一種ApoE試劑盒、引物及其用圖
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種ApoE試劑盒、引物及其用途，兩個(gè)SNP位點(diǎn)是否具有已知突變的測(cè)定方法。其中，該方法包括：利用第一引物和第二引物對(duì)核酸樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且在PCR擴(kuò)增體系中加入核酸探針，核酸探針對(duì)應(yīng)兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)之間至少一部分對(duì)應(yīng)的核酸序列；檢測(cè)反應(yīng)體系的發(fā)光，以便確定核酸樣本的預(yù)定位點(diǎn)是否存在已知突變，第一引物的近3’端包含與兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)之一已知突變對(duì)應(yīng)的堿基，第二引物的近3’端包含與另一個(gè)已知突變對(duì)應(yīng)的堿基，核酸探針具有：發(fā)光基團(tuán)，發(fā)光基團(tuán)形成于核酸探針的5’端，調(diào)節(jié)基團(tuán)，調(diào)節(jié)基團(tuán)形成于核酸探針的3’端，并且調(diào)節(jié)基團(tuán)可以調(diào)節(jié)發(fā)光基團(tuán)的發(fā)光。利用該方法能夠有效地確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
-種ApoE試劑盒、引物及其用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種ApoE試劑盒、引物及其用途，兩個(gè)SNP位點(diǎn)是否具有已知突變的測(cè) 定。具體設(shè)及一種確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變的方法、試劑盒W及引 物，屬于生物學(xué)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] ApoE是一種載脂蛋白，其遺傳多態(tài)性主要受控于兩個(gè)SNP位點(diǎn)rs429358和rs7412， 運(yùn)兩個(gè)SNP位點(diǎn)通過(guò)不同的核酸組合決定了ApoE的Ξ種等位基因型：e2(rs429358為T(mén)， rs7412 為T(mén))、e3(rs429358 為T(mén)，rs7412 為 C)、e4(rs429358 為C，rs7412 為C),運(yùn) Ξ種類(lèi)型等位 基因分別編碼Ξ種ApoE蛋白亞型，即ApoE2(其蛋白序列的112位和158位均為半脫氨酸）、 ApoE3(其蛋白序列的112位為半脫氨酸，158位為精氨酸）、ApoE4(其蛋白序列的112位和158 位均為精氨酸）。
[0003] 因此，ApoE 基因有 ε2/ε2、ε3/ε3、和 ε4/ε4Ξ 種純合子型與 ε2/ε3、ε2/ε4 和 ε3/ε4Ξ 種雜合子型。
[0004] 目前ApoE基因分型的方法主要有:傳統(tǒng)DNA測(cè)序法、等位基因特異性寡核巧酸探針 雜交法、聚合酶鏈反應(yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)性法、聚合酶鏈反應(yīng)-限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性法、 多重?cái)U(kuò)增受阻突變體系PCR技術(shù)法、高分辨率溶解曲線(xiàn)法W及雙色巧光分子探針?lè)ǖ取?br>[0005] 然而，目前確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變的方法，仍有待改進(jìn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于，提供一種ApoE試劑盒、引物及其用途，兩個(gè)SNP位點(diǎn)是否具有 已知突變的測(cè)定，W克服現(xiàn)有技術(shù)所存在的上述缺點(diǎn)和不足。
[0007] 本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問(wèn)題之一。為此，本發(fā)明提出了可W 有效確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變的方法。本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問(wèn) 題，可W通過(guò)W下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：
[000引在本發(fā)明的第一個(gè)方面，一種ApoE試劑盒，其特征在于，包括：
[0009] 第一引物，所述第一引物的近3'端包含與所述兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)之一已知突變對(duì)應(yīng)的 堿基，
[0010] 第二引物，所述第二引物的近3'端包含與所述兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)另一個(gè)已知突變對(duì)應(yīng) 的堿基，
[0011] 核酸探針，所述核酸探針與兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)之間至少一部分對(duì)應(yīng)的核酸序列，并且 所述核酸探針具有：
[0012] 發(fā)光基團(tuán)，所述發(fā)光基團(tuán)形成于所述核酸探針的5'端，
[0013] 調(diào)芐基團(tuán)，所述調(diào)芐基團(tuán)形成于所述核酸探針的3'端，并且所述調(diào)芐基團(tuán)可W調(diào) 節(jié)所述發(fā)光基團(tuán)的發(fā)光，
[0014] 其中，所述預(yù)定位點(diǎn)是SNP rs429358和rs7412，
[0015] 其中，所述述第一引物的近3'端包含與rs429358的已知突變對(duì)應(yīng)的堿基，所述第 二引物的近3'端包含與rs7412的已知突變對(duì)應(yīng)的堿基，
[0016] 其中，所述第一引物的3'端堿基為與rs429358的已知突變對(duì)應(yīng)的堿基，所述第二 引物的3'端堿基為與rs7412的已知突變對(duì)應(yīng)的堿基，
[0017]其中，所述第一引物作為正向引物，所述第二引物作為反向引物，
[001引其中，所述第一引物包括：
[0019] 5'-CGGACATGGAGGACGTGT-3'
[0020] 5 '-GCGGACATGGAGGACGAGT-3 '
[0021] 日 '-CGCGGACATGGAGGACGTTT-3 '
[0022] 5 '-CGGACATGGAGGACGAGC-3 '
[0023] 5 '-GCGGACATGGAGGACGTGC-3 '
[0024] 5 '-CGCGGACATGGAGGACGTTC-3 '，
[00巧]所述第二引物包括：
[0026] 5'-TGGTACACTGCCAGGTA-3'
[0027] 5 '-CTGGTACACTGCCAGTCA-3 '
[0028] 5'-CCTGGTACACTGCCAGGCA-3'
[0029] 5 '-TGGTACACTGCCAGGCG-3 '
[0030] 5 '-CTGGTACACTGCCAGGTG-3 '
[0031] 5 '-CCTGGTACACTGCCAGTCG-3 '，
[0032] 其中，所述核酸探針的長(zhǎng)度為20個(gè)核巧酸。
[0033] 其中，所述核酸探針的序列為:5'-〔46口'0：1^66了6口'口'66(：-3'。
[0034] 進(jìn)一步，所述核酸探針的發(fā)光基團(tuán)為巧光基團(tuán)，所述巧光基團(tuán)為FAM，所述調(diào)芐基 團(tuán)為澤滅基團(tuán)，所述澤滅基團(tuán)為B冊(cè)1。
[0035] Ξ種基因的陽(yáng)性質(zhì)粒用Tr i S-HC1緩沖液（lOmM，P冊(cè).0)進(jìn)行稀釋?zhuān)玫?400拷貝/μ 1、240拷貝/μ巧日24拷貝/μ1的，并對(duì)運(yùn)些樣本進(jìn)行檢測(cè)，95 % (η>20)的陽(yáng)性率作為最低檢 測(cè)限的標(biāo)準(zhǔn)，
[0036] 濃度為2400拷貝/μ1和濃度為240拷貝/μ1陽(yáng)性質(zhì)粒陽(yáng)性質(zhì)粒，重復(fù)檢測(cè)20次，20個(gè) 可檢出結(jié)果，檢出率為100% ;
[0037] 濃度為24拷貝/μ1陽(yáng)性質(zhì)粒，重復(fù)檢測(cè)20次，ε2、ε3和ε4檢測(cè)試劑分別有16、18和14 個(gè)可檢出結(jié)果，檢出率分別為80%、90%和70%;
[0038] 所述試劑盒檢測(cè)最低檢出限為240拷貝/μ1，換算成基因組DNA的量為O.Sng/μΙ，即 4ng/反應(yīng)；
[0039] AP0E基因檢測(cè)試劑能夠耐受總量為6*104拷貝/反應(yīng)的其它亞型的DNA，根據(jù)陽(yáng)性 質(zhì)控品的大小，換算成基因組DNA的量為20化g/反應(yīng)。
[0040] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述試劑盒可W應(yīng)用于前面所述的確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù) 定位點(diǎn)是否具有已知突變的方法。由此，利用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù) 定位點(diǎn)是否具有已知突變的試劑盒對(duì)核酸樣本進(jìn)行檢測(cè)，可W有效地確定核酸樣本的兩個(gè) 預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變，并進(jìn)一步可W有效地確定ApoE的等位基因分型，對(duì)于阿爾茨 海默癥和屯、腦血管疾病的預(yù)防W及早期診斷具有非常重要的意義。另外，前面針對(duì)確定核 酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變的方法所描述的特征和優(yōu)點(diǎn)，也當(dāng)然地適用該試 劑盒，不再寶述。
[0041] 本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一組確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有已 知突變的PCR引物。
[0042] -種ApoE試劑盒的引物，其特征在于，所述引物包括：
[0043] 第一引物，所述第一引物的近3'端包含與所述兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)之一已知突變對(duì)應(yīng)的 堿基，
[0044] 第二引物，所述第二引物的近3'端包含與所述兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)另一個(gè)已知突變對(duì)應(yīng) 的堿基，
[0045] 所述第一引物的近3'端包含與rs429358的已知突變對(duì)應(yīng)的堿基，所述第二引物的 近3 '端包含與rs7412的已知突變對(duì)應(yīng)的堿基，
[0046] 所述第一引物的3'端堿基為與rs429358的已知突變對(duì)應(yīng)的堿基，所述第二引物的 3 '端堿基為與rs7412的已知突變對(duì)應(yīng)的堿基，
[0047] 所述第一引物作為正向引物，所述第二引物作為反向引物，
