用于檢測與胃癌相關(guān)的ndrg4基因甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于檢測與胃癌相關(guān)的NDRG4基因甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)用，特點(diǎn)是一對(duì)NDRG4基因甲基化特異性擴(kuò)增引物對(duì)及甲基化特異性測序引物，具體核苷酸序列如下：上游引物：5'? AGGGTTGGGGGTTTTAGA?3'；下游引物：5'?Biotin?CACCCTCTACCAAAAACTCAAAACTCAATT?3' ；測序引物：5'?GGGGTTTTAGAGTGTAT?3'，優(yōu)點(diǎn)是檢測簡單方便、針對(duì)性強(qiáng)、檢測準(zhǔn)確率和效率高，用于制備胃癌早期診斷的試劑或試劑盒。
【專利說明】
用于檢測與胃癌相關(guān)的NDRG4基因甲基化程度的試劑盒及其 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種輔助胃癌早期診斷的方法，尤其是設(shè)及一種用于檢測與胃癌相關(guān) 的NDRG4基因甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 胃癌是起源于胃上皮的惡性腫瘤，為世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一。其發(fā)病 率和病死率高居全球第4位和第3位，是一種嚴(yán)重威脅人類生命健康的疾病。在中國，胃癌的 發(fā)病率達(dá)29.9/10萬，死亡率達(dá)22.3/10萬。與世界各國相比，中國胃癌人群中男、女性世界 癌癥死亡率高居于首位。隨著醫(yī)療手段的發(fā)展及健康觀念的普及，盡管胃癌的發(fā)病率和死 亡率呈下降趨勢(shì)，但總體預(yù)后仍然較差。因胃癌患者的起病癥狀不典型和胃的解剖位置的 特點(diǎn)等原因，使得胃癌的早期診斷和及時(shí)治療受到較大的限制，臨床發(fā)現(xiàn)的胃癌多處于晚 期，從而使患者失去最佳治療時(shí)期。同時(shí)臨床亦有大量事實(shí)證明，惡性腫瘤若在病變初期就 給予及時(shí)治療，其治愈率可迅速提高。從疾病篩查和預(yù)防角度來看，胃癌發(fā)病機(jī)制的研究， 尤其是應(yīng)用于早期診斷方面的生物標(biāo)記物相關(guān)研究迫在眉睫。
[0003] 胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段、多基因異常表達(dá)累積的病變過程。近年來 研究發(fā)現(xiàn)，除了遺傳學(xué)改變，表觀遺傳學(xué)改變亦參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展過程。表觀遺傳學(xué)修 飾是指不設(shè)及基因組的堿基序列改變，卻能導(dǎo)致可遺傳性的表型變異，主要包括DNA甲基化 修飾、組蛋白修飾、RNA編輯等。DNA甲基化是最常見的表觀遺傳修飾，異常的DNA甲基化水平 將導(dǎo)致基因表達(dá)異常。腫瘤基因組CpG島甲基化的改變W高甲基化為主。近年來，隨著表觀 遺傳學(xué)研究的逐漸開展和深入，基因體區(qū)的甲基化變化在調(diào)控基因表達(dá)過程中也發(fā)揮了關(guān) 鍵作用，研究人員發(fā)現(xiàn)，3'端CpG位點(diǎn)的甲基化與基因表達(dá)的關(guān)系最為密切，掲示其為胃癌 發(fā)生的另一重要機(jī)制。因此，抑癌基因基因體區(qū)CpG島高甲基化的發(fā)生也可作為胃癌早期診 斷的生物標(biāo)志物。另外，與遺傳學(xué)改變不同，甲基化過程不改變DNA的一級(jí)結(jié)構(gòu)，通過逆轉(zhuǎn)甲 基化過程，沉默的抑癌基因可能重新表達(dá)，運(yùn)也為胃癌的治療提供了一條新途徑。
[0004] N-myc下游調(diào)控基因4(N-Myc downstream regulated gene 4，NDRG4)屬于NDRG家 族成員之一，能通過調(diào)節(jié)祀基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)揮生物學(xué)作用。目前，NDRG4與腫瘤相關(guān)性的研究 備受重視。有研究表明，NDRG4的表達(dá)水平隨著膠質(zhì)瘤惡性程度的升高而降低，提示NDRG4基 因的抑癌效應(yīng)具有腫瘤細(xì)胞來源特異性。另外，NDRG4基因在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)較正常結(jié) 腸組織明顯降低，且其表達(dá)量增加可減少腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲，提示該基因甲基化可作 為臨床對(duì)腫瘤早期診斷的候選指標(biāo)。
