一種融合基因室內(nèi)質(zhì)控品、制作方法及其固定液的配方的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種采用固定的細胞懸液制作常見融合基因室內(nèi)質(zhì)控品的方法及其固定液的配方。本發(fā)明可用于室內(nèi)質(zhì)量控制的融合基因檢測包括：BCR?ABL P210(b2a2型和b3a2型)、BCR?ABL P190、PML?RaRa(L型和S型)和AML1?ETO四種融合基因。該方法所使用的固定液價格低廉，無毒無害；一管質(zhì)控品能同時完成4種融合基因的室內(nèi)質(zhì)控，方便經(jīng)濟；而目前市場上尚無可售的融合基因質(zhì)控品，該發(fā)明填補了目前業(yè)內(nèi)無融合基因質(zhì)控品的空白。
【專利說明】
-種融合基因室內(nèi)質(zhì)控品、制作方法及其固定液的配方
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬生命科學和生物技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種采用固定的細胞懸液制作常見 融合基因室內(nèi)質(zhì)控品、制作方法及其固定液的配方。
【背景技術(shù)】
[0002] 白血病的發(fā)病率日趨升高，最近10年來的發(fā)病率幾乎是此前的兩倍。隨著醫(yī)療水 平及技術(shù)的發(fā)展，白血病的分類、治療及預(yù)后評價體系都得到了系統(tǒng)性的提升和完善。祀向 治療藥物的問世使分子診斷成為疾病診斷、治療及預(yù)后監(jiān)測過程中不可或缺的一部分。其 中融合基因的檢測不僅輔助疾病分類和診斷，還與用藥及治療方案的選擇息息相關(guān)。特別 像BCR-ABL P210和BCR-A化P190融合基因，是診斷慢性粒細胞白血病(CML)的特征性分子 標志物；同時也是指導格列衛(wèi)等酪氨酸激酶抑制劑的祀標，其還可發(fā)生于B系的急性淋己細 胞白血病(B-A化）；PMkRaRa是急性早幼粒細胞白血病(M3)的診斷指標，而M3的治療是區(qū)別 于其他急性髓系白血病(AML)的;AML1-ET0融合基因也是AML的一個診斷指標，同時也是預(yù) 后良好的一個預(yù)后指標。
[0003] 運些分子祀標，同時又是診斷指標，在臨床應(yīng)用上發(fā)揮著相當大的作用；同時也承 載著臨床檢測需求的壓力。既然與疾病的諸多環(huán)節(jié)相關(guān)，那么其檢測結(jié)果的準確性和穩(wěn)定 性自然成為行業(yè)關(guān)注的焦點，即其質(zhì)量控制顯得尤為重要。由于國內(nèi)相關(guān)檢測起步較晚，而 融合基因檢測的目標是RNA，一種非常容易被環(huán)境中到處充斥著的RNA酶降解的核酸，所W 用于監(jiān)控實驗室檢測質(zhì)量的質(zhì)控物一直沒有面市。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 鑒于目前市面上尚無融合基因檢測室內(nèi)質(zhì)控品銷售，而室內(nèi)質(zhì)控又是衡量和評估 一個實驗室檢測體系的精確度和穩(wěn)定性的重要方法和質(zhì)量指標，故本發(fā)明設(shè)計了一種配置 融合基因質(zhì)控品的方法和用于配置質(zhì)控品的固定液。
[0005] -種用于配置細胞懸液作為質(zhì)控品的固定液，包括70-75 %的無水冰乙醇和1-5 % 的冰醋酸，溶劑為水。
[0006] 更進一步具體的方案中，所述固定液WlOOml計算，包括4°C預(yù)冷無水乙醇70ml，冰 醋酸1ml，其余為水。