[004引其中，所述第一引物包括：
[0049] 日 '-CGGACATGGAGGACGTGT-3 '
[0050] 5 '-GCGGACATGGAGGACGAGT-3 '
[0051 ] 5 '-CGCGGACATGGAGGACGTTT-3 '
[0化。5 ' -CGGACATGGAGGACGAGC-3 '
[0053 ] 5 '-GCGGACATGGAGGACGTGC-3 '
[0054] 5 '-CGCGGACATGGAGGACGTTC-3 '，
[0化5]所述第二引物包括：
[0化6] 5'-TGGTACACTGCCAGGTA-3'
[0057 ] 5 '-CTGGTACACTGCCAGTCA-3 '
[005引 5'-CCTGGTACACTGCCAGGCA-3'
[0059] 5 '-TGGTACACTGCCAGGCG-3 '
[0060] 5 '-CTGGTACACTGCCAGGTG-3 '
[0061 ] 5 '-CCTGGTACACTGCCAGTCG-3 '。
[0062] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，所述PCR引物可W應(yīng)用于前面所述的確定核酸樣本的兩個(gè) 預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變的方法W及試劑盒。由此，PCR擴(kuò)增過(guò)程中引物可W與模板按照 堿基配對(duì)原則選擇性結(jié)合，PCR擴(kuò)增可W按照預(yù)定方向進(jìn)行有效擴(kuò)增，并且能夠特異地?cái)U(kuò)增 出不同等位基因。另外，前面針對(duì)確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變的方法 及試劑盒所用引物的描述的特征和優(yōu)點(diǎn)，也當(dāng)然地適用該P(yáng)CR引物，不再寶述。
[0063] 在本發(fā)明的又一個(gè)方面，一種ApoE試劑盒的用途，其特征在于，用于確定核酸樣本 的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變。
[0064] 其中，所述確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變的方法，包括W下步 驟：
[0065] a.引物設(shè)計(jì)：
[0066] b.巧光DNA分子探針設(shè)計(jì)：
[0067] c.PCR反應(yīng)體系配制：
[006引 d.PCR反應(yīng)體系配制：
[0069] 利用第一引物和第二引物對(duì)所述核酸樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且在所述PCR擴(kuò)增體系 中加入核酸探針，所述核酸探針對(duì)應(yīng)兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)之間至少一部分的核酸序列；W及
[0070] e.檢測(cè)反應(yīng)體系的發(fā)光，
[0071] f.數(shù)據(jù)分析與結(jié)論：
[0072] W便確定所述核酸樣本的預(yù)定位點(diǎn)是否存在已知突變。
[0073] 進(jìn)一步，所述第一引物的近3'端包含與所述兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)之一已知突變對(duì)應(yīng)的堿 基，
[0074] 所述第二引物的近3'端包含與所述兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)另一個(gè)已知突變對(duì)應(yīng)的堿基，
[0075] 所述第一引物和第二引物之一作為正向引物，所述第一引物和所述第二引物的另 一個(gè)作為反向引物，
[0076] 所述核酸探針具有：
[0077] 發(fā)光基團(tuán)，所述發(fā)光基團(tuán)形成于所述核酸探針的5'端，
[0078] 調(diào)芐基團(tuán)，所述調(diào)芐基團(tuán)形成于所述核酸探針的3'端，并且所述調(diào)芐基團(tuán)可W調(diào) 節(jié)所述發(fā)光基團(tuán)的發(fā)光，
[0079] 其中，所述核酸樣本來(lái)源于人體組織或細(xì)胞、重組核酸或轉(zhuǎn)基因生物組織細(xì)胞，
[0080] 其中，所述預(yù)定位點(diǎn)是SNP rs429358和rs7412，
[0081 ] 其中，所述述第一引物的近3'端包含與rs429358的已知突變對(duì)應(yīng)的堿基，所述第 二引物的近3'端包含與rs7412的已知突變對(duì)應(yīng)的堿基，
[0082] 其中，所述第一引物的3'端堿基為與rs429358的已知突變對(duì)應(yīng)的堿基，所述第二 引物的3'端堿基為與rs7412的已知突變對(duì)應(yīng)的堿基，
[0083] 其中，所述第一引物作為正向引物，所述第二引物作為反向引物，
[0084] 其中，所述第一引物包括：
[0085] 日 '-CGGACATGGAGGACGTGT-3 '
[00 化]5'-GCGGACATGGAGGACGAGT-3'
[0087] 5 '-CGCGGACATGGAGGACGTTT-3 '
[0088] 5'-CGGACATGGAGGACGAGC-3'
[0089] 5 '-GCGGACATGGAGGACGTGC-3 '
[0090] 5 '-CGCGGACATGGAGGACGTTC-3 '，
[0091] 所述第二引物包括：
[0092] 5 '-TGGTACACTGCCAGGTA-3 '
[0093] 5 '-CTGGTACACTGCCAGTCA-3 '
[0094] 5'-CCTGGTACACTGCCAGGCA-3'
[00 巧]5 '-TGGTACACTGCCAGGCG-3 '
[0096] 5'-CTGGTACACTGCCAGGTG-3'
[0097] 5 '-CCTGGTACACTGCCAGTCG-3 '，
[0098] 其中，所述核酸探針的長(zhǎng)度為20個(gè)核巧酸。
[0099] 進(jìn)一步，所述核酸探針的序列為:5'-〔46口'(：口^66了6口'口'66(：-3'。
[0100] 更進(jìn)一步，所述核酸探針的發(fā)光基團(tuán)為巧光基團(tuán)，所述巧光基團(tuán)為FAM，所述調(diào)節(jié) 基團(tuán)為澤滅基團(tuán)，所述澤滅基團(tuán)為B冊(cè)1。
[0101] 根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的方法，能夠通過(guò)檢測(cè)PCR擴(kuò)增體系所產(chǎn)生的巧光，有效地確定 所檢測(cè)的核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)同時(shí)存在相應(yīng)的已知突變，并進(jìn)一步可W有效地確定 ApoE的等位基因分型，對(duì)于阿爾茨海默癥及屯、腦血管等與ApoE基因型相關(guān)疾病的預(yù)防、早 期診斷W及疾病預(yù)后具有非常重要的意義。
[0102] 根據(jù)本發(fā)明的一些實(shí)施例，上述確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變 的方法還可W具有下列附加技術(shù)特征：
[0103] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述核酸樣本來(lái)源于重組核酸或轉(zhuǎn)基因生物組織細(xì) 胞，根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，可W對(duì)上述來(lái)源的核酸樣本進(jìn)行有效地確定突變類(lèi)型，從而可W 對(duì)提供核酸樣本的個(gè)體進(jìn)行有效地分析。
[0104] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述預(yù)定位點(diǎn)是SNP rs429358和rs7412。由此，利用根 據(jù)本發(fā)明實(shí)施例，可W有效地確定核酸樣本中在兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)SNP rs429358和rs7412是否 具有已知突變，從而可W有效地確定ApoE等位基因分型。
[0105] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述第一引物的近3'端包含與rs429358的已知突變對(duì) 應(yīng)的堿基，所述第二引物的近3'端包含與rs7412的已知突變對(duì)應(yīng)的堿基。由此，利用根據(jù)本 發(fā)明實(shí)施例的確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變的方法對(duì)核酸樣本進(jìn)行檢 巧。，在PCR反應(yīng)時(shí)引物可W與模板按照堿基配對(duì)原則選擇性結(jié)合，從而可W特異地?cái)U(kuò)增出 ApoE的不同等位基因，并進(jìn)一步可W有效地確定ApoE等位基因的類(lèi)型。
[0106] 由此，利用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變 的方法對(duì)核酸樣本進(jìn)行檢測(cè)，在PCR反應(yīng)過(guò)程中，引物可W與模板按照堿基配對(duì)原則選擇性 結(jié)合，從而可W特異地?cái)U(kuò)增出ApoE的不同等位基因，并進(jìn)一步可W有效地確定ApoE等位基 因的類(lèi)型。
[0107] 由此，利用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變 的方法對(duì)核酸樣本進(jìn)行檢測(cè)，通過(guò)檢測(cè)各基因型對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增體系中有無(wú)巧光信號(hào)，即可判 斷待測(cè)樣品中是否含有該亞型的ApoE基因。
[0108] 本發(fā)明的有益效果：
[0109] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變的方法 可W實(shí)現(xiàn)下列優(yōu)點(diǎn)至少之一：
[0110] 1、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變的方 法，該方法操作簡(jiǎn)便，僅需PCR擴(kuò)增和巧光檢測(cè)兩個(gè)步驟，減少了實(shí)驗(yàn)步驟，避免交叉污染；
[0111] 2、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變的方 法，該方法容易實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化操作，可W大大減小手工操作過(guò)程中的人為誤差，使得到的結(jié)果 更加準(zhǔn)確；
[0112] 3、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變的方 法，該方法快速省時(shí)，完成整個(gè)檢測(cè)的時(shí)間不到1.5小時(shí)，耗時(shí)少于現(xiàn)有的方法；
[0113] 4、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變的方 法，該方法的成本較低，僅需一個(gè)巧光探針和常規(guī)PCR體系即可；
