用于鑒定萱草屬植物遺傳群體結(jié)構(gòu)的引物組、試劑盒及方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)萱草屬(Hemerocallis L.)植物遺傳多態(tài)性的引物組，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。所述引物組選自由34對(duì)引物對(duì)構(gòu)成的群組：所述34對(duì)引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ ID No.1至SEQ ID No.68所示。上述引物組還可用于萱草屬植物遺傳群體結(jié)構(gòu)的鑒定。采用本發(fā)明所提供的引物組和鑒定方法，可在萱草屬植物的任一生長階段采樣，并進(jìn)行遺傳分類鑒定，具有周期短、限制少、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】
用于鑒定宣草屬植物遺傳群體結(jié)構(gòu)的引物組、試劑盒及方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種用于鑒定宣草屬植物遺傳群體結(jié)構(gòu)的 引物組、試劑盒及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 黃花菜化日111日1'〇。日1113(^付;[]1日)又名金針菜，俗名金針花，為百合科多年生草本植 物，原產(chǎn)于中國南部及日本，其根、葉、莖、花在東亞地區(qū)作為食品和傳統(tǒng)的藥品已有幾千年 的歷史。黃花菜鮮甜味美，華素兼優(yōu)，在中國醫(yī)學(xué)3000多年的食療歷史中，黃花菜被列為常 用食療食品之一。中醫(yī)認(rèn)為黃花菜具有平肝養(yǎng)血、消腫利尿、抗菌消炎、止血、鎮(zhèn)痛、通乳、健 胃和安神的功能，能治療肝炎、黃痘、大便下血、感冒、頻疾、尿路感染、頭暈、耳鳴、屯、惇、腰 痛、水腫、缺乳、關(guān)節(jié)腫痛等多種病癥。黃花菜營養(yǎng)豐富，含有糖類、蛋白質(zhì)、維生素、無機(jī)鹽 及多種人體必需的氨基酸。黃花菜屬高蛋白、低熱值、富含維生素及礦物質(zhì)的蔬菜。在現(xiàn)代 生活中，黃花菜與香茹、木耳、冬算一起被稱為蔬菜類中的四大珍品。選育優(yōu)質(zhì)黃花菜品種， 可使性狀更穩(wěn)定，增加產(chǎn)量，營養(yǎng)更豐富，富含花粉、糖類、蛋白質(zhì)、氨基酸、Ca、P、Fe等礦物 質(zhì)，胡蘿l·素、硫胺素、核黃素等維生素類;抗逆行增強(qiáng)，對(duì)病蟲害有極強(qiáng)的抵御能力，既耐旱 又耐潰、既耐肥又耐瘡薄、耐鹽堿，不需特殊管理，能在路邊、溝邊及荒地生長，其野生性很 強(qiáng)，綜合品質(zhì)優(yōu)良等特點(diǎn)。
[0003] 現(xiàn)有技術(shù)領(lǐng)域中，分子標(biāo)記的種類大概包括:RFLP、RAPD、AFLP、SNP、SSR。
[0004] EST化xpressed Sequence Tags)即表達(dá)序列標(biāo)簽，指從C DNA文庫中隨機(jī)挑取單 克隆測(cè)序所獲得的序列片段。序列長度一般約為60-500bp，由于cDNA的5'端或3'端的有限 序列可特異性地代表一個(gè)基因，故稱為"表達(dá)序列標(biāo)簽"。表達(dá)序列標(biāo)簽化ST)作為表達(dá)基因 所在區(qū)域的分子標(biāo)簽因編碼DNA序列高度保守而具有自身的特殊性質(zhì)，與來自非表達(dá)序列 的標(biāo)記(如RAPD、SSR、AFLP等)相比，更有可能突破家系與種的限制。因此，EST標(biāo)記在親緣關(guān) 系較遠(yuǎn)的物種間具有更重要的意義。
