核酸的擴增和/或檢測方法、試劑盒及所述方法的應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及擴增和/或檢測方法，其用于防止含有希望擴增的感興趣的核酸的液體生物學樣品中的污染物，所述方法包括如下步驟：a)對所述生物學樣品進行化學或者酶促處理，以使得所述感興趣的核酸的一種類型的堿基轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N類型的堿基；b)加入擴增引物，用以特異性擴增所述轉(zhuǎn)變的感興趣的核酸，每種引物由三種不同類型的堿基組成；c)在這些處理之后，在所述生物學樣品中加入擴增所必需的試劑，如水溶液、溶劑、核苷酸、酶，以及預先合成的所述引物；d)將所述溶液和試劑置于使得轉(zhuǎn)變的核酸被擴增和/或被檢測的條件下。本發(fā)明還涉及應用所述方法的試劑盒，以及涉及所述方法或者所述試劑盒在特異性擴增和檢測細菌、真細菌、真菌、泛真菌(pan-fungal)、病毒或者酵母靶中的應用。本發(fā)明優(yōu)選用在診斷領域中。
【專利說明】核酸的擴増和/或檢測方法、試劑盒及所述方法的應用
[0001] 本發(fā)明是申請日為2010年1月4日，申請?zhí)枮?01080004048.X，標題為"核酸的擴增 和/或檢測方法、試劑盒及所述方法的應用"的專利申請的分案申請。
[0002] 本發(fā)明設及一種擴增方法，其用于防止含有希望擴增的感興趣的核酸的液體生物 學樣品中的污染物，在運種方法中，處理所述生物學樣品W使得所述感興趣的核酸的一種 堿基轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N堿基，W及導入特異于轉(zhuǎn)變的核酸的引物和檢測探針。本發(fā)明還設及應 用所述方法的試劑盒，W及所述方法或者試劑盒在特異性擴增和檢測細菌、真細菌、真菌、 泛真菌(pan-fungal )、病毒或者酵母祀中的應用。
[0003] 分子生物學的進步已經(jīng)使其可W操作核酸。目前體外基因擴增方法在生物學診斷 中成為必不可少的工具，例如使得已知DNA或者RNA序列可W被大量拷貝，在相對短的時間 內(nèi)W十億的數(shù)量級倍增。運些技術的主要缺點是不希望的核酸被擴增，導致錯誤的結(jié)果，即 甚至在不存在所尋找的祀的情況下出現(xiàn)陽性結(jié)果。運些被稱作由于污染所致的假陽性。
[0004] 通過PCR(聚合酶鏈反應）、NASBA(基于核酸序列的擴增）、TMA(轉(zhuǎn)錄介導的擴增)或 者擴增遺傳學材料的任何其它技術擴增細菌祀是一種靈敏性技術，其要求使用沒有所有痕 量污染核酸的水溶液、酶、試劑等W及塑料容器。事實上，由于運些技術的靈敏性，運些污染 核酸可W被擴增，并且可W產(chǎn)生假陽性，顯著降低了診斷檢驗的可靠性。在細菌或者真菌擴 增情況中運是真實存在的，甚至在泛細菌(也稱作真細菌（eubacterial))和泛真菌擴增中 更明顯，其中使用的引物(和探針)能擴增(及檢測)大多數(shù)細菌或者真菌祀。此外，在運種特 殊的情況中，用于生產(chǎn)擴增試劑盒的大多數(shù)試劑衍生自天然來源(核巧酸、酶等），因此外源 核酸污染的潛在危險較高。因此，在用于評估生物學樣品中細菌污染水平并通過擴增進行 的檢測中，由于使用的一些酶衍生自細菌克隆并提供可能被擴增的核酸，因此會系統(tǒng)地產(chǎn) 生陽性結(jié)果，導致錯誤的診斷。
[0005] 運種污染也可W來自環(huán)境及來自去污不良的設備，例如：實驗工作臺、實驗人員、 設備W及移液裝置，甚至是塑料容器。
[0006] 已經(jīng)實施了針對限制運些污染的一些建議。運些建議包括例如設及樣品處理(特 別是滅菌技術)或者實驗設備(物理上分隔的工作帶，使用排風罩，在外部和內(nèi)部之間的壓 力梯度，W便流體總是使得W希望的方向排出等)的預防方法。
[0007] 正如已經(jīng)提及的，不可忽略的污染源存在于實際用于擴增反應的原材料中，如酶、 試劑、塑料容器中。因此，Corless C.E.等描述了化q聚合酶的污染對于檢測RNA 16S的實時 PCR靈敏性的不利影響（J.Clin.Microbiol. ; (2000) ;May;38(5): 1747-52)。
[000引糾正擴增所需的酶污染第一種方式是酶促去污染方法。
[0009]由Aslikenas S.et al.(Biotechniques;2005;Jul. ;39(1) :69-73)描述的酶促方 法包括對含有擴增必需的所有元素的溶液進行去污染。運種方法包括在RT-PCR范圍內(nèi)使用 限制酶混合物。運些酶使含有待擴增的祀RNA的擴增反應混合物中存在的雙鏈DNA降解。然 后在發(fā)生逆轉(zhuǎn)錄時，通過加熱使其失活。因此也描述了運種方法在存在祀雙鏈DNA的情況中 的另一種PCR應用，但是限于使用單一類型的限制酶(Type IIS RE)。然而，使用限制酶具有 僅使雙鏈脫氧核糖核酸片段化的缺點，所述雙鏈脫氧核糖核酸必須具有所用酶的特定限制 位點。因此，沒有除去單鏈形式的和/或具有極少運種限制位點的污染成分。
[0010] 去污染的其它酶促方法包括在與核酸祀位接觸之前從溶液中防止不希望的核酸。 專利申請W0-A-99/07887描述了在與核酸祀位接觸之前使用不耐熱的DNase降解反應混合 物中包含的雙鏈脫氧核糖核酸。然后通過加熱使所述酶失活。運種技術的主要缺點是在反 應混合物中通過加熱使運種酶失活需要使用耐熱聚合酶。此外，反應混合物中存在的試劑 也可W由于溫度而改變。
[0011] 現(xiàn)有技術還提示處理試劑或者原材料的非酶促方法。
[0012] 因此，Mohammadi T.et al.(J.Clin.Microbiol. ;2003;0ct. ;41(10):4796-8)描 述了一種技術，其包括試劑的柱過濾，用于在擴增之前提取及任選通過限制酶Sau3AI消化 PC時式劑。過濾技術的缺點是運些技術不能用于復合的培養(yǎng)基而不改變其濃度或者性質(zhì)。此 夕h運種技術不能除去塑料容器上存在的污染物。
[0013] 專利申請W0-A-94/12515描述了使用光反應性化合物處理含有化q聚合酶及潛在 污染核酸的溶液的方法。運種光反應性化合物，如巧喃香豆素(furocoumarin)衍生物，通過 暴露于紫外線而活化。除了其限制性應用之外，運種技術的主要缺點是由于所述核酸的隨 機降解而不是非常有效，W及其可W產(chǎn)生仍可被擴增的片段。運種技術的另一缺點是其僅 對使用的化q聚合酶的酶制備物去污染。核酸擴增方法需要的其它試劑如水、緩沖液、塑料 容器等必須通過其它方法去污染。運樣需要耗時且可能昂貴的其它操作。
[0014] 由Delehanty J.B.et al.，（RNA. ;2005;May; 11(5) :831-6)描述的另一非酶促方 法應用鉆復合物W抑制翻譯。運種復合物使得DM和RNA的憐酸二醋鍵水解。
[0015] 運種技術的主要缺點是核酸的不完全降解W及緩慢的去污染反應(24小時）。
[0016] 本
【申請人】的專利申請W0-A-2008/132412描述了通過金屬馨合劑使核巧酸序列失 活的方法。在擴增步驟之后，片段化復合物，如雙（1，10-菲咯嘟)/化，用于對溶液存在的所 有核酸去污染。運樣使得可W避免新樣品被得自先前擴增反應的擴增子污染。
[0017] 在第一種應用的情況中，運個方法的主要問題是其未真正使所有污染核酸降解， 而僅降解得自先前擴增反應的擴增子。另一方法必須在運個方法上游及并行使用，W除去 核酸擴增反應需要的原材料污染。
[0018] 因此仍然需要簡便且有效的技術針對感興趣的核酸處理生物學溶液或者液體生 物學樣品，W便極大地降低或者甚至消除進行核酸擴增需要的所有試劑W及設備上存在的 污染物的影響。運也使得不必使用常規(guī)技術對試劑和環(huán)境去污染，運些技術非常復雜且通 常無效，且存在再污染的危險。
[0019] 本發(fā)明人因此提議用于處理含有感興趣的核酸的溶液的一種完全新的方法，其不 是對擴增反應的擴增試劑包括原材料直接去污染，而是使擴增絕對特異于初始生物學樣品 中存在的感興趣的祀核酸。
[0020] 為此，
