神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病基因聯(lián)合篩查方法、試劑盒及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病基因聯(lián)合篩查方法、試劑盒及其制備方法。本發(fā)明的基因篩查方法首先是構(gòu)建受檢者的全基因組DNA文庫(kù)，然后利用制備的神經(jīng)系統(tǒng)遺傳疾病基因篩查試劑盒捕獲靶基因序列，再通過(guò)高通量測(cè)序平臺(tái)(Illumina HiSeq 3000)的雙端150bp測(cè)序模式對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)，生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)結(jié)果，找出與神經(jīng)系統(tǒng)遺傳疾病相關(guān)基因的突變信息位點(diǎn)，以達(dá)到基因診斷的目的。本發(fā)明提供的方法能快速、準(zhǔn)確且能夠覆蓋目前已知的所有神經(jīng)系統(tǒng)遺傳疾病基因的外顯子區(qū)域。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病基因聯(lián)合篩查方法、試劑盒及其制備 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及基因篩查技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，設(shè)及一種篩查各類(lèi)神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾 病的試劑盒及其制備和使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 神經(jīng)系統(tǒng)遺傳疾病是由于生殖細(xì)胞或受精卵遺傳物質(zhì)的異常，使發(fā)育的個(gè)體出現(xiàn) W神經(jīng)系統(tǒng)功能缺損為主要臨床表現(xiàn)的疾病。神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病的病種最多，在人類(lèi) 5000余種單基因病中，累及神經(jīng)系統(tǒng)的約占60%。遺傳方式包含單基因遺傳、多基因遺傳、 線(xiàn)粒體病W及染色體病，中國(guó)的神經(jīng)系統(tǒng)單基因遺傳病患病率約為109.3/100，000。神經(jīng)系 統(tǒng)遺傳病可在任何年齡發(fā)病，但絕大多數(shù)在小兒或青少年期出現(xiàn)臨床癥狀與體征，具有家 族性和終生性特點(diǎn)，不少疾病的病因和發(fā)病機(jī)制尚未闡明，致殘、致崎及致愚率很高，治療 困難，危害極大。很多神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病具有顯著的臨床和遺傳異質(zhì)性，一種疾病可W由不同 的致病基因引起，而一個(gè)基因的突變又可累及不同的系統(tǒng)。因此，常有不能判斷引起疾病的 具體的基因突變，或疾病本身癥狀不典型，導(dǎo)致鑒別診斷的困難。W往對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)遺傳疾病 的診斷主要依靠病史、癥狀體征、家系調(diào)查或常規(guī)輔助檢查等方法，但運(yùn)些常規(guī)診斷方法難 W對(duì)遺傳疾病做出早診斷或癥狀前診斷，從而導(dǎo)致錯(cuò)過(guò)預(yù)防或早期治療的最佳時(shí)期，對(duì)身 體造成不可逆的損傷。
[0003] 基因檢測(cè)是神經(jīng)系統(tǒng)遺傳病早期診斷的有效手段。然而，目前仍然沒(méi)有一種能同 時(shí)篩查多種神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病的試劑盒。歸結(jié)原因有二:其一，致病基因多，序列長(zhǎng)，目前 被定位或克隆的神經(jīng)遺傳性疾病相關(guān)致病基因約235個(gè);其二，傳統(tǒng)測(cè)序方法效率低，成本 高。傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序每小時(shí)只能檢測(cè)6千個(gè)堿基序列，對(duì)于很多具有遺傳和臨床異質(zhì)性的 疾病，該方法無(wú)法高效富集基因組片段進(jìn)行大規(guī)模測(cè)序。理論上一次性篩查多種疾病可能 需要數(shù)月之久，且耗費(fèi)極高，不適合于臨床推廣。
