一組1型和新血清型鴨肝炎病毒的rt-pcr鑒別診斷引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一組區(qū)別1型和新血清型鴨肝炎病毒的RT?PCR鑒別診斷引物，所述引物序列如SEQ ID NO.1?2所示。該引物根據(jù)1型和新血清型鴨肝炎病毒全基因組序列的3’?端核苷酸序列存在差異來設(shè)計，該組引物在擴增1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒的特異性擴增區(qū)域核苷酸序列存在長短差異來進行鑒別診斷，其中1型鴨肝炎病毒擴增片段大小為258bp左右，新血清型鴨肝炎病毒擴增片段大小為321bp左右。利用本發(fā)明所述引物的鑒定方法操作簡單快速，準確率高，僅需一組引物就能區(qū)分1型和新血清型鴨肝炎病毒感染類型，為水禽業(yè)健康養(yǎng)殖提供技術(shù)保證。
【專利說明】
-組1型和新血清型鴨肝炎病毒的RT-PCR鑒別診斷引物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于獸醫(yī)傳染病快速診斷技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一組區(qū)別1型鴨肝炎病毒和 新血清型鴨肝炎病毒的RT-PCR鑒別診斷引物。
【背景技術(shù)】
[0002] 1型鴨肝炎病毒(Duck hepatitis virus type 1，DHV-1)是由鴨肝炎病毒引起的 一種急性、高度接觸性傳染病，主要侵害3周齡內(nèi)維鴨，W肝炎為典型特征。該病發(fā)病急、病 程短、發(fā)病率和死亡率高，嚴重威脅養(yǎng)鴨業(yè)健康發(fā)展[楊維星，施少華，陳紅梅，等.3株鴨肝 炎病毒1型全基因序列分析[J].中國農(nóng)學通報，2010,26(14) :8-12.]。
[0003] 1999年中國農(nóng)業(yè)大學蘇敬良等從發(fā)病的北京鴨和樓桃谷鴨中分離到2株與1型鴨 肝炎病毒無血清學相關(guān)性的鴨肝炎病毒新血清型（Duck hepatitis virus new serotype， DHV-N)。本團隊施少華等對鴨肝炎病毒新血清型DHV-N G株進行了基因組序列測定，發(fā)現(xiàn)鴨 肝炎病毒新血清型G株和鴨肝炎病毒1型的5'UTR和3'UTR相比，發(fā)生了較大的插入與缺失現(xiàn) 象，并明確鴨肝炎病毒1型和新血清型存在較大差異[施少華，程龍飛，傅光華，等.鴨肝炎病 毒新血清型基因組序列分析[J].微生物學報，2009,49(3):309-315.]。
[0004] 目前，關(guān)于1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒病原學檢測的RT-PCR鑒別診斷 方法均有相關(guān)報道。但相關(guān)方法均需要針對1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒特異性 核巧酸序列分別設(shè)計特異性引物，建立雙重PCR鑒別診斷方法，但雙重PCR條件優(yōu)化較為繁 瑣，對操作者要求較高。本發(fā)明提供的方法僅需一組引物(比分別設(shè)計特異性引物檢測時少 1組引物），該引物根據(jù)1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒全基因組序列在3'-端存在長 短差異來設(shè)計引物;該組引物可同時對1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒進行有效擴 增，且引物擴增的1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒區(qū)域核巧酸序列存在長短差異來 進行區(qū)分，其中1型鴨肝炎病毒擴增片段大小為258bp，新血清型鴨肝炎病毒擴增片段大小 為321bp左右，根據(jù)1型和新血清型鴨肝炎病毒擴增的目的片段大小差異來對1型和新血清 型鴨肝炎病毒感染進行檢測。本發(fā)明的方法操作簡單，無需復雜繁瑣的條件優(yōu)化過程，本發(fā) 明在1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒病原學檢測上快捷準確，可填補國內(nèi)外相關(guān)領(lǐng) 域研究空白。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種區(qū)別1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒的RT-PCR引 物。該引物能有效區(qū)分1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒感染(或共感染），為水禽業(yè)健 康養(yǎng)殖提供技術(shù)保證。
