離體的抗體生產(chǎn)的制作方法【專利摘要】本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)倍增時間短的改進(jìn)的離體B細(xì)胞培養(yǎng)物的手段和方法?！緦＠f明】離體的抗體生產(chǎn)
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥、分子生物學(xué)和免疫學(xué)的領(lǐng)域。【
背景技術(shù)：
】[0002]離體的B細(xì)胞培養(yǎng)物是生產(chǎn)抗體，優(yōu)選單克隆抗體的重要工具。單克隆抗體(mAb)代表一種抗體分子的多個相同拷貝，這些拷貝以相同的親和性結(jié)合抗原，并且促進(jìn)相同的效應(yīng)子功能。在mAb的益處之中，是它們對抗原上的同一表位的特異性。與其它常規(guī)治療相比，該特異性賦予mAb特定的臨床優(yōu)點(diǎn)，同時賦予患者通常具有低副作用的有效且耐受良好的治療選擇。此外，mAb可用于生物和醫(yī)學(xué)研究。[0003]獲得mAb的常規(guī)途徑是雜交瘤技術(shù)，其中B細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，以形成產(chǎn)生雜交抗體的細(xì)胞系（雜交瘤）。但是，使用人B細(xì)胞的雜交瘤技術(shù)不是很成功，因?yàn)榈玫降碾s交瘤是不穩(wěn)定的。同時，已經(jīng)開發(fā)了改進(jìn)的技術(shù)，其中生產(chǎn)具有延長的復(fù)制壽命的離體B細(xì)胞培養(yǎng)物(W02007/067046)。該技術(shù)涉及人的離體培養(yǎng)物，其中在B細(xì)胞中表達(dá)Bcl-6以及Blimp-1和/或抗凋亡的核酸。這改善了這些B細(xì)胞的復(fù)制壽命。典型地，培養(yǎng)人的B細(xì)胞，以獲得人mAb。對于人類中的治療應(yīng)用來說，人mAb是優(yōu)選的，因?yàn)榕c其它物種的抗體相比，人mAb具有較低的免疫原性。使用W02007/067046的技術(shù)，獲得了平均倍增時間約為25~36小時的離體的人B細(xì)胞培養(yǎng)物。[0004]為了工業(yè)生產(chǎn)感興趣的mAb，諸如治療mAb，有利地使用B細(xì)胞培養(yǎng)物，其中的B細(xì)胞具有較短的倍增時間。在如癌癥治療的治療途徑中，例如當(dāng)使用患者的癌細(xì)胞對非人的哺乳動物進(jìn)行免疫，隨后從動物中收獲癌癥特異性B細(xì)胞并且用于離體的抗體生產(chǎn)時，較短的倍增時間也是非常重要的。因?yàn)檫@樣的抗體是對個體患者的定制型藥物，應(yīng)當(dāng)盡快生產(chǎn)這些抗體，以便患者能夠盡快開始他/或她的Ab治療。對個體腫瘤具有特異性的上述抗體是不能提前生產(chǎn)的。【
發(fā)明內(nèi)容】[0005]本發(fā)明的目標(biāo)之一是提供用于生產(chǎn)具有較短倍增時間的改進(jìn)的離體B細(xì)胞培養(yǎng)物的手段和方法。[0006]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)當(dāng)使用兔B細(xì)胞時，獲得了與W02007/067046中公開的B細(xì)胞培養(yǎng)物相比，具有更短倍增時間的B細(xì)胞培養(yǎng)物。然后，普遍使用的B細(xì)胞，諸如人的B細(xì)胞、鼠的B細(xì)胞和美洲駝的B細(xì)胞一般具有25~36小時的倍增時間，本發(fā)明人驚奇地發(fā)現(xiàn)可獲得具有20小時或更短的倍增時間的兔B細(xì)胞培養(yǎng)物。