[0004] 近幾年，隨著第二代測(cè)序平臺(tái)（Next-Generation Sequencing,NGS)的誕生和發(fā) 展，可在10個(gè)小時(shí)內(nèi)檢測(cè)4-6億個(gè)堿基序列。不僅極大地減少了測(cè)序時(shí)間，同時(shí)也極大地降 低了成本?？朔?Sanger測(cè)序在應(yīng)用范圍和應(yīng)用成本上的不足，基于NGS的祀向基因測(cè)序 (target gene sequencing,TGS)、全基因外顯子組測(cè)序(whole exome sequencing,肥S)和 全基因組測(cè)序(whole genome sequencing,WGS)，在神經(jīng)系統(tǒng)單基因遺傳病的基因診斷中 已有應(yīng)用。
[0005] 因此，設(shè)計(jì)一種設(shè)及最多種類(lèi)神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病、包含最全面的致病基因的檢 測(cè)試劑盒，并且能結(jié)合第二代測(cè)序技術(shù)，高效低成本地篩查遺傳性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，實(shí)現(xiàn)對(duì)患 者、致病基因攜帶者及高危產(chǎn)兒等對(duì)象的早期篩查，可在基因表達(dá)水平上確診和預(yù)測(cè)疾病， 對(duì)早期治療、干預(yù)措施提供指導(dǎo)意見(jiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種能高效、準(zhǔn)確地聯(lián)合篩查多種神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病的 試劑盒及其制備方法。另一方面還提供一種廣譜的神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病的基因聯(lián)合篩查方 法。
[0007] 本發(fā)明一方面，提供一種神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病基因聯(lián)合篩查試劑盒，所述試劑盒 包含與929種各類(lèi)神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病相關(guān)的854個(gè)致病基因或疾病易感基因中全部外顯 子序列的特異性寡核巧酸捕獲探針。
[000引進(jìn)一步地，所述探針長(zhǎng)度為50~10化P。
[0009] 進(jìn)一步地，所述探針W生物素標(biāo)記。
[0010] 具體地，所述與神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病相關(guān)的致病基因或疾病易感基因如表1所示：
[0011] 表1:神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病基因篩查列表
[0012]






[0019] 本發(fā)明另一方面，提供一種制備上述神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病基因聯(lián)合篩查試劑盒的 方法，包含如下步驟：
[0020] (1)根據(jù)人類(lèi)基因組HG19序列，調(diào)取表1中全部與神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病發(fā)生相關(guān)基 因的外顯子序列；
[0021] (2)針對(duì)全部外顯子序列非重復(fù)區(qū)域設(shè)計(jì)50~10化P長(zhǎng)度的捕獲探針，每個(gè)探針沿 著基因位置挪動(dòng)3~lObp，目標(biāo)區(qū)域每個(gè)堿基被探針覆蓋3~20次。
[0022] (3)合成步驟(2)所設(shè)計(jì)的捕獲探針，并W生物素標(biāo)記。
[0023] 本發(fā)明的再一方面，提供一種神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病基因聯(lián)合篩查方法，包括W下 步驟：
[0024] (1)獲取、檢測(cè)受檢者的全基因組DNA(曲NA)樣本；
[00巧](2)構(gòu)建受檢者全基因組文庫(kù)；
[0026] (3)采用上述試劑盒中的捕獲探針與受檢者DNA文庫(kù)混合，目標(biāo)區(qū)域基因片段與探 針雜交，探針通過(guò)標(biāo)記的生物素與帶有親和素的磁珠結(jié)合；
[0027] (4)將未結(jié)合的非目標(biāo)區(qū)域的DNA片段洗脫；
[0028] (5)利用新一代高通量測(cè)序儀對(duì)目標(biāo)區(qū)域基因組進(jìn)行測(cè)序、分析，獲取疾病相關(guān)基 因的所有突變信息。
[00巧]進(jìn)一步地，所述高通量測(cè)序儀為111皿ina化Seq 3000型。
[0030] 進(jìn)一步地，步驟(5)中所述分析過(guò)程包括W下步驟：
