HTLV衣殼抗原p24的可溶性和免疫反應性變體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及可以融合至分子伴侶的可溶性和抗原性HTLV p24變體及其在診斷應用諸如用于檢測分離的生物樣品中的針對HTLV?I或HTLV?II的抗體的免疫測定中的用途。具體而言，本發(fā)明涉及包含p24的N?或C?末端結構域且缺乏其它結構域的可溶性HTLV?I或HTLV?II p24抗原。而且，本發(fā)明涵蓋編碼這些HTLV?I和?II融合抗原的重組DNA分子以及使用表達載體和用這樣的表達載體轉化的宿主細胞的它們的重組產生。此外，本發(fā)明聚焦于這些HTLV p24抗原與HTLV gp21抗原的組合物和用于使用本發(fā)明的抗原檢測HTLV抗體的免疫測定方法。還包括HTLV p24抗原在體外診斷測定中的用途以及包含所述HTLV抗原的用于檢測抗?HTLV?的抗體的試劑盒。
【專利說明】HTLV衣亮抗原p24的可溶性和免疫反應性變體
[0001 ]人T-細胞嗜淋己細胞病毒化TLV)I型化TLV-I)是1980年在人中發(fā)現(xiàn)的第一個逆轉 錄病毒。其為T-細胞白血病和/或淋己瘤和HTLV相關的脊髓病(最終導致熱帶疫李性輕截擁 的嚴重脫髓銷病況)的病原體。在HTLV-I的無癥狀攜帶者中，發(fā)展運些致命和難治愈的疾病 的累積終生風險總計為~5 %dHTLV-I主要感染CD4-陽性T-細胞。其也被稱為成人T-細胞淋 己瘤病毒1型。HTLV-n與HTLV-I共享約70%基因同源性(轉化為在蛋白水平的80-95%結構 相似性）dHTLV-II的致病潛力還沒有完全闡明，但HTLV-II被認為是輸血的風險標志物，因 為其主要在全世界的靜脈內吸毒者中發(fā)現(xiàn)(化ndamme等人，Evolutionary strategies of human T-cell lym地otropic virus type II, Gene 261 (2000) 171-180)。兩種病毒在 全球傳播，但HTLV-I的流行率在南日本化yushu、Shikoku和Okinawa)、撒哈拉W南非洲、加 勒比(牙買加和海地)和南美洲的熱點地區(qū)中是最高的。
[0002] HTLV-VII的主要傳播模式是通過性接觸、輸血、共用注射針頭和通過哺乳的母嬰 傳播。當與其它感染性疾病相比時，HTLV感染之后的血清轉化期長。窗口期，即，其內無法檢 測到針對病毒的抗體的感染后的時間段可W范圍為數(shù)周至數(shù)月。
[0003] 在日本于1986年、在美國和加拿大于1988/1989年、在法國于1991年和在幾個歐洲 和南美國家在1991年之后首次引入針對HTLV的獻血者篩選。至今還沒有出現(xiàn)用于診斷HTLV 感染的金標準。已經在過去幾年中引入了基于重組和/或合成膚抗原的幾種免疫測定法。
[0004] 用于檢測抗-HTLV-抗體的市售免疫測定法通常使用源自病毒包膜的多膚(gp46表 面蛋白和gp21跨膜蛋白）或源自gag編碼的p24衣殼蛋白的多膚。
[0005] 由于長血清轉化時間，一旦抗體在感染后的早期階段出現(xiàn)即檢測甚至非常少量的 抗體是重要的。因此，開發(fā)適當?shù)目乖糜诟叨让舾械拿庖邷y定是必需的。理所當然的是， 期望閉合感染和檢測之間的診斷間隙，W防止病毒的意外傳播和繁殖。
[0006] 已經知道一段時間的是，HTLV-感染后，針對gag蛋白的抗體在血清轉化早期出現(xiàn)。 具體而言，gag編碼的衣殼抗原p24是體液免疫應答的優(yōu)選早期目標(Manns等人，Blood (1991) 77: 896-905)。迄今為止，p24衣殼蛋白的膚和重組變體已被用作免疫測定中的抗 原。借助運些抗原，已經W高精確度和令人滿意的靈敏度檢測到G型的抗-p24免疫球蛋白。 然而，運種類型的p24衣殼抗原無法結合和檢測Μ型的免疫球蛋白。由于IgM分子通常在血清 轉化期間在IgG分子之前出現(xiàn)，所W我們推理，W其被IgM識別和結合的方式修飾重組的p24 衣殼抗原應當是值得的?？傊?，我們想知道是否可能通過定制和工程改造 p24衣殼抗原而改 進抗-p24免疫球蛋白檢測的靈敏度。具體而言，我們正在尋求設計能夠與IgM分子相互作用 并檢測IgM分子的p24變體。
[0007] 因此，本發(fā)明的基本問題是開發(fā)用于檢測針對HTLV-I和HTLV-II的抗體的免疫測 定法，其克服了迄今為止可用的免疫測定法的有限的血清轉化靈敏度。
[000引通過如權利要求中指定的本發(fā)明解決了該問題。
[0009] 發(fā)明概述： 本發(fā)明設及融合至分子伴侶的可溶性HTLV p24抗原及其在診斷應用諸如用于檢測分 離的生物樣品中的針對HTLV-I或HTLV-n的抗體的免疫測定中的用途。具體而言，本發(fā)明設 及包含p24序列的N-或C-末端結構域的可溶性HTLV-I或HTLV-II p24抗原片段，其中所述 HTLV p24抗原片段可W融合至分子伴侶。而且，本發(fā)明涵蓋編碼運些HTLV-I和-II融合抗原 的重組DNA分子W及使用表達載體和用運樣的表達載體轉化的宿主細胞的它們的重組產 生。此外，本發(fā)明聚焦于運些HTLV p24抗原中的幾種的組合物和用于使用本發(fā)明的抗原檢 測HTLV抗體的免疫測定方法。還包括HTLV p24抗原在體外診斷測定中的用途W(wǎng)及包含所述 HTLV p24抗原的用于檢測抗-HTLV-的抗體的試劑盒。
[0010] 公開的氨基酸序列的說明： 沈Q ID N0.1: P24/HTLV-I (146-344)// P10274, 199個氨基酸殘基 顯示如從SwissProt數(shù)據(jù)庫ID P10274檢索的HTLV-I p24序列(來自人T-細胞白血病病 毒1，毒株化pan ATK-1亞型A的146-344的146-344 Gag-Pro多蛋白）。編號是指未成熟多蛋 白前體(aa 1-130的序列是指基質蛋白pl9)。注意，已經省略來自aa 131-145的N-末端15個 氨基酸殘基(富含脯氨酸的序列）。
[0011] 沈Q ID NO.2: p24 NTD (146-260)/HTLV-I, 115個氨基酸殘基 顯示HTLV-I p24的來自氨基酸146-260的N-末端結構域(對于氨基酸位置的編號，還參 見SEQ ID NO.1)。注意，一個位置被標記為X(加下劃線），運意味著天然序列的半脫氨酸殘 基可W被替代為丙氨酸或絲氨酸(X = C、A或S)。
[0012] 沈Q ID NO.3: p24 CTD (261-344)/HTLV-I, 84個氨基酸殘基 顯示HTLV-I p24的來自氨基酸殘基261-344的C-末端結構域(對于氨基酸位置的編號， 還參見SEQ ID NO.1)。注意，兩個位置被標記為X(加下劃線），運意味著天然序列的半脫氨 酸殘基可W被替代為丙氨酸或絲氨酸(X = C、A或S)。
[0013] 沈Q ID NO.4: p24 (146-：M4)/HTLV-I，199個氨基酸殘基 顯示就長度和位置而言類似于SEQ ID NO. 1的HTLV-I p24序列。然而，Ξ個氨基酸位置 顯示Χ(加下劃線），運意味著在運些位置中，天然存在的半脫氨酸(根據(jù)前體多膚序列編號 的位置編號193、311和332)可W被取代為丙氨酸或絲氨酸(X = C、A或S)。
[0014] 沈Q ID NO.5: P24/HTLV-II (152-350)//P03353，199個氨基酸殘基 顯示如從SwissProt數(shù)據(jù)庫ID P03353檢索的HTLV-II p24序列（來自人T-細胞白血病 病毒2的152-3350 Gag-Pro多蛋白）。編號是指未成熟多蛋白前體(aa 1-136的序列是指基 質蛋白Pl9)。注意，已經省略來自aa 137-151的N-末端15個氨基酸(富含脯氨酸的序列）。