這一發(fā)現(xiàn)允許顯著更快地生產(chǎn)感興趣的抗體，在給定時間范圍內(nèi)得到更高的產(chǎn)量，這對于抗體的工業(yè)生產(chǎn)和治療應(yīng)用是特別有價值的。[0007]相應(yīng)地，本發(fā)明提供了兔B細(xì)胞在獲得具有20小時或更短的平均倍增時間的離體B細(xì)胞培養(yǎng)物中的應(yīng)用。一般通過在兔B細(xì)胞中表達(dá)Bcl-6或其兔同源物，和抗凋亡的核酸分子，來獲得根據(jù)本發(fā)明的離體兔B細(xì)胞培養(yǎng)物。因此，進(jìn)一步提供了一種獲得具有20小時或更短的平均倍增時間的離體B細(xì)胞培養(yǎng)物的方法，所述方法包括：[0008]-在B細(xì)胞中，誘導(dǎo)、增強(qiáng)和/或維持Bcl-6或其兔同源物的表達(dá)；以及[0009]-在所述B細(xì)胞中，誘導(dǎo)、增強(qiáng)和/或維持抗凋亡的核酸分子的表達(dá)，[0010]其特征在于，所述B細(xì)胞是兔B細(xì)胞。[0011]優(yōu)選地，生產(chǎn)具有小于20小時的平均倍增時間的離體兔B細(xì)胞培養(yǎng)物。更優(yōu)選地，上述平均倍增時間小于19小時或甚至小于18小時。較短的倍增時間允許較快和較高的抗體生產(chǎn)，這改善了測試和篩選期望抗體的時間和效率，并且改善了感興趣抗體的分離和/或鑒定。此外，如果需要開發(fā)針對個體患者的mAb，則兔B細(xì)胞的較短的倍增時間允許更快地開始患者的特異性mAb治療。[0012]因此，根據(jù)本發(fā)明的方法使用兔B細(xì)胞提供了以下優(yōu)點(diǎn)：與目前已知的人、鼠或美洲駝的B細(xì)胞培養(yǎng)物相比，可在更短的時間范圍內(nèi)離體獲得、測試、鑒定、分離和/或生產(chǎn)抗體。[0013]本發(fā)明提供具有短倍增時間的B細(xì)胞培養(yǎng)物這一事實(shí)提供了以下優(yōu)點(diǎn)：與現(xiàn)有方法相比，可在更短的時間段內(nèi)獲得足量的抗體。例如，在W02007/067046公開的方法中，使用Bcl-6和抗凋亡的核酸(或增加這樣的核酸表達(dá)的化合物)穩(wěn)定從人類個體中獲得的B細(xì)胞集合，隨后進(jìn)行培養(yǎng)。這樣得到能夠增殖且生產(chǎn)抗體的穩(wěn)定的人的B細(xì)胞。在培養(yǎng)過程中，穩(wěn)定的B細(xì)胞生產(chǎn)抗體，該抗體被分泌到培養(yǎng)基中。隨后，優(yōu)選測試這些抗體的期望的特異性(和/或親和性）。對于目前的測試程序，一般需要抗體濃度至少為l〇〇ng/ml培養(yǎng)基。在穩(wěn)定的人的B細(xì)胞培養(yǎng)15~20天之后，獲得這樣的最小抗體濃度。因此，使用人的B細(xì)胞培養(yǎng)物，抗體在開始培養(yǎng)之后至少15~20天，一般大約在第20天進(jìn)行收獲。美洲駝的B細(xì)胞具有與人的B細(xì)胞類似的生長速率，因此如果使用美洲駝的B細(xì)胞培養(yǎng)物，則一般也在開始培養(yǎng)之后至少15~20天時收獲抗體。鼠的B細(xì)胞具有更長的倍增時間，一般在超過20天之后獲得100ng/ml最小濃度的抗體。[0014]在測試抗體之后，常常選擇并且分離出感興趣的對應(yīng)的B細(xì)胞，以備進(jìn)一步的使用。鑒于抗體測試正常耗費(fèi)約三天，則一般從開始B細(xì)胞培養(yǎng)18~23天之后選擇并且分離出感興趣的人或美洲駝的B細(xì)胞，而一般在超過23天之后選擇并且分離出感興趣的鼠的B細(xì)胞。然后，對分離出的B細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步培養(yǎng)。