[0005] EST技術(shù)的基本原理是:基因表達(dá)遵從中屯、法則，即遺傳信息由DNA序列經(jīng)轉(zhuǎn)錄、剪 接后到mRNA分子，mRNA分子由5'-UTR(5'-un1:ranslatedregion，5'非編碼區(qū)）、編碼區(qū) (Coding sequence,簡稱CDS,為最大的開放閱讀框0RF)、3'-UTR(3'region，3'非編碼區(qū)）和 poly A四部分組成。任何一個(gè)基因的5 ' -UTR和3 ' -UTR都是特定的，即每條cDNA的5 '或3 '的 部分序列可特異性地代表某個(gè)基因在生物體中的表達(dá)情況。由于所測(cè)定的cDNA來源于 mRNA，因此，每個(gè)EST均代表了所采樣品特定發(fā)育時(shí)期和生理狀態(tài)下的基因組DNA中一個(gè)表 達(dá)基因的部分轉(zhuǎn)錄序列。由此可W表明，EST的數(shù)目可W反映某個(gè)基因的表達(dá)情況，一個(gè)基 因的拷貝數(shù)越多，其表達(dá)越豐富，測(cè)定的相應(yīng)EST序列就越多，從而通過對(duì)生物體EST分析可 W獲得生物體內(nèi)基因的表達(dá)種類和豐度。Craig Venter為EST技術(shù)的發(fā)展做出了不懈努力， 而自動(dòng)化測(cè)序技術(shù)將EST技術(shù)從結(jié)構(gòu)基因組學(xué)擴(kuò)展到功能基因組學(xué)。
[0006] 然而目前，在黃花菜中開發(fā)出一種有效的EST-SSR分子標(biāo)記引物，用于檢測(cè)宣草屬 植物的遺傳多態(tài)性及遺傳結(jié)構(gòu)，在本領(lǐng)域仍屬空白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明基于本領(lǐng)域的上述空白，提供了一種基于黃花菜材料EST-SSR分子標(biāo)記的 引物組，它們可用于檢測(cè)不同宣草屬植物間的遺傳多態(tài)性及遺傳結(jié)構(gòu)。
[000引本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0009] 用于檢測(cè)宣草屬化emerocallis L.)植物遺傳多態(tài)性的引物組，其特征在于，所述 引物組選自由下述引物對(duì)構(gòu)成的群組：
[0010] sau00003F/sau00003R；sau00006F/sau00006R；sau00008F/sau00008R； sau00009F/sau00009R;
[0011] sau00010F/sau00010R；sau00029F/sau00029R；sau00042F/sau00042R； sau00045F/sau00045R；
[0012] sau00047F/sau00047R；sau00048F/sau00048R；sau00052F/sau00052R； sau00055F/sau00055R;
[0013] sau00063F/sau00063R；sau00080F/sau00080R；sau00095F/sau00095R； sau00102F/sau00102R;
[0014] sau00104F/sau00104R；sau00109F/sau00109R；sau00120F/sau00120R； sau00121F/sau00121R；
[0015] sau00124F/sau00124R；sau00132F/sau00132R；sau00135F/sau00135R； sau00137F/sau00137R；
[0016] sau00138F/sau00138R；sau00141F/sau00141R；sau00143F/sau00143R； sau00144F/sau00144R；
[0017] sau00150F/sau00150R；sau00160F/sau00160R；sau00164F/sau00164R； sau00171F/sau00171R；
[001 引 sau00172F/sau00172R；sau00180F/sau00180R；
[0019] 上述引物對(duì)的核巧酸序列如沈Q ID No. 1至沈Q ID No.68所示。
[0020]用于鑒定宣草屬植物遺傳群體結(jié)構(gòu)的試劑盒，其特征在于，包括所述的引物組。 [0021 ]所述試劑盒還包括用于PCR反應(yīng)和/或電泳的常規(guī)試劑。
[0022] 用于鑒定宣草屬植物遺傳群體結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于，采用所述的引物組或所 述的試劑盒進(jìn)行如下步驟：
[0023] (1)采用所述引物組中的每對(duì)引物對(duì)分別對(duì)待鑒定宣草屬植物材料群體中的每個(gè) 材料的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0024] (2)凝膠電泳檢測(cè)所述PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物；