[0015] 沈Q ID NO.6: p24 NTD (152-266)/HTLV-II，115個氨基酸殘基 顯示HTLV-II p24的來自氨基酸152-266的N-末端結構域(對于氨基酸位置的編號，還 參見SEQ ID NO.5)。注意，一個位置被標記為X(加下劃線），運意味著天然序列的半脫氨酸 殘基可W被替代為丙氨酸或絲氨酸(X = C、A或S)。
[0016] 沈Q ID NO.7: p24 CTD (267-350)/HTLV-II, 84個氨基酸殘基 顯示HTLV-II p24的來自氨基酸267-350的C-末端結構域(對于氨基酸位置的編號，還 參見SEQ ID NO.5)。注意，Ξ個位置被標記為X(加下劃線），運意味著天然序列的半脫氨酸 殘基可W被替代為丙氨酸或絲氨酸(X = C、A或S)。
[0017] 沈Q ID NO.8: p24 (152-350)/HTLV-II，199個氨基酸殘基 顯示就長度和位置而言類似于SEQ ID NO.5的HTLV-II p24序列。四個氨基酸位置顯示 X(加下劃線），運意味著在運些位置中，天然存在的半脫氨酸(根據(jù)前體多膚序列編號的位 置編號199、281、317和338)可^被取代為丙氨酸或絲氨酸^ = (：、4或5)。
[001引 W下氨基酸序列（SEQ ID NO.9-16和18-24)顯示如實施例部分中使用的HTLV-I或 HTLV-II p24(完全或部分)序列的融合序列。怎cSlyD、怎C FkpA和怎cSkp的蛋白命名中的 兩個字母怎C表明來自大腸桿菌的蛋白序列來源。各蛋白在其C-末端具有六-組氨酸標簽， 其用于促進蛋白純化和重折疊。
[0019]沈Q ID NO.25:甜21/HTLV-l (339-446)// P14075, 108個氨基酸殘基 顯示根據(jù)SwissProt條目ID P14075的包膜糖蛋白甜21(源自6醇多蛋白前體)的氨基酸 殘基號339-446。完整多蛋白前體包含:人T-細胞白血病病毒1(分離株化r化bean HS-35亞 型A)的表面蛋白（=糖蛋白46，gp46)和跨胺蛋白（=糖蛋白21即21)。注意，二個殘基被柄；記 為x(加下劃線），運意味著天然序列的半脫氨酸殘基可W被替代為丙氨酸或絲氨酸(X = C、 A 或 S)。
[0020] 肌LV即21也可w有利地應用為增強溶解性的分子伴侶融合多膚，如例如SEQ ID NO. 26和27中所示。
[0021]
【附圖說明】： 圖 1 顯示Skp-p24/CTD (267-350)，沈Q ID NO.22的近UV CD光譜。
[0022] 圖2顯示Skp-p24/CTD (沈Q ID NO. 22)的烙化曲線。通過在277 nm的近UV CD光譜 監(jiān)測熱誘導的解折疊和重折疊。
[0023] 圖3顯示化pA-p24/CTD (267-350)，沈Q ID NO.21 的近UV CD光譜。
[0024] 國蘭顯示在熱誘導的解折疊/重折疊循環(huán)之后，完全恢復天然化pA-p24/CTD分子的 近UV CD信號。
[00劇發(fā)明詳述 肌LV p24是用于檢測抗-HTLV抗體的重要抗原。p24衣殼蛋白在本領域中長時間已知， 并且已經在用于檢測抗抗體的免疫測定中使用（Manns等人，Blood (1991) 77: 896-905)。用于檢測IgG和IgM分子兩者的免疫測定需要一組抗原，其不僅被IgG分子、而且 被IgM分子識別和結合。IgM分子通常存在于HTLV感染后的血清轉化的早期階段。多價IgM分 子的結合關鍵取決于高抗原表位密度。因此，設計用于特異性檢測IgM分子的抗原具有和展 示運樣的高表位密度是必要的。
[0026] 生成具有高表位密度的IgM檢測模塊的常規(guī)方法是借助化學交聯(lián)聚合單體抗原。 存在大量同雙功能和異雙功能交聯(lián)劑，其可很大優(yōu)勢使用，并且是本領域中眾所周知 的。然而，在用于用作血清學測定中的指示劑(specifiers)的抗原的化學誘導的聚合中存 在一些嚴重的缺點。例如，將交聯(lián)劑部分插入抗原可W通過干擾天然樣構象或通過掩蔽關 鍵表位而損害抗原性。此外，非天然Ξ級接觸的引入可W干擾蛋白折疊/解折疊的可逆性， 并且此外，其可W是干擾問題的來源，所述干擾問題必須通過免疫測定混合物中的抗干擾 策略來克服。
[0027] 生成IgM檢測模塊的一種更近的技術是將目標抗原融合至寡聚分子伴侶，由此為 抗原賦予高表位密度。該技術的優(yōu)點在于其高可重復性和寡聚分子伴侶融合伴侶的Ξ重功 能:首先，分子伴侶增強宿主細胞中的融合多膚的表達率，其次，分子伴侶促進目標抗原的 重折疊過程并增強其整體溶解度，W及第Ξ，其將目標抗原可重復地組裝成有序寡聚結構。 [00%]歐洲專利申請公開號EP1982993A2公開了用于使用融合至寡聚分子伴侶的抗原早 期檢測病原體諸如人巨細胞病毒的真實原發(fā)感染的方法和工具。然而，該出版物沒有提到 HTLV感染的檢測。
[0029] 我們用HTLV p24的全長版本的初始嘗試已經掲示，該蛋白當融合至作為分子伴侶 的怎C S lyD-怎C S lyD或^ C FkpA時表現(xiàn)出高溶解度。然而，當將p24融合至Ξ聚Skp分子伴侶 時，其溶解度是有限的。不言自明的是，所有化合物的溶解度是異質免疫測定應用的關鍵特 征。免疫測定中的蛋白性成分的聚集過程通常導致信號的損失（由于表位的損失)和特異性 的損失（由于標記的抗原聚集體與固相的非特異性結合）。我們觀察到，來自HTLV的全長p24 -當融合至寡聚分子伴侶i?cSkp時-顯示在環(huán)境溫度在生理緩沖液中聚集的傾向。因此， 從某種程度上在靈敏IgM免疫測定中的簡單且直接的應用中排除全長p24變體。
[0030] 不再聚焦于p24的全長版本，我們現(xiàn)在試圖設計截短的、但構象折疊的p24的片段。 換言之，我們試圖使用蛋白結構域而非全長p24蛋白作為用于抗原開發(fā)的基礎。蛋白結構域 是蛋白結構內的自主折疊實體，即，不依賴于蛋白在其折疊中的其它部分或區(qū)域的蛋白結 構域。迄今為止，已經闡明了許多天然蛋白結構域，其大小范圍為~40個氨基酸殘基(WW結 構域)至超過300個氨基酸殘基。也已經表明，可W從scratch設計非常小、但穩(wěn)定的蛋白結 構域:已經顯示具有23-28個氨基酸序列的片段長度的人工多膚序列協(xié)同地折疊，并且具有 蛋白結構域的特有特征（Shuthers, M. D.等人.，Design of a monomeric 23-residue polypeptide with defined tertiary structure, Science (1996) 271 (5247) 342- 345; Dahiyat, B. I. & Mayo, S.L., De novo protein design: fully automated sequence selection, Science (1997) 278 (5335) 82-87; Dahiyat, B. I.等人，化 打ΟΚΟ protein design: towards fully automated protein design, J. Mol. Biol. (1997) 273 (4) 789-796)。從理論考慮和實驗證據(jù)，假定蛋白結構域的最小長度要求為約 25個氨基酸殘基（Porter L. L. & Rose, G. D., A thermodynamic definition of protein domains, PNAS (2012) 109 (24)， 9420-9425)。