[0006] 本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)： 一組區(qū)別1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒的RT-PCR鑒別診斷引物，所述引物的 序列如下： 上游引物P1:5 ' - AGGCCCAGAAGCATTCAAACA -3 ' ； 下游引物P2:5'- TGGGTGTTTTACGTGTACTC -3'。
[0007] 所述的引物需要對1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒均可進行RT-PCR擴增， 且在該擴增區(qū)域1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒存在核巧酸片段長短差異，其中1型 鴨肝炎病毒擴增片段大小為258bp左右，新血清型鴨肝炎病毒擴增片段大小為32化P左右。
[0008] 如圖1所示，本發(fā)明設(shè)計的上游引物在1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒保守 區(qū)設(shè)計的；如圖2所示，本發(fā)明設(shè)計的下游引物在1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒保 守區(qū)設(shè)計的。本發(fā)明設(shè)計的上下游引物可同時對1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒進 行擴增。如圖2所示，本發(fā)明設(shè)計的上下游引物對1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒進 行擴增時，擴增區(qū)域存在核巧酸差異（見圖2差異區(qū)，其中1型鴨肝炎病毒擴增片段大小為 258bp左右，新血清型鴨肝炎病毒擴增片段大小為32化P左右）。
[0009] 從圖3所示，圖1和圖2選取的1型鴨肝炎病毒(DHV-1)和新血清型鴨肝炎病毒(DHV- N)均符合要求，可代表GenBank中相關(guān)病毒的特征。
[0010] 一組區(qū)別1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒的RT-PCR檢測方法，利用上游引 物P1:5' - AGGCCCAGAAGCATTCAAACA -3'和下游引物P2:5' - TGGGTGTTTTACGTGTACTC -3'建 立基于1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒基因組3'-端差異區(qū)設(shè)計，引物對1型鴨肝炎 病毒和新血清型鴨肝炎病毒核酸RNA進行RT-PCR擴增后的產(chǎn)物1型鴨肝炎病毒擴增片段大 小為258bp左右，新血清型鴨肝炎病毒擴增片段大小為32化P左右(如圖4所示）。
[0011] 具體包括W下步驟： 1) 按照常規(guī)方法提取1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒的核酸RNA; 2) 利用上游引物Pl:5'- AGGCCCAGAAGCATTCAAACA -3'和下游引物P2:5'- TGGGTGTTTTACGTGTACTC -3'，同時對1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒進行RT-PCR檢 測，反應完成后進行常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳鑒定； 3) 根據(jù)RT-PCR擴增的產(chǎn)物大小可直接對1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒感染進 行鑒別診斷，其中1型鴨肝炎病毒擴增片段大小為258bp左右，新血清型鴨肝炎病毒擴增片 段大小為32化P左右。
[0012] 所述引物在制備檢測1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒試劑中的的應用。
[0013] 較之現(xiàn)有技術(shù)而言，本發(fā)明的優(yōu)點在于:本發(fā)明鑒定方法簡單，快捷和準確率高： 本發(fā)明對12份臨床采集的肝炎癥狀死亡鴨病料進行檢測，提取核酸RNA后進行RT-PCR檢測， 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見看出有1型鴨肝炎病毒陽性病料2份，陽性率為16.67%(2/12);新血 清型鴨肝炎病毒陽性病料5份，陽性率為41.67%(5/12)，未檢測到12份樣品存在共感染現(xiàn) 象;本發(fā)明僅需上游引物P1和下游引物P2運一組引物即可對1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨 肝炎病毒感染進行鑒別診斷，無虛復雜繁瑣的條件優(yōu)化過程，本發(fā)明在1型鴨肝炎病毒和新 血清型鴨肝炎病毒快速鑒別診斷檢測上快捷準確，可填補國內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域研究空白。