[0114] 5、根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例的確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變的方 法，該方法的檢測(cè)結(jié)果直觀，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果可W直接讀出待測(cè)樣本的ApoE基因型，無(wú)需繁瑣 的分析過(guò)程。
[0115] 本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變 得明顯，或通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐了解到。
【附圖說(shuō)明】
[0116] 本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變得 明顯和容易理解，其中：
[0117] 圖1是根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變 的方法的不同引物對(duì)ApoE不同等位基因特異性擴(kuò)增原理示意圖，在該圖中，1表示含SNP rs42358和rs7412的ApoE基因 DNA片段示意圖；
[0118] 圖2是根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變 的方法的ApoE基因 PCR擴(kuò)增體系示意圖，在該圖中，1表示ApoE基因 DNA模板反義鏈，2表示正 向擴(kuò)增引物，3表示偶聯(lián)有巧光基團(tuán)（F)和澤滅基團(tuán)（Q)的DNA分子探針，4表示ApoE基因 DNA 模板正義鏈，5表示反向擴(kuò)增引物，6表示DNA聚合酶；
[0119] 圖3是根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變 的方法的巧光探針工作原理示意圖，在該圖中，1表示ApoE基因 DNA模板反義鏈，2表示正向 擴(kuò)增引物，3表示巧光基團(tuán)（F)脫離的DNA分子探針，4表示ApoE基因 DNA模板正義鏈，5表示反 向擴(kuò)增引物，6表示DNA聚合酶；
[0120] 圖4是根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變 的方法的實(shí)例樣品檢測(cè)巧光信號(hào)讀值的柱型分析圖。
[0121] 圖5ε2檢測(cè)試劑中加入濃度為2400拷貝/μ1陽(yáng)性質(zhì)粒，重復(fù)檢測(cè)20次，20個(gè)可檢出 結(jié)果，檢出率為100%。畫(huà)陰性結(jié)果陽(yáng)性結(jié)果，ε2陽(yáng)性質(zhì)粒，濃度為2400拷貝/μ1。
[0122] 圖6ε2檢測(cè)試劑中加入濃度為240拷貝/μ1陽(yáng)性質(zhì)粒，重復(fù)檢測(cè)20次，20個(gè)可檢出結(jié) 果，檢出率為100%。畫(huà)陰性結(jié)果陽(yáng)性結(jié)果，。陽(yáng)性質(zhì)粒，濃度為240拷貝/μ1。
[0123] 圖7ε2檢測(cè)試劑中加入濃度為24拷貝/μ1陽(yáng)性質(zhì)粒，重復(fù)檢測(cè)20次，16個(gè)可檢出結(jié) 果，檢出率為80%。圓陰性結(jié)果陽(yáng)性結(jié)果，ε2陽(yáng)性質(zhì)粒，濃度為24拷貝/μ1。
[0124] 圖8ε3檢測(cè)試劑中加入濃度為2400拷貝/μ1陽(yáng)性質(zhì)粒，重復(fù)檢測(cè)20次，20個(gè)可檢出 結(jié)果，檢出率為100%。圓陰性結(jié)果陽(yáng)性結(jié)果，ε3陽(yáng)性質(zhì)粒，濃度為2400拷貝/μ1。
[0125] 圖9ε3檢測(cè)試劑中加入濃度為240拷貝/μ1陽(yáng)性質(zhì)粒，重復(fù)檢測(cè)20次，20個(gè)可檢出結(jié) 果，檢出率為100%。畫(huà)陰性結(jié)果陽(yáng)性結(jié)果，ε3陽(yáng)性質(zhì)粒，濃度為240拷貝/μ1。
[0126] 圖10ε3檢測(cè)試劑中加入濃度為24拷貝/μ1陽(yáng)性質(zhì)粒，重復(fù)檢測(cè)20次，18個(gè)可檢出結(jié) 果，檢出率為90%。圍陰性結(jié)果陽(yáng)性結(jié)果，ε3陽(yáng)性質(zhì)粒，濃度為24拷貝/μ1。
[0127] 圖11 ε4檢測(cè)試劑中加入濃度為2400拷貝/μ1陽(yáng)性質(zhì)粒，重復(fù)檢測(cè)20次，20個(gè)可檢出 結(jié)果，檢出率為100%。圓陰性結(jié)果陽(yáng)性結(jié)果，ε4陽(yáng)性質(zhì)粒，濃度為2400拷貝/μ1。
[0128] 圖12ε4檢測(cè)試劑中加入濃度為240拷貝/μ1陽(yáng)性質(zhì)粒，重復(fù)檢測(cè)20次，20個(gè)可檢出 結(jié)果，檢出率為100%。麵陰性結(jié)果陽(yáng)性結(jié)果，ε4陽(yáng)性質(zhì)粒，濃度為240拷貝/μ1。
[0129] 圖13ε4檢測(cè)試劑中加入濃度為24拷貝/μ1陽(yáng)性質(zhì)粒，重復(fù)檢測(cè)20次，14個(gè)可檢出結(jié) 果，檢出率為70%。;誦陰性結(jié)果陽(yáng)性結(jié)果，ε4陽(yáng)性質(zhì)粒，濃度為24拷貝/μ1。
[0130] 圖14 ΑΡ0Εε2基因檢測(cè)試劑對(duì)陽(yáng)性質(zhì)控品的擴(kuò)增效果?！う?陽(yáng)性質(zhì)控品圍ε3陽(yáng)性 質(zhì)巧品 ε4陽(yáng)性質(zhì)巧品。
[0131] 圖15 ΑΡΟΕε3基因檢測(cè)試劑對(duì)陽(yáng)性質(zhì)控品的擴(kuò)增效果，結(jié)果如圖15所示。 ε2陽(yáng)性 質(zhì)巧品圍ε 3陽(yáng)性質(zhì)巧品 ε4陽(yáng)性質(zhì)巧品。
[0132] 圖16 ΑΡ0Εε4基因檢測(cè)試劑對(duì)陽(yáng)性質(zhì)控品的擴(kuò)增效果，結(jié)果如圖16所示。·ε2陽(yáng)性 質(zhì)巧品圓ε 3陽(yáng)性質(zhì)巧品 ε4陽(yáng)性質(zhì)巧品。
【具體實(shí)施方式】
[0133] W下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)步說(shuō)明。應(yīng)理解，W下實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā) 明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0134] 在本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明提出了一種確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有 已知突變的方法。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變 的方法可W包括W下步驟：
[0135] S100:利用第一引物和第二引物對(duì)核酸樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且在PCR擴(kuò)增體系中 加入核酸探針
[0136] 在該步驟中，針對(duì)核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)之一的核酸序列設(shè)計(jì)一條PCR引物:第 一引物，針對(duì)核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)另一個(gè)預(yù)定位點(diǎn)的核酸序列設(shè)計(jì)一條PCR引物:第二 引物，并且加入核酸探針，然后對(duì)核酸樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由此，獲得PCR擴(kuò)增樣本，W便進(jìn)一 步對(duì)其進(jìn)行巧光檢測(cè)。
[0137] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在PCR擴(kuò)增時(shí)，如果第一引物的近3'端包含與核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位 點(diǎn)之一的已知突變對(duì)應(yīng)的堿基，第二引物的近3'端包含與核酸樣本的另一個(gè)預(yù)定位點(diǎn)的已 知突變對(duì)應(yīng)的堿基，W及第一引物和第二引物之一作為正向引物，第一引物和所述第二引 物的另一個(gè)作為反向引物，則在PCR擴(kuò)增時(shí)引物可W與模板按照堿基配對(duì)原則選擇性結(jié)合， PCR擴(kuò)增可W按照預(yù)定方向進(jìn)行有效擴(kuò)增，并且能夠特異地?cái)U(kuò)增出不同等位基因。
[013引根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，第一引物的3'端堿基為與rs429358的已知突變對(duì)應(yīng)的堿 基，第二引物的3'端堿基為與rs7412的已知突變對(duì)應(yīng)的堿基。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，第一引 物作為正向引物，第二引物作為反向引物。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，
[0139] 其中，所述第一引物包括：
[0140] 5'-CGGACATGGAGGACGTGT-3'
[0141] 5 '-GCGGACATGGAGGACGAGT-3 '
[0142] 5，-CGCGGACATGGAGGACGTTT-3，
[0143] 5，-CGGACATGGAGGACGAGC-3，
[0144] 5'-GCGGACATGGAGGACGTGC-3'
[0145] 5 '-CGCGGACATGGAGGACGTTC-3 '，
[0146] 所述第二引物包括：
[0147] 5'-TGGTACACTGCCAGGTA-3'
[0148] 5'-CTGGTACACTGCCAGTCA-3'
[0149] 5'-CCTGGTACACTGCCAGGCA-3'
[01加 ]5'-TGGTACACTGCCAGGCG-3'
[0151] 5 '-CTGGTACACTGCCAGGTG-3 '
[0152] 5 '-CCTGGTACACTGCCAGTCG-3 '。
[0153] 由此，PCR擴(kuò)增時(shí)引物可W與模板按照堿基配對(duì)原則選擇性結(jié)合，PCR擴(kuò)增可W按 照預(yù)定5'到3'方向進(jìn)行有效擴(kuò)增，并且能夠特異地?cái)U(kuò)增出不同等位基因。
[0154] 根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，針對(duì)SNP rs429358為T(mén)或C的核酸序列分別設(shè)計(jì)一條 PCR正向引物下稱(chēng)為P112T或P112C)，針對(duì)SNP rs7412為T(mén)或C的核酸序列分別設(shè)計(jì)一條 PCR反向引物m下稱(chēng)為P158T或P158C)。根據(jù)ApoE基因型的區(qū)別可得知，ApoE不同基因型 SNP rs429358和rs7412之間的核酸序列可由如下引物對(duì)在PCR反應(yīng)中特異擴(kuò)增：引物P112T 和P158T能夠特異擴(kuò)增ε2型基因，引物P112T和P158C能夠特異地?cái)U(kuò)增ε3型基因，W及引物 P112C和P158C能夠特異地?cái)U(kuò)增ε4型基因。由此，PCR能夠特異地?cái)U(kuò)增出不同等位基因，從而 可W有效地確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變，進(jìn)一步可W有效地確定核酸 樣本中ApoE等位基因的類(lèi)型。