[0005] 本項(xiàng)目采用焦憐酸測序方法檢測胃癌患者癌組織與癌旁組織DNA中NDRG4基因3' 端CpG島的甲基化水平，提供操作簡便、特異性好、周期短、檢測結(jié)果穩(wěn)定可靠的甲基化定量 檢測方法，同時(shí)為患者的治療隨訪和預(yù)后評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)。目前，國內(nèi)外還沒有公開任何 關(guān)于在胃癌中運(yùn)用焦憐酸測序法檢測NDRG4基因3'端CpG島甲基化程度的檢測試劑盒的相 關(guān)研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種檢測簡單方便、針對(duì)性強(qiáng)、檢測準(zhǔn)確率和 效率高的用于檢測與胃癌相關(guān)的NDRG4基因甲基化程度的試劑盒及其應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：一種用于檢測與胃癌相關(guān)的 NDRG4基因甲基化程度的試劑盒，包括一對(duì)NDRG4基因甲基化特異性擴(kuò)增引物對(duì)及甲基化特 異性測序引物，具體核巧酸序列如下： 上游引物：5'- AGGGTTGGGGGTTTTAGA-3' ； 下游引物：5'-Biotin-CACCCTCTACCAAAAACTCAAAACTCAATT-3' ； 測序引物：5 ' -GGGGTTTTAGAGTGTAT-3 '。
[000引還包括甲基化特異性PCR反應(yīng)體系，其組成為:Zymo化q PreMix 10.0 ul;濃度為5 liM的上、下游引物各1.0 μ1;此0 6.5 μ1，甲基化修飾的DNA樣本模板1.5 yl;PCR反應(yīng)條件 如下：95°C預(yù)變性lOmin; 95°C變性303,55.4°(：退火403,72°(：延伸1111111，共45個(gè)循環(huán)的退 火反應(yīng);然后延伸反應(yīng)72°C 7min。
[0009] 上述用于檢測與胃癌相關(guān)的NDRG4基因甲基化程度的試劑盒的用途，其特征在于： 用于制備胃癌早期診斷的試劑或試劑盒。
[0010] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:本發(fā)明用于檢測與胃癌相關(guān)的NDRG4基因甲 基化程度的試劑盒及其用途，所述的檢測試劑盒包含用于檢測NDRG4基因3'端CpG島甲基化 的一對(duì)特異性擴(kuò)增引物及一個(gè)甲基化特異性測序引物。該試劑盒通過焦憐酸測序技術(shù)檢測 人體組織中是否存在胃癌早期NDRG4基因甲基化修飾變化。此技術(shù)的基本原理:采用生物素 標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物純化并變性為單鏈后，向其中加入四種酶的混合物： DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、巧光素酶及Ξ憐酸腺巧雙憐酸酶。在測序過程中，每次加入一種 類型的dNTP，若該dNTP能與模板鏈互補(bǔ)配對(duì)，則在四種酶的作用下發(fā)生一系列的反應(yīng)，最終 將巧光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)體現(xiàn)出來，顯示為一個(gè)個(gè)高度不一的峰，峰的高度與堿基的個(gè)數(shù) 成正比。反之，當(dāng)dNTP不能與模板鏈結(jié)合時(shí)，將直接被Ξ憐酸腺巧雙憐酸酶降解，相應(yīng)的將 不會(huì)顯示峰值。原始數(shù)據(jù)會(huì)被軟件自動(dòng)轉(zhuǎn)化為序列信息，通過軟件直接顯示的NDRG4基因甲 基化率判斷受試者患胃癌的風(fēng)險(xiǎn)。該試劑盒可解決樣本中DNA含量少、丟失率高、帶有致癌 污染物等缺陷，相對(duì)傳統(tǒng)胃癌檢測技術(shù)具有發(fā)現(xiàn)早，靈敏度高，周期短、簡單、方便，檢測效 率高，針對(duì)性強(qiáng)，檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠、靈活快速和經(jīng)濟(jì)節(jié)約的優(yōu)點(diǎn)，有利于胃癌的早期發(fā)現(xiàn) 和及時(shí)治療。