[0025] (3)根據(jù)STRUCTURE軟件要求的格式對(duì)上述電泳條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；
[0026] (4)將上述統(tǒng)計(jì)結(jié)果輸入STRUCTURE軟件進(jìn)行分析，得出似然值LnP(D)達(dá)到最大值 時(shí)或Δ K達(dá)到最大值時(shí)對(duì)應(yīng)的K值，即為確定所述待鑒定宣草屬植物材料群體所包含的遺傳 群體數(shù)目；
[0027] 所述ΔΚ計(jì)算公式如下：
[0028] AK=m[ lUK+l)-化化)+L(K-1) I ]/s|L(K)
[0029] 上述公式中，Uk)為每個(gè)Κ的對(duì)數(shù)值，s為標(biāo)準(zhǔn)差，m為平均值。
[0030] 所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：0.2化/化的所述基因組DM做為擴(kuò)增模板，2 XTaq PCR 1曰816礎(chǔ)1如.化1/41，0.5皿〇1/1的所述引物對(duì)，其余為雙蒸水。
[0031] 所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C，3min; W94°C45s，68~58°Clmin，72°Clmin為 1 個(gè)循環(huán)，6個(gè)循環(huán)；W94°C30s，58~50°(：1111111，72°(：1111111為1個(gè)循環(huán)，9個(gè)循環(huán)；^941：3〇3,50 °C 30s，72°C Imin 為 1 個(gè)循環(huán)，20 個(gè)循環(huán)；72°C 5min; 4°C 保存。
[0032] 所述電泳指，采用8%非變性聚丙締酷胺凝膠，于180V恒功率電壓下，電泳分離150 ~180分鐘，然后銀染顯色。
[0033] 所述STRUCTURE軟件要求的格式指，每個(gè)材料對(duì)應(yīng)的條帶大小依次編號(hào)記錄，相同 大小的條帶記為同一編號(hào)。
[0034] 所述方法在鑒定宣草屬植物材料所屬遺傳群體中的用途，特征在于:將多種已知 遺傳群體分類的宣草屬植物材料與待測(cè)宣草屬植物材料組合起來作為所述待鑒定宣草屬 植物材料，進(jìn)行步驟（1) - (4 )，通過STRUCTURE軟件分析所確定的已知材料和待測(cè)材料的遺 傳群體分類結(jié)果來確定待測(cè)材料所屬的的遺傳類群。
[0035] 本發(fā)明首先采用已知黃花菜品種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，找到相關(guān)的SSR位點(diǎn)，初步篩選 設(shè)計(jì)192對(duì)引物，在192對(duì)引物中得到34對(duì)引物對(duì)構(gòu)成本發(fā)明所述的用于鑒定宣草屬 化emerocallis L.)植物遺傳群體結(jié)構(gòu)的引物組，采用所述引物組對(duì)待測(cè)宣草屬植物材料 的基因組DNA進(jìn)行PC則寸，擴(kuò)增效果好，背景清晰，條帶差異明顯和便于統(tǒng)計(jì)帶型，如圖5所 /J、- 〇
[0036] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施，上述34對(duì)引物對(duì)中的任意一對(duì)、多對(duì)或全部組成的引物組來 來檢測(cè)宣草屬植物材料的遺傳多態(tài)性。