[0031] (1)從高通量測(cè)序儀(111皿ina化Seq 3000)獲取原始數(shù)據(jù)；
[0032] (2)利用化im Galore軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)從3'端動(dòng)態(tài)去除接頭序列片段和低質(zhì)量片 段；
[0033] (3)用化stQC軟件對(duì)預(yù)處理數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制分析；
[0034] (4)通過(guò)BWA軟件把有效測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到人類(lèi)參考基因組中；
[0035] (5)統(tǒng)計(jì)祀標(biāo)區(qū)域信息，包括祀標(biāo)區(qū)域平均覆蓋度、插入片段平均分布圖、目標(biāo)區(qū) 域測(cè)序深度等；
[0036] (6)采用GATK3.1.1進(jìn)行變異檢測(cè)，SNP和Indel變異識(shí)別、校正、過(guò)濾；
[0037] (7)用ANN0VAR對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行注釋?zhuān)詈蠛Y選出疾病相關(guān)的SNP或Indel變異。
[0038] 縮寫(xiě)與定義：
[0039] SNP 單核巧酸多態(tài)性
[0040] Indel插入缺失標(biāo)記 [0041 ] 曲NA全基因組DNA
[0042] 神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病
[0043] 神經(jīng)系統(tǒng)遺傳疾病是由于生殖細(xì)胞或受精卵遺傳物質(zhì)的異常，使發(fā)育的個(gè)體出現(xiàn) W神經(jīng)系統(tǒng)功能缺損為主要臨床表現(xiàn)的疾病。神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病的病種最多，在人類(lèi) 5000余種單基因病中，累及神經(jīng)系統(tǒng)的約占60%。表1I中為常見(jiàn)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的名稱(chēng)及分 類(lèi)情況：
[0044] 表1I.常見(jiàn)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的名稱(chēng)及分類(lèi)
[0045]





[0051] 目標(biāo)序列捕獲探針
[0052] 目標(biāo)序列捕獲是指通過(guò)某種方法有選擇性的分離或者富集基因組的特定片段。目 標(biāo)序列捕獲的一種重要的方法是根據(jù)核酸分子堿基互補(bǔ)雜交原理發(fā)展的。即根據(jù)目標(biāo)基因 組序列，設(shè)計(jì)與之完全互補(bǔ)的探針，將運(yùn)些探針固定在某些支持物上（用于分離），然后打斷 基因組DM,加上接頭（用于測(cè)序)后與探針雜交，洗脫未雜交上的DNA，回收目標(biāo)DM片段，可 W直接建庫(kù)進(jìn)行DNA測(cè)序。
[0053] 根據(jù)雜交時(shí)狀態(tài)不同，目標(biāo)序列捕獲可W分為固相雜交法和液相雜交法。固相雜 交法所用的探針通常都是固定在固體支持物上，如玻璃片2,3、塑料球等，其中最典型的是 基因忍片。固相捕獲系統(tǒng)構(gòu)建如下，首先選定目標(biāo)DNA區(qū)域，在修飾了的玻璃片基上原位合 成一系列與目標(biāo)區(qū)域互補(bǔ)的探針。通常，基因忍片是雜交后，洗脫未雜交上的DNA片段，然后 掃描成像獲取每個(gè)探針的雜交信號(hào)，而固相雜交捕獲則只有最后一步不同，即與探針雜交 的DNA被洗脫下來(lái)，用于后序的測(cè)序工作。
[0054] 液相雜交與固相雜交最大的差異在于雜交反應(yīng)的環(huán)境不同。液相雜交是通過(guò)在溶 液中，目標(biāo)DNA片段和已帶有生物素標(biāo)記探針直接雜交，然后通過(guò)生物素-親和素的反應(yīng)使 目標(biāo)DNA片段錯(cuò)定在帶有親和素的微珠上。洗去非目標(biāo)DNA，洗脫后，富集的DNA用于測(cè)序。液 相雜交與固相雜交相比有兩大優(yōu)勢(shì):第一、雜交效率更高;第二、易于操作，時(shí)間短，便于自 動(dòng)化操作。