因此，一般從開始B細(xì)胞培養(yǎng)約三周之后，獲得具有感興趣的人、美洲駝或鼠的B細(xì)胞的B細(xì)胞培養(yǎng)物。然而，使用根據(jù)本發(fā)明的方法，在11~12天之后已經(jīng)獲得了至少100ng/ml的抗體濃度。因此，現(xiàn)在能夠在開始B細(xì)胞培養(yǎng)之后11~12天時收獲抗體，而之前，在收獲抗體之前必須使人(或美洲駝)的B細(xì)胞培養(yǎng)物維持至少15~20天。如果測試程序耗費(fèi)三天，則從開始B細(xì)胞培養(yǎng)14~15天內(nèi)選擇并且分離出感興趣的兔B細(xì)胞，這顯著快于培養(yǎng)人或鼠的B細(xì)胞的情況?？傊@得生產(chǎn)足夠濃度的抗體的人、美洲駝或鼠的B細(xì)胞培養(yǎng)物一般耗費(fèi)約三周，而本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)，在兩周之后就獲得了具有生產(chǎn)足夠Ab濃度的兔B細(xì)胞的B細(xì)胞培養(yǎng)物。這是與現(xiàn)有方法相比的主要優(yōu)點(diǎn)。因此，本發(fā)明的一個方面提供了獲得抗體的方法，優(yōu)選用于需要最小抗體濃度至少為l〇〇ng/ml的一種或多種測試檢驗(yàn)中，該方法包括：[0015]-在兔B細(xì)胞中，誘導(dǎo)、增強(qiáng)和/或維持Bcl-6的表達(dá)；[0016]-在所述B細(xì)胞中，誘導(dǎo)、增強(qiáng)和/或維持抗凋亡的核酸分子的表達(dá)；[0017]-離體培養(yǎng)所述B細(xì)胞；以及[0018]-在10~14天內(nèi)，優(yōu)選在11~12天內(nèi)，收獲由所述B細(xì)胞生產(chǎn)的抗體。優(yōu)選使用需要最小抗體濃度至少為lOOng/ml的一種或多種檢驗(yàn)，來測試收獲的上述抗體。[0019]如上所述，獲得的抗體一般用于測試期望的特異性和/或親和性。目前的測試方法常常需要l〇〇ng/ml的最小抗體濃度，但是如果使用更敏感的檢測方法，則能提前收獲抗體。無論測試方法的敏感性如何，由于兔B細(xì)胞的倍增時間顯著更快，因此根據(jù)本發(fā)明的方法使用兔B細(xì)胞，能比使用目前已知的人、美洲駝或鼠的B細(xì)胞更早地得到所需的最小抗體濃度。例如，如果僅需要30ng/ml的最小抗體濃度，則使用人的B細(xì)胞通常從在開始B細(xì)胞培養(yǎng)13~18天之后達(dá)到該濃度，而兔B細(xì)胞培養(yǎng)僅需9~10天就會到該最小抗體濃度。因此，同樣地可更早地進(jìn)行抗體測試和感興趣的B細(xì)胞的分離。在實(shí)踐中，本發(fā)明人從開始B細(xì)胞培養(yǎng)7~14天內(nèi)，得到并且測試了兔的抗體。在本發(fā)明之前，不能獲得與離體的人類B細(xì)胞培養(yǎng)物相比，能夠在顯著更早的階段進(jìn)行抗體測試的離體的B細(xì)胞培養(yǎng)物。因此，進(jìn)一步提供了獲得抗體的方法，該方法包括：[0020]-在兔B細(xì)胞中，誘導(dǎo)、增強(qiáng)和/或維持Bcl-6或其兔同源物的表達(dá)；[0021]-在所述兔B細(xì)胞中，誘導(dǎo)、增強(qiáng)和/或維持抗凋亡的核酸分子的表達(dá)；[0022]_離體培養(yǎng)所述B細(xì)胞；以及[0023]-在7~14天內(nèi)，優(yōu)選在9~12天或9~10天內(nèi)，收獲由所述B細(xì)胞生產(chǎn)的抗體。優(yōu)選使用需要最小抗體濃度約為30ng/ml的一種或多種檢驗(yàn)，來測試收獲的所述抗體。