【申請人】因此提議使用化學或者酶試劑修飾生物學樣品的祀核酸的序列，W 轉(zhuǎn)變感興趣的核酸。運種操作可W就在擴增之前但是在加入擴增需要的試劑進行所述擴增 之前進行。然后利用適于特異性雜交于轉(zhuǎn)變的祀的引物和檢測探針進行擴增和檢測步驟， 所述引物和檢測探針不特異性雜交于衍生自例如試劑或者水或者塑料容器等的任何污染 成分。運種方法使得在提取祀直至對其擴增期間不必對使用的所有試劑和設備進行去污 染。
[0021] 根據(jù)第一個實施方案，本發(fā)明設及一種擴增方法，其用于防止含有感興趣的希望 擴增的核酸的液體生物學樣品中的污染物，所述方法包括如下步驟：
[0022] a)對所述生物學樣品進行化學或者酶促處理，W使得所述感興趣的核酸的一種類 型的堿基轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N類型的堿基；
[0023] b)加入擴增引物，用W特異性擴增所述轉(zhuǎn)變的感興趣的核酸，每種引物由Ξ種不 同類型的堿基組成；
[0024] C)在運些處理之后，向所述生物學樣品加入擴增所必需的試劑，如水溶液、溶劑、 核巧酸、酶，W及預先合成的所述引物；
[0025] d)將所述溶液和試劑置于使得轉(zhuǎn)變的核酸被擴增的條件下。
[00%]根據(jù)第二個實施方案，本發(fā)明還設及一種檢測方法，其用于防止含有希望擴增和 檢測的感興趣的核酸的液體生物學樣品中的污染物，所述方法包括如下步驟：
[0027] a)對所述生物學樣品進行化學或者酶促處理，W使得所述感興趣的核酸的至少一 種類型的堿基轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N類型的堿基；
[0028] b)加入擴增引物和檢測探針，分別用W擴增和用W檢測從感興趣的核酸的擴增獲 得的擴增子，每種引物和探針由Ξ種不同類型堿基組成；
[0029] C)向所述生物學樣品加入擴增和檢測所需的試劑，如水溶液、溶劑、核巧酸、酶，W 及預先合成的所述引物和探針；
[0030] d)將所述溶液和試劑置于使得轉(zhuǎn)變的核酸被擴增W及產(chǎn)生的擴增子被檢測的條 件下。
[0031] 無論使用哪種先前的方法，根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案，在步驟a)和b)之 間進行至少一個純化步驟。
[0032] 無論使用哪種先前的方法，也根據(jù)本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案，在步驟a)之前 進行至少一個提取所述液體生物學樣品中包含的核酸的提取步驟。
[0033] 根據(jù)前述任一實例，所述擴增引物對于轉(zhuǎn)變的感興趣的核酸或者與其互補的那些 核酸具有特異性。
[0034] 根據(jù)本發(fā)明方法的第二個實施方案，所述檢測探針對于轉(zhuǎn)變的祀核酸及擴增子具 有特異性。
[0035] 在所有前述實例及根據(jù)一個特定的實施方案，由Ξ種不同類型的堿基組成的所述 引物和/或探針含有至少一個修飾的核巧酸。
[0036] 根據(jù)最后的實施方案，所述修飾的核巧酸選自α-寡核巧酸、PNA、LNA、2 ' -0-烷基核 糖核巧酸。
[0037] 根據(jù)運個最后的實施方案，所述修飾的核巧酸是2'-0-甲基核糖核巧酸。
[0038] 在所有前述實例中，使得一種類型的堿基轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N類型的堿基的轉(zhuǎn)變是通過 含硫化學劑的作用實現(xiàn)的。
[0039] 在所有前述實例中，使得一種類型的堿基轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N類型的堿基的化學劑含有 亞硫酸氨根離子（HS03-)，如亞硫酸氨鋼（NaHS〇3)、亞硫酸氨錠（NH4HS03)、亞硫酸氨儀 (Mg服〇3)、焦亞硫酸鋼(化2S2O日）、亞硫酸氨鋼（sodium hy化ogen sulfite)或者亞橫酸。
[0040] 根據(jù)所述方法的另一實施方案，使得一種類型的堿基轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N類型的堿基的 酶劑是胞喀晚脫氨酶。
[0041] 根據(jù)所述方法的另一實施方案，所述化學或者酶促處理包括使一種類型的堿基轉(zhuǎn) 變?yōu)槟蚩ν砘?。
[0042] 根據(jù)所述方法的再一實施方案，所述化學或者酶促處理包括使胞喀晚(C)轉(zhuǎn)變?yōu)?尿喀晚化）。
[0043] 根據(jù)所述方法的運個最后的實施方案，與轉(zhuǎn)變的感興趣的核酸雜交的第一引物由 腺嚷嶺(A)、胞喀晚(C)和/或胸腺喀晚(T)形成，W及與所述第一引物延伸所得的鏈雜交的 第二引物由腺嚷嶺(A)、鳥嚷嶺(G)和/或胸腺喀晚(T)形成。
[0044] 可W使用酶劑代替化學劑，所述酶劑可W使得一種類型的堿基轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N類型 的堿基;運種酶劑優(yōu)選是腺巧脫氨酶。
[0045] 根據(jù)運個最后的新實施方案，所述酶促處理包括使腺嚷嶺(A)轉(zhuǎn)變?yōu)榇吸S嚷嶺。
[0046] 在酶劑的情況中，與轉(zhuǎn)變的感興趣的核酸雜交的第一引物由腺嚷嶺(A)、胞喀晚 (C)和/或鳥嚷嶺(G)形成，W及與所述第一引物延伸所得的鏈雜交第二引物由胞喀晚(C)、 鳥嚷嶺(G)和/或胸腺喀晚(T)形成。
[0047] 無論使用上述何種方法，W及根據(jù)第一個實施方案，進行的擴增是RT-PCR擴增。
[0048] 無論使用上述何種方法，W及根據(jù)第二個實施方案，進行的擴增是對單鏈進行的 PCR擴增。
[0049] 無論使用上述何種方法，W及根據(jù)第Ξ個實施方案，進行的擴增是對雙鏈進行的 PCR擴增。
[0050] 在后者的情況中，所述擴增是利用特異于轉(zhuǎn)變的感興趣的核酸的每條鏈的兩對擴 增引物實現(xiàn)的。
[0051] 無論使用上述何種方法，W及根據(jù)第四個實施方案，進行的擴增是轉(zhuǎn)錄后擴增，如 NASBA 或者 TMA。
[0052] 在所有上述情況中，感興趣的核酸是脫氧核糖核酸(DNA)和/或核糖核酸(RNA)。
[0053] 本發(fā)明還設及用于實施上述方法的試劑盒，特征在于其包含：
[0054] a.使得所述感興趣的核酸的至少一種類型的堿基轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N類型的堿基的物 質(zhì)；
[0055] b.擴增引物，及任選存在的檢測探針，其適合于轉(zhuǎn)變的感興趣的核酸或者產(chǎn)生的 擴增子，運些序列由Ξ種不同類型的堿基組成；
[0056] C.擴增及任選地檢測需要的試劑，如水溶液、溶劑、核巧酸、酶。
[0057] 根據(jù)所述試劑盒的一個實施方案，所述轉(zhuǎn)變物質(zhì)選自亞硫酸氨鋼(化HS化）、亞硫 酸氨錠（NH4HSO3)、亞硫酸氨儀（M巧S〇3)、焦亞硫酸鋼（Na2S2〇5)、亞硫酸氨鋼（sodium hy化ogen sulfite)或者亞橫酸。
[0058] 根據(jù)所述試劑盒的另一個實施方案，所述物質(zhì)選自腺巧脫氨酶或者胞喀晚脫氨 酶。
[0059] 本發(fā)明最后設及上述方法或者上述試劑盒在擴增和檢測真細菌和/或真菌和/或 病毒和/或酵母祀中的應用。
[0060] 根據(jù)不同的應用，所述擴增引物特異于細菌的屬，且每種檢測探針特異于至少一 個菌種。
[0061 ]如下術語可W單數(shù)或者復數(shù)形式任意使用。
[0062] 術語"試劑"、"擴增試劑"、"提取試劑"或者"純化試劑"或者"原材料"是指運樣的 試劑，如進行核酸提取、純化或者酶促擴增反應所需的反應緩沖液、酶、一憐酸核巧、溶劑、 ±h πττ. ο
[0063] "容器"或者"塑料容器"在本發(fā)明中是指任何容器，如試管、錐形瓶或者移液器吸 管尖，無論其是否是塑料(例如化pendorf管)還是玻璃或者任何其他材料。
[0064] "核酸"在本發(fā)明中是指至少兩個核巧酸的序列，優(yōu)選選自如下四種類型遺傳密碼 核巧酸的至少十個核巧酸，即
[0065] 如果所述核酸是DNA，則選自：
[0066] dAMP (脫氧腺巧5'-一憐酸）
[0067] dGMP(脫氧鳥巧5'-一憐酸）