[0037] 進(jìn)一步地，采用上述％對(duì)引物對(duì)可用來鑒定不同宣草屬植物之間的遺傳群體結(jié) 構(gòu)，具體步驟和原理如下：用上述34對(duì)引物對(duì)中的每對(duì)引物，分別擴(kuò)增每個(gè)待測(cè)宣草屬植物 的基因組DNA，所得的電泳條帶，按照每個(gè)泳道的條帶大小位置，分別記下編號(hào)，相同大小位 置的條帶記為同一編號(hào)，例如，第1泳道出現(xiàn)雜合帶型，即一大一小兩條帶，則記為1，2;第2 泳道僅出現(xiàn)一條與1泳道大帶型位置一樣的純和帶型，則記為1，1;第3泳道僅出現(xiàn)一條與1 泳道小帶型位置一樣的純和帶型，則記為2,2。依次記錄下每對(duì)引物擴(kuò)增的每個(gè)待測(cè)材料的 電泳條帶數(shù)據(jù)，即形成STRUCTURE軟件要求的數(shù)據(jù)文件，將該數(shù)據(jù)文件輸入STRUCTURE軟件， 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析:在該軟件的分析過程中出現(xiàn)最大似然值時(shí)或A K達(dá)到峰值時(shí)，則此時(shí)對(duì)應(yīng)得 到的K值即為多個(gè)待測(cè)材料所分屬的遺傳亞群數(shù)目；上一步得到分析結(jié)果中，上述K值對(duì)應(yīng)K 種不同顏色，不同顏色對(duì)應(yīng)不同遺傳亞群;每個(gè)材料對(duì)應(yīng)的分析結(jié)果由不同比例的1-K種顏 色填充，因此可W通過某種顏色所占比例直觀看出，不同遺傳亞群對(duì)該材料的遺傳背景影 響程度，即該材料中不同遺傳亞群所占的遺傳背景份額。
[0038] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的上述方法還可W用于檢測(cè)某種材料的遺傳群體歸屬。將已知 遺傳群體分類的宣草屬植物材料的基因組DNA與待測(cè)宣草屬植物材料的基因組DNA-起進(jìn) 行上述擴(kuò)增、電泳、ST抓CTURE標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)、ST抓CTURE軟件分析步驟，通過所述待測(cè)材料在 STRUCTURE軟件中的顯示結(jié)果是否落入已知材料所屬的類群來判斷待測(cè)材料的具體遺傳類 群。
[0039] 采用本發(fā)明所提供的引物組、試劑盒和/或方法鑒定宣草屬植物遺傳群體結(jié)構(gòu)，不 僅能直觀顯示供試材料分屬的類群數(shù)目，而且還能直觀看出供試材料所含遺傳背景的所占 份額，更重要的是，能對(duì)未知遺傳類群的宣草屬植物進(jìn)行遺傳分類，最終確定其所屬的遺傳 類群。本發(fā)明在分析宣草屬植物遺傳結(jié)構(gòu)時(shí)選用STRUCTURE軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，分析結(jié)果可 直觀看出供試材料分屬類群及所含遺傳背景占的份額，能通過數(shù)據(jù)比例直觀看出不同遺傳 亞群對(duì)某種具體材料的遺傳背景影響程度。
[0040]采用本發(fā)明所提供的方法，可在宣草屬植物的任一生長階段采樣，并進(jìn)行遺傳分 類鑒定，具有周期短、限制少、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0041 ]圖1為轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程圖。
[0042] 圖2為K值的變化趨勢(shì)。
[0043] 圖3為ΔΚ隨k值的變化趨勢(shì)。
[0044] 圖4為Κ = 2時(shí)，不同材料的分類結(jié)果，圖中的序號(hào)與表1的材料序號(hào)相對(duì)應(yīng)。
[0045] 圖5為本發(fā)明所述引物組中的某些引物的電泳圖。
【具體實(shí)施方式】
[0046] W下結(jié)合具體實(shí)施實(shí)例進(jìn)一步闡述本發(fā)明，需要說明的是，實(shí)例僅用于解釋本發(fā) 明而不限制本發(fā)明的范圍。本發(fā)明未特別說明的實(shí)驗(yàn)試劑均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑，或采用本 領(lǐng)域常規(guī)方法配制而得，可商購獲得，規(guī)格為實(shí)驗(yàn)室純級(jí)即可。
[0047] 生物材料的來源說明
[0048] 本發(fā)明實(shí)施例1所用到的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序樣品：大同黃花，W及實(shí)施例3所用到的116株 宣草屬植物均為現(xiàn)有已知品種，均可商購獲得，其來源說明如下表1所示。
[0049] 表1供試材料信息
[(Κ)加 ]
[0化1 ]
[0化2]