【附圖說明】
[0014] 圖1是本發(fā)明設(shè)計的上游引物在1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒保守區(qū)基 因分析圖。
[0015] 圖2是本發(fā)明設(shè)計的下游引物在1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒保守區(qū)基 因分析圖和本實驗設(shè)計的引物擴增1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒的差異區(qū)基因分 析圖。
[0016] 圖3是圖1和圖2選取的1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒遺傳進化分析圖。從 結(jié)果可見，本發(fā)明選取的代表株具有代表性。根據(jù)上述代表株設(shè)計的特異性上下游引物符 合實驗預期。
[0017] 圖4是利用引物P1和P2進行對1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒RT-PCR擴增 的電泳圖。其中：1: DHV-1; 2: DHV-N; 3:空白對照;Μ: DL2000 DNA分子量標準。
[0018] 圖5是引物Ρ1和Ρ2特異性檢測的電泳圖。其中：1:禽流感病毒;2:禽1型副粘病毒； 3:呼腸孤病毒;4:禽坦布蘇病毒;5:鴨圓環(huán)病毒;6:鴨攝病毒;7:番鴨細小病毒;8:新血清型 鴨肝炎病毒:9:1型鴨肝炎病毒；M:DL2000 DNA分子量標準。
【具體實施方式】
[0019] 下面結(jié)合說明書附圖和實施例對本
【發(fā)明內(nèi)容】
進行詳細說明： 一組區(qū)別1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒的RT-PCR鑒別診斷引物及檢測方法， 所述引物的序列如下： 上游引物P1:5 ' - AGGCCCAGAAGCATTCAAACA -3 ' ； 下游引物P2:5'- TGGGTGTTTTACGTGTACTC -3'。
[0020] 一組區(qū)別1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒的RT-PCR檢測方法，它包括W下 步驟： 1) 提取1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒的核酸RNA; 2) 利用上游引物Pl:5'- AGGCCCAGAAGCATTCAAACA -3'和下游引物P2:5'- TGGGTGTTTTACGTGTACTC -3'，同時對1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒進行RT-PCR檢 測，反應完成后進行常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳鑒定； 3) 根據(jù)RT-PCR擴增的產(chǎn)物大小可直接對1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒感染進 行鑒別診斷，其中1型鴨肝炎病毒擴增片段大小為258bp左右，新血清型鴨肝炎病毒擴增片 段大小為32化P左右。
[0021] 所述的一組區(qū)別1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒的RT-PCR鑒別診斷引物及 檢測方法，其特征在于:所述RT-PCR檢測的反應體系為： 在20化體系中加入W下成分：
步驟2)中所述基RT-PCR檢測設(shè)置的反應條件為:45 °C反轉(zhuǎn)錄30min后進行PCR反應， 94 °C預變性5min ;隨后進行94°C 50s、54°C 30s、72°C 30s，進行40個循環(huán)后72°C延伸 lOmin。反應結(jié)束后，經(jīng)常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。
[0022] 實施例1 1材料與方法： 1.1實驗試劑與耗材：病毒核酸RNA提取試劑盒(EasyPure Viral DNA/RNA Kit)、RT- PCR試劑盒(EasyScript One-St巧RT-PCR SuperMix)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司， 實時PCR購自AXYGEN公司； 1.2實驗毒株： 1型鴨肝炎病毒（DHV-l)(GenBank號JX390983)和新血清型鴨肝炎病毒（DHV-N) (GenBank號抓755009)、禽流感病毒、禽1型副粘病毒、呼腸孤病毒、禽坦布蘇病毒、鴨圓環(huán)病 毒、鴨攝病毒和番鴨細小病毒均由福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所分離鑒定和保存。