[006引 dTMP(脫氧胸巧5'-一憐酸），w及
[0069] dCMP(脫氧胞巧5'-一憐酸）；
[0070] 如果所述核酸是RNA，則選自：
[0071] AMP(腺巧 5'-一憐酸）
[0072] GMP(尿巧 5'-一憐酸）
[0073] IMP(尿巧 5'-一憐酸），W及
[0074] CMP (胞巧 5'-一憐酸）。
[00巧]所述核酸也可任選地包含至少一個肌巧和/或至少一個修飾的核巧酸。術語"修飾 的核巧酸"在本發(fā)明中是指運樣的核巧酸，例如具有修飾的堿基、脫氧尿巧、二氨基-2,6-嚷 嶺、漠-5-脫氧尿巧或者任何其它修飾的堿基的至少一種核巧酸，優(yōu)選除了 5-甲基胞喀晚之 夕K所述核酸也可W在核巧酸間鍵水平修飾，如硫代憐酸醋、H-憐酸醋、烷基憐酸醋，在主鏈 水平修飾，如α-寡核巧酸（FR-A-2,607,507)或者聚酷胺核酸（PMAKEgholm M.et al.; J. Am. Chem. Soc. ; 1992; 114; 1895-97)或者2 ' -0-烷基-核糖核巧酸和/或2 ' -0-氣代核巧酸 和/或2'-胺核巧酸和/或阿拉伯糖核巧酸，W及LNA(Sun B.W.et al.，Biochemist巧；2004; Apr 13; 43 (14): 4160-69)。在2 ' -0-烷基-核糖核巧酸中，優(yōu)選2 ' -0-甲基-核糖核巧酸，但是 也可W使用5-丙烘基喀晚寡核巧酸（Seitz 0.,Angewandte Chemie International Edition 1999;38(23);Dec:3466-69)。
[0076] 術語"核巧酸"是指核糖核巧酸或者脫氧核糖核巧酸。
[0077] 在本發(fā)明中，"生物學樣品"或者"液體生物學樣品"是指可含有核酸的任何樣品。 后者可提取自患者的組織、血、血清、唾液或者循環(huán)細胞，或者可W衍生自農(nóng)產(chǎn)品或者食物 產(chǎn)品，或者可W源于環(huán)境。提取是通過本領域技術人員已知的任何方案進行，例如根據(jù)專利 EP-B-0，369，063所述分離方法進行。
[0078] "污染物"或者"污染酸"或者"污染核酸"或者"污染成分"在本發(fā)明中是指其擴增 是不希望的且在檢測期間可產(chǎn)生假陽性結(jié)果的任何核酸。
[0079] 術語"亞硫酸氨鹽(bisulfite)"在本發(fā)明中是指其反應組分是亞硫酸氨根離子的 任何化學試劑。本領域技術人員能例如使用亞硫酸氨鋼(化服化）、亞硫酸氨錠(畑4服〇3)、亞 硫酸氨儀(M巧S〇3)、焦亞硫酸鋼(化2S2O日）、亞硫酸氨鋼（sodium hy化ogen sulfite)或者亞 橫酸作為所述化學試劑。優(yōu)選所述化學試劑是焦亞硫酸鋼。
[0080] "擴增"或者"擴增反應"是指本領域技術人員熟知的任何核酸擴增技術，如：
[0081 ] -PCR(聚合酶鏈反應），在專利US-A-4，683，195、US-A-4，683，202和US-A-4，800， 159中描述，W及其衍生的RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄PCR)，尤其是一步形式的RT-PCR，其在專利6?-8- 0，569，272中描述。優(yōu)選使用單一引物對對單鏈進行PCR。
[0082] -LCR(連接酶鏈反應），例如在專利申請EP-B-0，201，184中掲示，
[0083] -RCR(修復鏈反應），在專利申請W0-A-90/01069中掲示，
[0084] -3SR(自主序列復制），在專利申請W0-A-90/06995中描述，
[0085] -NASBA(基于核巧酸序列的擴增），在專利申請W0-A-91/02818中描述，
[0086] -TMA(轉(zhuǎn)錄介導的擴增），在專利US-5，399，491中描述，和
[0087] -RCA(滾環(huán)擴增），在專利US-6，576，448中描述。
[0088] -RT-PCR(逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應）。
[0089] 在本發(fā)明中，"祀"或者"核酸祀"或"核祀(nucleic ta巧etr或者"感興趣的祀"或 者"感興趣的核酸"是指待擴增和/或檢測的核酸(寡核巧酸、多核巧酸、核酸片段、核糖體 RNA、信使RNA、轉(zhuǎn)移RNA)。所述祀可W自細胞提取或者化學合成。所述祀可W游離于溶液中 或者可W結(jié)合固體支持物。
[0090] 術語"溶液"是指均質(zhì)或者異質(zhì)水溶液。
[0091] "固體支持物"是指顆粒，其可W是橡膠、玻璃(CPG)、二氧化娃、聚苯乙締、瓊脂糖、 瓊脂糖（Sepharose)、尼龍等。運些材料可任選使得磁性材料包囊。其也可W是濾膜、薄膜、 膜或者條帶。運些材料為本領域技術人員熟知。
[0092] 祀可W是WDNA和/或RNA的單鏈或者雙鏈形式存在于混合物中的病毒、細菌、真菌 或者酵母的核酸。通常地，所述祀的長度在50-10000個核巧酸之間，但是最通常在100-1000 個核巧酸之間。
[0093] 術語"天然祀"，稱作CNT，在本發(fā)明中是指待擴增的祀核酸，由至少四種核巧酸的 核巧酸序列組成，所述核巧酸的堿基是四種不同類型的堿基，選自：腺嚷嶺、鳥嚷嶺、胞喀晚 和胸腺喀晚(對于DNA而言）或者尿喀晚(對于RNA而言）。任選地，可W存在如先前所述修飾 的核巧酸。當然，使得CNT擴增的所謂的天然引物被稱作PNT1和PNT2。如果同時存在幾個擴 增，則所述引物例如被稱作PNTla和PNT2a(對于第一對引物)及PNT化和PNT2b(對于第二對 引物)。
[0094] 術語"轉(zhuǎn)變的祀"或者"四種堿基的祀"稱作C4B，是指祀或者祀核酸已經(jīng)用化學劑 或者酶劑處理，使得由核巧酸攜帶的一種類型的堿基轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N不同類型堿基。核巧酸 的數(shù)目和順序不被所述化學劑或者酶劑的作用改變。所述轉(zhuǎn)變的祀核酸(C4B)因此具有與 未轉(zhuǎn)變的祀核酸(CNT)相同的核巧酸總數(shù)，但是由其中至少一種類型的堿基被改變?yōu)榱硪?種類型的堿基的核巧酸序列組成。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)變的祀由具有選自如下類型的堿基的核 巧酸序列組成:腺嚷嶺、胸腺喀晚、鳥嚷嶺、尿喀晚、胞喀晚和次黃嚷嶺。
[00M]所述四種堿基祀可因此是已經(jīng)由亞硫酸氨鹽轉(zhuǎn)變的待擴增的祀核酸，即：
[0096] ?腺嚷嶺、鳥嚷嶺和胸腺喀晚未改變，但是胞喀晚被轉(zhuǎn)變?yōu)槟蚩ν恚▽τ贒NA而 言)。
[0097] ?腺嚷嶺、鳥嚷嶺和尿喀晚未改變，但是胞喀晚也被轉(zhuǎn)變?yōu)槟蚩ν恚▽τ赗NA而 言）。在運種情況中，所述轉(zhuǎn)變使得可W獲得具有Ξ種堿基的轉(zhuǎn)變的祀，天然存在的尿喀晚 保持未改變，而胞喀晚被轉(zhuǎn)變?yōu)槟蚩ν?。該RNA由僅具有Ξ種類型堿基的核巧酸序列組成， 即腺嚷嶺、鳥嚷嶺和尿喀晚。
[0098] 為了簡化使用的術語，術語C4B用于描述轉(zhuǎn)變的DNA祀（四種堿基），但是也用于描 述轉(zhuǎn)變的RNA祀(Ξ種堿基）。在任何情況中，運不影響使用上游引物稱作P3B1及下游引物稱 作P3B2的特異性引物從C4B開始的祀核酸的擴增，所述擴增子C3B總是具有Ξ種堿基（見下 文）。同樣，在多重擴增的情況中，所述特異性引物被稱作P3Bla和P3Blb(對于上游引物而 言），及被稱作P3B2a和P3B2b(對于下游引物而言）。
[0099] 運種轉(zhuǎn)變可應用胞喀晚脫氨酶，其中：
[0100] ?腺嚷嶺、鳥嚷嶺和胸腺喀晚不改變，但是胞喀晚被轉(zhuǎn)變?yōu)槟蚩ν恚▽τ贒NA而 言)。
[0101] ?腺嚷嶺、鳥嚷嶺和尿喀晚未改變，而胞喀晚也被轉(zhuǎn)變?yōu)槟蚩ν恚▽τ赗NA而言） (見專利EP-B-1，654,388所述）。在運種情況中，轉(zhuǎn)變使得可W獲得具有Ξ種堿基的轉(zhuǎn)變的 祀，天然存在的尿喀晚保持未改變，而胞喀晚被轉(zhuǎn)變?yōu)槟蚩ν怼Ｔ揜NA由僅具有Ξ種類型堿 基的核巧酸序列組成，即腺嚷嶺、鳥嚷嶺和尿喀晚。同樣，為了簡化所用術語，術語C4B也用 于描述轉(zhuǎn)變的RNA祀。在任何情況中，運不影響使用上游引物稱作P3B1及下游引物稱作P3B2 的特異性引物從C4B開始的祀核酸的擴增，所述擴增子C3B仍然具有Ξ種堿基(見下文）。