[0版3] 試劑與耗材
[0054]用于DNA提取的2 X CTAB溶液配方如下表2所示：
[0化5]
[0化6]
[0057]其中β-琉基乙醇、氯仿：異戊醇（24:1)、70%乙醇、無水乙醇及異丙醇（需冷藏）。 Tris、邸TANa2、化 C1、CTAB、20 %PVP 需提前滅菌。
[005引電泳所需的丙締酷胺凝膠母液(29:1)配方如下:丙締酷胺(C3也NO) 29g，N，N ' -亞甲 基雙丙締酷胺(C化Q02N2)lg，dd也0溶解后定容至100m L。
[0化9] 丙締酷胺凝膠的配方如下：5*Τ邸:Tri巧4g，棚酸化濁〇3)27.5g，邸TA-Na23.7224g， 力時(shí)d也0溶解后定容至1000m L。
[0060]引發(fā)劑（10%APS):過硫酸錠Ig，加 dd也ο溶解后定容至10m L。
[0061 ]銀染過程中用到的試劑配方如下：
[0062] 固定液:888m L蒸饋水+100m L無水乙醇+20m L冰乙酸，攬拌均勻。
[0063] 滲透液:0.?硝酸銀定容至1L蒸饋水中，充分溶解并攬拌均勻。
[0064] 顯色液:37.5g氨氧化鋼+10m L甲醒定容于2.化蒸饋水中充分溶解并攬拌均勻。
[0065] 上述試劑均為國產(chǎn)分析純，可商購獲得。
[0066] 實(shí)施例1、本發(fā)明所述的引物組
[0067] 本發(fā)明選用黃花菜的地方品種"大同黃花"作為樣本，送至北京百邁克生物科技有 限公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得一系列EST-SSR引物序列用于篩選符合要求的引物對(duì)。
[006引1.轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
[0069] 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程包括樣品檢測(cè)、文庫構(gòu)建及其質(zhì)量控制和上機(jī)測(cè)序。實(shí)驗(yàn)流 程如圖1所示。
[0070] 2.EST-SSR 引物篩選
[0071] 測(cè)序結(jié)果顯示可識(shí)別的SSR共5517個(gè)，對(duì)應(yīng)每個(gè)SSR標(biāo)記設(shè)計(jì)引物，在設(shè)計(jì)的引物 中，根據(jù)特征標(biāo)記篩選了 192對(duì)引物進(jìn)行合成。用宣草屬中H.cihina Baroni、'沖里花'、 '東莊黃花'、H.coreana化kai、H.f lava L.和'金娃娃'6個(gè)材料對(duì)合成的引物進(jìn)行多態(tài)性 篩選，得到34對(duì)多態(tài)性SSR引物，運(yùn)34對(duì)引物對(duì)構(gòu)成了本發(fā)明所述的用于鑒定宣草屬 化emerocallis L.)植物遺傳群體結(jié)構(gòu)的引物組，它們的引物名稱與序列如下表3所示。
[0072] 表3 34對(duì)EST-SSR引物序列
[0073]
[00巧]上述引物對(duì)的序列分別對(duì)應(yīng)序列表中的SEQ ID No. 1至SEQ ID No.68。
[0076] 本實(shí)施例提供的引物組可W選自上述34對(duì)引物對(duì)中的任意1對(duì)、任意2對(duì)，任意3 對(duì)、......、任意10對(duì)、任意11對(duì)、......、任意15對(duì)、......、任意20對(duì)、......、任意25對(duì)、......任意 30對(duì)、任意31對(duì)、任意32對(duì)、任意33對(duì)，或者全部34對(duì)。采用全部34對(duì)進(jìn)行宣草屬遺傳群體結(jié) 構(gòu)分析，數(shù)據(jù)更充分、分析效果更為準(zhǔn)確。
[0077] 實(shí)施例2、本發(fā)明所述的試劑盒及制備方法
[0078] 本實(shí)施例提供一種用于鑒定宣草屬植物遺傳群體結(jié)構(gòu)的試劑盒，該試劑盒包括實(shí) 施例1所述的引物組，即序列如SEQ ID No. 1至SEQ ID No.68所示的34對(duì)引物對(duì)。
[0079] 本實(shí)施例還提供所述試劑盒的制備方法，包括在標(biāo)有鑒定宣草屬植物遺傳群體結(jié) 構(gòu)的用途的包裝盒內(nèi)放入實(shí)施例1所述34條引物對(duì)，和/或，組裝所述試劑盒的試劑包括實(shí) 施例1所述34條引物對(duì)。