[0155] 在該步驟中，針對(duì)核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)之間的核酸序列設(shè)計(jì)一段具有特異性 的核酸巧光探針，核酸探針對(duì)應(yīng)兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)之間至少一部分對(duì)應(yīng)的核酸序列。
[0156] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，如果核酸探針具有：發(fā)光基團(tuán)，發(fā)光基團(tuán)形成于所述核酸探針的5' 端，調(diào)芐基團(tuán)，調(diào)芐基團(tuán)形成于所述核酸探針的3'端，并且所述調(diào)芐基團(tuán)可W調(diào)節(jié)所述發(fā)光 基團(tuán)的發(fā)光，則當(dāng)含有核酸探針對(duì)應(yīng)核酸序列被PCR擴(kuò)增時(shí)，探針能夠特異結(jié)合到擴(kuò)增模板 上，此時(shí)核酸聚合酶的外切酶活性能夠切下探針5'端基團(tuán)，使發(fā)光基團(tuán)和調(diào)芐基團(tuán)分離，從 而發(fā)出可檢測(cè)的信號(hào)。
[0157] 根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，核酸探針的發(fā)光基團(tuán)為巧光基團(tuán)，優(yōu)選巧光基團(tuán)為 FAM。根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，核酸探針的調(diào)芐基團(tuán)為巧光基團(tuán)，優(yōu)選調(diào)芐基團(tuán)為B冊(cè)1。根據(jù)本 發(fā)明的實(shí)施例，核酸探針的長(zhǎng)度不受特別限制，例如，核酸探針的長(zhǎng)度可W為20個(gè)核巧酸。 根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，針對(duì)SNP rs429358和rs7412之間的核酸序列設(shè)計(jì)一段具有特異 性的核酸巧光探針。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，核酸探針的序列為5 'FAM- CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-BHQ1 3 '。由此，當(dāng)檢測(cè)核酸樣本的ApoE基因型時(shí)，僅需在PCR擴(kuò)增 體系中加入按上述方法設(shè)計(jì)的核酸巧光探針，利用。Α3/ε4基因型各自對(duì)應(yīng)的不同引物分 另化CR擴(kuò)增待巧陽(yáng)ΝΑ模板。PCR反應(yīng)結(jié)束后，檢測(cè)各反應(yīng)孔的擴(kuò)增情況，即可判斷待測(cè)核酸樣 本中的ApoE基因。
[0158] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，核酸樣本的類(lèi)型及來(lái)源并不受特別限制，例如，可W是人基 因組DNA的至少一部分，可W來(lái)源于任何人體組織或細(xì)胞、重組核酸或轉(zhuǎn)基因生物組織細(xì) 胞。由此，利用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的方法，可W有效地確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具 有已知突變，進(jìn)一步可W有效地確定ApoE的等位基因分型，對(duì)于阿爾茨海默癥和屯、腦血管 疾病的預(yù)防W及早期診斷具有非常重要的意義。
[0159] 在本發(fā)明中所使用的術(shù)語(yǔ)"核酸樣本"的含義是指在任何設(shè)及人基因組DNA的至少 一部分，檢測(cè)的核酸樣本可W來(lái)源于任何人體組織或細(xì)胞、重組核酸或轉(zhuǎn)基因生物組織細(xì) 胞。在本發(fā)明中，除非特別說(shuō)明，"第一與、第二"僅是為了便于描述本發(fā)明，不能理解為對(duì)本 發(fā)明的限制。在本發(fā)明中，除非特別說(shuō)明，"近3'端"指的是，距離3'末端的堿基為預(yù)定范圍 W內(nèi)的堿基，例如距離10個(gè)，9個(gè)，8個(gè)，7個(gè)，6個(gè)，5個(gè)，4個(gè)，3個(gè)，2個(gè)，1個(gè)或者0個(gè)(即3'末端）。
[0160] S200:檢測(cè)反應(yīng)體系的發(fā)光，W便確定核酸樣本的預(yù)定位點(diǎn)是否存在已知突變
[0161 ] 在該步驟中，對(duì)步驟S100中所得到的PCR擴(kuò)增樣本進(jìn)行巧光檢測(cè)，在巧光檢測(cè)時(shí)， 根據(jù)PCR擴(kuò)增體系中有無(wú)巧光信號(hào)即可定性判斷待測(cè)核酸樣本中是否具有該P(yáng)CR擴(kuò)增體系 引物對(duì)所對(duì)應(yīng)的ApoE等位基因分型。由此，可W確定核酸樣本的預(yù)定位點(diǎn)是否存在已知突 變，并進(jìn)一步可W有效地確定ApoE等位基因的類(lèi)型。
[0162] 根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，對(duì)人體基因組DNA的PCR擴(kuò)增樣本進(jìn)行巧光檢測(cè)，如果 僅在ε2擴(kuò)增體系中檢測(cè)到巧光信號(hào)，則該樣品來(lái)源的待測(cè)人ApoE基因型為ε2/ε2;同理如果 僅在ε3(或ε4)擴(kuò)增體系中檢測(cè)到巧光信號(hào)，則該樣品來(lái)源的待測(cè)人ApoE基因型為ε3/ε3(或 ε4/ε4);如果同時(shí)在ε2和ε3擴(kuò)增體系中檢測(cè)到巧光信號(hào)，則該樣品來(lái)源的待測(cè)人ApoE基因 型為。A3;同理如果同時(shí)在ε2和ε4擴(kuò)增體系中檢測(cè)到巧光信號(hào)，則該樣品來(lái)源的待測(cè)人 ApoE基因型為ε2/ε4;同理如果同時(shí)在ε2和ε4(或ε3和ε4)擴(kuò)增體系中檢測(cè)到巧光信號(hào)，則該 樣本來(lái)源的待測(cè)人ApoE基因型為ε2/ε4(或ε3/ε4)。由此，可W有效地確定核酸樣本的兩個(gè) 預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變，進(jìn)一步可W有效地確定ApoE的等位基因分型，對(duì)于阿爾茨海 默癥和屯、腦血管疾病的預(yù)防、早期診斷W及疾病預(yù)后具有非常重要的意義。
[0163] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施例，PCR擴(kuò)增及巧光檢測(cè)的手段并不受特別限制，可W借助任何 已知的方法與設(shè)備來(lái)進(jìn)行PCR擴(kuò)增及巧光檢測(cè)。例如根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，利用美國(guó) Applied Biosystems公司的TSOCFast Real-Time PCR system和Roche公司的Li曲Cycler 480，可W將PCR熱循環(huán)、巧光檢測(cè)及各種應(yīng)用分析軟件結(jié)合在一起，可W動(dòng)態(tài)觀察PCR每一 循環(huán)各反應(yīng)管中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物逐漸增加的情況，PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)束后可W馬上得到結(jié)果，無(wú)需凝 膠電泳分析，無(wú)需純化PCR產(chǎn)物，具有時(shí)間省、靈敏度高、準(zhǔn)確性好等優(yōu)點(diǎn)，再例如，相關(guān)技術(shù) 人員可W根據(jù)具體實(shí)際需要的不同，對(duì)引物W及PCR溫度等進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整，在此不再寶 述，運(yùn)些均在本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0164] 在本發(fā)明的又一個(gè)方面，本發(fā)明提出了一種確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具 有已知突變的試劑盒。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，該試劑盒可W應(yīng)用于前面所述的確定核 酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變的方法。由此，利用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的確定核 酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變的試劑盒對(duì)核酸樣本進(jìn)行檢測(cè)，可W有效地確定 核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變，并進(jìn)一步可W有效地確定ApoE的等位基因分 型。另外，前面針對(duì)確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變的方法所描述的特征 和優(yōu)點(diǎn)，也當(dāng)然地適用該試劑盒，不再寶述
[0165] 在本發(fā)明的又一個(gè)方面，本發(fā)明提出了一組確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具 有已知突變的PCR引物。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施例，該引物可W應(yīng)用于前面所述的確定核酸 樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變的方法W及試劑盒。由此，PCR擴(kuò)增過(guò)程中引物可W 與模板按照堿基配對(duì)原則選擇性結(jié)合，PCR擴(kuò)增可W按照預(yù)定方向進(jìn)行有效擴(kuò)增，并且能夠 特異地?cái)U(kuò)增出不同等位基因。另外，前面針對(duì)確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知 突變的方法及試劑盒所用引物的描述的特征和優(yōu)點(diǎn)，也當(dāng)然地適用該P(yáng)CR引物，不再寶述。
[0166] 本法明的確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變的方法、試劑盒及引物 可W應(yīng)用在阿爾茨海默癥W及屯、腦血管等疾病的預(yù)防W及早期診斷方面，相關(guān)技術(shù)人員當(dāng) 然也可W將其擴(kuò)大至其它其應(yīng)用領(lǐng)域，在此不予寶述，運(yùn)些均在本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍之 內(nèi)。