[0055] -般來(lái)說(shuō)一個(gè)8堿基的探針就有了足夠的雜交特異性，而探針越長(zhǎng)，雜交的特異性 就越差。目前商業(yè)試劑盒的探針長(zhǎng)度都在60nt到200nt之間，運(yùn)其中的一個(gè)重要考慮是，雜 交的特異性限定(或雜交的錯(cuò)配容忍度）。我們需要研究的是目標(biāo)DNA片段中發(fā)生的突變、插 入/缺失等，如果探針特異性太高，在DNA捕獲時(shí)就會(huì)產(chǎn)生有利于參考序列（與探針完全互補(bǔ) 的序列）的選擇，運(yùn)在后期數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)上就會(huì)產(chǎn)生明顯的偏差，而探針太長(zhǎng)又會(huì)有太多的非特 異雜交，非目標(biāo)序列會(huì)急劇增加。
【附圖說(shuō)明】
[0056] 圖1、神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病基因篩查方法示意圖。
[0057] 圖2、高通量測(cè)序示意圖。
[005引圖3、1例脾骨肌萎縮癥患者家系圖譜和Sanger測(cè)序結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0059] -、使用試劑盒篩查216例神經(jīng)遺傳性疾病患者的致病基因
[0060] 患者病征:女，17歲，自六歲開(kāi)始出現(xiàn)行走不穩(wěn)，十五歲因左側(cè)足內(nèi)翻行手術(shù)矯正。
[0061] 臨床表現(xiàn)：四肢遠(yuǎn)端肌力減弱，雙手肌肉萎縮，四肢腫反射減弱。肌電圖檢查提示 多發(fā)性周?chē)窠?jīng)損害，運(yùn)動(dòng)感覺(jué)神經(jīng)軸索損害為主。
[0062] 診斷:脾骨肌萎縮癥(化arcot-Marie-ToothiCMT)亦稱(chēng)為遺傳性運(yùn)動(dòng)感覺(jué)神經(jīng)病 (HMSN)。
[0063] 發(fā)病率:1/2500。
[0064] 疾病特點(diǎn)：具有明顯的遺傳異質(zhì)性，臨床主要特征是四肢遠(yuǎn)端進(jìn)行性的肌無(wú)力和 萎縮伴感覺(jué)障礙。多數(shù)呈常染色體顯性遺傳，也可呈常染色體隱性或X-連鎖遺傳。
[0065] 檢測(cè)病種:運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病、遺傳性共濟(jì)失調(diào)、肌肉疾病、遺傳代謝病等。
[0066] 致病基因：PMP22、MPZ、LITAF、EGR2、W^、KIF1B、MFN2、RAB7A、LMNA、MED25、TRPV4、 GARS、肥化、HSPB1、GDAP1、MPZ、HSPB8、面M2、AARS、DYNC1Η1、LRSAM1、畑TKD1、EGR2、PMP2 2、 PRX、MTMR2、S邸2、SBF1、S冊(cè) TC2、NDRG1、EGR2、PRX、服1、FGD4、FIG4、SURF1、DNM2、YARS、INF2、 GNB4、GDAP1、KARS、PLEK服5、GJB1、BSCL2、PRPS1、PDK3、HOXD1ο、CTDP1、SEPT9、SOXlο、CCT5 等。
[0067] 檢測(cè)手段：用制備的神經(jīng)系統(tǒng)遺傳疾病基因篩查試劑盒捕獲目的基因序列，再利 用高通量測(cè)序平臺(tái)（Illumina HiSeq 3000)的雙端15化Ρ測(cè)序模式對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)生 物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)結(jié)果，找出與神經(jīng)系統(tǒng)遺傳疾病相關(guān)基因的突變信息位點(diǎn)，W達(dá)到基因 診斷的目的。
[0068] 檢測(cè)過(guò)程如圖1所示。具體包括W下幾個(gè)環(huán)節(jié)：
[0069] ( - )神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病外顯子區(qū)域捕獲探針試劑盒制備
[0070] 根據(jù)人類(lèi)基因組HG19序列，調(diào)取表1中全部與神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病發(fā)生相關(guān)基因 的外顯子序列，基于羅氏液相雜交技術(shù)（SeqCap EZ)，采用Roche NimbleGen優(yōu)化的迭代 (Repeat mask)算法，對(duì)每個(gè)外顯子區(qū)域中非重復(fù)區(qū)域設(shè)計(jì)50-105bp的探針序列，每個(gè)探針 沿著基因位置挪動(dòng)設(shè)計(jì)，探針之間的挪動(dòng)大小3-lObp，且目標(biāo)區(qū)域每個(gè)堿基被探針至少覆 蓋3次，最多不超過(guò)20次。采用常規(guī)技術(shù)將探針W生物素標(biāo)記。
[0071] (二)患者全基因組文庫(kù)構(gòu)建
[0072] 從患者體內(nèi)抽取3~5血血液，從中抽提3-扣g基因組DNA(曲NA)，片段化處理曲NA， 加接頭、純化、擴(kuò)增W構(gòu)建全基因組DNA文庫(kù)。具體過(guò)程如下：