[0023] 1.3 方法： 1.3.1 RT-PCR的引物設(shè)計： 利用01ig〇7對其進行引物設(shè)計，該對引物設(shè)計時需要對DHV-1和DHV-N均可同時進行擴 增，且在該擴增區(qū)域DHV-1和DHV-N存在核巧酸序列長度差異，所述的引物為： 上游引物P1:5 ' - AGGCCCAGAAGCATTCAAACA -3 ' ； 下游引物P2:5'- TGGGTGTTTTACGTGTACTC -3'。
[0024] 其中1型鴨肝炎病毒擴增片段大小為258bp左右，新血清型鴨肝炎病毒擴增片段大 小為32化P左右。
[0025] 1.3.2 RT-PCR的檢測的反應體系和反應條件的優(yōu)化： 所述RT-PCR檢測的反應體系為： 在20化體系中加入W下成分：
步驟2)中所述基RT-PCR檢測設(shè)置的反應條件為:45 °C反轉(zhuǎn)錄30min后進行PCR反應， 94 °C預變性5min ;隨后進行94°C 50s、54°C 30s、72°C 30s，進行40個循環(huán)后72°C延伸 lOmin。反應結(jié)束后，經(jīng)常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳鑒定。如圖4所示:從圖4可知:僅1型鴨肝炎病毒 (DHV-lKGenBank 號 JX390983)和新血清型鴨肝炎病毒（DHV-N)(GenBank 號抓755009)可 W RT-PCR擴增。從圖4可見，1型鴨肝炎病毒擴增片段大小為258bp左右，新血清型鴨肝炎病毒 擴增片段大小為32化P左右。
[0026] 1.3.3特異性實驗 用本研究設(shè)計的引物(上游引物P1和下游引物P2)對鴨群常見傳染病如禽流感病毒、禽 1型副粘病毒、呼腸孤病毒、禽坦布蘇病毒、鴨圓環(huán)病毒、鴨攝病毒和番鴨細小病毒核酸進行 檢測，均未出現(xiàn)特異性條帶擴增，檢測結(jié)果均未陰性，僅1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎 病毒核酸出現(xiàn)特異性擴增(見圖5)，表明本研究設(shè)計的引物具有極強的特異性。
[0027] 1.3.4臨床應用 利用本發(fā)明提供的一組區(qū)別1型和新血清型鴨肝炎病毒的RT-PCR鑒別診斷引物及檢測 方法對12份臨床采集的肝炎癥狀死亡鴨病料進行檢測，提取核酸RNA后進行RT-PCR檢測，經(jīng) 瓊脂糖凝膠電泳可見看出有1型鴨肝炎病毒陽性病料2份，陽性率為16.67%(2/12);新血清 型鴨肝炎病毒陽性病料5份，陽性率為41.67%巧/12)，未檢測到12份樣品存在共感染現(xiàn)象； 本發(fā)明僅需上游引物P1和下游引物P2運一組即可對1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒 進行鑒別，無虛復雜繁瑣的條件優(yōu)化過程，本發(fā)明在1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒 快速鑒別診斷檢測上快捷準確，可填補國內(nèi)外相關(guān)領(lǐng)域研究空白。
[002引 1.3.5結(jié)果驗證 將上述鑒定為1型鴨肝炎病毒陽性病料2份、新血清型鴨肝炎病毒陽性病料5份，用文獻 使用的RT-PCR方法進行重復檢測驗證。1型鴨肝炎病毒陽性病料2份使用文獻[楊維星，施少 華，陳紅梅，等.3株鴨肝炎病毒1型全基因序列分析[J].中國農(nóng)學通報，2010,26( 14):8- 12.]進行檢測，結(jié)果和本研究的方法一致，符合率為100%。新血清型鴨肝炎病毒陽性病料5 份，用文獻使用的RT-PCR方法進行重復檢測驗證。新血清型鴨肝炎病毒陽性病料5份使用文 獻[施少華，程龍飛，傅光華，等.鴨肝炎病毒新血清型基因組序列分析[J].微生物學報， 2009,49(3):309-315.]進行檢測，結(jié)果和本研究的方法一致，符合率為100%。
[0029] W上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與 修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【主權(quán)項】
1. 一組區(qū)別1型鴨肝炎病毒和新血清型鴨肝炎病毒的RT-PCR鑒別診斷引物，其特征在 于:所述引物的序列如下： 上游引物PI: 5 ' - AGGCCCAGAAGCATTCAAACA -3 ' ； 下游引物P2:5'_ TGGGTGTTTTACGTGTACTC -3'。2. 如權(quán)利要求1所述引物在制備檢測1型和新血清型鴨肝炎病毒試劑中的的應用。
【文檔編號】C12Q1/70GK106011315SQ201610657565
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年8月12日
【發(fā)明人】萬春和, 施少華, 黃瑜, 程龍飛, 傅光華, 陳紅梅, 傅秋玲, 陳翠騰, 劉榮昌
【申請人】福建省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所