[0167]下面通過(guò)具體的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，需要說(shuō)明的是運(yùn)些實(shí)施例僅僅是為 了說(shuō)明目的，而不能W任何方式解釋成對(duì)本發(fā)明的限制。另外，在下列實(shí)施例中如果沒(méi)有特 別說(shuō)明，則所采用的設(shè)備和材料均為市售可得的。
[016引一般方法；
[0169] 1材料與試劑：
[0170] 1)DNA 引物P112T: 5 ' -GCGGACATGGAGGACGTGT-3 '，Tm = 59.5 °C，GC含量=63.2 %， 5 . 6nM/0D/管，加無(wú)菌去離子水55 . 6μ1配制成100μΜ反應(yīng)液，于4°C儲(chǔ)藏；5'- CGGACATGGAGGACGTGT-3 '，Tm = 57.2 °C，GC含量=61.1 %，5.9nM/0D/管，加無(wú)菌去離子水 58.9μ1配制成100μΜ反應(yīng)液，于4°C儲(chǔ)藏。引物均合成于英濰捷基(上海）貿(mào)易有限公司，純化 方式為:PAGE純化。
[0171] 2)0麻引物口112(：:5'-〔664〔4了664664〔6了6(：-3'，時(shí)1 = 59.5。(：，6(：含量=66.7%， 5.化M/0D/管，加無(wú)菌去離子水59μ1配制成lOOiiM反應(yīng)液，于4°C儲(chǔ)藏。引物均合成于上海博 尚生物技術(shù)有限公司，純化方式為:PAGE純化。
[0172] 3)DNA 引物P158T: 5 ' -CCTGGTACACTGCCAGGCA-3 '，Tm = 59.5 °C，GC含量=63.2 %， 5.7nM/0D/管，加無(wú)菌去離子水57.2μ1配制成100μΜ反應(yīng)液，于4°C儲(chǔ)藏。引物均合成于上海 博尚生物技術(shù)有限公司，純化方式為:PAGE純化。
[0173] 4)0麻引物口158(：:5'-(：了66了4〔4(：了6此466〔6-3'，時(shí)1 = 59.5。(：，6(：含量=66.7%， 6nM/0D/管，加無(wú)菌去離子水60μ1配制成lOOiiM反應(yīng)液，于4°C儲(chǔ)藏。引物均合成于上海博尚 生物技術(shù)有限公司，純化方式為:PAGE純化。
[0174] 5)巧光DNA分子探針：5'FAM-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-B冊(cè)13'，Tm=65°C，GC含量= 70 %，5. InM/OD/管，加無(wú)菌去離子水51μ1配制成100μΜ反應(yīng)液，于4°C避光儲(chǔ)藏。巧光DNA分 子探針合成于英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司，純化方式為:HPLC純化。
[01巧]6)PCR預(yù)混液：購(gòu)于美國(guó)Applied Biosystems公司的TaqMan Genotyping Master Mix(包括DNA聚合酶，dNTPs，ROX參比巧光），ROX參比巧光在PCR反應(yīng)中不會(huì)加入擴(kuò)增，它作 為巧光內(nèi)參能夠矯正在PCR反應(yīng)中由于濃度和體積改變引起的巧光信號(hào)變化。
[0176] 7)無(wú)菌去離子水:去離子水取自英國(guó)化GA純水儀(型號(hào)purelab 3000)，并經(jīng)高壓 蒸汽滅菌后所得。
[0177] 8)1.5ml離屯、管:購(gòu)于美國(guó)Axygen公司。
[0178] 9)PCR板：MicroAmp⑥Optical 96-Well Reaction Plate購(gòu)于美國(guó)Applied Biosystems 公司。
[0179] 10)PCR封板膜:Mi.C.r〇Am|>⑥96-Well Optical A化esive Film購(gòu)于美國(guó)Applied Biosystems 公司。
[0180] 11)-次性醫(yī)用無(wú)菌注射器:一次性醫(yī)用無(wú)菌注射器(5ml規(guī)格)購(gòu)于河南新鄉(xiāng)市宇 安醫(yī)用衛(wèi)材有限公司。
[0181] 12)人血液基因組DNA提取相關(guān)試劑：
[0182] 曰、紅細(xì)胞裂解液:稱(chēng)取3.735g氯化錠、Ξ徑甲基氨基甲燒(Tris)1.3g加水溶解并 稀釋至500ml，0.22m濾膜(購(gòu)于美國(guó)Millipore公司）過(guò)濾除菌，于4°C保存；
[0183] b、Nuclei Lysis Solution(購(gòu)于美國(guó)Promega公司）；
[0184] c、Precipitation Solution(購(gòu)于美國(guó)Promega公司）。
[0185] 13) ε 2/ ε 2DNA已知樣本:從ε2/ε2基因組DM中PCR擴(kuò)增并測(cè)序驗(yàn)證的DM樣品。
[0186] 14) ε 3/ ε 3DNA已知樣本:從ε3/ε3基因組DM中PCR擴(kuò)增并測(cè)序驗(yàn)證的DM樣品。
[0187] 15) ε 4/ ε 4DNA已知樣本:從ε 4/ ε 4基因組DNA中PCR擴(kuò)增并測(cè)序驗(yàn)證的DNA樣品。
[018引 16) ε 2/ ε 3DNA已知樣本:從ε2/ε3基因組DNA中PCR擴(kuò)增并測(cè)序驗(yàn)證的DNA樣品。
[0189] 17) ε 2/ ε 4DNA已知樣本:從ε 2/ ε 4基因組DNA中PCR擴(kuò)增并測(cè)序驗(yàn)證的DNA樣品。
[0190] 16) ε 3/ ε 4DNA已知樣本:從ε 3/ ε 4基因組DNA中PCR擴(kuò)增并測(cè)序驗(yàn)證的DNA樣品。
[0191] 2儀器與設(shè)備：
[0192] 1)移液器:微量移液器(1化1，20μ1，100μΙ，100化1)購(gòu)于德國(guó)化pendorf公司。
[0193] 2)離屯、機(jī):小型高速離屯、機(jī)(型號(hào):5424)，購(gòu)于德國(guó)化pendorf公司。
[0194] 3)離屯、機(jī)：Universal 32R型控溫高速離屯、機(jī)，購(gòu)于德國(guó)Hettich zentri化gen公 司。
[01M] 4)滿(mǎn)旋混合器:購(gòu)于江蘇海口其林貝爾儀器制造有限公司。
[0196] 5)全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀:The;rmo Scientific Varioskan Flash全波長(zhǎng)掃 描式多功能讀數(shù)儀，購(gòu)于化ermo Scientific公司。
[0197] 6)Real-Time PCR儀器：7500Fast Real-Time PCR system,購(gòu)于美國(guó)Applied Biosystems公司；LightCycler 480,購(gòu)于Roche公司。
[019引 7 )分析軟件：7500sof tware V2.0.6，購(gòu)于美國(guó) Appl ied Biosystems公司； Lighixycler 480Software，購(gòu)于Roche公司。
[0199]在下列實(shí)施例中（詳細(xì)見(jiàn)下面的實(shí)施例1-3)，確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否 具有已知突變的方法的步驟如下：
[0200] 1引物設(shè)計(jì)：
[0201] ApoE基因的DNA序列由美國(guó)國(guó)家生物科技信息中屯、（NCBI)網(wǎng)站提供，根據(jù)包含 ApoE基因多態(tài)性位點(diǎn)SNP rs429358和SNP rs7412的DNA序列信息，對(duì)引物進(jìn)行如下設(shè)計(jì)：
[0202] 1)針對(duì)SNP rs429358位點(diǎn)核酸形式為T(mén)的正向PCR擴(kuò)增引物(P112T)，其DNA序列 為：5 '-GCGGACATGGAGGACGTGT-3 ' 和5 '-CGGACATGGAGGACGTGT-3 '；
[0203] 2)針對(duì)SNP rs429358位點(diǎn)核酸形式為C的正向PCR擴(kuò)增引物(P112C)，其DNA序列 為：5 '-CGGACATGGAGGACGTGC-3 '；
[0204] 3)針對(duì)SNP rs7412位點(diǎn)核酸形式為T(mén)的反向PCR擴(kuò)增引物(P158T)，其DNA序列為： 5'-CCTGGTACACTGCCAGGCA-3'；
[0205] 4)針對(duì)SNP rs7412位點(diǎn)核酸形式為C的反向PCR擴(kuò)增引物(P158C)，其DM序列為： 5 '-CTGGTACACTGCCAGGCG-3 '。
[0206] 2巧光DNA分子探針設(shè)計(jì)：
[0207] 根據(jù)美國(guó)國(guó)家生物科技信息中屯、(NCBI)網(wǎng)站提供的ApoE基因 DNA序列信息，該基 因 SNP rs429358位點(diǎn)與SNP rs7412位點(diǎn)之間的DNA序列為： t邑C邑邑CC邑cct邑邑t邑C曰邑t曰CC邑C邑邑C邑曰邑邑t邑C曰邑邑CC曰t邑etc邑邑CC曰邑曰邑C曰CC邑曰邑邑曰邑ct邑C邑邑邑t邑C邑cct cgcctcccacctgcgcaagctgcgtaagcggctcctccgcgatgccgatgacctgcagaagcgc,選取該序列中 的一段作為探針的互補(bǔ)核酸序列部分，該序列為5 ' -CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-3 '。選用巧光 探針，選取FAM巧光基團(tuán)W及B冊(cè)1澤滅基團(tuán)，F(xiàn)AM巧光基團(tuán)偶聯(lián)在互補(bǔ)核酸序列的5 '端，B冊(cè)！ 澤滅基團(tuán)偶聯(lián)在互補(bǔ)核酸序列的3 '端，巧光探針為：5 ' FAM-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-BHQ1 3'。
[0208] W下部分W基因組DM樣本為檢測(cè)樣品進(jìn)行闡述：
[0209] 3操作流程
[0210] 2)基因組DNA提取：
[0別。曰、含有900μ1紅細(xì)胞裂解液的1.5ml離屯、管中，上下顛倒5-6次。
[0212] b、室溫放置10分鐘(期間顛倒2-3次），室溫條件下13000-16000g離屯、20秒。
[0213] C、吸去上清，剩下約10-20μ1于管底。
[0214] d、滿(mǎn)旋振蕩重懸白細(xì)胞，加入Nuclei Lysis Solution,吹吸5-6次，可選步驟加入 1.5μ1的RNA酶混勻，37 °C條件下放置15分鐘。
[0215] e、加入lOOul Precipi1:ation Solution,滿(mǎn)旋振蕩10-20秒。
[0216] f、室溫條件下13000-16000g離屯、10分鐘。
[0217] g、轉(zhuǎn)移上清到新的1.5ml離屯、管，加入300ul異丙醇，上下輕輕顛倒直到有白色絮 狀DNA出現(xiàn)。
[021引 h、室溫條件下13000-16000g離屯、1分鐘。
[0219] i、吸去上清，加入70%乙醇，輕輕的上下顛倒幾次洗涂DNA，室溫條件下13000- leooog離屯、1分鐘。
[0220] j、輕輕吸去乙醇，將1.5ml離屯、管倒置在干凈的吸水紙上10-15分鐘。
[0221] k、加入lOOul無(wú)菌去離子水溶解DNA，65°C水浴1小時(shí)，也可W4°C過(guò)夜。
[0222] 1、利用全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀中的DNA濃度測(cè)量程序測(cè)量所提DNA的濃度，取 一部分DNA溶液用無(wú)菌去離子水稀釋至化g/ml，作為后續(xù)PCR檢測(cè)模板，剩余DNA溶液存放于 2 ~8°C 或-2(TC。
[0223] 3)PCR反應(yīng)體系配制：