[0024]如本文所使用的，術(shù)語"兔B細(xì)胞"指已經(jīng)從兔獲得的B細(xì)胞，或者來源于兔B細(xì)胞的B細(xì)胞。來源于兔B細(xì)胞的B細(xì)胞的實(shí)例是兔B細(xì)胞在一次或多次細(xì)胞分裂周期之后形成的后代。這樣的后代例如包括兔B細(xì)胞的離體培養(yǎng)物。[0025]離體兔B細(xì)胞培養(yǎng)物是包含兔B細(xì)胞和/或其后代的培養(yǎng)物。其它類型的細(xì)胞也可存在于培養(yǎng)物中。例如，諸如CD40陽性L細(xì)胞和/或EL4B5細(xì)胞的B細(xì)胞刺激細(xì)胞通常也存在于根據(jù)本發(fā)明的B細(xì)胞培養(yǎng)物中。此外，也存在于含B細(xì)胞樣品中的其它類型的細(xì)胞仍然可存在于B細(xì)胞培養(yǎng)物中。當(dāng)在B細(xì)胞培養(yǎng)條件下存在時，這些非B細(xì)胞的增殖能力通常比B細(xì)胞弱，這樣的污染細(xì)胞的數(shù)目通常會隨時間逐漸降低。優(yōu)選地，兔B細(xì)胞培養(yǎng)物的至少70%的細(xì)胞是兔B細(xì)胞。更優(yōu)選地，上述兔B細(xì)胞培養(yǎng)物的至少75%、80%、85%、90%或95%的細(xì)胞是兔B細(xì)胞。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，兔B細(xì)胞和諸如CD40陽性L細(xì)胞和/或EL4B5細(xì)胞的B細(xì)胞刺激細(xì)胞基本是在兔B細(xì)胞培養(yǎng)物中存在的僅有的細(xì)胞類型。[0026]優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的兔B細(xì)胞培養(yǎng)物的B細(xì)胞是一個原始的兔B細(xì)胞的后代，這樣通過所述B細(xì)胞培養(yǎng)物來生產(chǎn)單克隆抗體。[0027]術(shù)語"平均倍增時間"在本文中被限定為，從具有一定初始量的B細(xì)胞的培養(yǎng)物開始，至獲得具有該初始B細(xì)胞量的兩倍數(shù)量的B細(xì)胞的培養(yǎng)物，所需的平均時間。因?yàn)椴皇敲恳粋€B細(xì)胞都會以完全相同的速率進(jìn)行增殖，因此平均值通常用于作為一個整體的B細(xì)胞培養(yǎng)物。[0028]Bcl-6編碼正常B細(xì)胞和T細(xì)胞的發(fā)育和成熟，以及形成生發(fā)中心所需的轉(zhuǎn)錄阻抑因子。Bcl-6在生發(fā)中心的B細(xì)胞中高表達(dá)，而幾乎不在漿細(xì)胞中表達(dá)。Bcl-6抑制活化的B細(xì)胞分化成漿細(xì)胞。在根據(jù)本發(fā)明的方法中，Bcl-6的表達(dá)產(chǎn)物，或其兔同源物的表達(dá)產(chǎn)物，依然存在于離體培養(yǎng)物的兔B細(xì)胞中。Be1-6或其兔同源物的存在，與抗凋亡的核酸的存在一起，延長了B細(xì)胞的復(fù)制壽命。優(yōu)選通過向用于培養(yǎng)的兔B細(xì)胞給予促Bcl-6表達(dá)的化合物或促Bcl-6的兔同源物的表達(dá)的化合物，或通過在上述化合物的存在下培養(yǎng)兔B細(xì)胞，誘導(dǎo)、增強(qiáng)或維持Bcl-6或其兔同源物的表達(dá)。[0029]因此，進(jìn)一步提供了根據(jù)本發(fā)明的方法，該方法包括：[0030]-向所述兔B細(xì)胞提供能直接或間接增強(qiáng)Bcl-6的表達(dá)或Bcl-6的兔同源物的表達(dá)的化合物;和/或[0031]-在能直接或間接增強(qiáng)Bcl-6的表達(dá)或Bcl-6的兔同源物的表達(dá)的化合物的存在下，培養(yǎng)所述兔B細(xì)胞。