[003。在Molecular Biology ( 1999) Aug. 13; 291 (2) :491-505的雜志中， 趾orasanizadeh等人呈現(xiàn)了衣殼蛋白p24的醒R結構，并且掲示了該蛋白的結構域拓撲學。 根據(jù)該工作，來自HTLV-I的p24主要是螺旋的，并且由兩個良好分離的結構域組成，即，p24 包含兩個明確定義的自主折疊單元。N-末端結構域(NTD)具有螺旋1-7,而C-末端結構域 (CTD)包含螺旋8-12。我們想知道在大腸桿菌中單獨表達兩種結構域是否是可行的，我們是 否能夠獲得可溶和抗原形式的寡聚分子伴侶多膚融合體。
[0032] 趾orasanizadeh等人沒有提到p24的抗原特性（例如，B-細胞表位）和醒R-表征的 HTLV衣殼蛋白的任何診斷應用。從p24衣殼抗原的僅僅Ξ維溶液結構無法預測其抗原性是 否主要位于N-末端結構域(NTD)或C-末端結構域(CTD)中，或者其B-細胞表位是否在整個分 子均勻散布。
[0033] 令人驚訝的是，我們能夠表達與分子伴侶模塊諸如SlyD、FkpA和Skp融合的分離的 HTLV p24結構域NTD和CTD。如實施例部分中可見，所有運些構建體都可W被純化至均質，它 們是充分可溶的，并且我們能夠在自動免疫測定分析儀中使用抗-肌LV陽性人血清評價它 們的抗原性。結果是相當明確的：抗原性對于兩個結構域相當高，并且對于c-結構域(CTD) 甚至略高。引人注目的是，NTD可W被鑒定為相對于空白值不確定，當與CTD相比時，其顯著 增加。CTD表現(xiàn)出優(yōu)異的信號動力學，因為其對于陽性血清生成高信號，并且對于陰性血清 生成非常低的信號。運是令人驚訝的，因為推測CTD具有p24衣殼組裝所需的天然二聚化基 序。憑借其天然寡聚化行為，我們已經推理CTD會表現(xiàn)出比NTD的聚集傾向顯著更高的聚集 傾向。
[0034] 當我們用兔抗-肌LV血清學轉換血清(沒有商購的人HTLV血清轉化實驗對象組，所 W我們必須回到人工兔模型）評價p24 CTD和NTD時，我們發(fā)現(xiàn)在DAGS測定的兩側使用分子 伴侶誘導的寡聚p24變體大大增強了免疫測定的靈敏度。與單體p24變體相比，用寡聚p24變 體對血清轉化樣品的識別好得多。
[0035] 簡言之，來自HTLV-I和HTLV-n的p24的C-結構域被鑒定為具有高抗原性和高溶解 度的p24片段。當融合至分子伴侶諸如SlyD、FkpA或Skp時，p24 CTD保持可溶，穩(wěn)定，并且非 常適合于檢測通常在HTLV感染后存在于血清轉化的早期階段中的IgM分子。因此，具體而 言，p24 CTD的寡聚FkpA和Skp融合變體可用于增強HTLV-免疫測定的靈敏度。
[0036] 我們已經開發(fā)了來自HTLV的衣殼蛋白p24的變體，其比全長p24分子更可溶且聚集 傾向顯著更低。W抗原性為代價，溶解度和穩(wěn)定性得到改善-然而，新開發(fā)的p24變體有希 望作為HTLV免疫測定中的抗原，因為它們在大腸桿菌中大量過表達，容易經由固定化的金 屬馨合層析法（IMAC)純化和重折疊，表現(xiàn)出令人滿意的穩(wěn)定特性，并且可W用于可靠地檢 測人血清中的抗-肌LV抗體(據(jù)推測與GP2U來自HTLV的另一種免疫顯性蛋白）的胞外結構 域組合）。至關重要的是，例如，F(xiàn)kpA-p24/CTD和Skp-p24/CTD融合蛋白形成具有足W檢測 IgM分子的表位密度的天然寡聚體。因為我們旨在開發(fā)用于總免疫球蛋白檢測（即IgG型IgM 的檢測）的免疫測定法，所W寡聚種類inq)A-p24/CTD和Skp-p24/CTD可W有利地用作DAGS形 式的兩側的指示劑（例如inq)A-p24/CTD-生物素和Skp-p24/CTD-釘）。初步數(shù)據(jù)表明，寡聚 p24變體的使用確保競爭劑測定法無法匹配的優(yōu)異的血清轉化靈敏度。
[0037] 因此，本發(fā)明設及分別包含N-末端結構域且缺乏C-末端結構域或包含全長HTLV p24多膚的C-末端結構域且缺乏N-末端結構域的可溶性HTLV p24抗原。根據(jù)本發(fā)明，p24抗 原可W融合至分子伴侶。還包括運些HTLV p24抗原在診斷應用諸如用于檢測分離的生物樣 品中的針對HTLV-I或HTLV-II的抗體的免疫測定中的用途。術語"HTLV"意指"人T-細胞嗜淋 己細胞病毒"。除非特別標記為HTLV-I或HTLV-II，否則術語HTLV是指兩種病毒類型兩者。
[0038] 根據(jù)本發(fā)明，所述抗原僅包含完整HTLV p24抗原的特定結構域，諸如N-末端結構 域(NTD)或C-末端結構域(CTD)。優(yōu)選地，所述抗原包含HTLV-I p24的SEQ ID N0.2的N-末端 結構域或SEQ ID NO.3的C-末端結構域。對于HTLV-n抗原，融合抗原優(yōu)選包含SEQ ID NO.6 的N-末端結構域或SEQ ID. NO. 7的C-末端結構域。在一個進一步優(yōu)選模式中，如果N-末端 結構域是所述抗原的部分，則C-末端結構域缺失，反之亦然。
[0039] 具體而言，本發(fā)明設及可溶性HTLV p24抗原，其包含如SEQ ID N0.2 (p24 NTD HTLV-I)或沈 Q ID NO.6 (p24 NTD HTLV-II)中指定的 HTLV p24 的 N-末端結構域(NTD),其 中所述HTLV p24抗原缺乏如SEQ ID NO. 3 (p24 CTD HTLV-I)和SEQ ID NO.7 (p24 CTD HTLV-II)中指定的C-末端結構域(CTD)。
[0040] 此外，本發(fā)明設及可溶性HTLV p24抗原，其包含如SEQ ID NO.3 (p24 CTD HTLV- I)或沈Q ID N0.7 (p24 CDT HTLV-II)中指定的HTLV p24的c-末端結構域，其中所述HTLV p24抗原缺乏如SEQ ID N0.2 (p24 NTD HTLV-I)和SEQ ID N0.6 (p24 NTD HTLV-II)中指 定的N-末端結構域。
[0041 ] 術語HTLV p24抗原也包括變體。HTLV p24變體可w由本領域技術人員通過保守或 同源取代公開的氨基酸序列(諸如例如用丙氨酸或絲氨酸取代半脫氨酸)而容易地生成。在 該上下文中的術語"變體"還設及與所述蛋白基本上類似的蛋白或蛋白片段（即，多膚或 膚）。例如，修飾諸如C-或N-末端截短1至10個氨基酸在請求保護的HTLV p24抗原的范圍內。 具體而言，變體可W是與最普遍的蛋白同種型相比顯示氨基酸交換、缺失或插入的同種 型。在一個實施方案中，運樣基本上類似的蛋白與蛋白最普遍的同種型具有至少80%，在另 一個實施方案中至少85%或至少90 %，在又另一個實施方案中至少95 %的序列相似性。術 語"變體"還設及翻譯后修飾的蛋白諸如糖基化或憐酸化的蛋白。根據(jù)本發(fā)明，變體分類為 ffTLV p24抗原變體，只要維持體外診斷免疫測定法中的免疫反應性，即變體仍然能夠結合 并檢測分離的樣品中存在的抗-HTLV p24抗體。"變體"也是運樣的蛋白或抗原，其已經例如 通過將標記物或載體部分共價或非共價附接至蛋白或抗原而被修飾?？赡艿臉擞浳锸欠派?性的、巧光的、化學發(fā)光的、電化學發(fā)光的、酶或其它例如像異徑基洋地黃毒巧或生物素。 運些標記物是本領域技術人員已知的。
[0042] 本發(fā)明的HTLV p24抗原是可溶的，穩(wěn)定的和免疫反應的，即，它們適合作為抗原用 于免疫學測定法中使用。運意味著根據(jù)本發(fā)明的抗原在生理緩沖劑條件下，例如在沒有添 加去污劑的情況下在環(huán)境溫度在憐酸鹽緩沖劑系統(tǒng)中是可溶的。所述抗原也能夠結合對于 HTLV p24特異性的抗體(如例如分離的樣品諸如人血清中存在的抗-p24抗體)或被其識別 和結合。
[0043] 根據(jù)本發(fā)明的HTLV p24抗原可W與分子伴侶融合。如本發(fā)明中所使用的術語"融 合蛋白"、"融合多膚"或"融合抗原"是指運樣的蛋白，其包含至少一個對應于HTLV p24多膚 的蛋白部分和至少一個充當融合伴侶的作用的源自分子伴侶的蛋白部分。