[0080] 進(jìn)一步地，所述制備方法還包括，在標(biāo)有鑒定宣草屬植物遺傳群體結(jié)構(gòu)的用途的 包裝盒內(nèi)放入用于PCR反應(yīng)和/或電泳的常規(guī)試劑，和/或，組裝所述試劑盒的試劑還包括用 于PCR反應(yīng)和/或電泳的常規(guī)試劑。
[0081] 實(shí)施例3、用所述引物組或試劑盒進(jìn)行宣草屬植物遺傳群體結(jié)構(gòu)鑒定
[0082] 采用實(shí)施例1所述的引物組和/或?qū)嵤├?所述的試劑盒對(duì)116個(gè)現(xiàn)有已知的宣草 屬植物進(jìn)行遺傳群體結(jié)構(gòu)鑒定，過程如下：
[0083] 1.基因組DNA提取過程及檢測(cè)方法
[0084] 采用CTAB法提取供試材料的基因組DNA，一般選擇供試材料的新鮮嫩葉作為DNA提 取部位。
[0085] 用1 %瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)JDNA的質(zhì)量，用Thermo Scientific Nano Drop 2000C分光光度計(jì)檢測(cè)DNA樣品濃度。
[00化]2.PCR擴(kuò)增反應(yīng)
[0087] 所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下：0.2化/化的所述基因組DNA做為擴(kuò)增模板，2 X Τ39Μ38?θΓΜ?χ0.3^/μ^0.5(皿ol/L)AiL的所述引物對(duì)，其余為雙蒸水。
[0088] 在本實(shí)施例中，PCR反應(yīng)體系具體為10化，包含2.化L的模板DNA，2X化qMasterMix 3.0化，5皿〇1 · L-1的引物1. Oul (上、下游引物混合工作液），d地2〇4化。2 X TaqMasterMix購 自中科瑞泰(北京)生物科技有限公司，含有染料。
[0089] PCR采用梯度PCR(即touchdown PCR)，具體程序?yàn)椋侯A(yù)變性（94°C，3min)，變性（94 °C，45s)，退火(68~58°C，Imin)，延伸（72°C，Imin)，6個(gè)循環(huán);變性(94°C，30s)，退火(58~ 501：，1111111)，延伸（721：，1111111)，9個(gè)循環(huán);變性(94°(：，303)，退火（50°(：，303)，延伸（72°(：， Imin)，20個(gè)循環(huán)；延伸（72°C，5min)，，10°C保存PCR產(chǎn)物。因?yàn)椴煌腅ST-SSR引物的退火 溫度不同，故退火溫度設(shè)為68~50°C。
[0090] 3.PCR產(chǎn)物檢測(cè)
[0091] PCR產(chǎn)物用8%的非變性聚丙締酷胺凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。電泳過程中，PCR產(chǎn)物的上 樣量為2.5~化L，緩沖液為0.5 XT肥，電壓180V，電泳150~ISOmin，銀染參考張軍等(2000) 的程序并照相保存。
[0092] 8%非變性聚丙締酷胺凝膠配方及用量（100ml體系）參照表2-4,配置過程中需要 注意TEM抓和10%APS起到促凝作用，使用時(shí)需要現(xiàn)用現(xiàn)加。此外，室溫升高時(shí)兩者的促凝作 用加快，用量需要適當(dāng)減少。
[0093] 4.數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析
[0094] 4.1帶型統(tǒng)計(jì)方法
[00M]帶型按照STRUCTURE要求的格式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，具體為，按照帶型依次編號(hào)記錄，相同 帶型記為同一編號(hào)。例如，按照?qǐng)D5中顯示的條帶，其中14份材料(此處編號(hào)只為示例，與表1 序號(hào)不同）的帶型統(tǒng)計(jì)如下， 序號(hào) 帶型 I 1 2 (注：巧料1為雜合帶型，讀作12) % 1 I (注：材料2為純合帶型，讀作11) 3 1 1 (注；材料3與材料2帶型相同，讀作1 1) 4 1 2 (注：材料4與材料1帶型相同，讀作1 2) 5. 1 1 6 1 ,2