[0032]能直接或間接增強(qiáng)Bcl-6的表達(dá)或Bcl-6的兔同源物的表達(dá)的各種化合物在本領(lǐng)域中是已知的。這樣的化合物例如包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子5(STAT5)蛋白，或其兔同源物，或其功能部分或功能衍生物，和/或編碼STAT5的核酸序列。STAT5是能增強(qiáng)Bcl-6表達(dá)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子。STAT5存在兩種已知的形式，STAT5a和STAT5b，這是由兩個不同的串聯(lián)連接的基因編碼的。給予和/或活化STAT5或其兔同源物使Bcl-6水平增強(qiáng)，或使Bcl-6的兔同源物水平增強(qiáng)。因此，STAT5或其兔同源物或其功能部分或功能衍生物能夠直接增加Bcl-6的表達(dá)或Bcl-6的兔同源物的表達(dá)。因此，提供了根據(jù)本發(fā)明的方法，該方法包括：向所述兔B細(xì)胞提供STAT5，或其兔同源物，或其功能部分或功能衍生物;或者，向所述兔B細(xì)胞提供編碼STAT5,或其兔同源物，或其功能部分或功能衍生物的核酸分子;或者，在STAT5的存在下，或在其兔同源物或其功能部分或功能衍生物的存在下，培養(yǎng)所述兔B細(xì)胞。[0033]STAT5或其兔同源物的存在直接增加Bcl-6的量或Bcl-6的兔同源物的量。還可以間接增加Bcl-6的表達(dá)或Bcl-6的兔同源物的表達(dá)。這例如通過調(diào)節(jié)特定化合物的量來完成，該特定化合物反過來能夠直接或間接活化STAT5或其兔同源物，和/或增加STAT5的表達(dá)或其兔同源物的表達(dá)。因此，在一個實(shí)施方式中，增加了內(nèi)源性和/或外源性STAT5的表達(dá)和/或活性，或其兔同源物的表達(dá)。例如，通過在白介素（IL)2和/或IL4的存在下培養(yǎng)兔B細(xì)胞，可以間接增強(qiáng)Bcl-6的表達(dá)或其兔同源物的表達(dá)，其中IL2和/或IL4能夠活化STAT5或活化STAT5的兔同源物，該STAT5或其兔的同源物反過來增加Bcl-6的表達(dá)或Bcl-6的兔同源物的表達(dá)。[0034]如本文所使用的，術(shù)語Bcl-6或STAT5的"兔同源物"例如指對應(yīng)于Bcl-6或STAT5的兔的蛋白，這意味著與人B細(xì)胞中的Bcl-6或STAT5的功能相比，Bcl-6或STAT5的"兔同源物"在兔B細(xì)胞中具有對應(yīng)的類似的功能。[0035]但是，優(yōu)選提供兔B細(xì)胞，該兔B細(xì)胞具有編碼Be1-6或編碼其兔同源物或其功能部分或功能衍生物的核酸分子。通過這種方式，可以直接調(diào)節(jié)所述兔B細(xì)胞中的Be1-6的濃度或其兔同源物的濃度。因此，還提供了根據(jù)本發(fā)明的方法，該方法包括:向所述兔B細(xì)胞提供編碼Bcl-6或編碼Bcl-6的兔同源物，或其功能部分或功能衍生物的核酸分子。在一個實(shí)施方式中，所述核酸分子是組成性活化的，這意味著Bcl-6或其兔同源物或其功能部分或功能衍生物是不依賴于調(diào)節(jié)因子的存在而持續(xù)表達(dá)。在另一實(shí)施方式中，所述核酸分子是可誘導(dǎo)的，這意味著該核酸分子的表達(dá)受至少一種誘導(dǎo)因子和/或阻抑因子的調(diào)節(jié)。通過這種方式，所述核酸分子的表達(dá)可隨意進(jìn)行調(diào)節(jié)。