[0224] 根據(jù)ApoE基因的Ξ個(gè)多態(tài)性，與Ξ種檢測(cè)試劑（ε2試劑、ε3試劑和ε4試劑），分別用 于人群中存在6種不同4口〇6基因型62/62,63/63,64八4,62八3,62/64和63/64的檢測(cè)。6種已 知ApoE基因型DNA已知樣本（ε 2/ ε 2DNA已知樣本、ε 3/ ε 3DNA已知樣本、ε 4/ ε 4DNA已知樣本、ε 2/ε 3DNA已知樣本、ε 2/ε 4DNA已知樣本和ε 3/ε 4DNA已知樣本)作為對(duì)照
[02巧]其中。試劑包括：
[0。6]曰、對(duì)應(yīng)ΑροΕε2等位基因型SNP位點(diǎn)rs429358SNP核酸形式的正向引物Ρ112Τ(該實(shí) 例中核酸序列為5 ' -GCGGACATGGAGGACGTGT-3 '）。
[0227] b、對(duì)應(yīng)ΑροΕε2等位基因型SNP位點(diǎn)rs7412反向引物核酸形式的反向引物P158T(該 實(shí)例中核酸序列為5 ' -CCTGGTACACTGCCAGGCA-3 '）。
[022引 C、巧光探針
[0229] (該實(shí)例中探針形式為5'FAM-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-B冊(cè)13'）。
[0230] d、PCR預(yù)混液TaqMan Genotyping Master Mix。
[0231] 其各成分具體劑量為： 化qMan Geiiotyping Master Mix 4.85μ1 ε2 正向引物 pll2T (100μΜ) 0.05μ1 「02321 ε2 正向引物 ρ158Τ (100μΜ) 0.05μ1 癸光探針（100μΜ) 0.05μ1
[0233] 其中ε3試劑包括：
[0234] a、對(duì)應(yīng)ΑροΕε3等位基因型SNP位點(diǎn)rs429358SNP核酸形式的正向引物ρ112Τ(該實(shí) 例中核酸序列為5 ' -CGGACATGGAGGACGTGT-3 '）。
[0235] b、對(duì)應(yīng)ΑροΕε3等位基因型SNP位點(diǎn)rs7412反向引物核酸形式的反向引物P158C(該 實(shí)例中核酸序列為5 ' -CTGGTACACTGCCAGGCG-3 '）。
[0236] C、巧光探針
[0237] (該實(shí)例中探針形式為5'FAM-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-B冊(cè)13'）。
[02；38] cUPCR預(yù)混液TaqMan Genotyping Master Mix。
[0239] 其各成分具體劑量為： TaqMan Genotyping Master Mix 4.85μΙ ε3 正向引物 ρ112Τ (100μΜ) 0.05μ1
[0240] ε3 正向引物 pl58C ( 100μΜ) 0.05μ1 義化探針（100μΜ) 0 ()5μ1
[0241] 其中e4試劑包括：
[0242] a、對(duì)應(yīng)ΑροΕε4等位基因型SNP位點(diǎn)rs429358SNP核酸形式的正向引物pll2C(該實(shí) 例中核酸序列為5 ' -CGGACATGGAGGACGTGC-3 '）。
[0243] b、對(duì)應(yīng)ApoE ε 4等位基因型SNP位點(diǎn)rs7412反向引物核酸形式的反向引物P158C (該 實(shí)例中核酸序列為5 ' -CTGGTACACTGCCAGGCG-3 '）。
[0244] C、巧光探針
[0245] (該實(shí)例中探針形式為5'FAM-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-B冊(cè)13'）。
[0246] d、PCR預(yù)混液TaqMan Genotyping Master Mix。
[0247] 其各成分具體劑量為： 化qMan G州otyping Master Mix 4.85μΙ ε4 正向引物 pll2C (100μΜ) 0.05μ1 W2483 ε4 ιΚ|!\?引物 pl58C (100μΜ) 0.05μ1 巧化採(cǎi)針（?ΟΟμΜ) 0.05μ1
[0249] 使用ΑροΕ基因分型檢測(cè)試劑需要10μ1反應(yīng)體系就可W充分檢測(cè)到信號(hào)。
[0250] ε2基因檢測(cè)的PCR反應(yīng)體系為：
[0巧1]。試劑： 5μ1
[0 巧2]待測(cè) DNA 樣品（2ngAU): 5μ1
[0253] ε2陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)體系1:
[0巧4]。試劑： 5μ1
[0 巧 5] e2A2DNA 已知樣本（2pgAU): 5μ1
[0256] ε2陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)體系2:
[0巧7]。試劑： 5μ1
[0258] e2A3DNA 已知樣本（2pg/ul): 5μ1
[0259] ε2陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)體系3:
[0260] ε2 試劑： 5μ1 惦61] e2A4DNA 已知樣本（2pg/ul): 5μ1
[0262] ε2陰性對(duì)照檢測(cè)體系1:
[0%3] ε2 試劑： 5μ1
[0264] e3A3DNA 已知樣本（2pg/ul): 5μ1
[02化]ε2陰性對(duì)照檢測(cè)體系2:
[0%6] ε2 試劑： 5μ1
[0%7] e4A4DNA 已知樣本（2pg/ul): 5μ1
[0%引ε2陰性對(duì)照檢測(cè)體系3:
[0269] ε2 試劑： 5μ1
[0270] e3A4DNA 已知樣本（2pg/ul): 5μ1
[0271] ε3基因檢測(cè)的PCR反應(yīng)體系為：
[0272] ε3 試劑： 5μ1
[0273] 待測(cè) DM 樣品（2ngAU): 5μ1
[0274] ε3陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)體系1:
[0275] ε3 試劑： 5μ1
[0276] e3A3DNA 已知樣本（2pg/ul): 5μ1
[0277] ε3陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)體系2:
[027引 ε3 試劑： 5μ1
[0279] e2A3DNA 已知樣本（2pg/ul): 5μ1
[0280] 。陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)體系3:
[0281] ε3 試劑： 5μ1
[0282] e3A4DNA 已知樣本（2pg/ul): 5μ1
[0283] 。陰性對(duì)照檢測(cè)體系1:
[0284] ε3 試劑： 5μ1
[0285] e2A2DNA 已知樣本（2pg/ul): 5μ1
[0286] ε3陰性對(duì)照檢測(cè)體系2:
[0287] ε3 試劑： 5μ1
[028引 e4A4DNA 已知樣本（2pg/ul): 5μ1
[0289] ε3陰性對(duì)照檢測(cè)體系3:
[0巧0]。試劑： 5μ1
[0巧 1] e2A4DNA 已知樣本（2pg/ul): 5μ1
[0巧2] ε4基因檢測(cè)的PCR反應(yīng)體系為：
[0巧3] e4 試劑： 5μ1
[0294]待測(cè) DM 樣品（2ngAU): 5μ1
[02巧]ε4陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)體系1:
[0 巧 6] e4 試劑： 5μ1
[0 巧 7] e4A4DNA 已知樣本（2pg/ul): 5μ1
[029引ε4陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)體系2:
[0 巧9] e4 試劑： 5μ1
[0300] e2A4DNA 已知樣本（2pg/ul): 5μ1
[0301] ε4陽(yáng)性對(duì)照檢測(cè)體系3:
[0302] ε4 試劑： 5μ1
[0303] e3A4DNA 已知樣本（2pg/ul): 5μ1
[0304] ε4陰性對(duì)照檢測(cè)體系1:
[0305] ε4 試劑： 5μ1
[0306] e2A2DNA 已知樣本（2pg/ul): 5μ1
[0307] ε4陰性對(duì)照檢測(cè)體系2:
[030引 ε4 試劑： 5μ1
[0309] e3A3DNA 已知樣本（2pg/ul): 5μ1
[0310] ε4陰性對(duì)照檢測(cè)體系3:
[0311] ε4 試劑： 5μ1
[0312] e2A3DNA 已知樣本（2pg/ul): 5μ1
[0313] 4)PCR擴(kuò)增反應(yīng)：
[0314] 將待測(cè)樣品即人血液提取的基因組DNA( 2ngAil)與已知ApoE基因型的DNA已知樣 品分別加入ε2，ε3和ε4基因檢測(cè)的10μ1 PCR反應(yīng)體系中。用滅菌的去離子水作為整個(gè)PCR體 系的陰性對(duì)照。在PC財(cái)反中配制好所有PCR反應(yīng)體系后，用PCR封板膜封閉好PC財(cái)反，殘留在 PC財(cái)反孔壁上液體用化iversal 32R型控溫高速離屯、機(jī)離屯、到管底并排除氣泡。然后，將該 PCR板放入750(Fast Rea^Time PCR system儀器中，打開(kāi)7500software V2.0.6軟件，選擇 軟件中的Genotyping模塊，在Plate setup中設(shè)置對(duì)應(yīng)放入PCR板上每孔的檢測(cè)內(nèi)容。然后 在Run method中設(shè)置PCR反應(yīng)程序及反應(yīng)體系，運(yùn)些項(xiàng)目設(shè)置完畢后，便可運(yùn)行程序，該程 序默認(rèn)PCR反應(yīng)之前先在60°C條件下預(yù)讀取本底巧光強(qiáng)度值再進(jìn)行PCR擴(kuò)增W消除背景巧 光值。待PCR反應(yīng)完成之后，儀器可自動(dòng)在60°C條件下收集巧光數(shù)據(jù)。表1為該實(shí)例PCR反應(yīng) 過(guò)程的標(biāo)準(zhǔn)熱循環(huán)程序。
[031引表1 PCR反應(yīng)程序
[0316]
[0317] 5)數(shù)據(jù)分析與結(jié)論：
[0318] 表2 Real-Time PCR儀讀完巧光值之后導(dǎo)出巧光數(shù)值
[0319]
[0320] 表2是根據(jù)本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例的確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變 的方法的實(shí)例樣品檢測(cè)巧光信號(hào)讀值結(jié)果。
[0321] 在Real-Time PCR儀讀完巧光值之后導(dǎo)出巧光數(shù)值，結(jié)果如表2所示。在ApoE基因 型為ε2/ε2的DNA已知樣品中，ε2基因檢測(cè)體系為陽(yáng)性結(jié)果，其巧光值為2.23623729。63,64 基因檢測(cè)體系為陰性結(jié)果，其巧光值分別為0.218611和0.51656318;在ApoE基因型為ε3/ε3 的DNA已知樣品中，ε3基因檢測(cè)體系為陽(yáng)性結(jié)果，其巧光值為2.50921822。62,64基因檢測(cè)體 系為陰性結(jié)果，其巧光值分別為0.1933465和0.40723515;在ApoE基因型為ε4/ε4的DNA已知 樣品中，ε4基因檢測(cè)體系為陽(yáng)性結(jié)果，其巧光值為2.5952146Κε2，ε3基因檢測(cè)體系為陰性 結(jié)果，其巧光值分別為0.17685843和0.22782183。作為陰性對(duì)照的無(wú)菌去離子水樣品，在ε 2，ε3和ε4基因檢測(cè)體系中，其巧光值分別為0.17888165,0.22742152和-0.0582402。運(yùn)樣， 在運(yùn)一實(shí)例中最大的陰性結(jié)果巧光值為0.51656318,而所有陽(yáng)性結(jié)果的巧光值均遠(yuǎn)大于最 大的陰性結(jié)果巧光值。在此定義W最大陰性結(jié)果巧光值的2倍數(shù)值作為巧光信號(hào)陽(yáng)性和陰 性結(jié)果的分界值，該實(shí)例中運(yùn)一分界值為1.03312636。