[0044] 分子伴侶，被稱為經典的助折疊物，是輔助其它蛋白的折疊和結構完整性的維持 的蛋白。助折疊物的實例詳細描述于W0 03/000877中。根據(jù)本發(fā)明，膚基脯氨酷異構酶類別 的分子伴侶諸如FKBP家族的分子伴侶可用于與肌LV p24抗原變體融合。適合作為融合伴 侶的F邸P分子伴侶的實例是化pA、SlyD和SlpA。適合作為HTLV p24的融合伴侶的其它分子 伴侶是Skp，來自大腸桿菌的周質的Ξ聚分子伴侶，其不屬于FKBP家族。并不總是必須使用 分子伴侶的完整序列。也可W使用仍然具有所需能力和功能的分子伴侶的功能片段(所謂 的能夠結合的模塊）（參照W0 98/13496)。
[0045] 根據(jù)本發(fā)明的一個進一步實施方案，F(xiàn)KBP分子伴侶（諸如例如大腸桿菌SlyD、 SlpA或化pA)中的至少一個或至少兩個模塊被用作用于表達HTLV p24抗原的融合部分。分 子伴侶Skp同樣可用作融合伴侶。兩個F邸P-分子伴侶結構域的融合導致所得融合多膚的溶 解性提高。融合部分可位于HTLV p24抗原的N-末端或C-末端或兩端(夾屯、樣） 優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的HTLV p24抗原融合至寡聚分子伴侶。寡聚分子伴侶是運樣的分 子伴侶，其天然形成二聚體、Ξ聚體或更高階多聚體，使得通過特異性非共價相互作用組裝 多個單體亞基。優(yōu)選的寡聚分子伴侶是FkpA和Skp。
[0046] 特別優(yōu)選的是融合至選自SEQ ID NO. 9至16和18至24的分子伴侶的可溶性HTLV p24抗原。
[0047]可W借助重組DM技術生成和制備根據(jù)本發(fā)明的HTLV p24抗原。因此本發(fā)明的另 一個方面是編碼如上進一步定義的HTLV p24抗原及其變體的重組DNA分子。
[004引術語"重組DNA分子"是指運樣的分子，其通過組合兩個W其它方式分離的DNA序列 區(qū)段而制成，所述組合由通過遺傳工程改造技術或通過化學合成人工操作多核巧酸的分離 的區(qū)段而完成。運樣做時，可W將具有期望功能的多核巧酸區(qū)段接合在一起W生成期望的 功能組合。用于在原核或低等或高等真核宿主細胞中表達蛋白的重組DNA技術是本領域中 眾所周知的。它們已經例如由Sambrook等人，（1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual)描述。
[0049] 根據(jù)本發(fā)明的重組DNA分子也可W含有運樣的序列，所述序列編碼在HTLV p24抗 原和融合部分之間和還在幾個融合部分之間的10至100個氨基酸殘基的接頭膚。運樣的接 頭序列可W例如攜帶蛋白水解切割位點。
[0050] 本發(fā)明的一個進一步方面是表達載體，其包含可操作連接的根據(jù)本發(fā)明的重組 DNA分子，即編碼HTLV p24抗原和任選膚基脯氨酷異構酶分子伴侶諸如F邸P-分子伴侶的重 組DNA分子，其中F邸P-分子伴侶選自FkpA、別7〇和別口4。在一個替代實施方案中，所述重組 DNA分子編碼包含HTLV p24抗原和Skp的融合蛋白。根據(jù)本領域眾所周知的方法，包含根據(jù) 本發(fā)明的重組DNA的表達載體可用于在無細胞翻譯系統(tǒng)中表達HTLV p24抗原或可用于轉 化宿主細胞用于表達HTLV p24抗原。本發(fā)明的另一個方面因此設及用根據(jù)本發(fā)明的表達載 體轉化的宿主細胞。在本發(fā)明的一個實施方案中，在大腸桿菌細胞中產生重組HTLV p24抗 原。
[0051] -個額外方面是用于產生根據(jù)本發(fā)明的可溶的、穩(wěn)定的和免疫反應性的HTLV p24 抗原。所述p24抗原可W作為含有HTLV p24抗原和分子伴侶的融合蛋白產生。優(yōu)選地，使用 分子伴侶，諸如Skp或膚基脯氨酷異構酶類別分子伴侶如F邸P分子伴侶。在本發(fā)明的一個進 一步實施方案中，所述FKBP分子伴侶選自SlyD、FkpA和SlpA。
[0052] 該方法包括W下步驟 a) 培養(yǎng)用含有編碼HTLV p24抗原的基因的上述表達載體轉化的宿主細胞 b) 表達編碼所述HTLV p24抗原的基因 C)純化所述HTLV p24抗原。
[0053] 任選地，作為額外的步驟d)，需要實施功能性增溶，使得借助本領域已知的重折疊 技術使HTLV p24抗原成為可溶和免疫反應性的構象。
[0054] 本發(fā)明的一個額外方面設及用于檢測分離的人樣品中的抗-肌LV抗體的方法，其 中使用根據(jù)本發(fā)明的HTLV p24抗原作為抗體的結合伴侶。本發(fā)明因此涵蓋用于檢測分離的 樣品中的對于HTLV特異性的抗體的方法，所述方法包括 a) 通過混合體液樣品與根據(jù)本發(fā)明的HTLV p24抗原而形成免疫反應混合物 b) 維持所述免疫反應混合物一定時間段，所述時間段足W允許所述體液樣品中存在 的針對所述HTLV p24抗原的抗體與所述HTLV p24抗原免疫反應，W形成免疫反應產物;和 C)檢測所述免疫反應產物中的任一種的存在和/或濃度。
[0055] 在一個進一步方面，所述方法適合于檢測IgG和IgM亞類的HTLV抗體。
[0056] 用于檢測抗體的免疫測定法是本領域中眾所周知的，并且用于實施運樣的測定法 和實際應用的方法和程序也是本領域中眾所周知的。根據(jù)本發(fā)明的HTLV p24抗原可用于不 依賴于使用的標記物并且不依賴于檢測模式(例如，放射性同位素測定，酶免疫測定，電化 學發(fā)光測定等)或測定原理(例如測試條測定、夾屯、測定、間接測試概念或均質測定等)而改 進用于檢測抗-肌LV抗體的測定法。專家已知的所有生物學液體都可W用作用于檢測抗- HTLV抗體的分離的樣品。通常使用的樣品是體液如全血、血清、血漿、尿或唾液。
[0057]本發(fā)明的一個進一步實施方案是根據(jù)所謂的雙抗原夾屯、概念(DAGS)進行的用于 檢測分離的樣品中的抗-肌LV抗體的免疫測定法。有時，該測定概念也稱為雙抗原橋概念， 因為兩個抗原通過抗體分析物橋接。在運樣的測定法中，需要和利用抗體用其兩個（IgG、 I巧）、四個(IgA)或十個(IgM)互補位結合給定抗原的至少兩個不同分子的能力。
[005引更詳細地，通過解育含有抗-肌LV抗體的樣品與兩種不同的HTLV p24抗原，即，第 一Γ固相"）HTLV p24抗原和第二HTLV Ρ24Γ檢測"）抗原，實施根據(jù)雙抗原橋形式的用于 巧憶抗-HTLV抗體的免疫測定法，其中所述抗原各自與所述-HTLV抗體特異性結合。第一抗 原可W直接或間接結合至固相并且通常攜帶效應基團，所述效應基團是生物親和力 (bioaffine)結合對(如例如生物素和抗生物素蛋白）的部分。例如，如果第一抗原綴合至 生物素，則用抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白包被固相。第二抗原攜帶標記物。因此，形 成包含第一抗原、樣品抗體和第二抗原的免疫反應混合物。在向所述抗原添加樣品之前，或 在形成免疫反應混合物之后，添加第一抗原可W結合的固相。維持該免疫反應混合物一定 時間段，所述時間段足W允許所述體液樣品中的針對所述HTLV p24抗原的抗-HTLV抗體與 所述HTLV p24抗原免疫反應，W形成免疫反應產物。下一步是分離步驟，其中將液相與固相 分離。最后，在所述固相或液相或兩者中檢測所述免疫反應產物中的任一種的存在。