[0073] 1、DNA樣本制備（使用QIGEN公司QIAamp DNA Blood Maxi Kit提取）：
[0074] (1)取20化1 QIGEN蛋白酶加入到2mL全血中，混勻。
[00巧](2)加2.4mL AL溶液，充分混勻，振蕩lmin，7(TC解育lOmin。
[0076] (3)加入2mL無(wú)水乙醇，充分振蕩混勻后，轉(zhuǎn)移至裝在新離屯、管上的QIAampMidi column 中，3000巧m 離屯、3min。
[0077] (4)去離屯、后的廢液，重復(fù)離屯、一次。
[007引（5)在QIAampMidi column中加2mL AW1 溶液，5000巧m離屯、15min。
[0079] (6)棄廢液，向QIAampMidi column中加2mL AW2溶液，5000巧m離屯、15min。
[0080] (7)將QIAampMidi column轉(zhuǎn)移至新的離屯、管上，在QIAampMidi column上加入300 μL AE，室溫放15min，而后5000巧m離屯、2min。
[0081 ] (8)重復(fù)步驟7,最后得到60化1曲ΝΑ溶液。
[0082] 2、曲ΝΑ質(zhì)檢：
[0083] 取化L曲ΝΑ加入到化no化op儀器(美國(guó)Thermo公司）中檢測(cè)DNA溶液濃度，根據(jù)濃 度取50ng用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)。
[0084] 3、DNA文庫(kù)構(gòu)建
[00化](l)DNA片段化：取化g DNA，用RB溶液稀釋至120yL，用超聲破碎儀（Bior叫ter公 司）打斷，7.5min/次，超聲8次。
[0086] (2)DNA末端補(bǔ)平：取60化片段化的DNA，加40化末端補(bǔ)平緩沖液（illumina En化邱air buffer)，混勻，離屯、；PCR儀中30°C反應(yīng)30min，再加入 160μΙ AmpureBeads(美國(guó) Beckman公司），充分混勻，室溫放置15min;放磁力架，室溫放置5min，去上清;加200化80% 乙醇，室溫30s，去上清，重復(fù)1次;室溫干燥15min;加20化RB溶液，從磁力架上取下，充分混 勻，室溫放置5min，取上清17.5化到一個(gè)新管中。
[0087] (3)加 A:加 12.5化 A-tailing buffer(瑞±Roche公司巧Ijl7.扣L DNA中，充分混 勻，PCR儀中37°C反應(yīng)30min。
[008引 （4)加接頭：依次加2.扣L RB，2.化L ligation Mix 2.5化接頭，混勻30°(：反應(yīng) lOmin;方口5μΙ Stop ligation buffer，混勻;再方口42.5μΙ AmpureBeads(美國(guó)Beckman公 司），充分混勻，室溫放置15min;放磁力架上，室溫反應(yīng)5min，去上清，勿動(dòng)beads;加入20化L 80%乙醇，室溫30s，去上清，重復(fù)1次;室溫干燥15min;加22化RB，從磁力架上取下，充分混 勻，室溫放置5min;放置磁力架上，取上清20化到一個(gè)新管中。
[0089] (5化〔3富集：取20化0魁，5化？?(：，2化1?0?1111義；98°(：反應(yīng)3〇3，10個(gè)循環(huán)（981： 10s，6(TC30s，72°C30s)，72°C5min，1(TC保存；再加入50化 AmpureBeads(美國(guó)Beckman公 司），充分混勻，室溫放置15min ;放磁力架，室溫放置5min，去上清，勿動(dòng)beads ;加200μΙ 80%乙醇，室溫30s，去上清，重復(fù)1次，室溫干燥15min;加32化RB，從磁力架上取下，充分混 勻，室溫放置5min;放置磁力架上，取上清30化到一個(gè)新管中。
[0090] (6)定量:如bit(美國(guó)invitrogen公司）定量DNA文庫(kù)。
[0091] (Ξ)采用試劑盒捕獲目的基因序列并進(jìn)行高通量測(cè)序、分析
[0092] 用步驟(一）制備的神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病基因篩查試劑盒捕獲祀基因序列并進(jìn)行 高通量測(cè)序、分析過(guò)程如圖2所示，具體步驟如下：
[OOW] 1、祀序列捕獲
[0094] (1)第一次雜交:每個(gè)文庫(kù)取50化g，6個(gè)不同接頭的文庫(kù)等量混合，真空濃縮至40μ L;方口50μΙ Capture Target buffer 1;方口ΙΟμΙ Exome Enrichment Use Capture Target 011旨〇3(瑞壬1?〇證日公司），充分混勻，離屯、；？〔1?，95"€1〇111；[]1，18個(gè)循環(huán)（93"€1111；[]1，每個(gè)循環(huán) 降低 2°C)，58°C18h。