【附圖說明】
[00川圖巧根據(jù)TCGA數(shù)據(jù)中450K甲基化忍片和mRNA測序數(shù)據(jù)的相關(guān)性確定了 NDRG4基 因3'端CpG島被檢測序列所在全基因組的位置，W及所檢測的5個(gè)CpG點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)性分析 結(jié)果(例如CpGl與CpG2的相關(guān)系數(shù)為0.88，CpG2與CpG3的相關(guān)系數(shù)為0.66); 圖2為癌組織甲基化水平檢測結(jié)果示例，如圖示CpGl到CpG5的甲基化程度分別為38%， 29%，38%，36%，44%;圖中陰影部分顯示的是對(duì)應(yīng)CpG位點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度，結(jié)合該位點(diǎn)附近堿基 種類可分析得到其甲基化水平(即陰影框?qū)?yīng)的上方數(shù)字）； 圖3為癌旁組織甲基化水平檢測結(jié)果示例，如圖示CpGl到CpG5的甲基化程度分別為 13%, 9% a 7% a 2% a 9%； 圖4為NDRG4基因甲基化水平在癌組織與癌旁組織的比較； 圖5為NDRG4基因甲基化在診斷胃癌時(shí)的ROC曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0012] W下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[001引1、研究對(duì)象和樣本的收集 收集浙江省杭州市某醫(yī)院2007年12月至2010年2月普外科手術(shù)切除的胃癌組織W及相 應(yīng)配對(duì)的癌旁正常組織各110例，其中癌組織取自腫瘤組織的中屯、位置，癌旁組織距離癌組 織5cmW上且為非癌組織，所有病例手術(shù)前均未行放療和化療并經(jīng)病理組織學(xué)檢查證實(shí)?；?者年齡21~83歲，其中男性76例，女性34例;有吸煙史30例，無吸煙史80例;有飲酒史28例，無 飲酒史82例；腫瘤大?。?gt;6cm 43例，<6cm 67例。根據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)胃癌TOM 分期：I和II期17例，III和IV期93期;無淋己結(jié)轉(zhuǎn)移16例，有淋己結(jié)轉(zhuǎn)移94例；組織分化程 度：高分化或中分化47例，低分化或無分化63例。所取標(biāo)本離體后立即于液氮罐轉(zhuǎn)運(yùn)，然后 存在于-80 °C冰箱。
[0014] 納入標(biāo)準(zhǔn):①初治的胃癌患者;②胃部病變均經(jīng)病理證實(shí);③胃部病灶要求為原發(fā) 病灶，而非轉(zhuǎn)移病灶;④術(shù)前未行放化療;⑤無其他惡性腫瘤病史。
[0015] 排除標(biāo)準(zhǔn):①無法得到病理證實(shí)的胃部病變;②有嚴(yán)重的未控制的內(nèi)科疾病或急 性感染者;③妊娠或哺乳期婦女。
[0016] 預(yù)設(shè)最長隨訪時(shí)間5年，W胃癌患者死亡為終點(diǎn)事件，生存時(shí)間從術(shù)日算起。
[0017] 所有入組對(duì)象均告知并簽署知情同意書。
[001引 2、全基因組DNA的提取 采用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen，Hilden，德國）DNA提取試劑盒提取組織全基因 組DNA，再通過化noDropSOOO超微量分光光度計(jì)（Thermo Fisher Scientific,美國）檢測 所得DM的濃度，W供NDRG4基因甲基化水平的檢測。
[0019] 3、甲基化修飾 采用EZ DNA Methylation Gold? Kit甲基化轉(zhuǎn)化試劑盒（Zymo research,美國），嚴(yán) 格按照試劑盒說明步驟進(jìn)行操作。經(jīng)此步后，DNA序列中未甲基化的胞喀晚(C)轉(zhuǎn)變?yōu)槟蚩?晚化）。