[0322] 根據(jù)表2中的巧光值可W作柱形圖，柱形圖如圖5所示，在陽(yáng)性與陰性結(jié)果分界值 處劃一直線(xiàn)，可W直觀的看出所有的陽(yáng)性結(jié)果都在直線(xiàn)上方，而所有陰性結(jié)果都在直線(xiàn)下 方。該實(shí)例中待測(cè)DNA樣品在ε2和ε3基因檢測(cè)體系得到結(jié)果根據(jù)上述分析方法判斷為陽(yáng)性 結(jié)果，而在ε4基因檢測(cè)體系得到結(jié)果根據(jù)上述分析方法判斷為陰性結(jié)果。由此得知，該實(shí)例 中待測(cè)DNA樣品的ApoE基因型為ε 2/ ε 3型。
[0323] 實(shí)施例1
[0324] 在實(shí)施例中，如圖1所示，引物pi 12T僅與SNP rs429358為Τ的核酸序列匹配，引物 P112C僅與SNP rs429358為C的核酸序列匹配，引物Ρ158Τ僅與SNP rs7412為Τ的核酸序列匹 配，引物P158C僅與SNP rs7412為C的核酸序列匹配。由此，含引物對(duì)ρ112Τ/ρ158Τ的PCR體系 僅能擴(kuò)增SNP rs429358為Τ同時(shí)SNP rs7412為Τ的ApoE等位基因（即ε2);含引物對(duì)ρ112Τ/ pl58C的PCR體系僅能擴(kuò)增SNP rs429358為Τ同時(shí)SNP rs7412為C的ApoE等位基因（即ε3);含 引物對(duì)pll2C/pl58C的PCR體系僅能擴(kuò)增SNP rs429358為C同時(shí)SNP rs7412為C的ApoE等位 基因（即ε4)。所W，利用上述Ξ種引物對(duì)，可W特異地?cái)U(kuò)增出ApoE的不同等位基因，并確定 DNA樣品中人ApoE等位基因的類(lèi)型。
[03巧]實(shí)施例2
[0326] 在實(shí)施例中，如圖2所示，巧光基團(tuán)（F)脫離的DNA分子探針3的兩段分別偶聯(lián)有巧 光基團(tuán)和澤滅基團(tuán)，此時(shí)由于澤滅基團(tuán)能吸收巧光基團(tuán)的激發(fā)能量，因此，體系中只能檢測(cè) 到本底巧光信號(hào)。巧光基團(tuán)（F)脫離的DNA分子探針3能與ApoE基因 DNA模板反義鏈1特異互 補(bǔ)匹配，且匹配序列位于正向擴(kuò)增引物2和反向擴(kuò)增引物5對(duì)應(yīng)的DNA序列之間，當(dāng)PCR擴(kuò)展 反應(yīng)開(kāi)始后，正向擴(kuò)增引物巧日巧光基團(tuán)（F)脫離的DNA分子探針3將與ApoE基因 DNA模板反 義鏈1結(jié)合，反向擴(kuò)增引物引尋與ApoE基因 DNA模板正義鏈4結(jié)合，在DNA聚合酶6的作用下開(kāi) 始擴(kuò)增模板DNA。
[0327] 實(shí)施例3
[032引在實(shí)施例中，如圖3所示，DNA聚合酶6在PCR反應(yīng)過(guò)程中從正向擴(kuò)增引物2或反向擴(kuò) 增引物5開(kāi)始，WApoE基因 DNA模板反義鏈1或ApoE基因 DNA模板正義鏈4為模板，起始DNA的 延伸，當(dāng)DNA聚合酶6在介導(dǎo)DNA延伸的過(guò)程中遇到結(jié)合在ApoE基因 DNA模板反義鏈1上的巧 光基團(tuán)（F)脫離的DNA分子探針3，DNA聚合酶則尋利用其外切酶活性從巧光基團(tuán)（F)脫離的 DNA分子探針3的5'端逐一切掉探針上的核巧酸，致使巧光基團(tuán)從探針上脫離并與澤滅基團(tuán) 分離，此時(shí)即能檢測(cè)到巧光基團(tuán)激發(fā)出的巧光信號(hào)，并由此確定檢測(cè)樣品含有該引物對(duì)所 對(duì)應(yīng)的ApoE等位基因類(lèi)型。
[0329] 發(fā)明人認(rèn)為引物序列對(duì)于檢測(cè)效果是有非常重要的影響的，引物序列的任何改變 都有可能造成檢測(cè)效果的不可信。將正向引物或者反向引物的端點(diǎn)堿基進(jìn)行改造，結(jié)果假 陽(yáng)性幾乎達(dá)到100 %。
[0330] 1、本發(fā)明的產(chǎn)品具有更高的靈敏度
[0331] 發(fā)明人把^種基因的陽(yáng)性質(zhì)粒用Tris-HCl緩沖液（10mM，pH8.0)進(jìn)行稀釋?zhuān)玫?2400拷貝/μ1、240拷貝/μ1和24拷貝/μ1的，并對(duì)運(yùn)些樣本進(jìn)行檢測(cè)，95% (η>20)的陽(yáng)性率 作為最低檢測(cè)限的標(biāo)準(zhǔn)。
[0332] (1) ε2檢測(cè)試劑Ξ種濃度的檢測(cè)結(jié)果：
[0333] 圖5ε2檢測(cè)試劑中加入濃度為2400拷貝/μ1陽(yáng)性質(zhì)粒，重復(fù)檢測(cè)20次，20個(gè)可檢出 結(jié)果，檢出率為100%。結(jié)果如圖5所示:圓輛性結(jié)果陽(yáng)性結(jié)果，ε2陽(yáng)性質(zhì)粒，濃度為2400拷 貝/μL
[0334] 圖6ε2檢測(cè)試劑中加入濃度為240拷貝/μ1陽(yáng)性質(zhì)粒，重復(fù)檢測(cè)20次，20個(gè)可檢出結(jié) 果，檢出率為100%。結(jié)果如圖6所示:畫(huà)陰性結(jié)果陽(yáng)性結(jié)果，ε2陽(yáng)性質(zhì)粒，濃度為240拷貝/ μΙο
[0335] 圖7ε2檢測(cè)試劑中加入濃度為24拷貝/μ1陽(yáng)性質(zhì)粒，重復(fù)檢測(cè)20次，16個(gè)可檢出結(jié) 果，檢出率為80%。結(jié)果如圖7所示陰性結(jié)果陽(yáng)性結(jié)果，ε2陽(yáng)性質(zhì)粒，濃度為24拷貝/μ 1〇
[0336] (2) ε3檢測(cè)試劑Ξ種濃度的檢測(cè)結(jié)果：
[0337] 圖8ε3檢測(cè)試劑中加入濃度為2400拷貝/μ1陽(yáng)性質(zhì)粒，重復(fù)檢測(cè)20次，20個(gè)可檢出 結(jié)果，檢出率為100%。結(jié)果如圖8所示:圓陰性結(jié)果陽(yáng)性結(jié)果，ε3陽(yáng)性質(zhì)粒，濃度為2400拷 貝/μL。
[0338] 圖9ε3檢測(cè)試劑中加入濃度為240拷貝/μ1陽(yáng)性質(zhì)粒，重復(fù)檢測(cè)20次，20個(gè)可檢出結(jié) 果，檢出率為100%。結(jié)果如圖9所示:圍陰性結(jié)果陽(yáng)性結(jié)果，ε3陽(yáng)性質(zhì)粒，濃度為240拷貝/ μΙο
[0339] 圖10ε3檢測(cè)試劑中加入濃度為24拷貝/μ1陽(yáng)性質(zhì)粒，重復(fù)檢測(cè)20次，18個(gè)可檢出結(jié) 果，檢出率為90%。結(jié)果如圖10所示:圓陰性結(jié)果陽(yáng)性結(jié)果，ε3陽(yáng)性質(zhì)粒，濃度為24拷貝/μ 1〇
[0340] (3) ε4檢測(cè)試劑Ξ種濃度的檢測(cè)結(jié)果：
[0%1 ]圖11 ε4檢測(cè)試劑中加入濃度為2400拷貝/μ1陽(yáng)性質(zhì)粒，重復(fù)檢測(cè)20次，20個(gè)可檢出 結(jié)果，檢出率為100%。結(jié)果如圖11所示:圓:陰性結(jié)果陽(yáng)性結(jié)果，ε4陽(yáng)性質(zhì)粒，濃度為2400 拷貝/μL。
[0342] 圖12ε4檢測(cè)試劑中加入濃度為240拷貝/μ1陽(yáng)性質(zhì)粒，重復(fù)檢測(cè)20次，20個(gè)可檢出 結(jié)果，檢出率為100%。結(jié)果如圖12所示:圓陰性結(jié)果陽(yáng)性結(jié)果，ε4陽(yáng)性質(zhì)粒，濃度為240拷 貝/μL。
[0343] 圖13ε4檢測(cè)試劑中加入濃度為24拷貝/μ1陽(yáng)性質(zhì)粒，重復(fù)檢測(cè)20次，14個(gè)可檢出結(jié) 果，檢出率為70%。結(jié)果如圖13所示陰性結(jié)果陽(yáng)性結(jié)果，ε4陽(yáng)性質(zhì)粒，濃度為24拷貝/μ 1〇
[0344] 人類(lèi)基因組約有30億個(gè)堿基，1個(gè)細(xì)胞約為6pg的基因組，1個(gè)拷貝人類(lèi)基因組DNA 約為化g，因此lOpg人類(lèi)基因組DNA約有3個(gè)拷貝，lng的基因組DNA人類(lèi)基因組DNA約有300個(gè) 拷貝。因此240個(gè)拷貝相當(dāng)于0.8ng的人類(lèi)基因組DNA，所W本試劑盒檢測(cè)最低檢出限為 0. Sng/μL，即4ng/反應(yīng)。
[0345] 2、本發(fā)明的產(chǎn)品具有更高的特異性
[CX346] 我們選擇考察了 1.5*106拷貝/反應(yīng)、3*105拷貝/反應(yīng)、6*104拷貝/反應(yīng)、1.2*104 拷貝/反應(yīng)、2.4*103拷貝/反應(yīng)、4.8*102拷貝/反應(yīng)、96拷貝/反應(yīng)和19.2拷貝/反應(yīng)，換算后 相當(dāng)于基因組DNA含量為5000ng/反應(yīng)、lOOOng/反應(yīng)、200ng/反應(yīng)、40ng/反應(yīng)、8ng/反應(yīng)、 1.6ng/反應(yīng)、0.3化g/反應(yīng)和0.064ng/反應(yīng)，結(jié)果如圖14所示。 ε2陽(yáng)性質(zhì)控品畫(huà)ε3陽(yáng)性質(zhì) 巧品 ε4陽(yáng)性質(zhì)巧品。
[0347]圖14 ΑΡ0Εε2基因檢測(cè)試劑對(duì)陽(yáng)性質(zhì)控品的擴(kuò)增效果。
[(Χ34引表3 ΑΡ0Εε2基因檢測(cè)試劑對(duì)陽(yáng)性質(zhì)控品的擴(kuò)增Ct值 [0349]

[0350] ~圖15ΑΡ0Εε3基因檢測(cè)試劑對(duì)陽(yáng)性質(zhì)控品的擴(kuò)增效果，結(jié)果如圖15所示。 ε2陽(yáng)性I 質(zhì)控品畫(huà)。陽(yáng)性質(zhì)控品·ε4陽(yáng)性質(zhì)控品。
[0351] 表4 ΑΡ0Εε3基因檢測(cè)試劑對(duì)陽(yáng)性質(zhì)控品的擴(kuò)增Ct值
[0352]
[0353]
[0354] 圖16ΑΡ0Εε4基因檢測(cè)試劑對(duì)陽(yáng)性質(zhì)控品的擴(kuò)增效果，結(jié)果如圖16所示。 ε2陽(yáng)性 質(zhì)控品畫(huà)。陽(yáng)性質(zhì)控品·ε4陽(yáng)性質(zhì)控品。
[0巧日]表5 ΑΡ0Εε4基因檢測(cè)試劑對(duì)陽(yáng)性質(zhì)控品的擴(kuò)增Ct值
[0356]____