[0059] 在所述DAGS免疫測定中，"固相抗原"和"檢測抗原"的基礎結構是基本上相同的。 在雙抗原橋測定中，也可能使用相似、但不同的HTLV p24抗原，所述HTLV p24抗原是免疫 學交叉反應性的。進行運樣的測定的本質要求是相關的一個或多個表位存在于兩個抗原 上。根據(jù)本發(fā)明，可能對每個HTLV p24抗原使用不同的融合部分(例如，融合至固相側上的 肌LV p24的SlyD和融合至檢測側上的HTLV p24的化pA p24)，因為運樣的變異顯著減輕非 特異性結合的問題，因此降低假陽性結果的風險。
[0060] 優(yōu)選地，在所述DAGS免疫測定中，應用不對稱形式，其組合融合至化pA的HTLV p24 和融合至Skp的HTLV p24抗原。更優(yōu)選地，在固相側使用融合至化pA的HTLV p24，并且在檢 測側應用融合至Skp的HTLV p24,但它也可能具有反向排列，即在固相側上使用融合至Skp 的HTLV p24抗原，并且在檢測側上使用融合至化pA的HTLV p24。最優(yōu)選地，HTLV p24 FkpA 融合蛋白攜帶用于附接至已經用鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白包被的固相的生物素 部分，并且HTLV p24 Skp融合蛋白攜帶電化學發(fā)光標記物諸如釘絡合物。在相反排列的情 況下，p24 Skp融合蛋白攜帶生物素，且p24 FkpA攜帶所述標記物。
[0061] 本發(fā)明的一個進一步實施方案因此是根據(jù)雙抗原橋概念的免疫測定法，其中使用 根據(jù)本發(fā)明的第一HTLV p24抗原，和根據(jù)本發(fā)明的第二HTLV p24抗原。
[0062] 本發(fā)明進一步設及HTLV p24的至少一種抗原在用于檢測抗-HTLV抗體的診斷測試 中的用途。
[0063] 本發(fā)明的額外主題是用于檢測針對HTLV的抗體的試劑盒，所述試劑盒，除了用于 免疫測定法的通常的測試添加劑W外，含有適合于特異性結合待測定的HTLV抗體并且如果 必要可能攜帶標記物W及其它通常的添加劑的根據(jù)本發(fā)明的HTLV p24抗原的至少一種抗 原。
[0064] 具體而言，所述試劑盒含有根據(jù)SEQ ID NO.9至16和18至24中任一種的HTLV p24 抗原。
[0065] 此外，W上定義的試劑盒含有對照和標準溶液W及一種或多種溶液中的試劑與如 本領域普通技術人員所使用的通常的添加劑、緩沖劑、鹽、去污劑等，連同使用說明書。
[0066] 另一個實施方案是包含根據(jù)本發(fā)明的可溶性HTLV p24抗原和HTLV env抗原、優(yōu)選 包含SEQ ID NO.25的甜21的HTLV抗原組合物。術語"組合物"是指作為個別不同分子存在于 混合物中的分開表達的多膚。術語組合物排除在單個多膚鏈具有p24和gp21片段的蛋白。
[0067] 優(yōu)選的是包含HTLV p24的C-末端結構域的組合物，特別優(yōu)選的是包含根據(jù)SEQ ID N0.3(缺乏沈QIDN0.2)的HTLV-Ip24抗原和/或根據(jù)沈QIDN0.7(缺乏沈QIDN0.6)的 肌LV-II p24抗原和HTLV即21的組合物。例如，在所述組合物中，可W存在包含SEQ ID NO. 25、26或27中任一種的ffTLV即21序列。對于根據(jù)DAGS形式的免疫測定中的應用，所述 組合物包含兩種形式的每種HTLV抗原，所述兩種形式即，使得能夠將抗原附接至固相的形 式(例如，可W結合至用鏈霉抗生物素蛋白包被的表面的生物素化的抗原），和使得能夠檢 測在樣品中存在的HTLV抗體和應用的HTLV抗原之間的免疫復合物的標記的形式。
[0068] 本發(fā)明還設及根據(jù)本發(fā)明的HTLV p24抗原在用于檢測抗-HTLV抗體的體外診斷測 試中的用途。
[0069] 本發(fā)明通過實施例進一步舉例說明。
[0070] 實施例1 p24衣殼融合多膚的克隆和純化 表達盒的克隆 基于Novagen (Madison, WI, USA)的祀T24a表達質粒，基本上如所述（Scholz, C.等 人，J. Mol. Biol. (2005) 345，1229-1241)獲得編碼來自HTLV-I和HTLV-n的p24融合 蛋白的表達盒。從SwissProt數(shù)據(jù)庫檢索來自HTLV-I和HTLV-n的p24抗原的序列（分別為 SwissProt ID P10274和P03353)。編碼來自HTLV-I的p24衣殼抗原aa 146-344(編號是指 Gag-Pro蛋白前體）（在成熟衣殼蛋白的N-末端缺乏富含脯氨酸的15個氨基酸）與同框融合 至N-末端的富含甘氨酸的接頭區(qū)域的合成基因購自Medigenomix (Martinsried， Germany)。將p24在位置193、311和332的半脫氨酸殘基改變?yōu)楸彼釟埢鵚防止不想要的 副作用諸如氧化或分子間二硫橋接。公am///和ZAo/限制性位點分別在p24-編碼區(qū)的5' 和3'末端。編碼經由富含甘氨酸的接頭區(qū)連接的兩個i?cSlyD單位（SwissProt登錄號 P0A9K9的殘基1-165)和涵蓋C-末端的進一步接頭區(qū)的部分的進一步合成基因同樣購自 MedigenomixsWc/e/和公amW/限制性位點分別在該盒的5'和3'末端。設計基因和限制性 位點W使得能夠通過簡單連接同框融合分子伴侶部分i?cSlyD-i?cSlyD和p24抗原部分。為 了避免意外的重組過程且為了增加大腸桿菌宿主中的表達盒的遺傳穩(wěn)定性，簡并編碼 i?cSlyD單位的核巧酸序列，同樣簡并編碼延伸的接頭區(qū)的核巧酸序列，即，使用不同的密 碼子組合編碼相同的氨基酸序列。
[0071] 用M/el和ΖΑοΓ消化祀T24a載體并插入包含與HTLV-I p24 (146-344)同框融合 的串聯(lián)-SlyD的盒。因此構建包含多殺性己氏桿菌SlyD (1-156，SwissProt ID Q9CKP2)、 大腸桿菌化P (21-161，SwissProt ID P0AEU7)或大腸桿菌化pA (26-270，SwissProt ID P45523)的表達盒，W及包含來自HTLV-II的p24和p24片段（SwissProt ID P03353)的表達 盒。如同來自HTLV-I的p24,將來自HTLV-II的p24的位置199、281、317和338(再次，編號是指 前體Gag-Pro多蛋白）的真正半脫氨酸殘基改變?yōu)楸彼釟埢?，W防止不希望的副作用諸如 氧化或分子間二硫鍵橋接。所有重組融合多膚變體含有C-末端六組氨酸標簽W便于M-NTA 輔助的純化和重折疊。使用如ikChange (Stratagene，La Jolla, CA, USA)和標準PCR技 術W在各自的表達盒中生成點突變、缺失、插入和延伸變體或限制性位點。
[0072] 下圖顯示具有與其N-端末端同框融合的兩個SlyD分子伴侶單位的N-末端截短的 HTLV-I p24抗原146-344的方案。為了表示SlyD融合伴侶的大腸桿菌來源，已經將描繪的融 合多膚命名為怎C SlyD-怎C SlyD-p24 (146-344)。
[0073] 將所得質粒的插入物測序并發(fā)現(xiàn)其編碼期望的融合蛋白。來自HTLV-I和HTLV-II 的p24融合多膚的完整氨基酸序列顯示于SEQ ID NO.9至16和18至24中。接頭L的氨基酸序 列顯示于沈Q ID NO. 17中。