[0020] 4、TCGA數(shù)據(jù)庫450K甲基化和mRNA測序數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析 下載TCGA數(shù)據(jù)庫中胃癌患者癌組織Illumina Human Methylation 450K甲基化忍片數(shù) 據(jù)和11 lumina化Seq_RNA-SeqV2基因表達(dá)數(shù)據(jù)。提取NDRG4基因基因體區(qū)所有CpG位點(diǎn)的甲 基化數(shù)據(jù)和基因表達(dá)數(shù)據(jù)做相關(guān)性分析，可見圖1中與基因表達(dá)高度負(fù)相關(guān)的CpG位點(diǎn)富集 于靠近3 '端的CpG島（CpG: 41)，因此，發(fā)明人用焦憐酸測序法檢測NDRG4基因 3 '端CpG島的甲 基化水平。
[0021] 5、焦憐酸測序法 本實(shí)驗(yàn)采用焦憐酸測序技術(shù)對(duì)基因 3'端CpG島的5個(gè)CpG位點(diǎn)（圖2)進(jìn)行了 DNA甲 基化水平分析。此技術(shù)的基本原理:采用生物素標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物純化并 變性為單鏈后，向其中加入四種酶的混合物:DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、巧光素酶及Ξ憐酸 腺巧雙憐酸酶。在測序過程中，每次加入一種類型的dNTP，若該dNTP能與模板鏈互補(bǔ)配對(duì)， 則在四種酶的作用下發(fā)生一系列的反應(yīng)，最終將巧光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)體現(xiàn)出來，顯示為 一個(gè)個(gè)高度不一的峰，峰的高度與堿基的個(gè)數(shù)成正比。反之，當(dāng)dNTP不能與模板鏈結(jié)合時(shí)， 將直接被Ξ憐酸腺巧雙憐酸酶降解，相應(yīng)的將不會(huì)顯示峰值。本次研究采用PyroMark Assay Designs.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，NDRG4基因 3'端CpG島甲基化水平的甲基化特異性引 物對(duì)及測序引物序列如下： 上游引物：5'- AGGGTTGGGGGTTTTAGA-3' ； 下游引物：5'-Biotin-CACCCTCTACCAAAAACTCAAAACTCAATT-3' ； 測序引物：5 ' -GGGGTTTTAGAGTGTAT-3 '。
[0022] 20 μ1的甲基化特異性PCR反應(yīng)體系的組成為:ZymoTaq PreMix 10.0 ul;上、下游 引物各1.0 μΚ5 μΜ);此0 6.5 μ1，甲基化修飾的DNA樣本模板1.5 yLPCR反應(yīng)條件如下： (1)95°C 預(yù)變性 10min;(2)95°C變性3〇3,55.4°(：退火4〇3,72°(：延伸1111111，共45個(gè)循環(huán)的退 火反應(yīng);然后延伸反應(yīng)72°C 7min。
[0023] 焦憐酸測序的前期準(zhǔn)備:在PSQ96板中預(yù)先加入45μ1含有0.3ιχΜ上述甲基化特異性 測序引物的退火緩沖液(PyroMark Annealing Buffer; Qiagen);將需要使用的混勻的瓊 脂糖珠總量（每樣本3μ1)轉(zhuǎn)移到一個(gè)微量離屯、管中；在瓊脂糖珠中加入結(jié)合緩沖液 (PyroMark Binding Buffer; Qiagen)，使得平均每個(gè)樣品約有50μ1的體積，將混合物混 勻；將W上混合物加入PCR產(chǎn)物(5化1反應(yīng)體積）中，每樣本50μ1;將PCR產(chǎn)物在常溫下混勻 lOmin，使得磁珠與生物素結(jié)合;在真空預(yù)備工作站中，四個(gè)樣品板中依次加入180ml的高純 水、70%乙醇、洗涂緩沖液（PyroMark Wash Buffer; Qiagen)和120ml的變性緩沖液 (PyroMark Denaturation Solution; Qiagen);打開真空預(yù)備工作站的累，將真空準(zhǔn)備工 具在高純水中清洗30s;然后將真空準(zhǔn)備工具（PyroMark Vacuum Prep Filter Probes; Qiagen)移到PCR板中，抓取瓊脂糖珠(在磁珠與PCR產(chǎn)物結(jié)合后Ξ分鐘內(nèi)完成此操作）;拿起 PC財(cái)反，檢查是否大部分磁珠都被吸附在了真空準(zhǔn)備工具上;將真空準(zhǔn)備工具放入70%乙醇 中5s;然后移到變性緩沖液中5s;再移到洗涂緩沖液中清洗5-lOs;關(guān)掉累;將真空準(zhǔn)備工 具放入含有測序引物的板中，搖動(dòng)，釋放瓊脂糖珠(測序引物也可最后加入）;使用高純水清 洗真空準(zhǔn)備工具;將放有樣品的PSQ96板放在加熱板上加熱到80°C 2min，再冷卻到室溫，隨 后放在巧roMark Q24焦憐酸測序儀上。