[0007] 配制好后的固定液在4°C冷藏保存。
[000引所述水為選自DEPC水。所述無水乙醇和冰醋酸均選自分析純(AR)。
[0009] 本發(fā)明還提供了使用上述固定液配置融合基因室內(nèi)質(zhì)控品的方法，其包括W下步 驟：
[0010] (1)提取已知融合基因表達的樣本中的有核細胞；
[0011] 間用固定液重懸有核細胞沉淀，離屯、棄上清;再加固定液重懸，獲得融合基因室內(nèi) 質(zhì)巧品。
[0012] 若W收集的全血樣品中的白細胞配置融合基因室內(nèi)質(zhì)控品，其配制方法包括W下 步驟：
[0013] (1)采用紅細胞裂解液裂解紅細胞的方法提取已知融合基因表達的樣本中的有核 細胞。
[0014] 間用固定液重懸有核細胞沉淀，離屯、棄上清;再加固定液重懸即可。
[0015] 所述固定液包括70-75 %的冰乙醇和1-5 %的冰醋酸，溶劑為水。
[0016] 所述 10X 紅細胞裂解液配方為：NH4C1 82g，NaHC038.4g，抓 TA-Na2 3.72g，加 d地20定容至1000ml。
[0017] 若W收集的培養(yǎng)細胞配制融合基因室內(nèi)質(zhì)控品，其配制方法包括W下步驟：
[0018] (1)消化收集表達已知融合基因的培養(yǎng)細胞，離屯、棄上清。
[0019] 間用固定液重懸細胞沉淀，離屯、棄上清;再加固定液重懸。
[0020] 所述固定液包括包括70-75 %的冰乙醇和1-5 %的冰醋酸，溶劑為水。
[0021] 有核細胞可W選自BCR-ABL P210融合基因 b2a2型陽性、b3a2型陽性，BCR-A化 P190融合基因陽性，PMkRaRa融合基因 L型陽性、S型陽性和AML1-ET0融合基因陽性等樣本。 運些有核細胞可W單獨經(jīng)固定液重懸后，配制成質(zhì)控品，也可W將它們中的兩種或兩種W 上的有核細胞經(jīng)固定液重懸后，等體積混合，備用。還可W進一步將混合后的細胞懸液按 lOOul/份分裝備用。
[0022] 本發(fā)明還提供了用于一種融合基因室內(nèi)質(zhì)控品，所述質(zhì)控品包括有核細胞和細胞 固定液，所述細胞固定液包括70-75 %的冰乙醇和1-5 %的冰醋酸，溶劑為水。
[0023] 有核細胞可W選自BCR-ABL P210融合基因 b2a2型陽性、b3a2型陽性，BCR-A化 P190融合基因陽性，PML-RaRa融合基因 L型陽性、S型陽性和AML1-ET0融合基因陽性中等樣 本中的一種或多種。
[0024] 本發(fā)明還提供了使用上述質(zhì)控品進行臨床檢測過程質(zhì)量控制的方法，其包括W下 步驟：
[00巧](1)取質(zhì)控品，加入1ml生理鹽水，靜置5min后離屯、棄上清。再加1ml生理鹽水洗涂一 次。
[0026] 間按實驗室日常融合基因檢測流程，同臨床樣本一起進行操作。
[0027] 據(jù)統(tǒng)計，BCR-A化 P210、BCR-ABL P190、PMkRaRa和ML1-ET0四種融合基因的樣本 檢測量占所有融合基因檢測量的90% W上。幾乎每一個開展融合基因檢測的實驗室都會開 展運四項。實驗室檢測的精密度和穩(wěn)定性對疾病的診斷，特別是治療后微小殘留病灶(MRD) 的監(jiān)測具有非常重要的影響。故對該四種常見融合基因檢測的質(zhì)量控制在實驗室檢測中顯 得尤為重要。