惦57] 從圖5-16和表3-5可W看出，ΑΡ0Εε2基因檢測(cè)試劑對(duì)ε2陽(yáng)性質(zhì)控品濃度為1.5*10? 拷貝/反應(yīng)、3*105拷貝/反應(yīng)、6*104拷貝/反應(yīng)、1.2*104拷貝/反應(yīng)、2.4*10 3拷貝/反應(yīng)、4.8* 1〇2拷貝/反應(yīng)、96拷貝/反應(yīng)時(shí)可W得到很好的擴(kuò)增，但對(duì)ε3陽(yáng)性質(zhì)控品濃度為1.5*106拷 貝/反應(yīng)、3*105拷貝/反應(yīng)時(shí)出現(xiàn)了非特異的擴(kuò)增;ΑΡ0Εε3擴(kuò)增液對(duì)ε3陽(yáng)性質(zhì)控品濃度為 1.5*106拷貝/反應(yīng)、3*105拷貝/反應(yīng)、6*104拷貝/反應(yīng)、1.2*10 4拷貝/反應(yīng)、2.4*103拷貝/反 應(yīng)、4.8*102拷貝/反應(yīng)、96拷貝/反應(yīng)時(shí)可W得到很好的擴(kuò)增，但對(duì)ε4陽(yáng)性質(zhì)控品濃度為 1.5*106拷貝/反應(yīng)時(shí)出現(xiàn)了非特異的擴(kuò)增;ΑΡ0Εε4擴(kuò)增液對(duì)ε4陽(yáng)性質(zhì)控品濃度為1.5*106拷 貝/反應(yīng)、3*105拷貝/反應(yīng)、6*10哦貝/反應(yīng)、1.2*104拷貝/反應(yīng)、2.4*10 3拷貝/反應(yīng)、4.8*102拷貝/反應(yīng)、96拷貝/反應(yīng)時(shí)可W得到很好的擴(kuò)增，但對(duì)ε3陽(yáng)性質(zhì)控品濃度為1.5*106拷貝/ 反應(yīng)時(shí)出現(xiàn)了非特異的擴(kuò)增。因此，表明ΑΡΟΕ基因檢測(cè)試劑能夠耐受總量為6*104拷貝/反 應(yīng)的其它亞型的DNA，根據(jù)陽(yáng)性質(zhì)控品的大小，換算成基因組DNA的量為2(K)ng。
[0358] W上對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行了說(shuō)明，但本發(fā)明并不W此為限，只要不脫離 本發(fā)明的宗旨，本發(fā)明還可W有各種變化。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種ApoE試劑盒，其特征在于，包括： 第一引物，所述第一引物的近3'端包含與所述兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)之一已知突變對(duì)應(yīng)的堿 基， 第二引物，所述第二引物的近3'端包含與所述兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)另一個(gè)已知突變對(duì)應(yīng)的堿 基， 核酸探針，所述核酸探針與兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)之間至少一部分對(duì)應(yīng)的核酸序列，并且所述 核酸探針具有： 發(fā)光基團(tuán)，所述發(fā)光基團(tuán)形成于所述核酸探針的5 '端， 調(diào)芐基團(tuán)，所述調(diào)芐基團(tuán)形成于所述核酸探針的3'端，并且所述調(diào)芐基團(tuán)可以調(diào)節(jié)所 述發(fā)光基團(tuán)的發(fā)光， 其中，所述預(yù)定位點(diǎn)是SNP rs429358和rs7412， 其中，所述述第一引物的近3'端包含與rs429358的已知突變對(duì)應(yīng)的堿基，所述第二引 物的近3'端包含與rs7412的已知突變對(duì)應(yīng)的堿基， 其中，所述第一引物的3'端堿基為與rs429358的已知突變對(duì)應(yīng)的堿基，所述第二引物 的3'端堿基為與rs7412的已知突變對(duì)應(yīng)的堿基， 其中，所述第一引物作為正向引物，所述第二引物作為反向引物， 其中，所述第一引物包括： 5，-CGGACATGGAGGACGTGT-3， 5，-GCGGACATGGAGGACGAGT-3， 5，-CGCGGACATGGAGGACGTTT-3， 5，-CGGACATGGAGGACGAGC-3， 5 '-GCGGACATGGAGGACGTGC-3 ' 5 '-CGCGGACATGGAGGACGTTC-3 '， 所述第二引物包括： 5 '-TGGTACACTGCCAGGTA-3 ' 5，-CTGGTACACTGCCAGTCA-3 ' 5 '-CCTGGTACACTGCCAGGCA-3 ' 5，-TGGTACACTGCCAGGCG-3 ' 5 '-CTGGTACACTGCCAGGTG-3 ' 5 '-CCTGGTACACTGCCAGTCG-3 '， 其中，所述核酸探針的長(zhǎng)度為20個(gè)核苷酸。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述核酸探針的序列為：5'_ CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-3'。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于:所述核酸探針的發(fā)光基團(tuán)為熒光基團(tuán)， 所述熒光基團(tuán)為FAM，所述調(diào)芐基團(tuán)為淬滅基團(tuán)，所述淬滅基團(tuán)為BHQ1。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒檢測(cè)最低檢出限為240個(gè)拷 貝/μL，根據(jù)換算為基因組DNA0.8ngAU，即4ng/反應(yīng)； AP0E基因檢測(cè)試劑能夠耐受總量為6*104拷貝/反應(yīng)的其它亞型的DNA，根據(jù)陽(yáng)性質(zhì)控品 的大小，換算成基因組DNA的量為200ng/反應(yīng)。5. -種如權(quán)利要求1所述的ApoE試劑盒的引物，其特征在于，所述引物包括： 第一引物，所述第一引物的近3'端包含與所述兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)之一已知突變對(duì)應(yīng)的堿 基， 第二引物，所述第二引物的近3'端包含與所述兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)另一個(gè)已知突變對(duì)應(yīng)的堿 基， 所述第一引物的近3'端包含與rs429358的已知突變對(duì)應(yīng)的堿基，所述第二引物的近3' 端包含與rs7412的已知突變對(duì)應(yīng)的堿基， 所述第一引物的3'端堿基為與rs429358的已知突變對(duì)應(yīng)的堿基，所述第二引物的3'端 堿基為與rs7412的已知突變對(duì)應(yīng)的堿基， 所述第一引物作為正向引物，所述第二引物作為反向引物， 其中，所述第一引物包括： 5，-CGGACATGGAGGACGTGT-3， 5，-GCGGACATGGAGGACGAGT-3， 5，-CGCGGACATGGAGGACGTTT-3， 5，-CGGACATGGAGGACGAGC-3， 5 '-GCGGACATGGAGGACGTGC-3 ' 5 '-CGCGGACATGGAGGACGTTC-3 '， 所述第二引物包括： 5 '-TGGTACACTGCCAGGTA-3 ' 5，-CTGGTACACTGCCAGTCA-3 ' 5 '-CCTGGTACACTGCCAGGCA-3 ' 5，-TGGTACACTGCCAGGCG-3 ' 5 '-CTGGTACACTGCCAGGTG-3 ' 5 '-CCTGGTACACTGCCAGTCG-3 '，6. -種如權(quán)利要求1所述的ApoE試劑盒的用途，其特征在于，用于確定核酸樣本的兩 個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具有已知突變。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于:所述確定核酸樣本的兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)是否具 有已知突變的方法，包括以下步驟： a. 引物設(shè)計(jì)： b. 熒光DNA分子探針設(shè)計(jì)： c. PCR反應(yīng)體系配制： d. PCR反應(yīng)體系配制： 利用第一引物和第二引物對(duì)所述核酸樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且在所述PCR擴(kuò)增體系中加 入核酸探針，所述核酸探針對(duì)應(yīng)兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)之間至少一部分的核酸序列；以及 e. 檢測(cè)反應(yīng)體系的發(fā)光， f. 數(shù)據(jù)分析與結(jié)論： 以便確定所述核酸樣本的預(yù)定位點(diǎn)是否存在已知突變。8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于： 其中，所述第一引物的近3'端包含與所述兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)之一已知突變對(duì)應(yīng)的堿基， 所述第二引物的近3 '端包含與所述兩個(gè)預(yù)定位點(diǎn)另一個(gè)已知突變對(duì)應(yīng)的堿基， 所述第一引物和第二引物之一作為正向引物，所述第一引物和所述第二引物的另一個(gè) 作為反向引物， 所述核酸探針具有： 發(fā)光基團(tuán)，所述發(fā)光基團(tuán)形成于所述核酸探針的5 '端， 調(diào)芐基團(tuán)，所述調(diào)芐基團(tuán)形成于所述核酸探針的3'端，并且所述調(diào)芐基團(tuán)可以調(diào)節(jié)所 述發(fā)光基團(tuán)的發(fā)光， 其中，所述核酸樣本來(lái)源于人體組織或細(xì)胞、重組核酸或轉(zhuǎn)基因生物組織細(xì)胞， 其中，所述預(yù)定位點(diǎn)是SNP rs429358和rs7412， 其中，所述述第一引物的近3'端包含與rs429358的已知突變對(duì)應(yīng)的堿基，所述第二引 物的近3'端包含與rs7412的已知突變對(duì)應(yīng)的堿基， 其中，所述第一引物的3'端堿基為與rs429358的已知突變對(duì)應(yīng)的堿基，所述第二引物 的3'端堿基為與rs7412的已知突變對(duì)應(yīng)的堿基， 其中，所述第一引物作為正向引物，所述第二引物作為反向引物， 其中，所述第一引物包括： 5，-CGGACATGGAGGACGTGT-3， 5，-GCGGACATGGAGGACGAGT-3， 5，-CGCGGACATGGAGGACGTTT-3， 5，-CGGACATGGAGGACGAGC-3， 5 '-GCGGACATGGAGGACGTGC-3 ' 5 '-CGCGGACATGGAGGACGTTC-3 '， 所述第二引物包括： 5 '-TGGTACACTGCCAGGTA-3 ' 5，-CTGGTACACTGCCAGTCA-3 ' 5 '-CCTGGTACACTGCCAGGCA-3 ' 5，-TGGTACACTGCCAGGCG-3 ' 5 '-CTGGTACACTGCCAGGTG-3 ' 5 '-CCTGGTACACTGCCAGTCG-3 '。 其中，所述核酸探針的長(zhǎng)度為20個(gè)核苷酸。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于:所述核酸探針的序列為： 5 '-CAGCTCCTCGGTGCTCTGGC-3 '。10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的用途，其特征在于:所述核酸探針的發(fā)光基團(tuán)為熒光基團(tuán)，所 述熒光基團(tuán)為FAM，所述調(diào)芐基團(tuán)為淬滅基團(tuán)，所述淬滅基團(tuán)為BHQ1。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK106011298SQ201610629197
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年8月3日
【發(fā)明人】許華曦, 卜國(guó)軍, 張含
【申請(qǐng)人】廈門(mén)人瑞生物醫(yī)藥科技有限公司