[0024] 焦憐酸測序：在PyroMark Q24焦憐酸測序儀上，采用Pyromark Gold Q24試劑盒 (Pyromark Gold Q24 Reagents; Qiagen; #978802)對(duì)PSQ96板中的樣本進(jìn)行測序，然后應(yīng) 用巧roMark CpG軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行甲基化分析（甲基化水平檢測結(jié)果示例見圖2和圖3)。
[0025] 6、焦憐酸測序結(jié)果計(jì)算 應(yīng)用PyroMark CpG軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行甲基化分析。圖巧日?qǐng)D3中所示百分?jǐn)?shù)為對(duì)應(yīng)NDRG4 基因 CpG位點(diǎn)的甲基化程度，圖2所示癌組織中CpGl到CpG5的甲基化程度分別為38%，29%， 38%，36%和44%;圖3所示癌旁組織中CpGl到CpG5的甲基化程度為13%，9%，17%，12%和19%。由 于5個(gè)CpG位點(diǎn)之間的甲基化率相關(guān)系數(shù)較高(相關(guān)系數(shù)均大于0.6，P值小于0.001)，發(fā)明人 取其均值代表整體甲基化水平進(jìn)行后續(xù)分析。
[00%] 7、結(jié)果分析 本次實(shí)驗(yàn)采用SPSS 18.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理分析。發(fā)明人對(duì)3 '端CpG島甲基化水平進(jìn)行配 對(duì)t檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn):癌組織中NDRG4基因甲基化水平高于癌旁組織，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值小 于0.001，見圖4)。為了定量地反映 NDRG4基因甲基化診斷胃癌風(fēng)險(xiǎn)的準(zhǔn)確性大小，發(fā)明人進(jìn) 一步分析了其受試者工作特征曲線(ROC曲線）。圖5顯示，焦憐酸測序檢測NDRG4基因甲基化 診斷胃癌風(fēng)險(xiǎn)的ROC曲線下面積(AUC)為0.635，與0.5相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P = 0.001)， 提示用焦憐酸測序該基因甲基化用于胃癌早期診斷的準(zhǔn)確性較高。因此，可W找出最佳診 斷分界點(diǎn)用于實(shí)際診斷。一般可W將正確診斷指數(shù)最大的分界點(diǎn)確定為最佳診斷分界點(diǎn)， 即圖5中最靠近坐標(biāo)圖左上方的點(diǎn)為敏感性和特異性均較高的臨界值，該點(diǎn)對(duì)應(yīng)的縱坐標(biāo) 為敏感性，橫坐標(biāo)為（1-特異性）。因此，焦憐酸測序檢測NDRG4基因甲基化用于診斷胃癌的 敏感性為39.1%，特異性為90.0%。
[0027] 發(fā)明人W癌組織甲基化率均數(shù)20%為臨界值(此臨界值與最佳診斷分界點(diǎn)相近）， 將甲基化水平分為高甲基化和低甲基化，發(fā)現(xiàn):攜帶高甲基化NDRG4基因的人群患胃癌的危 險(xiǎn)性為不攜帶高甲基化NDRG4基因的6.413倍(P = 5.08E-7，見表l)。
[0028] 表1 NDRG4基因 3'端CpG島甲基化水平在癌組織與癌旁組織間的比較
注：P值小于0.05,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[00巧]表2中只對(duì)癌組織進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)NDRG4基因3 '端CpG島甲基化差異與不同的危險(xiǎn) 因素(性別、腫瘤部位、腫瘤大小、淋己結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期、吸煙飲酒史)無關(guān)(P值均大于 0.05)，但年齡小于50歲的胃癌患者NDRG4基因甲基化率(63.64%)要高于年齡大于50歲的胃 癌患者（24.68%)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P < 0.001);腫瘤分化程度低的患者NDRCM基因甲 基化率(47.62%)要高于分化程度高的患者(21.28%)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P = 0.004)。因 此，NDRG4基因3'端CpG島高甲基化是胃癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素。