[0096] 7 1 3 (往：此處只是部分材料擴(kuò)増結(jié)果，帶型3 3在其他部分出現(xiàn)） 8 13 9 0 Q 10 I 3 II I I 12 2 2 13 1 2 14 I 2
[0097] 4.2群體結(jié)構(gòu)分析
[0098] 利用STRUCTURES. 3.4軟件估算供試材料的群體結(jié)構(gòu)。對(duì)供試材料進(jìn)行基于數(shù)學(xué)模 型的類群劃分。將上一步按照STRUCTURE要求的格式統(tǒng)計(jì)好的帶型數(shù)據(jù)輸入 STRUCTURES.3.4軟件，根據(jù)計(jì)算結(jié)果中K值對(duì)應(yīng)的似然值化nP(D)值)進(jìn)行作圖，最后，依據(jù) 最大似然值原則確定合適的K值。如果似然值隨K值增大持續(xù)增大，則根據(jù)Δ K來確定合適的 K值。
[0099] 似然值(LnP(D)值）（是STRUCTURE軟件運(yùn)行直接得出的。）
[0100] ΔΚ計(jì)算公式如下：
[0101] AK=m[ lUK+l)-化化)+L(K-1) I ]/s|L(K)
[0102] 公式中，Uk)為每個(gè)Κ的對(duì)數(shù)值，s為標(biāo)準(zhǔn)差，m為平均值。
[0103] 利用ST抓CTURE軟件將116份供試材料進(jìn)行基于數(shù)學(xué)模型的群體結(jié)構(gòu)劃分。在Κ = 1-10時(shí)，隨著Κ值的增大，似然值(Ln P(D))也持續(xù)增大（圖2)，因而，無法依據(jù)最大似然值的 原則確定合適的K值。所W，依據(jù)Evanno等(2005)提出的方法，根據(jù)AK確定亞群數(shù)目。如圖 2，在K = 2時(shí)Δ K有顯著的峰值，由此將供試的116材料劃分為2個(gè)亞群:亞群I，亞群II(圖3)。
[0104] 本實(shí)施例中所采用的116份供試材料中，大部分均為已知遺傳類群的材料，分屬宣 草亞群和黃花菜亞群，因此，在鑒定未知遺傳類群的宣草屬植物材料時(shí)，可用其DNA與上述 已知材料的DNA-起進(jìn)行上述實(shí)驗(yàn)步驟，在STRUCTURE軟件的顯示分類結(jié)果中，直觀得出未 知材料所屬的遺傳類群。
[0105] 圖3中10、14、21、……36、9、40共計(jì)75份材料(紅色部分)為亞群I ;3、8、11、……97、 111、4共計(jì)41份材料(綠色部分)為亞群11(圖3中序號(hào)與表1中序號(hào)相對(duì)應(yīng)）。
【主權(quán)項(xiàng)】
1 ·用于檢測(cè)萱草屬(Hemerocallis L.)植物遺傳多態(tài)性的引物組，其特征在于，所述引 物組選自由下述引物對(duì)構(gòu)成的群組： sau00003F/sau00003R；sau00006F/sau00006R；sau00008F/sau00008R；sau00009F/ sau00009R；sau00010F/sau00010R；sau00029F/sau00029R；sau00042F/sau00042R； sau00045F/sau00045R；sau00047F/sau00047R；sau00048F/sau00048R；sau00052F/ sau00052R；sau00055F/sau00055R；sau00063F/sau00063R；sau00080F/sau00080R； sau00095F/sau00095R；sau00102F/sau00102R；sau00104F/sau00104R；sau00109F/ sau00109R；sau00120F/sau00120R；sau00121F/sau00121R；sau00124F/sau00124R； sau00132F/sau00132R；sau00135F/sau00135R；sau00137F/sau00137R；sau00138F/ sau00138R；sau00141F/sau00141R；sau00143F/sau00143R；sau00144F/sau00144R； sau00150F/sau00150R；sau00160F/sau00160R；sau00164F/sau00164R；sau00171F/ sau00171R;sau00172F/sau00172R;和/或sau00180F/sau00180R; 上述引物對(duì)的核苷酸序列如SEQ ID No. 1至SEQ ID No.68所示。