[0102] 運種轉(zhuǎn)變可應用腺巧脫氨酶，其中：
[0103] ?胞喀晚、鳥嚷嶺和胸腺喀晚不改變，但是腺嚷嶺被轉(zhuǎn)變?yōu)榇吸S嚷嶺(對于DNA而 言)。
[0104] ?胞喀晚、鳥嚷嶺和尿喀晚不改變，但是腺嚷嶺被轉(zhuǎn)變?yōu)榇吸S嚷嶺（對于RNA而 言)。
[0105] 就此可W提及文獻Gerber A.P.et al.Science;1999;Nov 5;286(5442):1146- 49。
[0106] 術語"Ξ種堿基的祀"稱作C3B，在本發(fā)明中是指利用上游（或者正向）引物稱作 P3B1W及下游(或者反向）引物稱作Ρ3Β2的特異性引物從C4B中擴增的祀核酸，如下文描述。
[0107] 術語"堿基的類型"是指堿基的種類，即腺嚷嶺(Α)、或者胸腺喀晚(Τ)、或者胞喀晚 (C)、或者鳥嚷嶺(G)、或者尿喀晚(U)，或者次黃嚷嶺，不論事實其與核糖相關(任選是取代 的，例如通過2 甲基基團的存在）W及任選具有1、2或者3個憐酸基團。
[0108] "Ξ種堿基的引物"稱作Ρ3Β1和Ρ3Β2,在本發(fā)明中是指由修飾或未修飾的至少Ξ種 核巧酸組成的單鏈核巧酸序列，由選自腺嚷嶺、胸腺喀晚、鳥嚷嶺、胞喀晚的Ξ種不同類型 堿基組成。所述Ξ種堿基的有義引物(Ρ3Β1)與轉(zhuǎn)變的祀核酸(C4B)的至少一部分序列互補， 或者與自反義引物開始合成的核酸(擴增子)的至少一部分核巧酸序列互補，并且在存在擴 增試劑條件下作為核酸合成的起始點。所述反義Ξ種堿基的引物(Ρ3Β2)與從有義引物合成 的核酸的至少一部分核巧酸序列互補。運些引物的大小在10-100個核巧酸之間，優(yōu)選在12- 50個核巧酸之間，更優(yōu)選在15-30個核巧酸之間。
[0109] 根據(jù)使用的擴增技術，除了與轉(zhuǎn)變的祀的雜交序列之外，在NASBA或者ΤΜΑ型轉(zhuǎn)錄 后擴增的情況中，引物還可包含啟動子(例如Τ3、?7或者SP6)的核巧酸序列。本領域技術人 員熟知在運些轉(zhuǎn)錄后擴增的情況中，引物由運樣的序列的一部分組成，即所述序列的核巧 酸序列由四種不同類型堿基的核巧酸組成（啟動子序列），W及所述序列的核巧酸序列由Ξ 種不同類型堿基的核巧酸組成(使得引物與轉(zhuǎn)變的祀雜交的序列）。
[0110] "檢測探針"或者"探針"稱作SNT，是指選自腺嚷嶺、胸腺喀晚、鳥嚷嶺、尿喀晚、胞 喀晚的四種不同類型堿基的核巧酸序列的核酸序列，其能與擴增子特異性雜交且攜帶至少 一種標記物。所述探針可W是圓形探針(稱作0-探針，見本
【申請人】在2008年7月4日提交的專 利申請FR08/54549)、分子信標、了泌imatt露探針或者FRET探針。后Ξ種類型的探針為本領域 技術人員熟知。運些探針可任選完全或者部分由修飾的核巧酸組成。每種探針具有一種標 記物及任選一種巧滅劑。
[0111] "標記物"是指由核巧酸攜帶的分子。所述標記物與核巧酸之間的鍵合可W通過本 領域技術人員已知的各種方式實現(xiàn)。人工偶聯(lián)是使用攜帶活性基團、典型為簇基或者硫醇 的標記物進行，其與修飾攜帶相應反應基團（例如胺或者硫醇）的修飾的內(nèi)部核巧酸偶聯(lián)， 或者與用運些相同的反應基團修飾的核巧酸鏈的一端偶聯(lián)。自動偶聯(lián)是使用攜帶所述標記 物的亞憐酷胺進行，然后根據(jù)使用的亞憐酷胺的類型在核巧酸鏈的自動合成期間與鏈的一 端或者與內(nèi)在部位發(fā)生偶聯(lián)。所述標記物可W是巧光團或者巧光巧滅劑。
[0112] "巧光團"是指當通過適當波長的光激發(fā)時發(fā)出巧光信號的分子。所述巧光團特別 地可W是羅丹明（rhodamine)或者衍生物如德克薩斯紅（Texas Red)、巧光素或者衍生物 (例如FAM)、Alexa家族巧光團如Alexa 532和Alexa 647、Alexa 405、Alexa 700、Alexa 680、切5或者根據(jù)使用的測量儀器的合適的任何其它巧光團?？捎糜跈z測探針的巧光團非 常各式各樣并且為本領域技術人員已知。
[0113] 在本發(fā)明中，"巧光素"是指芳香族化學分子，當其由490-5(K)nm波長、優(yōu)選495nm波 長的光激發(fā)時發(fā)出巧光信號，最大發(fā)射在大約530nm。
[0114] "巧光巧滅劑"或者"巧滅劑"是指干擾巧光團發(fā)出巧光的分子。運種巧滅劑可選自 非巧光芳香族分子，W避免寄生發(fā)射。優(yōu)選地，所述巧滅劑是化bsyl或者化bcyl或者"Black hole quencher?"(Bffii)，其是非巧光芳香族分子，當其物理上接近巧光團時阻止巧光發(fā)射。 也可W使用巧光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET)技術，如Fluorescent Energy Transfer Nucleic Acid Probes，p.4，Ed.V.V.Didenko，Humana Press 2006JSSN 1064-3745所述。所述巧滅 劑也可W選自巧光分子，如TAMRA(簇基四甲基若丹明）。
[0115] "Ξ種堿基的檢測探針"或者"Ξ種堿基的探針"稱作S3B，是如前述的探針，并且其 除了前述特性之外，還是由選自腺嚷嶺、胸腺喀晚、鳥嚷嶺、胞喀晚的Ξ種不同類型堿基的 核巧酸序列組成。本領域技術人員易于理解，根據(jù)探針的形式(分子信標(Beacon)，0-探針 等），所述探針由運樣的序列的一部分組成，即所述序列的核巧酸序列由四種不同類型堿基 組成，W及所述序列的核巧酸序列由Ξ種不同類型堿基組成(使得擴增子雜交和檢測的序 列）。
[0116] 在某些情況中，為了改良與擴增子的雜交及因此的檢測，如果必要則本發(fā)明的探 針可含有尿喀晚代替胸腺喀晚。在運種情況中，本發(fā)明的探針由具有四種不同類型堿基(尿 喀晚、鳥嚷嶺、腺嚷嶺、胸腺喀晚）的核巧酸序列組成。為了簡化使用的術語，術語"Ξ種堿基 的探針"或者S3B也用于描述需要更好雜交的運種類型的探針。在任何情況中，運不影響C3B 擴增子和/或互補鏈C3Bc的檢測，所述C3B和C3Bc擴增子總是具有Ξ種堿基(見上文所述）。
[0117] 為了更好地理解本發(fā)明的原理，我們采用了其假定序列如下所示(SEQ ID No. 1) 的祀作為實例，其相應于CNT。在用亞硫酸氨鹽轉(zhuǎn)變的范圍內(nèi)，所述4種堿基的祀、3種堿基的 祀W及引物和探針具有如下序列：
[0118] · CNT:5'-ATCGAAATTTCCCGGGATCG-3'，沈Q ID No.1
[0119] · C4B:5'-ATUGAAATTTUUUGGGATUG-3'，沈Q ID No.2
[0120] · P3B1:3 '-TAAC-5 '，SEQ ID No.3
[0121] · C3B:3 '-TAACTTTAAAAAACCCTAAC-5 '，SEQ ID No.4
[0122] · P3B2:5 '-ATTG-3 '，沈Q ID No.5，W及
[0123] · S3B:3'-AAAAAA-5'，沈Q ID No.6。
[0124] C3B因此與C3Bc互補：
[01 巧] · C3B:3'-TAACTTTAAAAAACCCTAAC-5'，SEQ ID No.4 [01 %] · C3Bc:5'-ATTGAAATTTTTTGGGATTG-3'，沈Q ID No.7
[0127] 其與CNT完全不同：
[0128] · CNT: 5，-ATCGAAATTTCCCGGGATCG-3，，沈Q ID No. 1 [01 巧] .C3Bc: 5，-ATTGAAATTTTTTGGGATTG-3，，沈Q ID No. 7
[0130] "雜交"是指運^的過程此期1?在合適條件下，具有完全或者部分互補序列的 兩個單鏈核巧酸片段能形成由核酸堿基之間的氨鍵穩(wěn)定的雙鏈或者"雙鏈體"。所述雜交條 件由嚴格性確定，即嚴格和低鹽度運行條件。當用較高嚴格性條件進行時，雜交的特異性增 加。嚴格性特別地定義為探針/祀雙鏈體的堿基成分的函數(shù)W及通過兩個核酸之間的錯配 而定義。嚴格性也可W是反應參數(shù)的函數(shù)，如雜交溶液中存在的離子的濃度和類型、變性劑 的性質(zhì)和濃度和/或雜交溫度。其中雜交反應必定進行的條件的嚴格性主要依賴于使用的 雜交探針。所有運些數(shù)據(jù)均為本領域技術人員熟知，且可W由技術人員確定適當條件。