[00巧](2)第一次wash:加250化充分混勻的鏈霉親和素磁珠 （streptavidin Ma即etic Beads),充分混勻，室溫靜置30min;磁力架放置2min，去上清；加200化Wash solution 1 (瑞：tRoche公司），充分混勻；磁力架放置2min，去上清；加200化Wash solution 2(瑞：t Roche公司），充分混勻;磁力架放置2min，去上清。
[0096] (3 )DNA洗脫：加混合好的化0H，30化到管中，混勻，室溫放置5min;磁力架放置 2111；[]1，取上清28.5化至一新離屯、管中；加扣L Elute 1:a;rget buffer 2(瑞:tRoche公司），混 勻。
[0097] (4)第二次雜交：取30化 DNA，加 ΙΟμΙ d地2〇,至40化；加50μΙ Capture Target bufferl(瑞±Roche公司）；方口ΙΟμΙ Exome Enrichment Use Capture Target Oli邑os(瑞± 1?〇^16公司）；充分混勻，離屯、;？〇?，95°(：10111111，18個(gè)循環(huán)(93°(：1111111，每個(gè)循環(huán)降低2°(：)，58 °C18h〇
[0098] (5)第二次wash:加250化充分混勻的鏈霉親和素磁珠 （streptavidin Ma即etic Beads),充分混勻，室溫靜置30min;磁力架放置2min，去上清；加200化Wash solution 1 (瑞：tRoche公司），充分混勻；磁力架放置2min，去上清；加200化Wash solution 2(瑞：t Roche公司），充分混勻;磁力架放置2min，去上清。
[0099] (6 )DNA洗脫：加混合好的化0H，30化到管中，混勻，室溫放置5min;磁力架放置 2min，取上清28.5化至一新離屯、管中；加扣L Elute 1:arget buffer2(瑞:tRoche公司），混 勻。
[0100] (7)PCR:20yL 0臟，5化 PPC，2扣L PCRmix;98°C30s，10個(gè)循環(huán)（98°C10s，6(TC30s， 72°C30s)，72°C5min，10°C保存；加50μΙ AmpureBeads(美國(guó)Beckman公司），充分混勻，室溫 放置15min;放磁力架，室溫放置5min，去上清，勿動(dòng)beads;加20化L80 %乙醇，室溫30s，去上 清，重復(fù)1次;室溫干燥15min;加32化RB，從磁力架上取下，充分混勻，室溫放置5min;放置 磁力架上，取上清SOiiL到一個(gè)新管中，得到祀序列文庫(kù)。
[0101] 2、簇生成
[0102] (1)用如bit儀器(美國(guó)invitrogen公司）定量文庫(kù)；
[0103] (2)將文庫(kù)稀釋至lOnM;
[0104] (3)取化L lOnM文庫(kù)，加 ΙμΙ 2N NaOH，加 1 如L TrisCl，混勻，室溫放置5min;
[0105] (4)取化L步驟3溶液，力的9化L冷的雜交buffer;
[0106] (5)取14化L步驟4溶液，放在8連管中，置于cBot的template欄中；
[0107] 3、通過(guò)111皿ina Hiseq3000測(cè)序，得到測(cè)序數(shù)據(jù)。測(cè)序參數(shù)如下： 目標(biāo)基因數(shù)目 854個(gè) 目標(biāo)區(qū)域長(zhǎng)度（bp) 4.8 Mb
[010引 目標(biāo)區(qū)域覆蓋率 98.6% 目標(biāo)區(qū)域測(cè)序平均深度（X ) 100X 目標(biāo)區(qū)域平均深度>20X位點(diǎn)所占比例 95.9%
[0109] 4、生物信息分析流程：
[0110] (1)利用化im Galore軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)從3'端動(dòng)態(tài)去除接頭序列片段和低質(zhì)量片 段。
[0111] (2)用化stQC軟件對(duì)預(yù)處理數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制分析。
[0112] (3)通過(guò)BWA軟件把有效測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到人類(lèi)參考基因組中（最多的錯(cuò)誤匹配數(shù)目 為3個(gè)，seed長(zhǎng)度為32，seed中錯(cuò)誤匹配的個(gè)數(shù)不得超過(guò)2個(gè)）。
[0113] (4)統(tǒng)計(jì)祀標(biāo)區(qū)域信息:祀標(biāo)區(qū)域平均覆蓋度、插入片段的大小、Reads落于目的區(qū) 域、目的區(qū)域附近、非目的區(qū)域的分布比例、目的區(qū)域內(nèi)不同覆蓋深度的堿基分布比例等。