2. 用于鑒定萱草屬植物遺傳群體結(jié)構(gòu)的試劑盒，其特征在于，包括權(quán)利要求1所述的引 物組。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，還包括用于PCR反應(yīng)和/或電泳的常規(guī)試 劑。4. 用于鑒定萱草屬植物遺傳群體結(jié)構(gòu)的方法，其特征在于，采用權(quán)利要求1所述的引物 組或權(quán)利要求2或3所述的試劑盒進(jìn)行如下步驟： (1) 采用所述引物組中的每對(duì)引物對(duì)分別對(duì)待鑒定萱草屬植物材料群體中的每個(gè)材料 的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (2) 凝膠電泳檢測(cè)所述PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物； (3) 根據(jù)STRUCTURE軟件要求的格式對(duì)上述電泳條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)； (4) 將上述統(tǒng)計(jì)結(jié)果輸入STRUCTURE軟件進(jìn)行分析，得出似然值LnP(D)達(dá)到最大值或Δ K達(dá)到最大值時(shí)對(duì)應(yīng)的K值，即為確定所述待鑒定萱草屬植物材料群體所包含的遺傳群體數(shù) 目； 所述Δ K計(jì)算公式如下： AK=m[ |L(K+1)-2L(K)+L(K-1) | ]/s|L(K) 上述公式中，L(k)為每個(gè)K的對(duì)數(shù)值，s為標(biāo)準(zhǔn)差，m為平均值。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為:0.2yL/yL的所 述基因組DNA做為擴(kuò)增模板，2XTaq PCR MasterMix 0.3yLAiL，0.5ymol/L的所述引物對(duì)， 其余為雙蒸水。6. 根據(jù)權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于，、所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C， 3min;以94°C45s，68~58°C lmin，72°C lmin為 1 個(gè)循環(huán)，6個(gè)循環(huán)；以94°C30s，58~50°C lmin， 72°C lmin為1個(gè)循環(huán)，9個(gè)循環(huán)；以94°C30s，50°C30s，72°C lmin為1個(gè)循環(huán)，20個(gè)循環(huán)；72°C 5min;4°C 保存。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述電泳指，采用8%非變性聚丙烯酰胺凝 膠，于180V恒功率電壓下，電泳分離150~180分鐘，然后銀染顯色。8. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述STRUCTURE軟件要求的格式指，每個(gè)材 料對(duì)應(yīng)的條帶大小依次編號(hào)記錄，相同大小的條帶記為同一編號(hào)。9.權(quán)利要求4-8任一所述的方法在鑒定萱草屬植物材料所屬遺傳群體中的用途，特征 在于:將多種已知遺傳群體分類的萱草屬植物材料與待測(cè)萱草屬植物材料組合起來作為所 述待鑒定萱草屬植物材料，進(jìn)行步驟（1)-(4)，通過STRUCTURE軟件分析所確定的已知材料 和待測(cè)材料的遺傳群體分類結(jié)果來確定待測(cè)材料所屬的的遺傳類群。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK106011251SQ201610399561
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年6月7日
【發(fā)明人】李森, 史青青, 陳志峰, 侯非凡, 冀芳芳, 張寧, 王金耀, 亢秀萍, 邢國明
【申請(qǐng)人】山西農(nóng)業(yè)大學(xué)