[0074] 包含來自HTLV-I和HTLV-n的p24和p24變體的融合蛋白的純化 通過使用幾乎相同的方案純化所有p24融合蛋白變體。在37°C在加有卡那霉素(30 pg/ ml)的LB培養(yǎng)基中使攜帶特別的pET24a表達質粒的大腸桿菌化21 (DE3)細胞生長至1.5的 OD60G，并且通過添加1 mM異丙基-β-D-硫代半乳糖巧誘導胞質溶膠過表達。誘導后Ξ小時， 通過離屯、(20min，5000g川欠獲細胞，冷凍并儲存于-20°C。為了細胞裂解，將冷凍的沉淀在冰 冷的50 ml憐酸鋼抑8.0、7.0 Μ G血Cl、5mM咪挫中重懸浮，并且在冰上攬拌懸浮液2小時W 完成細胞裂解。在離屯、和過濾(0.45皿/0.2皿)之后，將粗裂解物應用于用包括5.0 ml TCEP 的裂解緩沖液平衡的Ni-NTA柱上。對于各目標蛋白定制隨后的洗涂步驟并且范圍為5至15 mM咪挫（在50 mM憐酸鋼抑8.0，7.0 Μ G血C1, 5.0 ml TCEP中）。至少應用10-15體積的洗 脫緩沖液。然后，通過50mM憐酸鐘抑8.0、100 ml KCU10 mM咪挫、5.0 mM TCEP替換GdmCl 溶液W誘導基質結合的蛋白的構象重折疊。為了避免共純化蛋白酶的重活化，在重折疊緩 沖液中包括蛋白酶抑制劑混合物(無 Complete?邸TA, Roche)。在過夜反應中應用總共15- 20柱體積的重折疊緩沖液。然后，通過用3-5柱體積50mM憐酸鐘抑8.0、100 mM KCU10 mM 咪挫洗涂而去除TCEP和無 Complete?抓了4抑制劑混合物。隨后，咪挫濃度-仍然在50mM憐酸 鐘抑8.0、100 mM KC1中-升高至20 - 80 mM(取決于各目標蛋白似去除非特異結合的蛋 白污染物。然后通過在相同緩沖液中的500 mM咪挫洗脫天然蛋白。通過化icine-SDS-PAGE 評價含有蛋白的級分的純度并合并所述級分。最后，對蛋白進行大小排阻層析（Superdex HiLoad, Amersham Pharmacia),合并含有蛋白的級分并在Amicon cell (YM10)將其濃縮 至10-20 mg/ml。
[0075] 在偶聯(lián)的純化和重折疊方案之后，可W從1 g大腸桿菌濕細胞獲得約10-30 mg的 蛋白產量，運取決于各目標蛋白。
[0076] 實施例2 光譜學測量 用Uvikon XL雙光束分光光度計進行蛋白濃度測量。通過使用由Pace (1995)， Protein Sci.4, 2411-2423描述的程序測定摩爾消光系數(shù)（6280)。表1中指明了用于獨特的 融合多膚的摩爾消光系數(shù)(ε M280)。
[0077] 表1:本研究中使用的ρ24融合變體的蛋白參數(shù)。所有參數(shù)都是指各自的蛋白單 體。
[0078] 融合多膚變體的氨基酸序列顯示示于SEQ ID NO.9至16和18至24。
[0079] 實施例3 生物素和釘部分與融合蛋白的偶聯(lián) 分別用N-徑基-班巧酷亞胺活化的生物素和釘標記物分子WlO-30 mg/ml的蛋白濃度 修飾融合多膚的賴氨酸ε-氨基基團。標記物/蛋白比率從2:1至5: l(mol:mol)變化，運取決 于各融合蛋白。反應緩沖液是150 ml憐酸鐘抑8.0、100 ml KC1、0.5 ml EDTA。在室溫實施 反應15分鐘并通過添加緩沖的心賴氨酸至10 mM的最終濃度而停止反應。為了避免標記物 的水解失活，在干燥的DMSO(無水品質，Merck,德國）中制備各儲備溶液。研究的所有融合 蛋白均良好耐受反應緩沖液中多至25%的DMSO濃度。在偶聯(lián)反應之后，通過將粗蛋白綴合物 通過凝膠過濾柱(Superdex 200 HiLoad)去除未反應的游離標記物。
[0080] 實施例4 HTLV免疫測定中不同的p24衣殼抗原變體的免疫反應性(即，抗原性） 在自動化Elecsys? 2010和cobas e 411分析儀（Roche Dia即ostics Gm地）中評價 肌LV p24衣殼抗原的多膚融合變體的免疫反應性(抗原性KElecsys?是Roche集團的注冊 商標。W雙抗原夾屯、形式實施測量。
[0081] Elecsys? 2010和cobas e 411中的信號檢測基于電化學發(fā)光。將生物素-綴合物 (即捕獲抗原）固定在鏈霉抗生物素蛋白包被的磁珠的表面上，而檢測-抗原具有絡合的釘 陽離子(在氧化還原態(tài)化和3+之間轉換)作為信號傳導部分。在特異性免疫球蛋白分析物存 在的情況下，生色釘絡合物與固相橋接并在銷電極激發(fā)之后在620 nm發(fā)光。信號輸出為相 對光單位。
[0082] W雙抗原夾屯、（DAGS)免疫測定形式評價重組p24衣殼抗原融合多膚。為此，重組 HTLV-I衣殼抗原p24分別用作生物素綴合物和釘綴合物，W檢測人血清中的抗p24抗體。
[0083] p24是HTLV的免疫顯性抗原之一，并且p24的可溶性變體-如本專利申請中所公 開-是用于檢測HTLV感染的非常有價值的工具。在所有測量中，在反應緩沖液中W大過量 (~10 μg/ml)實施化學聚合和未標記的優(yōu)SlyD- 和優(yōu)Skp作為抗干擾 物質W避免經由分子伴侶融合單位的免疫學交叉反應。
[0084] 具體而言，在本研究中詳細檢查來自HTLV-I的Ξ種p24變體，即全長p24 (146- 344,編號是指Gag-Pro多蛋白前體，參見SEQ ID N0.1和5)、p24 N-末端結構域(P24/NTD, 146-260)和p24 C-末端結構域(P24/CTD, 261-344)。為了檢測抗-p24 IgG分子，在R1(試劑 緩沖液1)和R2(試劑緩沖液2)中分別使用^cSlyD- ^cSlyD-p24-生物素和^cSlyD- SlyD-p24-釘。為了檢測抗-p24 IgM和IgG分子兩者，在R1 (試劑緩沖液1)和R2(試劑緩沖 液2)中分別使用怎C化pA-p24-生物素和怎C化P-P24-釘。R1和R2中的抗原綴合物的濃度分別 各自為100 ng/mLN-末端截短的成熟p24 (146-344)用作生物素-側的怎cSlyD-&?SlyD融 合多膚和釘側的FkpA融合多膚。
[0085] 不幸的是，人HTLV血清轉化實驗對象組-其為用于開發(fā)改進的體外診斷測定法 的不可缺少的工具-是不可商購的。為了評價HTLV感染的非常早期階段中的不同的p24變 體的抗原特性，我們必須回到充當血清轉化模型的兔血清。為此，用純化和滅活的HTLV-I和 -II病毒裂解物(購自Z邱tometrix，化W York, USA)和完全弗氏佐劑免疫新西蘭白兔來誘 導免疫應答(2次免疫，1周時間間隔）。我們意識到，當人中真正HTLV感染之后體液免疫應答 的模式可能不同于由兔的病毒裂解物接種觸發(fā)的免疫應答。然而，人工誘導的兔血清轉化 是我們可得的最好模擬物。
[0086] 在第一個實驗中，在前述DAGS免疫測定設置中用抗-肌LV-陰性人血清評價單體 p24 CTD (p24, 261-344),?知道背景信號。不可避免的系統(tǒng)固有的信號為約500個計數(shù)。 低背景信號表明各自釘綴合物的高溶解度和通常良性的物理化學特性。我們可W從表2推 斷，單體p24 CTD的物理化學特性是優(yōu)異的（第1列）。運同樣適用于寡聚p24 CTD(第2列）： 化pA-p24(261-344)-生物素和&φ-ρ24(261-344)-釘，當用作DAGS形式中的抗原對，導致陰 性人血清的~1100個計數(shù)的背景信號，其明確指出良好的溶解特性。然而，第一眼變得明顯 的是，p24 CTD的單體和寡聚形式在其檢測血清轉化實驗對象組中的抗-HTLV-抗體(且尤其 是IgM分子）的能力方面強烈不同，如表2中所示。更近查看血清轉化K5645,我們發(fā)現(xiàn)，單體 p24 CTD在第18天幾乎沒有檢測為陽性（1558個計數(shù)），而使用寡聚p24 CTD在第14天已經掲 示為明顯陽性的（8232個計數(shù)），并且導致在第18天高達50118個計數(shù)的信號。我們看到用血 清轉化實驗對象組Κ5646、Κ5647和K5648相同的景象:寡聚p24 CTD變體在更早時產生更高 的信號，因此保證在早期檢測血清轉化中的抗-p24抗體的優(yōu)異靈敏度。原則上，該情況與 p24的N-末端結構域(NTD)(其涵蓋氨基酸殘基146-260(編號是指Gag-Pro多蛋白前體））類 似。