例如，Tet-On和Tet-Off表達(dá)系統(tǒng)（例如Tet-On?和Tet-Q.iK|).AdvancedInducibleGeneExpressionSystems，Clontech)可用于感興趣的核酸序列的誘導(dǎo)性表達(dá)。在這些系統(tǒng)中，轉(zhuǎn)錄活化因子(tTA)的表達(dá)受到四環(huán)素(TC)或衍生物如強(qiáng)力霉素(dox)的存在(Tet-On)或不存在(Tet-Off)的調(diào)節(jié)。原則上來講，tTA由大腸桿菌(Escherichiacoli)Tet阻抑因子蛋白（TetR)和單純皰疹(Herpessimplex)病毒反式激活結(jié)構(gòu)域VP16構(gòu)成。tTA在四環(huán)素反應(yīng)元件(TRE)的控制下調(diào)節(jié)感興趣的核酸序列的轉(zhuǎn)錄，該四環(huán)素反應(yīng)元件(TRE)包括Tet操縱子(TetO)DNA序列和啟動子序列，例如人類巨細(xì)胞病毒(hCMV)啟動子序列?？蓪⒕幋a例如Bcl6或其兔同源物或其功能部分或功能衍生物的核酸序列放置在該啟動子的下游。[0036]在Tet-off系統(tǒng)中，tTA在沒有TC或dox的情況下結(jié)合TRE并且活化感興趣的核酸序列的轉(zhuǎn)錄，而在TC或dox的存在下，tTA不能結(jié)合TRE并且抑制感興趣的核酸序列的表達(dá)。與此相反，Tet-on系統(tǒng)使用反式tTA(rtTA)，該反式tTA(rtTA)僅在dox存在下結(jié)合TRE。感興趣的核酸序列的轉(zhuǎn)錄在沒有dox的情況下被抑制，而在存在dox的情況下被活化。[0037]在另一實(shí)施方式中，使用激素誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)，諸如蛻皮激素誘導(dǎo)的基因表達(dá)系統(tǒng)（例如RheoSvvitcldNewEnglandBiolabs)(Christopherson，K.S.etal.PNAS89，6314-8(1992))，來執(zhí)行誘導(dǎo)性表達(dá)。銳皮激素是來自例如果繩（Drosophilamelanogaster)的昆蟲類固醇激素。在轉(zhuǎn)染有蛻皮激素受體的細(xì)胞中，在蛻皮激素激動劑的存在下，形成由蛻皮激素受體(Ecr)和類視黃醇X受體(RXR)組成的異二聚體，其中蛻皮激素激動劑選自蛻皮激素，它的一種類似物(諸如幕黎留酮(muristeroneM和百日青蛻皮酮(ponasterone)A)，和非類固醇銳皮激素激動劑。在激動劑的存在下，Ecr和RXR相互作用并且結(jié)合存在于表達(dá)盒上的蛻皮激素反應(yīng)元件。因此，通過將兔B細(xì)胞暴露于蛻皮激素激動劑，誘導(dǎo)位于蛻皮激素反應(yīng)元件下游的表達(dá)盒中的感興趣的核酸序列的表達(dá)。[0038]在本發(fā)明的又一實(shí)施方式中，使用阿拉伯糖誘導(dǎo)性基因表達(dá)系統(tǒng)(例如pBAD/glll試劑盒，Invitrogen)(Guzman，L.M.etal.Bacteriol177，4121_4130(1995))，執(zhí)行誘導(dǎo)性表達(dá)。阿拉伯糖是含五個碳原子的單糖。在轉(zhuǎn)染有阿拉伯糖誘導(dǎo)性啟動子PBAD的細(xì)胞中，可在阿拉伯糖的存在下，誘導(dǎo)位于PBAD下游的感興趣的核酸序列的表達(dá)。[0039]還可以使用Bcl-6蛋白，或其兔同源物，或其功能部分或功能衍生物（編碼它們的核酸分子），其中所述Bcl-6蛋白或兔同源物或功能部分或功能衍生物受到至少一種誘導(dǎo)因子和/或阻抑因子的調(diào)節(jié)。