[0114] (5)采用GATK3.1.1進(jìn)行變異檢測(cè)，SNP和Indel變異識(shí)別、校正、過(guò)濾。采用picard- tools軟件去除由于在建庫(kù)過(guò)程中PCR產(chǎn)生的重復(fù)序列;采用Smith-Waterman序列比對(duì)算法 (Smith-Waterman alignment algorithm)針對(duì)已知indels(來(lái)自化SNP138數(shù)據(jù)庫(kù)，化G indels)附近區(qū)域進(jìn)行局部重新比對(duì)，去除在比對(duì)中的錯(cuò)誤;針對(duì)來(lái)自測(cè)序儀產(chǎn)生的堿基質(zhì) 量分?jǐn)?shù)Quality Score進(jìn)行校正；通過(guò)GATK的UnifiedGenotyper程序?qū)上一系列操作后 的比對(duì)BAM文件進(jìn)行SNP和Indel的變異檢測(cè);針對(duì)上一步call出來(lái)的變異位點(diǎn)進(jìn)行過(guò)濾，去 掉不可信的位點(diǎn)。
[011引（6)用ANN0VAR對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行注釋?zhuān)们嘶蚪M、化SNP信息、ESPXLINVAR、 CADD、C0SMIC、NCI60等數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)變異注釋。確定變異發(fā)生的基因、位置、堿基改變、雜合或純 合變異、變異發(fā)生的頻率等信息。判別SNP變異為同義或非同義變異、預(yù)測(cè)氨基酸的改變對(duì) 蛋白質(zhì)功能的影響，注釋Indel變異為譯碼框缺失或是插入突變等信息。
[0116] (7)對(duì)候選SNP和Indel位點(diǎn)篩選，對(duì)變異質(zhì)量分?jǐn)?shù)、基因組區(qū)域特征等信息過(guò)濾變 異位點(diǎn)，SNP變異位于編碼區(qū)且影響氨基酸變化的錯(cuò)義突變或終止子突變?yōu)楹Y選條件， Indel變異是否為譯碼框突變?yōu)楹Y選條件。其他輔助篩選條件包括測(cè)序深度、千人基因組中 突變頻率、物種間的保守性、是否為有害突變(SIFT Score)等，最后篩選出疾病相關(guān)的SNP 或Indel變異。
[0117] (8)檢測(cè)結(jié)果及分析
[0118] 本次基因測(cè)序檢測(cè)發(fā)現(xiàn)受檢者攜帶MFN2基因的一個(gè)雜合新的變異位點(diǎn)c.379G〉A(chǔ)。 MFN2基因中的多個(gè)位點(diǎn)突變是脾骨肌萎縮癥常見(jiàn)的致病原因，并多為顯性遺傳。c.379G〉A(chǔ) 突變導(dǎo)致MFN2基因編碼氨基酸序列上第127位甘氨酸突變?yōu)榻z氨酸。Engelfried (Engelfried Κ et al.,Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 2A:novel mutations in the mitofusin 2gene(MFN2).BMC medical genetics.,2006;7:53)和Qumg(Qumg KW et al.,Early onset severe and late-onset mild Charcot-Marie-Tooth disease with mitofusin 2(MFN2)mutations.Brain:a journal of neurology.2006Aug；129(Pt 8): 2103-18)等研究發(fā)現(xiàn)脾骨肌萎縮癥患者攜帶雜合型c. 379G〉A(chǔ)變異位點(diǎn)。此外，該位點(diǎn)經(jīng) Polyphen2軟件預(yù)測(cè)可能會(huì)產(chǎn)生蛋白毒性，并且在千人數(shù)據(jù)庫(kù)中檢出頻率極低。因此， c.379G〉A(chǔ)雜合型變異可能導(dǎo)致受檢者患病。
[0119] 表1II.1例脾骨肌萎縮癥患者發(fā)生MFN2基因 c.379G〉A(chǔ)突變位點(diǎn)信息
[0120]
[0121] 為了進(jìn)一步驗(yàn)證基因篩查結(jié)果，對(duì)患者遺傳病家系進(jìn)行連鎖分析。對(duì)患者及其父 母和兄弟的C. 3 79G〉A(chǔ)位點(diǎn)進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)患者C. 379G〉A(chǔ)位點(diǎn)的基因型與其 母親和兄弟的基因型相同，均為雜合型變異，患者父親該位點(diǎn)為正常型，而患者和其母親及 兄弟Ξ者均有脾骨肌萎縮癥相關(guān)臨床癥狀，其父親無(wú)相關(guān)臨床癥狀，表明c.379G〉A(chǔ)位點(diǎn)極 可能為患者疾病的致病原因，并為顯性遺傳。家系圖譜和Sanger測(cè)序結(jié)果如圖3所示。