[0131] 術語"Ceq"定義為細胞當量，是在真細菌PCR擴增中使用的一個單位，其相應于 1000拷貝的DNA。一個細胞可含有大約103個拷貝的RNA16S(真細菌引物和探針的祀）。
[0132] 實施例和附圖代表本發(fā)明的具體實施方案，不限制本發(fā)明的范圍。
[0133] -圖1示出在擴增之前應用亞硫酸氨鋼轉(zhuǎn)變核酸祀的步驟的優(yōu)勢。如果擴增是常規(guī) 進行的，即使用天然祀(未轉(zhuǎn)變的祀，在圖中被稱作天然的或者CNT)及使用正常核巧酸引物 (在圖中被稱作PNT1和PNT2)進行，則擴增混合物中天然存在的污染物任選與感興趣的祀共 擴增。相反，如果在圖中被稱作C4B的祀在擴增之間被轉(zhuǎn)變，W及使用針對轉(zhuǎn)變的祀設計的 被稱作P3B1和P3B2的Ξ種堿基的核巧酸引物進行擴增，則僅運個特定祀將被擴增和檢測。 盡管仍存在于溶液中，但是污染物不能被擴增。事實上，本發(fā)明的引物，Ξ種堿基的引物 P3B，不能與具有四種不同類型堿基的的核巧酸的污染核酸雜交，甚至不能非特異性雜交。 從轉(zhuǎn)變的祀C4B開始的擴增反應提供在圖中被稱作C3B的擴增子，然后提供與C3B鏈互補的 C3Bc。本發(fā)明對于細菌、真細菌、真菌、泛真菌、病毒或者酵母的祀的擴增(NASBA、PCR、RT- PCR、TMA等)特別有益。
[0134] -圖2描述了使得胞喀晚堿基轉(zhuǎn)變?yōu)槟蚩ν韷A基的化學反應（根據(jù)化yatsu H.; Mut. Research; 2008; 659:77-82所述進行）。
[0135] -圖3示出通過具有電噴霧離子化化SI)的質(zhì)譜分析對DNA組分的分析譜。運個分析 在由亞硫酸氨鋼轉(zhuǎn)變之前(a)和之后(b)對DNA祀進行。橫坐標示出W分鐘表示的時間，縱坐 標示出任意單位的吸光度。M+H值表示分子的分子量，其中加入了 1摩爾質(zhì)子的質(zhì)量。例如， 脫氧胞喀晚的存在通過出現(xiàn)相應于運個分子的質(zhì)量而證實。
[0136] -圖4是在用不同類型擴增引物(如前述PNT或者P3B)進行的真細菌NASBA擴增中陰 性對照(所述祀用水代替）的對比。擴增子的檢測通過測量在488皿的巧光而實時實現(xiàn)，所述 巧光W任意單位(相對巧光單位RFU)在縱坐標上示出；橫坐標示出W分鐘表示的經(jīng)過時間 (elapsed time)。實驗條件(a)相應于用引物(PNT)和天然檢測探針（SNT)進行的陰性對照 的擴增和檢測。實驗條件(b)相應于用Ξ種堿基的引物(P3B)和Ξ種堿基的檢測探針（S3B) 進行的陰性對照的擴增和檢測。
[0137]-圖5是當轉(zhuǎn)變的祀是雙鏈DNA時根據(jù)本發(fā)明原理的PCR擴增示意圖。需要兩個引物 對P3B進行該擴增。
[013引-圖6示出在真細菌NASBA擴增中系列稀釋的祀的對比。擴增子的檢測通過在488nm 測量作為時間(分鐘，橫坐標)的函數(shù)的巧光(任意單位RFU，縱坐標)而實時實現(xiàn)。
[0139] .圖6A:由四種不同類型堿基組成的合成祀(CNT)的〇-1〇67拷貝的稀釋系列的擴 增（引物PNT)和檢測(探針SNT)。
[0140] ?圖6B:由Ξ種不同類型堿基組成的合成祀(C3Bc)的0-1(Τ7拷貝的稀釋系列的擴 增（引物Ρ3Β)和檢測(探針S3B)。
[0141] -圖7示出真細菌PCR擴增。擴增子的檢測通過在每個循環(huán)結(jié)束時測量在488nm的巧 光(任意單位RFU)而實現(xiàn)。橫坐標示出循環(huán)次數(shù)，縱坐標示出任意單位的巧光。
[0142] ?圖7A:由四種不同類型堿基組成的合成祀(CNT)的0-10巧拷貝的稀釋系列的擴 增（引物PNT)和檢測(探針SNT)。
[0143] ?圖7B:由Ξ種不同類型堿基組成的合成祀(C3Bc)的0-10巧拷貝的稀釋系列的擴 增（引物P3B)和檢測(探針S3B)。
[0144] -圖8示出大腸桿菌的曲NA的系列稀釋物的真細菌PCR擴增。擴增子的檢測如已經(jīng) 提及的通過在每個循環(huán)結(jié)束時測量在488nm的巧光而實現(xiàn)。如前所述，橫坐標示出循環(huán)次 數(shù)，縱坐標示出任意單位的巧光。
[0145] ?圖8Α:0-1(Τ5拷貝的大腸桿菌的曲NA的稀釋系列的擴增（引物PNT)和檢測(探針 SNT)〇
[0146] .圖8B:通過用亞硫酸氨鹽處理而轉(zhuǎn)變的0-10巧拷貝的大腸桿菌的曲NA(C4B)的 稀釋系列的擴增（引物P3B)和檢測(探針S3B)。
[0147] 參考圖1和圖2,更準確地，如下所述進行通過亞硫酸氨鋼對祀進行轉(zhuǎn)變。運是包括 四步驟的方案：
[0148] (1)首先，轉(zhuǎn)變自用氨氧化鋼(化0H)使所述祀變性開始，然后加入亞硫酸氨鋼和氨 釀(后者可限制亞硫酸氨鹽的氧化）。
[0149] (2)然后通過柱過濾純化所述祀。
[0150] (3)在堿性介質(zhì)中對所述祀進行脫橫酸化。
[0151] (4)最后，最后的柱純化提供準備擴增的轉(zhuǎn)變的祀。
[0152] 現(xiàn)有技術領域已知通過亞硫酸氨鹽對核酸的化學轉(zhuǎn)變。關于此，發(fā)現(xiàn)如下證據(jù)：
[0153] 1)由化apiro及由化yatsu進行的非常早期的工作，其中：
[0154] · "Reaction of Cytosine and Uracil with sodium bisulfite"Shapiro R.et al.J.Biol.Chem.;1973;Jun;248:4060-64,
[0155] · "The addition of sodium bisulfite to uracil and to cytosine"Hayatsu H.et al.,J.Am.Qiem.Soc.;1970;40(26):724-26。
[0156] 運證明了在運個領域已經(jīng)公布了許多文獻，但是在那時未確切定義診斷學應用。
[0157] 2)設及用亞硫酸氨鹽處理DNA的專利申請，使用非簡并引物擴增屬于同一原始種 的一套核酸：
[015 引?細菌(W0-A-2006/058393 和 W0-A-2007/140506)，
[0159] ?病毒(W0-A-2007/030882)。
[0160] 3)用亞硫酸氨鹽處理核酸W檢測DNA基因組序列的甲基化基序的方法的改良，" High Sensitivity mapping of methylated cytosines"by Clark S.J.,Nucleic.Acids Res.；1994August 11；Vol.22(15):299〇-97〇
[0161] 4)用亞硫酸氨鹽處理核酸的新開發(fā)的方法，所述處理適合固定在固體支持物上的 核酸化P-B-1，590，362和EP-A-1，394，173)。
[0162] 5)概括本領域用亞硫酸氨鹽處理核酸W對基因組DNA進行測序及鑒別甲基化胞喀 晚基序狀況的出版物。運個概要由亞硫酸氨鹽技術的開發(fā)者描述：Hayatsu H.， Mut. Research；2008；659:77-82 〇
[0163] 因此明了使用亞硫酸氨鹽進行轉(zhuǎn)變的化學在35年前已經(jīng)充分描述。相反，用于在 祀核酸的提取、純化和擴增期間使用的試劑所致污染核酸的化學或者酶促轉(zhuǎn)變方法確定未 描述或者甚至未提及。
[0164] 我們的發(fā)明因此設及轉(zhuǎn)變的祀的特異性擴增，而無由于污染核酸所致的背景噪 音。
[0165] 本發(fā)明的目的因此是提供具有如下優(yōu)勢的一種方法：
[0166] 1)簡便且快速，
[0167] 2)就在擴增步驟之前可使用，
[016引3)能W高產(chǎn)量轉(zhuǎn)變祀，
[0169] 4)與眾多的擴增技術包括PCRW及所謂的轉(zhuǎn)錄后擴增(NASBA和TMA)相容，
[0170] 5)可W自動進行，且可W適合固體和/或磁性支持物。
[017。實嫌例】；通過亞硫酸氮鹽轉(zhuǎn)變核酸靴的證實