[0028] 作為質(zhì)控品，其基本要求如下：(1)接近于臨床樣品的狀態(tài)或保存于與臨床樣品相 似的基質(zhì)中，如血清類質(zhì)控品；間穩(wěn)定性好，易于保存;如-20°C保存至少半年，最好是一年； 間處理方法和過程與臨床樣本一致，能監(jiān)控整個檢測流程;(4)對環(huán)境和人員無毒無害。作為 檢測RNA的融合基因項目，其質(zhì)控品的穩(wěn)定性是個難W解決的大問題。因為空氣中，人的唾 液，皮膚等到處都存在著RNA酶，故RNA非常容易降解。穩(wěn)定RNA，保存RNA是質(zhì)控品制作的關(guān) 鍵所在。其次作為質(zhì)控品，其狀態(tài)，檢測過程需與臨床樣本保持一致，那么最接近臨床樣本 的物質(zhì)就是細胞懸液。本發(fā)明利用無水乙醇、冰醋酸及DEPC水配置固定液，一方面固定了細 胞，避免細胞之間的粘附聚集，易于均勻分裝使用;一方面其中的冰醋酸穩(wěn)定了細胞中的核 酸成分，不易變性降解。并且穩(wěn)定性實驗已證明，該方法制作的細胞懸液質(zhì)控品于-20°C條 件下至少能保存9個月。而配置固定液的成分價格低廉，無毒無害，配置方法簡單，易于實驗 室大批量配置使用。
【具體實施方式】
[0029] 實施例1:
[0030] 全血有核細胞的提取及細胞懸液的固定:在1.5ml離屯、管中加入1ml IX紅細胞裂 解液，取全血樣本0.5ml，顛倒混勻。400化pm離屯、3min，吸棄上清，加紅細胞裂解液洗涂一 次，加入細胞沉淀等體積的固定液50ul，即為配置好的質(zhì)控品。
[0031] 所述固定液包括4°C預(yù)冷無水乙醇(AR)，70-75ml;冰醋酸(AR)，l-5ml ;DEPC水定容 至100ml; 4°C冷藏保存。
[0032] 實施例2:
[0033] 質(zhì)控品的RNA提?。喝嵤├?中質(zhì)控品加入1ml生理鹽水，靜置5min后離屯、棄上 清。再加1ml生理鹽水洗涂一次。加1 ml Total RNA Isolation Reagent,反復吹吸直至無 明顯細胞團塊，加入氯仿200μ1，縱滿混勻30s，冰上靜置10min<a4,000巧m，4°C離屯、lOmin。 用移液器吸取上清液45化1轉(zhuǎn)移至另一離屯、管中，加入等體積的預(yù)冷異丙醇，顛倒混勻后在 冰上靜置10minJ4,000巧m，4°C離屯、lOmin。然后用75%的乙醇和無水乙醇分別洗涂離屯、一 次。室溫干燥5min，加入50μ1 DEPC-肥0溶解。
[0034] 實施例3:
[0035] 逆轉(zhuǎn)錄:取實施例2中RNA溶液4ul(濃度約200ng/ul)加 lul Primer mix(ReverTra Ace qPCR RT Kit)和 3ulDEPC-H20 混勻，70°C 預(yù)變性 5min;冰上驟冷 Imin 后加入 5*RT buffer4ul(ReverTra Ace qPCR RT Kit),Enzyme Mix lul(ReverTra Ace qPCR RT Kit), 并加 DEPC-H20 7ul至總體積為20ιιΚ37Γ60π?η反應(yīng)后98°C5min滅活，所得即為待檢質(zhì)控品 的cDNA。
[0036] 實施例4:
[0037] 不同配方固定液的比較實驗:按實施例1中方法提取有核細胞4份，分別加入4種不 同配方的固定液，4°C固定1天后和-20°C固定一天后分別進行檢測。按實施例2和3中方法得 到cDNA。檢巧U4份待比較樣品的內(nèi)參A化基因，W判斷RNA是否降解。A化基因檢測的引物探針 如下表1所示；試劑配置如下表2所示；加入實施例3中所得cDNA各化1。按如下程序進行檢 ?i:95°C預(yù)變性30s;95°C10s，58°C35s，共40個循環(huán);58°C時采集巧光。T冊NDERBI畑Probe qPCR Mix購自東洋紡(上海)生物科技有限公司。A化基因檢測拷貝數(shù)取L0G10后，下降值不 得>-7.5%。由所得結(jié)果可知(表3)，序號1(染色體核型分析常用配方)和序號3(本發(fā)明的 固定液)在4 °C固定1天后和-20°C固定一天后，A化內(nèi)參沒有降低，即RNA沒有降解。而序號1 由于冰醋酸含量大，具有刺激性，對工作人員的健康不利。而本發(fā)明的固定液配方則沒有運 個問題。