[0122] 上述具體實(shí)施方法，僅是對(duì)本發(fā)明的最優(yōu)實(shí)施方式進(jìn)行描述，而非對(duì)本發(fā)明的范 圍進(jìn)行限定，在不超出本發(fā)明基本設(shè)計(jì)思路的前提下，一切對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案做出的調(diào)整、 變形及改變，均應(yīng)歸入本發(fā)明權(quán)利要求書(shū)確定的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病基因篩查試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含與表1中所 示神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病相關(guān)的854個(gè)致病基因或疾病易感基因中全部外顯子序列的特異性 寡核苷酸捕獲探針。2. 如權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述探針長(zhǎng)度為50~105bp。3. 如權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述探針以生物素標(biāo)記。4. 制備如權(quán)利要求1所述試劑盒的方法，其特征在于，包含如下步驟： (1) 根據(jù)人類(lèi)基因組HG19序列，調(diào)取表1中全部與神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病發(fā)生相關(guān)基因的 外顯子序列； (2) 針對(duì)全部外顯子序列非重復(fù)區(qū)域設(shè)計(jì)50~105bp長(zhǎng)度的捕獲探針，每個(gè)探針沿著基 因位置挪動(dòng)3~10bp，目標(biāo)區(qū)域每個(gè)堿基被探針覆蓋3~20次。 (3) 合成步驟(2)所設(shè)計(jì)的捕獲探針，并以生物素標(biāo)記。5. -種神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病基因聯(lián)合篩查方法，包括以下步驟： (1) 獲取、檢測(cè)受檢者的全基因組DNA樣本； (2) 構(gòu)建受檢者全基因組文庫(kù)； (3) 采用如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述試劑盒中的捕獲探針與受檢者DNA文庫(kù)混合，目標(biāo) 區(qū)域基因片段與探針雜交，探針通過(guò)標(biāo)記的生物素與帶有親和素的磁珠結(jié)合； (4) 將未結(jié)合的非目標(biāo)區(qū)域的DNA片段洗脫； (5) 利用新一代高通量測(cè)序儀對(duì)目標(biāo)區(qū)域基因組進(jìn)行測(cè)序、分析，獲取疾病相關(guān)基因的 所有突變信息。6. 如權(quán)利要求5所述篩查方法，其特征在于，所述高通量測(cè)序儀為11 lumina HiSeq 3000 型。7. 如權(quán)利要求5所述篩查方法，其特征在于，步驟(5)中所述分析過(guò)程包含以下步驟： (1) 從高通量測(cè)序儀(IIlumina HiSeq 3000)獲取原始數(shù)據(jù)； (2) 利用Trim Galore軟件對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)從3'端動(dòng)態(tài)去除接頭序列片段和低質(zhì)量片段； (3) 用FastQC軟件對(duì)預(yù)處理數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制分析； (4) 通過(guò)BWA軟件把有效測(cè)序數(shù)據(jù)比對(duì)到人類(lèi)參考基因組中； (5) 統(tǒng)計(jì)靶標(biāo)區(qū)域信息，包括靶標(biāo)區(qū)域平均覆蓋度、插入片段平均分布圖、目標(biāo)區(qū)域測(cè) 序深度等； (6) 采用GATK3.1.1進(jìn)行變異檢測(cè)，SNP和Indel變異識(shí)別、校正、過(guò)濾； (7) 用ANN0VAR對(duì)變異位點(diǎn)進(jìn)行注釋?zhuān)詈蠛Y選出疾病相關(guān)的SNP或Indel變異。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK106011224SQ201510982601
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2015年12月24日
【發(fā)明人】熊玉宇, 鄒曉文, 楊福蘭, 葉思彬
【申請(qǐng)人】晶能生物技術(shù)（上海）有限公司