如同CTD，p24 NTD的寡聚形式更好地適合于檢測血清轉化的早期階段中出現(xiàn)的抗體 (即，Μ型的免疫球蛋白），運特別用血清轉化實驗對象組K5647和K5648例舉（表2,第3和4 列）。然而，當與CTD ρ24相比時，寡聚NTD ρ24的背景信號顯著增加。此外，ρ24的C-末端結構 域的抗原性似乎大大超過Ν-末端結構域的抗原性。總之，ρ24的寡聚C-末端結構域具有顯著 的物理化學特性和優(yōu)異的抗原特性，使其成為HTLV血清學的有吸引力的候選。其在早期IgM 檢測中的靈敏度方面明顯優(yōu)于全長p24(146-344，Gag-pro多蛋白前體的編號）。由于全長 p24 (146-344)的Skp融合多膚因為其顯著趨于聚集而不可得，所W我們被局限于p24全長 版本的SlyD-SlyD和化pA融合多膚。當在DAGS形式的生物素側使用單體SlyD-SlyD-p24 (146-344)且在DAGS形式的釘側使用寡聚化pA-p24 (146-344)時，其結果是相當明確的：全 長p24在血清轉化實驗對象組的晚期階段得到優(yōu)異的信號，但其在早期檢測中完全失敗(表 2,第5列）。寡聚CTD p24和NTD p24兩者均優(yōu)于單體全長變體，提供了良好的證據(jù)證明靈敏 的早期檢測主要取決于使用的p24片段的表位密度。提供完整的p24序列作為整體W獲得優(yōu) 異的血清轉化靈敏度似乎不是強制性的。相反，p24的N和C-結構域中的表位足W保證HTLV 感染的早期階段中的IgM分子的靈敏和可靠的檢測-條件是運些表位W寡聚形式提供。憑 借其優(yōu)異的溶解度（如低背景信號中所反映）及其顯著的抗原性，來自HTLV-I的p24的C-末 端結構域有希望作為HTLV免疫測定中的非常有價值的成分。運有點出乎意料：由于p24衣殼 抗原的C-結構域據(jù)推測參與p24寡聚化化horasanizadeh等人，J. Mol. Biol. (1999) 291，491-505)，我們推理，分離的C-結構域可能可能傾向于聚集，至少其應當比Ν-結構域 更難W處理。而且，我們的預期是，在很大程度上隱藏于成熟衣殼顆粒中的ρ24 C-結構域可 能比充分可及的Ν-結構域具有更少的免疫顯性表位。我們驚訝的是，事實相反。實際上，ρ24 的Ν-結構域也非常適合作為用于HTLV-免疫測定的抗原，盡管其在溶解度和抗原性方面似 乎劣于C-末端結構域。表2顯示來自HTLV-I的p24變體的結果。我們對于來自HTLV-n的相應 的p24變體發(fā)現(xiàn)了幾乎相同的結果。運與我們的預期一致，由于來自HTLV-I和HTLV-II的p24 的氨基酸序列共享84%同一性和93%同源性。來自HTLV-n的p24的相應序列為152-266(N- 結構域，NTD)、267-350(C-結構域，CTD)和152-350(成熟全長p24)，還參見沈Q ID NO.5-8。
[0087]表2:早期HTLV感染中的寡聚p24變體的優(yōu)異的免疫反應性(兔血清轉化實驗對象 組中的增加的靈敏度）。
[00則 實施例5 不對稱雙抗原夾屯、形式的寡聚分子伴侶載體蛋白的組合。
[0089] 基本上如實施例4中所述進行免疫測定。寡聚分子伴侶諸如化pA和Skp可W有利地 用作融合伴侶W實現(xiàn)其各自的客戶抗原的功能寡聚化。FkpA或Skp與目標蛋白（即，其客戶 或客座抗原）的任何可W得到良好定義的寡聚的融合多膚，其適合于在免疫測定中檢測IgM 分子。此處，我們解決了運樣的問題：當WDAGS(雙抗原夾屯、）形式使用時，是否存在Skp-X和 化pA-X融合多膚的特別優(yōu)選的組合。（注：?'通常是指任何目標蛋白或抗原。）換言之，我 們解決了運樣的問題:在(捕獲)生物素偵U、而不是在(信號傳導)釘側使用化pA-X融合多膚 是否是可建議的。相反，我們想知道在(信號傳導)釘側、而不是在(捕獲)生物素側使用Skp- X融合多膚是否是可建議的。
[0090] 在第一個實驗中，如實施例3中所述制備純化的重組怎cSkp和怎C化pA的生物素和 釘綴合物。即，借助N-徑基-班巧酷亞胺-活化的生物素標記物生物素化純化的分子伴侶 (即，沒有任何融合的目標序列的裸分子伴侶）。同樣，借助N-徑基-班巧酷亞胺-活化的釘標 記物產生釘化的分子伴侶(即，沒有任何融合的目標序列的裸分子伴侶）。
[0091] 然后，W不同的濃度在生物素和釘側用i?cSkp進行對稱DAGS。作為樣品，使用抗- HTLV陰性人血清的合并物，并且一式兩份實施測量。從表3中的數(shù)據(jù)顯而易見，當在DAGS形 式的生物素和釘側上使用非常相同的寡聚分子伴侶(此處:i?cSkp)(甚至W非常低的濃度） 時，背景信號是相當高的。背景信號W劑量依賴的方式隨著綴合物濃度強烈增加。因此，當 使用寡聚融合伴侶諸如來自大腸桿菌的Ξ聚分子伴侶Skp時，對稱DAGS形式似乎不是可行 的選項。對于二聚分子伴侶FkpA，已經發(fā)現(xiàn)了類似的結果。
[0092] 表3:在DAGS免疫測定的兩側使用非常相同的寡聚分子伴侶(對稱DAGS形式的寡 聚載體蛋白）
[0093] 然而，當我們W不對稱DAGS形式組合Skp和&?FkpA時，景象變得完全不同（參見 下表4)。無論分子伴侶的組合，當我們在捕獲和信號傳導側使用不同的分子伴侶時，背景信 號顯著降低。例如，在各250 ng/ml的綴合物濃度，對稱（即，Skp-Bi/aq)-Ru) DAGS形式中的 背景信號為約21,000個計數(shù)。在非常相同的綴合物濃度，不對稱DAGS形式中的背景信號分 別急劇降低至2,700個計數(shù)(51^)-81/化94-咖)和860個計數(shù)(。494-81/51^)-腳）。第一眼不言 自明的是，在DAGS免疫測定中的確存在FkpA和Skp的優(yōu)選組合:在DAGS免疫測定中使用化pA 作為生物素綴合物和Skp作為釘綴合物是可建議的，并且得出對于化pA-X和Skp-X融合多膚 也是如此的結論是合理的。
[0094] 表4:在DAGS免疫測定的兩側使用不同的寡聚分子伴侶(不對稱DAGS形式的寡聚 載體蛋白）
[00巧]實施例6 Skp-p24/CTD (267-350)和化pA-p24/CTD (267-350)的CD-檢測的熱誘導的解折疊 用具有恒溫室固定器的化SCO-720分光偏振計記錄近-UV CD光譜，并將其轉化為平均 殘余楠圓率。緩沖液為150 mM憐酸鐘pH 8.0U00 mM KCK0.5 mM EDTA。路徑長度為0.2 cm,蛋白濃度為218 μΜ(是指Skp-p24單體）或147.5 μΜ(是指?ηφΑ-ρ24單體）。測量范圍為 250 - 330 nm，頻帶寬度為1.0 nm，掃描速度為20 nm/min(分辨率為0.5加 1)，且響應為1 S。為了改善信噪比，九次測量光譜，并將其平均化。
[0096] 圓二色光譜(CD)是選擇W評價蛋白的二級和Ξ級結構的方法。芳香族區(qū)域(250- 330 nm)中的楠圓率報道蛋白內的Ξ級接觸（即，經常折疊蛋白的球狀結構），并且被認為是 天然樣折疊(構象)的指紋區(qū)域。
[0097] 分別監(jiān)測51^)可24/押0(267-350)和化94可24/(：了0(267-350)、沈9 10顯.22和21 的近UV CD光譜W解決運樣的問題:作為純化過程中的關鍵步驟的基質偶聯(lián)的重折疊程序 之后，融合蛋白是否采用有序構象。答案是相當明確的：Skp-p24/CTD(參見圖1)和化pA- p24/CTD(參見圖3)兩者的近UV CD信號明確報道了各融合多膚的有序Ξ級結構。顯然，Skp- P24/CTD和化pA-p24/CTD的芳香族殘基被嵌于親脂性蛋白核屯、中，并且因此經歷不對稱環(huán) 境，其強烈指向各自的融合構建體內的載體和目標蛋白組分的天然樣構象。Skp-p24/CTD的 近UV CD光譜表現(xiàn)出在282和277皿具有最大值的陰性信號（圖l)DFkpA-p24/CTD的近UV CD 光譜表現(xiàn)出在280 nm具有最大值的陽性信號（圖3)。