[00；3 引 表1:
[0039]
[0044] 注:*配方1為染色體核型分析實驗中的細胞懸液固定液，該固定液對染色體的形 態(tài)無影響;配方2為RNA提取過程中的洗涂液，可去除殘留的蛋白、鹽離子、提取試劑中殘留 的苯酪等有機物;配方3即本發(fā)明；配方4是常規(guī)病理的細胞固定液，用于細胞的固定。
[0045] 實施例5:
[0046] 不同樣品細胞間的干擾實驗:不同人的白細胞之間會發(fā)生粘附、聚集，然后其內(nèi)容 的核酸降解。由于質(zhì)控品的使用量較大，需要將同一種融合基因陽性但來自不同患者的白 細胞進行混合。本實驗旨在確定不同人白細胞在固定后是否會發(fā)生相互粘附而降解。按實 施例1方法獲取固定后的4份不同人員樣本，將樣品1和2進行混合，樣品3和4進行混合。按實 施例巧P3方法取得cDNA，按實施例4中方法檢測A化內(nèi)參基因。由所得結(jié)果(表4)可知，混合 后，內(nèi)參基因未降低，即RNA未發(fā)生降解。故本發(fā)明的固定液配方可W避免不同來源細胞 的粘附降解。
[0047]表4:
[004引
[0049] 實施例6:
[0050] 可操作性實驗：旨在評估該類型質(zhì)控品在現(xiàn)有實驗室流程及不同人員操作過程中 產(chǎn)生的誤差是否能滿足作為質(zhì)控品的穩(wěn)定性要求。按實施例1配置6份BCR-A化P210陽性的 質(zhì)控品；選兩名實驗室技術(shù)人員A和B，按照實施例2和3方法獲取cDNA，檢測BCR-ABL P210和 ABL，統(tǒng)計偏倚率。BCR-ABL P210的引物探針如下表5所示;試劑配置如下表6所示;A化檢測 按實施例4進行，各加入所得cDNA各化1。按如下程序進行檢測:95°C預(yù)變性30s; 95 °C 10s，58 °C35s，共40個循環(huán);58°C時采集巧光。BCR-A化P210和A化基因檢測拷貝數(shù)取LOGIO后，偏倚 不得>±7.5%。由所得結(jié)果(表7)可知，兩名技術(shù)員分別進行質(zhì)控品檢測后，其偏倚率在要 求范圍內(nèi)。即該類型質(zhì)控品的可操作性符合其作為質(zhì)控品的要求。
[0化1] 表5:
[0化2]
[0化6] 表7: 「00571
[0化引實施例7:
[0059] 保存穩(wěn)定性及臨床適用性實驗：
[0060] 選取已知BCR-A化P210b2a2型和b3a2型陽性樣品各兩份、BCR-ABL P190陽性樣品 4份、PMkRaRa L型和S型陽性樣品各4份;AML1-ET0陽性樣品2份，按實施例1方案制備成固 定的細胞懸液。取6種融合型別陽性的細胞懸液各300ul，混勻后lOOul/管分裝好，-20±2°C 保存?zhèn)溆谩Ｖ苽涑傻某Ｒ娙诤匣蚴覂?nèi)質(zhì)控品。
[0061] 按配置好后當天，一周，兩周，一個月，兩個月，Ξ個月，6個月和9個月等時間點進 行保存穩(wěn)定性實驗。質(zhì)控品檢測方法同實施例2進行RNA提取;檢測采用成品試劑盒，來自上 海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司，W驗證該質(zhì)控品是否適用于經(jīng)CFDA認證的成品檢測系統(tǒng)進 行室內(nèi)質(zhì)量控制使用。試劑配置如表8.每個PCR反應(yīng)管中加15U1RNA;按如下程序進行檢測： 42°C30min;94°C預(yù)變性5min;94°C15s，60°C60s，共40個循環(huán);60°C時采集巧光。檢測所得拷 貝數(shù)取L0G10后，偏倚不>±7.5%，則認為質(zhì)控品仍在有效范圍內(nèi)，若某次偏離范圍，則再 取一管重新檢測W排除偶然因素。由所得結(jié)果(表9)可知，-20±2°C保存9個月后，質(zhì)控品仍 穩(wěn)定可使用。且該質(zhì)控品適用于市面上的成品檢測試劑盒。