[0030]表2 NDRG4基因甲基化水平與胃癌患者臨床特征的關(guān)系

注：P值小于0.05,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0031] 本發(fā)明試劑盒利用焦憐酸測序法檢測胃癌患者組織樣本中NDRG4基因甲基化程 度，具有W下顯著特點(diǎn)：（1)操作簡便，周期短。該試劑盒可同時(shí)測定96個(gè)樣本，大大縮短檢 測時(shí)間，適合醫(yī)院或研究所大規(guī)模推廣應(yīng)用。（2)穩(wěn)定性。該試劑盒在-20°C溫度下可保存12 個(gè)月，其靈敏度和特異度都沒有下降。本項(xiàng)目開發(fā)計(jì)劃采用分析胃癌患者術(shù)后癌組織與癌 旁組織DNA中的NDRG4基因甲基化程度，結(jié)合現(xiàn)代的生物信息技術(shù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)原理，提供操作 簡便、靈敏度高、周期短、檢測結(jié)果穩(wěn)定可靠的甲基化定量檢測方法，同時(shí)為患者的治療隨 訪和預(yù)后評(píng)估提供科學(xué)依據(jù)。
[0032] 在本發(fā)明中，所述DNA樣本可W來源于任何生物樣品；更優(yōu)選地，所述待測DNA選自 組織(包括石蠟包埋組織）、細(xì)胞、血液、血清、血漿、唾液、精液、尿液，糞便及其他分泌物。
[0033] 上述說明并非對(duì)本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本技術(shù)領(lǐng)域的普通 技術(shù)人員在本發(fā)明的實(shí)質(zhì)范圍內(nèi)，作出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明的保護(hù) 范圍，本發(fā)明的保護(hù)范圍W權(quán)利要求書為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于檢測與胃癌相關(guān)的NDRG4基因甲基化程度的試劑盒，其特征在于:包括一對(duì) 基因甲基化特異性擴(kuò)增引物對(duì)及甲基化特異性測序引物，具體核苷酸序列如下： 上游引物：5'_ AGGGTTGGGGGITTTAGA-3' ； 下游引物：5 '-Biotin-CACCCTCTACCAAAAACTCAAAACTCAATT-3 ' ； 測序引物：5 ' -GGGGITTTAGAGTGTAT-3 '。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測與胃癌相關(guān)的NDRG4基因甲基化程度的試劑盒，其特 征在于包括甲基化特異性PCR反應(yīng)體系，其組成為:ZymoTaq PreMix 10.0 ul;濃度為5 μΜ 的上、下游引物各1.0 μ1;Η20 6.5 μL，甲基化修飾的DNA樣本模板1.5 yl;PCR反應(yīng)條件如 下：95°C預(yù)變性lOmin; 95°C變性3〇8,55.4°(：退火4〇8,72°(：延伸11^11，共45個(gè)循環(huán)的退火 反應(yīng);然后延伸反應(yīng)72°C 7min。3. -種根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測與胃癌相關(guān)的NDRG4基因甲基化程度的試劑盒 的用途，其特征在于:用于制備胃癌早期診斷和預(yù)后評(píng)估的試劑或試劑盒。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK106011263SQ201610496772
【公開日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年6月28日
【發(fā)明人】段世偉, 陳曉穎
【申請(qǐng)人】寧波大學(xué)