[017。 目的:
[0173] 為了證實亞硫酸氨鹽使具有四種不同類型堿基A、T、G、C的生物學祀（即A(腺嚷 嶺）、Τ(胸腺喀晚）、G(鳥嚷嶺)和C(胞喀晚））轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂兴姆N堿基A、T、G和U(尿喀晚）的祀。
[0174] 程序:
[01 巧]所述轉(zhuǎn)變是使用商購試劑盒ZYM0-EZ DNA Methylation-GoldTM Kit，ZYM0 Research,#D5005(0range,CA 92867-United States of America),根據(jù)該試劑盒提供的 方案進行。
[0176] 被轉(zhuǎn)變的祀是從大腸桿菌〇157，#IRMM449-化A，Sigma-Al化ich 化imie(L'Isle d'Abeau化esnes-FRANCE)中提取的具有500-4000個雙鏈核巧酸的基因組DM商購樣品。
[0177] 通過亞硫酸氨鹽轉(zhuǎn)變:根據(jù)所述試劑盒提供的方案，將13化1的CT轉(zhuǎn)化試劑加入20 μ1樣品（相應于從大腸桿菌中提取的200ng基因組DNA)中。將混合物在98°C保溫10分鐘，W 使大腸桿菌的基因組祀變性，然后在64°C保溫150分鐘及在4°C保溫5分鐘（Thermocycler Applied Biosystems GeneAmp 9700,Foster City,U.S.A.)。由此提供了含有轉(zhuǎn)變的革己的 溶液。
[0178] 純化:將在該試劑盒中被稱作結(jié)合緩沖液的60化1固定緩沖液加入15化1含有轉(zhuǎn)變 的祀的溶液中。將該混合物置于所述試劑盒提供的柱上，并在l〇,〇〇〇Xg離屯、30秒。將10化1 體積的洗涂緩沖液置于柱上，在12，000 X g離屯、30秒。
[0179] 脫橫酸化:將20化1體積的脫橫酸化緩沖液置于同一柱上，在室溫保溫15分鐘，然 后在12，000 X g離屯、30秒。然后通過加入20化1洗涂緩沖液將該柱洗涂兩次，及在12，000 X g 離屯、30秒。
[0180] 洗脫:將該柱置于清潔的管中。在該柱的中屯、加入稱作M-洗脫緩沖液的10μ1體積 的洗脫緩沖液，在12,000 Xg離屯、30秒。1化1洗脫液含有通過亞硫酸氨鹽轉(zhuǎn)變的DNA，準備用 于擴增。
[0181] 然后將轉(zhuǎn)變的大腸桿菌曲NA樣品用核酸酶Pl(13U)(N8630-lVL，SigmaAl化ich， St Louis，U.S.A.)和堿性憐酸酶(3U)(P7923-2KU，Sigma A1 化ich，St Louis，U.S.A.)的混 合物在37 °C水解過夜。然后通過HPLC分析水解的基因組DM。
[01劇 HPLC及通過電噴霧離子化質(zhì)譜分析檢測的條件
[0183] 為此，我們使用：
[0184] · WATERS Alliance 2795HPLC鏈（Milford,Connecticut(CT)USA)，
[01 化] · WATERS XTerra MS C18柱（Milford,CT，USA)4.6X30 2.5μπι，使用在30°C流速 為1ml/分鐘（在260nm檢測），在lOmM甲酸錠pH 7中的乙臘的線性梯度：0%-5%(4分鐘）、 5%-12%(5 分鐘）、12%-90%(2 分鐘)及 90%-0%(3 分鐘）。
[01 化]· PDA 996二極管陣列檢測儀，軟件Empower第二版(Milford,CT，USA)，
[0187] ?質(zhì)量檢測儀（ZQ Electrospray WATERS((Milford，CT,USA)。
[01則結(jié)論:
[0189] 圖3(a)示出通過電噴霧離子化化SI)質(zhì)譜分析對未用亞硫酸氨鹽轉(zhuǎn)化的大腸桿菌 中水解的曲NA組分的分析結(jié)果。可見四個主要的峰，相應于四種類型的核巧:脫氧腺巧dA、 脫氧胸巧dT、脫氧鳥巧dG、脫氧胞巧dC，及痕量的脫氧肌巧dl。脫氧肌巧來自腺巧脫氨酶對 脫氧腺巧的酶促作用。腺巧脫氨酶是在商業(yè)堿性憐酸酶制備物中W痕量水平發(fā)現(xiàn)的污染 物。
[0190] 圖3(b)示出對在通過亞硫酸氨鹽轉(zhuǎn)變后來自大腸桿菌的水解的曲NA的組分的分 析。在此出現(xiàn)一個新的洗脫峰（峰7)，相應于脫氧尿巧dU，W及幾乎消失的（quasi- disappearance)dC峰（峰2)。其它洗脫峰（峰3、4和5)未變，相應于dG、dT和dA的存在。運個層 析圖示出運個DNA由四種核巧組成，即加、dA、dT和dG。
[0191] 在運個實施例中，運些實驗條件中的轉(zhuǎn)變效率是80%。運個效率是待處理的感興 趣的DNA大小的函數(shù)。對DNA的短片段，轉(zhuǎn)變程度(或者效率水平)更高。在我們的實驗條件下 處理的DNA是來自大腸桿菌的基因組DNA，即較長的祀DNA，非常難W變性和轉(zhuǎn)變。然而，已經(jīng) 證實大多數(shù)dC轉(zhuǎn)變?yōu)榧印?br>[0192] 實施例2;使用四種堿基的(PNT)或者蘭種堿基的(P3B)擴增引物從Ξ種或 回卻髓基跑合虛苗_塞接昔遭麵稱值_-_?逃…祖-_g皿稀釋 NASBA擴增
[OIW] 目的:
[0194]為了提供證據(jù)，即證實使用Ξ種堿基的引物(P3B1和P3B2)和堿基探針（S3B)進行 的真細菌NASBA可W擴增及特異性檢測Ξ種堿基的合成祀，而不擴增天然祀(CNT)，如污染 的細菌祀。
[01Μ]利用四種堿基的檢測探針(SNT)或者Ξ種堿基的檢測探針(S3B)實現(xiàn)實時檢測。 [01%] 程序:
[0197] 運個檢驗通過進行真細菌NASBA擴增而進行，一方面使用：
[0198] -稱作CNT的四種堿基的寡核巧酸祀的稀釋系列，四種堿基的引物（稱作ΡΝΤ1和 ΡΝΤ2)及四種堿基的檢測探針(SNT)，所述四種類型的堿基是A、T、G和C;
[0199] 另一方面使用：
[0200] -稱作C3B的Ξ種堿基的寡核巧酸祀的稀釋系列，引物(P3B1和P3B2)及可W與C3B 雜交Ξ種堿基的檢測探針(S3B)。
[0201] 所述稀釋系列是每個檢驗0-107拷貝的祀。
[0202] 所述寡核巧酸祀、引物和探針W其本身從Eu;rogentec,Seraing,Belgium定制，未 被亞硫酸氨鹽轉(zhuǎn)變，并具有如下所示序列：
[0203] |ECNT(SEQ ID No.8)：
[0204] 5'-TGGAGCATGTGGTTTAATTCGCTACAACTGTCGTCAGCTCGTGTTCCGCGGGATGTTGGGTTAAGT CCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCT-3',
[0205] 引物PNTl(沈Q ID No.9):
[0206] 5 ' -aattc1:aatacgactcactataggGCGGGACTTAACCCAACATC-3 '
[0207] 引物PNT2(沈Q ID No.lO):
[0208] 5，一邑邑a邑cat邑t邑邑tttaattc邑一3，
[0209] 檢測探針SNT(SEQ ID No.ll):
[0^0] 5 ' -FM-Cgatc巧WTCGTCAGCTCGTGTcgatcg-Dabcy 1-3 '，W=2 ' -0-Me-鳥巧。
[0211] 祀C3B(沈Q ID No. 12):
[0212] 5'-TGGAGTATGTGGTTTAATTTGTTATAATTGTTGTTAGTTTGTGTTTTGTGGGATGTTGGGTTAAGT TTTGTAATGAGTGTAATTTTTATTTT-3'
[0213] 引物P3B1(SEQ ID No.l3):
[0214] 5' -aattc1:aatacgactcactataggACAAAACTTAACCCAACATC-3 '
[0215] 引物P3B2(SEQ ID No.l4):
[0216] 5'-GGAGTATGTGGTTTAATTTG-3'
[0217] 檢現(xiàn)臘針S3B(沈Q ID No. 15):
[021 引 5 ' -FM-cgatc巧WTTGTTAGTTTGTGTcgatcg-Dabsy 1-3 '，W=2 ' -0-Me-鳥巧。