[0062] 表8:
[0063]
[0067] 注:沖210包含b2a2和b3a2兩種型別。
【主權(quán)項】
1. 一種用于配置細胞懸液作為質(zhì)控品的固定液，其特征在于，包括70-75%的冰乙醇和 1-5%的冰醋酸，溶劑為水。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定液，其特征在于，包括70 %的冰乙醇和1 %的冰醋酸。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固定液，其特征在于，所述的水為DEPC水。4. 配置融合基因室內(nèi)質(zhì)控品的方法，其包括以下步驟： ⑴提取已知融合基因表達的樣本中的有核細胞； ⑵用固定液重懸有核細胞沉淀，離心棄上清;再加固定液重懸，獲得融合基因室內(nèi)質(zhì)控 品； 所述固定液包括70-75 %的冰乙醇和1-5 %的冰醋酸，溶劑為水。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于， 以收集的全血樣品中的白細胞配置融合基因室內(nèi)質(zhì)控品，其配制方法包括以下步驟： ⑴采用紅細胞裂解液裂解紅細胞的方法提取已知融合基因表達的樣本中的有核細胞； ⑵用固定液重懸有核細胞沉淀，離心棄上清;再加固定液重懸。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述紅細胞裂解液配方為：NH4C1 82g， NaHC038 · 4g，EDTA-Na2 3 · 72g，加 ddH20定容至 1000ml。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于， 以收集的培養(yǎng)細胞配制融合基因室內(nèi)質(zhì)控品，其配制方法包括以下步驟： ⑴消化收集表達已知融合基因的培養(yǎng)細胞，離心棄上清； ⑵用固定液重懸細胞沉淀，離心棄上清;再加固定液重懸。8. 根據(jù)權(quán)利要求4至8之一所述的方法，其特征在于，所述有核細胞選自BCR-ABL P210 融合基因 b2a2型陽性、b3a2型陽性，BCR-ABL P190融合基因陽性，PML-RaRa融合基因 L型陽 性、S型陽性和AML1-ETO融合基因陽性中的一種或多種。9. 一種融合基因室內(nèi)質(zhì)控品，包括有核細胞和細胞固定液，其特在在于，所述細胞固定 液包括70-75 %的冰乙醇和1-5 %的冰醋酸，溶劑為水。10. 使用權(quán)利要求9所述的質(zhì)控品進行臨床檢測過程質(zhì)量控制的方法，其包括以下步 驟： ⑴取質(zhì)控品，加入lml生理鹽水，靜置5min后離心棄上清。再加 lml生理鹽水洗滌一次； ⑵按實驗室日常融合基因檢測流程，同臨床樣本一起進行操作。
【文檔編號】C12Q1/68GK106011240SQ201610345672
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月19日
【發(fā)明人】鄒媛, 陳紅梅, 夏成青
【申請人】合肥艾迪康臨床檢驗所有限公司