180r/min的條件下培養(yǎng)3天，獲得種子一級(jí)培養(yǎng)基；
[0063](2)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)
[0064]將步驟(I)所獲得的種子一級(jí)培養(yǎng)基按10%的接種量接入150mL改良PDB培養(yǎng)基中，在搖床溫度30°C、搖床轉(zhuǎn)速180r/min的條件下培養(yǎng)3天，然后加入50mg黃苗甲苷底物(黃芪甲苷含34.5mg)，繼續(xù)培養(yǎng)2天，獲得發(fā)酵液；
[0065](3)純化
[0066]將步驟(2)所得發(fā)酵液與萃取劑乙酸乙酯等體積混合后在室溫下萃取三次、每次1min，所得萃取液真空濃縮至干，獲得萃取物；
[0067]將萃取物按10mg/mL的質(zhì)量體積比溶解至甲醇中，再按照與萃取物質(zhì)量比1:1的用量加入還原劑NaBH4，常溫反應(yīng)I Omin，獲得反應(yīng)液；
[0068]在反應(yīng)液中加入等體積的水，40°C濃縮去甲醇，然后加入等體積的乙酸乙酯，靜置分層;取有機(jī)相濃縮至干后以甲醇溶解，通過(guò)硅膠層析柱純化，干燥，即獲得目標(biāo)產(chǎn)物環(huán)黃芪醇。
[0069]經(jīng)檢測(cè)，產(chǎn)物純度為96.4%、反應(yīng)轉(zhuǎn)化率34.0%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種生物轉(zhuǎn)化降解黃芪甲苷制備環(huán)黃芪醇的方法，其特征在于:以黃芪甲苷為底物，通過(guò)菌種犁頭霉Absidia sp.CGMCC 3.2834發(fā)酵，制得環(huán)黃芪醇。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于包括如下步驟: (1)種子培養(yǎng) 在錐形瓶中配制I3DB培養(yǎng)基，然后接入菌種犁頭霉Absidia sp.CGMCC 3.2834，在搖床溫度25?35 °C、搖床轉(zhuǎn)速150?200r/min的條件下培養(yǎng)3天，獲得種子一級(jí)培養(yǎng)基； (2)轉(zhuǎn)化培養(yǎng) 將步驟(I)所獲得的種子一級(jí)培養(yǎng)基按1 %的接種量接入150mL改良PDB培養(yǎng)基中，在搖床溫度25?35°C、搖床轉(zhuǎn)速150?200r/min的條件下培養(yǎng)3天，然后加入25?50mg黃苗甲苷底物，繼續(xù)培養(yǎng)6天，獲得發(fā)酵液； (3)純化 將步驟(2)所得發(fā)酵液與萃取劑乙酸乙酯等體積混合后在室溫下萃取三次、每次1min，所得萃取液真空濃縮至干，獲得萃取物； 將萃取物溶解至甲醇中，再按照與萃取物質(zhì)量比1:1的用量加入還原劑NaBH4,常溫反應(yīng)IOmin，所得反應(yīng)液分離、提純，即獲得目標(biāo)產(chǎn)物環(huán)黃芪醇。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述改良PDB培養(yǎng)基的組成為:土豆浸出液300g/L,KH2PO4 3g/L,MgSO4.H2O 1.5g/L，Vb lmg/L。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于:所述黃芪甲苷底物的純度為50%?100 %。5.根據(jù)權(quán)要求2所述的方法，其特征在于:步驟(3)中分離、提純的步驟為:在反應(yīng)液中加入體積不少于反應(yīng)液體積的水，40°C減壓濃縮去甲醇，然后加入等體積的乙酸乙酯，靜置分層;取有機(jī)相濃縮至干后以甲醇溶解，通過(guò)硅膠層析柱純化，干燥，即獲得目標(biāo)產(chǎn)物。
【文檔編號(hào)】C12R1/65GK106011213SQ201610409748
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年6月3日
【發(fā)明人】陳彥, 王力鳴, 王亞, 蔡正楠, 楊維維
【申請(qǐng)人】安徽大學(xué)