[0219] 在運些序列中，啟動子T7的序列相應于小寫字母所示，檢測探針是分子信標，環(huán)的 序列W大寫字母表示，莖的序列W粗體的小寫字母表示。
[0220] 根據(jù)試劑盒NASBA NucliSENS EasyQ HIV-lvl.2(Ref.285 036，bioM紅ieux, Marcy ΓE：toi 1 e，F(xiàn)rance)中提供的廠商指導進行NASBA。簡而言之，如下所述制備擴增混合 物(Mix)和酶混合物。
[0221] 擴增混合物(8管的量）：
[0222] · NASBA級別的水，稱作NASBA水，11.化1，
[0223] .試劑稀釋劑:6化1
[0224] ·κα:12^
[0225] ?試劑的sphere: Isphere
[0226] ?引物與探針的混合物:祉1。
[0227] 酶混合物(8個試管的量）：
[022引 ?酶稀釋劑:45μ1(8個試管），及
[02巧]?酶sphere: Isphere。
[0230] 設置：將10μ1體積的擴增混合物置于0.2-ml試管中，向其中加入扣1體積的祀核 酸。將化1體積的酶混合物置于該管的塞子中。將該管蓋上，在65Γ保溫5分鐘，然后在4rC 保溫5分鐘。將該管不攬拌簡短離屯、，W組合運兩種混合物，然后在NucliSens EasyQ巧光計 (Ref. 200309 ,bioM紅ieux,Ma;rcy 1 'litoile ,France)中在41 °C保溫90分鐘（標準程序QL1- 90)。在反應期間在488nm讀取巧光。
[0231] 發(fā)現(xiàn)相應于圖4曲線(a)的祀CNT的NASBA擴增使污染核酸非常強地擴增，而在在四 種堿基的祀的NASBA擴增情況中，在圖4曲線(b)中的該信號保持非常弱。運個結(jié)果證實幾乎 沒有引物P3B1和P3B2對污染物的擴增，及幾乎沒有通過探針S3B對其檢測。
[0232] 圖6A示出使用引物PNT1和PNT2進行的NASBA擴增沒有使得特定祀CNT(每個檢驗的 濃度為0-1 〇7個拷貝）與陰性對照組(每個檢驗0個拷貝）有所區(qū)別。
[0233] 相反，使用引物P3B1和P3B2對Ξ種堿基的祀C3B進行的NASBA擴增（圖她良好的 檢測靈敏性給出的特定祀C3B的稀釋系列。在運個實施例中，靈敏性是每個檢驗103個拷貝。 [OZ34]結(jié)論:
[0235] 驗清晰示出運種對Ξ種堿基的祀的擴增的益處，使得祀的檢測靈敏性增加 大約4個對數(shù)級。在祀CNT的NASBA擴增中，陰性對照物通過相應于大約1〇67拷貝/檢驗的信 號鑒別，而在祀C3B的NASBA擴增中運個信號低于1(Τ3拷貝/檢驗。
[0236] 連施例3;使用ΡΝΤ或Ρ3Β弓懶從蘭種或四種堿基的合成氣核昔酸範巧瑜 釋系列實施真細菌PCR擴增
[ΟΖ37]目的:
[0238]為了證實在通過使用特異于Ξ種堿基的祀(C3B)的Ξ種堿基的引物(Ρ3Β)進行真 細菌PCR擴增之后，使得Ξ種堿基的合成的細菌祀(C3B)的檢測靈敏性相對于通過使用四種 堿基的引物(ΡΝΤ)和四種堿基的探針(SNT)對天然祀(CNT)進行真細菌PCR擴增增加。
[ΟΖ39]程序:
[0240] 使用稱作Taqmaii飯、SNT或S3B的巧光檢測引物和探針進行真細菌PCR擴增。所述 祀是具有92個核巧酸的合成的寡核巧酸，具有四種堿基的序列(對于CNT是A、T、G、C;SEQID No. 8)或者Ξ種堿基的序列(對于C3B是A、T、G; SEQ ID No. 12)。對0-105拷貝/檢驗的不同稀 釋度的祀進行擴增。
[0241] 根據(jù)試劑盒 Ro che Li ghtCyc 1 er Fas t Star t DNA Mas ter Hy probe , # 030003248001(Basle，Switzerland)中提供的廠商指導進行擴增。使用的引物和探針的序 列如下所示：
[02創(chuàng)對天然祀，祀CNT進行PCR:
[0243] ?引物PNTla(SEQ ID No.16):
[0244] 5 '-AGGATAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGG-3 '
[0245] ?引物PNT2a(SEQ ID No.l7):
[0246] 5，-TGGAGCATGTGGTTTMTTC-3，
[0247] ?探針Taq-Man飯SNTa(沈Q ID N〇.18):
[0248] 5'-FAM-TWTCGTCAGCTCGTGT-BHQl-3'with W=2'-〇Me-G
[0249] 對Ξ種堿基的祀，祀C3B進行PCR:
[0巧0] ?引物P3Bla(沈Q ID No.19):
[0巧 1 ] 5，-AAAATAAAAATTACACTCATTACAAA-3 '
[0巧2] ?引物P3B2a(沈Q ID No.20):
[0253] 5'-TGGAGTATGTGGTTTAATTT-3'
[0巧4] ?引物TaqMan飯S3Ba(沈Q ID N〇.21):
[0巧5] 5，-FM-TGTTGYYKWYYYGTGT-BHQl-3，，Υ = 2，-OMe-U，W=2，-OMe-G，Κ = 2，-OMe-A。
[0256] 核巧酸2'-0-Me使得可W補償雜交溫度的喪失(與Ξ種堿基的探針的序列中C堿基 的消失相關）。運個TaqMan?探針的設計中尿喀晚(在運種情況下是修飾的尿喀晚）的點 導入使得可W改良與擴增子的雜交。
[0257] 擴增混合物(一個管）：
[0巧引 ?用于PCR的水：10.化1
[0巧9] ?引物Ρ1(1〇μΜ):化1
[0260] ?引物Ρ2(10μΜ):化1 惦61] ?探針（2.5μΜ):化1
[0%2] · MgCl2(化化 1
[0%3] ?擴增混合物（lOXMaster Mix):化 1.
[0264] 將最終的擴增混合物在95°C預保溫10分鐘，然后進行45次循環(huán)擴增，所述循環(huán)包 括在95°C變性10秒鐘，在50°C雜交15秒鐘，及在60°C延伸15秒鐘。通過在95°C保溫5分鐘終 止擴增。在延伸循環(huán)期間在530nm讀取巧光。
[0265] 圖7A示出在低于每個檢驗103個拷貝CNT祀的條件下，PCR信號與陰性對照(0個拷 貝）的信號不能區(qū)分。真細菌PCR對于CNT祀的靈敏性因此是103個拷貝/檢驗。
[0266] 在圖7B中，對Ξ種堿基的寡核巧酸祀(C3B)進行的真細菌PCR示出與陰性對照(0個 拷貝/檢驗)保持水平曲線的極佳靈敏性，靈敏性高于10個拷貝/檢驗。
[0267] 結(jié)論:
[0268] 驗證實對Ξ種堿基的合成祀C3B使用真細菌PCR擴增增加靈敏性4個對數(shù) 級。
[0269] Ξ種堿基的祀擴增的靈敏性不依賴于使用的擴增技術和檢測方式。運些實驗示出 無論使用的擴增技術和Ξ種堿基的檢測探針的形式如何，本發(fā)明的Ξ種堿基的祀的擴增靈 敏性遠高于天然祀(CNT)的常規(guī)擴增的靈敏性。
[0270] 集施側(cè)4;巧實通過紐菌DNA鞭的轉(zhuǎn)變巧儘巧P3技引物的PCR擴增増化 靈敏性 腳1] 目的:
[0272]在對合成模型(實施例2和3)的證實之后，對通過亞硫酸氨鹽實驗性轉(zhuǎn)變的真實生 物學模型進行測定。目的是證實細菌祀在轉(zhuǎn)變及使用特異于轉(zhuǎn)變的祀的P3B擴增引物進行 PCR擴增后，檢測靈敏性增加。 腳引程序:
[0274] 運個證實是使用商購轉(zhuǎn)變試劑盒(幻mo Research)并根據(jù)該試劑盒供應商的指導 進行(參見實施例1)。所述轉(zhuǎn)變是對大腸桿菌(〇157,51旨111曰1觀1449-164)的基因組0魁提取 物進行，其由50-4000個核巧酸的核酸組成。W與實施例3所述那些相同的實驗條件、相同引 物和相同檢測探針進行真細菌PCR擴增。在延伸循環(huán)期間在530nm讀取巧光。
[0275] 圖8A相應于其中來自大腸桿菌的祀DNA未用亞硫酸氨鹽處理的實驗條件。該DNA因 此由具有四種不同類型堿基即A、T、G和C的核巧酸序列組成。該DNA的擴增產(chǎn)生由四種不同 類型堿基(A、T、G和C)的序列組成的擴增子。
[0276] 圖8B相應于其中來自大腸桿菌的DNA在用亞硫酸氨鹽處理后被轉(zhuǎn)變的實驗條件。 運種轉(zhuǎn)變的DNA(4種堿基的轉(zhuǎn)變的祀）由具有四種不同類型堿基即A、T、G、U的核巧酸序列組 成。使用本發(fā)明的引物(3種堿基的引物)轉(zhuǎn)變的該DNA的擴增產(chǎn)生由具有Ξ種不同類型堿基 A、T、C或者A、T、G的核巧酸序列組成的擴增子。