[0098] 為了解決Skp-p24/CTD和inq)A-p24/CTD的熱誘導的解折疊是否是可逆的問題，分 別在277和280 nm的檢測波長的近UV區(qū)域中監(jiān)測烙化曲線。溫度范圍為20-75°C，頻帶寬度 為2.0 nm，溫度斜率為rC/min，且響應為2 S。
[0099] 在分別對應于Skp-p24/CTD和inq)A-p24/CTD的最大信號振幅的277和280 nm監(jiān)測 熱誘導的解折疊。加熱后，穩(wěn)定融合多膚分子的天然構象的非共價接觸變得松散，并且最終 分解。對于Skp-p24/CTD，該熱誘導的解折疊（如在277 nm所監(jiān)測）反映于CD信號的增加，如 圖2中所示。Skp-p24/CTD明顯直至55°C保留其天然樣折疊及其Ξ聚結構。解折疊的開始在 55°C和60°C之間。在70°C，分子是完全解折疊，如通過圖2中的烙化曲線所判斷。引人注目的 是，當將蛋白溶液冷卻至20°C時，CD信號得到恢復（圖1、2)。然而，重折疊曲線的滯后是顯著 的，并且可能指向解折疊和重折疊的不同途徑。令人驚訝的是，復雜Ξ聚融合蛋白諸如Skp- P24/CTD的熱誘導的解折疊-至少部分地-是可逆過程。已經預期，Skp-p24/CTD，在熱誘 導的解折疊并解離成單體亞基之后，將在升高溫度諸如75Γ非常迅速且定量地聚集。然而， 我們發(fā)現(xiàn)，當?shù)鞍兹芤罕焕鋮s至20°C時，Skp-p24/CTD顯然能夠重新采用其天然樣構象。的 確，在熱誘導的解折疊之前和之后監(jiān)測的近UV CD光譜幾乎重疊(參見圖1)?？傊琒kp-p24/ CTD具有穩(wěn)健的折疊特性，其對于具有運樣程度的復雜性的分子是優(yōu)異的，并且對于免疫測 定中使用的抗原是高度期望的。我們對于化PA-P24/CTD發(fā)現(xiàn)了非常類似的結果：就像Skp- P24/CTD，!^pA-p24/CTD在近UV區(qū)域(250-330 nm，在280 nm信號最大）中表現(xiàn)出顯著的CD信 號，指向基質偶聯(lián)的重折疊過程之后的充分有序的構象（圖3)。當分子解折疊并失去其Ξ級 結構時，inq)A-p24/CTD的CD信號強烈降低（圖4)。借助熱轉變，我們觀察到，F(xiàn)kpA-p24/CTD的 確在直至55°C的溫度保留其天然樣構象。解折疊的開始-如通過在28化m的近UV CD光譜所 監(jiān)測-為60°C左右，并且在70°C，F(xiàn)kpA-p24/CTD被完全解折疊。值得注意的是，在熱解折疊/ 重折疊循環(huán)之后，完全恢復天然化PA-P24/CTD分子的CD信號（圖4)。如圖3中所舉例說明，解 折疊/重折疊循環(huán)之后的FkpA-p24/CTD的CD光譜幾乎完美重疊。
[0100]總之，Skp-p24/CTD和化pA-p24/CTD具有非常穩(wěn)健的折疊特性，其對于具有運樣程 度的復雜性的分子是優(yōu)異的，并且對于充當免疫測定中的抗原成分（即，指示劑）的融合多 膚是高度期望的。
【主權項】
1. 可溶性HTLVp24抗原，其包含如SEQIDN0.2或SEQIDN0.6中指定的HTLVp24的N-末端結構域(NTD)，其中所述HTLV p24抗原缺乏如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.7中指定的C-末端結構域(CTD)。2. 可溶性HTLVp24抗原，其包含如SEQIDN0.3或SEQIDN0.7中指定的HTLVp24的C-末端結構域，其中所述HTLV p24抗原缺乏如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6中指定的N-末端結 構域。3. 根據(jù)權利要求1或2所述的可溶性HTLV p24抗原，其中所述可溶性HTLV p24抗原融合 至分子伴侶。4. 根據(jù)權利要求3所述的可溶性HTLV p24抗原，其中所述分子伴侶是寡聚分子伴侶。5. 根據(jù)權利要求4所述的可溶性HTLV p24抗原，其中所述寡聚分子伴侶是選自Skp和 FkpA的分子伴侶。6. 產生可溶性和免疫反應性HTLV p24抗原的方法，所述方法包括以下步驟 -培養(yǎng)用表達載體轉化的宿主細胞，所述表達載體包含可操作連接的重組DNA分子，所 述重組DNA分子編碼根據(jù)權利要求1至5中任一項所述的HTLV p24抗原 -表達所述HLTV p24抗原，和 -純化所述HLTV p24抗原。 7. HTLV抗原的組合物，其包含根據(jù)權利要求1至5所述的HTLV p24抗原和包含根據(jù)SEQ ID NO.25所述的氨基酸序列的HTLV gp21抗原，其中所述p24和gp21抗原被表達為分開的多 肽。8. 用于檢測分離的樣品中的對于HTLV特異性的抗體的方法，其中根據(jù)權利要求1至5所 述的HTLV p24抗原或根據(jù)權利要求7所述的HTLV抗原的組合物用作所述HTLV抗體的捕獲試 劑和/或結合伴侶。9. 用于檢測分離的樣品中的對于HTLV特異性的抗體的方法，所述方法包括 a) 通過混合體液樣品與根據(jù)權利要求1至5中任一項所述的HTLV p24抗原或根據(jù)權利 要求7所述的HTLV抗原的組合物而形成免疫反應混合物 b) 維持所述免疫反應混合物一定時間段，所述時間段足以允許所述體液樣品中存在 的針對所述HTLV抗原或HTLV抗原的組合物的抗體與所述HTLV抗原或HTLV抗原的組合物免 疫反應，以形成免疫反應產物;和 c) 檢測所述免疫反應產物中的任一種的存在和/或濃度。10. 根據(jù)權利要求9所述的用于檢測分離的樣品中的對于HTLV特異性的抗體的方法，其 中以不對稱雙抗原夾心形式實施所述免疫反應，其包括 a) 向所述樣品添加可以直接或間接結合至固相且攜帶作為生物親和結合對的部分的 效應基團的第一HTLV p24抗原和攜帶可檢測標記物的第二HTLV p24抗原，其中所述第一和 第二HTLV p24抗原特異性結合至所述抗-HTLV抗體 b) 形成包含第一抗原、樣品抗體和第二抗原的免疫反應混合物，其中在形成所述免疫 反應混合物之前、期間或之后添加攜帶所述生物親和結合對的相應效應基團的固相， c) 維持所述免疫反應混合物一定時間段，所述時間段足以允許所述體液樣品中的針 對所述HTLV p24抗原的抗-HTLV抗體與所述HTLV p24抗原免疫反應，以形成免疫反應產物， d) 將液相與固相分離 e)檢測所述固相或液相或兩者中所述免疫反應產物中的任一種的存在。11. 根據(jù)權利要求10所述的用于檢測對于HTLV特異性的抗體的方法，其中所述第一抗 原是融合至FkpA且攜帶生物素部分的HTLV p24抗原，且所述第二抗原是融合至Skp的HTLV P24抗原且用電化學發(fā)光釕絡合物標記，或 其中所述第一抗原是融合至Skp且攜帶生物素部分的HTLV p24抗原，所述第二抗原是 融合至FkpA的HTLV p24抗原且用電化學發(fā)光釕絡合物標記。12. 根據(jù)權利要求1至5中任一項所述的HTLV p24抗原或根據(jù)權利要求7所述的HTLV抗 原的組合物在用于檢測抗-HTLV抗體的體外診斷測試中的用途。13. 用于檢測抗-HTLV抗體的試劑盒，其包含至少一種根據(jù)權利要求1至5中任一項所述 的HTLV p24抗原或根據(jù)權利要求7所述的HTLV抗原組合物。
【文檔編號】G01N33/569GK106029687SQ201580010787
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2015年2月26日
【發(fā)明人】E.法茨, P.明希, C.肖爾茨
【申請人】豪夫邁·羅氏有限公司