[0277] 如圖8A所示，在來自大腸桿菌的未轉(zhuǎn)變的DNA的真細菌PCR擴增的情況中，靈敏性 水平為lOOOCeq/檢驗。在OCeq/檢驗的陰性對照與lOOCeq/檢驗分不清。運個圖示出在低于 100，000個拷貝的祀DNA的闊值下，不能區(qū)分祀DNA與使用的各種試劑中存在的污染DNA。
[0278] 圖8B示出在通過亞硫酸氨鹽對樣品進行轉(zhuǎn)變及真細菌PCR擴增之后，獲得的靈敏 性水平為0.1-lCeq/檢驗。陰性對照提供非常弱的信號。運個實驗證實本發(fā)明的方法使得可 W規(guī)避所有污染物，因此獲得靈敏性的顯著增加。
[0279] 此外，盡管在我們的實驗條件下來自大腸桿菌的基因組DNA的轉(zhuǎn)變效率是80% (見 上述），但是檢測靈敏性相對較高，且不出現(xiàn)受未轉(zhuǎn)變的20%的大腸桿菌基因組DNA的影響。 因為運20 %的基因組DNA在其堿基類型水平未改變，其自動變成污染物且不被本發(fā)明的方 法擴增。
[0280] 結(jié)論:
[0281] 對通過亞硫酸氨鹽轉(zhuǎn)變的細菌DNA祀進行真細菌PCR擴增的運個實施例清晰證實 通過對樣品進行運種處理可W增加靈敏性。事實上，所述靈敏性增加4個對數(shù)級。通過應用 預先用亞硫酸氨鹽處理的擴增技術，得自陰性對照的信號可W關閉（turned off),即使轉(zhuǎn) 變處理的效率水平未接近100%。
[0282] 因此本發(fā)明提供了完全避免在提取、純化和擴增試劑中存在的細菌污染物的選擇 方法。
【主權項】
1. 一種特異性擴增方法在防止含有希望擴增的感興趣的核酸的液體生物學樣品中的 污染物中的用途，所述方法包括如下步驟： a) 對所述生物學樣品進行化學或者酶促處理，以使得所述感興趣的核酸的一種類型的 堿基轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N類型的堿基； b) 加入擴增引物，用以特異性擴增所述轉(zhuǎn)變的感興趣的核酸，每種引物由三種不同類 型的堿基組成，所述引物包含至少一個選自α-寡核苷酸、PNA、LNA、2 ' -0-烷基核糖核苷酸的 修飾的核苷酸； c) 在這些處理之后，向所述生物學樣品加入擴增所必需的試劑，如水溶液、溶劑、核苷 酸、酶，以及預先合成的所述引物； d) 將所述溶液和試劑置于使得轉(zhuǎn)變的核酸被擴增的條件下， 其中所述擴增絕對特異于初始生物學樣品中存在的感興趣的靶核酸。2. -種特異性檢測方法在防止含有希望擴增及檢測的感興趣的核酸的液體生物學樣 品中的污染物中的用途，所述方法包括如下步驟： a) 對所述生物學樣品進行化學或者酶促處理，以使得所述感興趣的核酸的至少一種類 型的堿基轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N類型的堿基； b) 加入擴增引物及檢測探針，分別用以擴增及檢測從感興趣的核酸的擴增所獲得的擴 增子，每種引物和探針由三種不同類型的堿基組成，所述引物包含至少一個選自α-寡核苷 酸、PNA、LNA、2 ' -0-烷基核糖核苷酸的修飾的核苷酸； c) 向所述生物學樣品加入擴增和檢測所需的試劑，如水溶液、溶劑、核苷酸、酶，以及預 先合成的所述引物和探針； d) 將所述溶液和試劑置于使得所述轉(zhuǎn)變的核酸被擴增及產(chǎn)生的擴增子被檢測的條件 下， 其中所述擴增絕對特異于初始生物學樣品中存在的感興趣的靶核酸。3. 權利要求1或2的用途，特征在于在步驟a)和b)之間進行至少一個純化步驟。4. 權利要求1-3任一項的用途，特征在于在步驟a)之前進行至少一個提取所述液體生 物學樣品中包含的核酸的步驟。5. 權利要求1-4任一項的用途，特征在于所述擴增引物對所述轉(zhuǎn)變的感興趣的核酸或 者與其互補的那些核酸具有特異性。6. 權利要求2的用途，特征在于所述檢測探針對所述轉(zhuǎn)變的靶和所述擴增子具有特異 性。7. 權利要求1或2的用途，特征在于所述修飾的核苷酸是2 ' -0-甲基核糖核苷酸。8. 權利要求1-7任一項的用途，特征在于使得一種類型的堿基轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N類型的堿 基的所述化學處理是通過含硫化學劑的作用實現(xiàn)的。9. 權利要求1-8任一項的用途，特征在于使得一種類型的堿基轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N類型的堿 基的化學劑含有亞硫酸氫根離子(HSOf)，如亞硫酸氫鈉(NaHS0 3)、亞硫酸氫銨(NH4HS03)、亞 硫酸氫鎂(MgHS〇3)、焦亞硫酸鈉(Na2S2〇5)、亞硫酸氫鈉 （sodium hydrogen sulfite)或者亞 磺酸。10. 權利要求1-7任一項的用途，特征在于使得一種類型的堿基轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N類型的堿 基的酶劑是胞嘧啶脫氨酶。11. 權利要求1-10任一項的用途，特征在于所述化學或者酶促處理包括使一種類型的 堿基轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?U)。12. 權利要求1-11任一項的用途，特征在于所述化學或者酶促處理包括使胞嘧啶(C)轉(zhuǎn) 變?yōu)槟蜞奏?U)。13. 權利要求12的用途，特征在于與轉(zhuǎn)變的感興趣的核酸雜交的第一引物由腺嘌呤 (A)、胞嘧啶(C)和/或胸腺嘧啶(T)組成，與所述第一引物延伸所得的鏈雜交的第二引物由 腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)和/或胸腺嘧啶(T)組成。14. 權利要求1-7任一項的用途，特征在于使得一種類型的堿基轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N類型的堿 基的酶劑是腺苷脫氨酶。15. 權利要求14的用途，特征在于所述酶促處理包括使腺嘌呤(A)轉(zhuǎn)變?yōu)榇吸S嘌呤。16. 權利要求14和15的用途，特征在于與轉(zhuǎn)變的感興趣的核酸雜交的第一引物由腺嘌 呤(A)、胞嘧啶(C)和/或鳥嘌呤(G)組成，與所述第一引物延伸所得的鏈雜交的第二引物由 胞嘧啶(C)、鳥嘌呤(G)和/或胸腺嘧啶(T)組成。17. 權利要求1-16任一項的用途，特征在于進行的擴增是RT-PCR擴增。18. 權利要求1-17任一項的用途，特征在于進行的擴增是對單鏈進行的PCR擴增。19. 權利要求1-17任一項的用途，特征在于進行的擴增是對雙鏈進行的PCR擴增。20. 權利要求19的用途，特征在于所述擴增是通過兩對擴增引物實現(xiàn)的，所述引物特異 于轉(zhuǎn)變的感興趣的核酸的每條鏈。21. 權利要求1-16任一項的用途，特征在于進行的擴增是轉(zhuǎn)錄后擴增，如NASBA或者 TMAo22. 權利要求1-22任一項的用途，特征在于感興趣的核酸是脫氧核糖核酸(DNA)和/或 核糖核酸(RNA)。23. 試劑盒在防止含有真細菌和/或真菌和/或病毒和/或酵母的核酸的液體生物學樣 品中的污染物，以擴增和檢測真細菌和/或真菌和/或病毒和/或酵母靶中的非診斷性用途， 其中所述試劑盒包含： a. 使得至少一種類型的堿基轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪环N類型的堿基的物質(zhì)； b. 擴增引物及任選存在的檢測探針，其適合于轉(zhuǎn)變的感興趣的核酸或者產(chǎn)生的擴增 子，所述引物和探針由三種不同類型的堿基組成，所述引物包含至少一個選自寡核苷酸、 PNA、LNA、2 ' -0-烷基核糖核苷酸的修飾的核苷酸； c. 擴增所需的試劑及任選存在的檢測所需的試劑，如水溶液、溶劑、核苷酸、酶， 其中所述擴增絕對特異于初始生物學樣品中存在的感興趣的靶核酸。
【文檔編號】C12Q1/68GK106011310SQ201610370995
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2010年1月4日
【發(fā)明人】A·拉尤, A·特勒施
【申請人】生物梅里埃公司