非限制性實(shí)例是一融合蛋白，其中調(diào)節(jié)元件與編碼Bcl-6或其兔同源物的至少一部分的序列融合。例如，雌激素受體(ER)與Bcl-6融合，產(chǎn)生融合蛋白ER-Bcl-6。該融合蛋白是沒有活性的，因?yàn)樗c細(xì)胞質(zhì)中的熱休克蛋白形成復(fù)合體。當(dāng)給予外源性誘導(dǎo)因子4羥基三苯氧胺(4HT)時，融合蛋白ER-Bcl-6與熱休克蛋白解離，以便融合蛋白的Bcl-6部分變成有活性的。[0040]如本文所使用的，術(shù)語"抗凋亡的核酸分子"指能夠延遲和/或阻止兔B細(xì)胞中的凋亡的核酸分子。優(yōu)選地，所述抗凋亡的核酸分子能夠延遲和/或阻止能增殖并且產(chǎn)生抗體的漿母細(xì)胞樣兔B細(xì)胞的凋亡。優(yōu)選地，所使用的抗凋亡的核酸分子包括外源性核酸分子。這意味著，所使用的核酸序列不是在兔B細(xì)胞中天然表達(dá)的，或者使用天然存在的核酸序列的額外拷貝，這樣與天然的兔B細(xì)胞相比，增強(qiáng)在得到的兔B細(xì)胞中的表達(dá)。各種抗凋亡的核酸分子在本領(lǐng)域中是已知的，這樣可獲得各種實(shí)施方式。優(yōu)選地，所使用的抗凋亡的核酸分子是Bcl-2家族的抗凋亡成員，因?yàn)榭沟蛲龅腂cl-2蛋白是B細(xì)胞中優(yōu)秀的凋亡抑制因子。受到Bcl-2家族(該家族包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白）控制的很多過程都與凋亡的線粒體途徑相關(guān)。使用抗凋亡的Bcl-2家族成員此1-2、8〇1-認(rèn)、8〇1-?、8(31-2相關(guān)蛋白41(也被稱為Bcl2-Al或Al)、Bcl-2樣10(Bcl2L10)和Mcl-1，或其兔同源物，或其功能部分或功能衍生物是優(yōu)選的，因?yàn)榇?-2、8〇111^、8(：1-￥^1、8(312110和11-1通常與線粒體外膜整合。它們直接結(jié)合且抑制屬于Bcl-2家族的促凋亡蛋白，以保護(hù)線粒體膜的完整性。[0041]因此，優(yōu)選實(shí)施方式提供了根據(jù)本發(fā)明的方法，其中，所述抗凋亡的核酸分子包括Bcl2家族的抗凋亡基因，優(yōu)選Bcl-xL或Mcl-1或Bcl-2或A1或Bcl-w或Bcl2L10,或其兔同源物，或其功能部分或功能衍生物。[0042]在一個實(shí)施方式中，通過向兔B細(xì)胞給予能夠促進(jìn)這些抗凋亡基因的表達(dá)的至少一種化合物，或在這樣的化合物的存在下培養(yǎng)兔B細(xì)胞，來誘導(dǎo)、增強(qiáng)或維持Bcl-xL或Mcl-1或Bcl-2或A1或Bcl-w或Bcl2L10,或其兔同源物的表達(dá)。因此，進(jìn)一步提供了根據(jù)本發(fā)明的方法，該方法包括：[0043]-向所述兔B細(xì)胞提供能夠直接或間接增強(qiáng)Bcl-xL和/或Mcl-1和/或Bcl-2和/或A1和/或Bcl-w和/或Bel2L10，或其兔同源物的表達(dá)的化合物;和/或[0044]-在能夠直接或間接增強(qiáng)Bcl-xL和/或Mcl-1和/或Bcl-2和/或A1和/或Bcl-w和/或Bcl2L10,或其兔同源物的表達(dá)的化合物的存在下，培養(yǎng)所述兔B細(xì)胞。[0045]但是，優(yōu)選向兔B細(xì)胞提供編碼Bcl2家族的抗凋亡基因的至少一種核酸分子，該Bcl2家族的抗凋亡基因優(yōu)選選自由Bcl-xL、Mcl-l、Bcl-2、Al、Bcl-w、Bcl2L10,及其兔同源物，及其功能部分和功能衍生物所組成的組。通過這種方式，可以直接增強(qiáng)在所述兔B細(xì)胞中的表達(dá)產(chǎn)物的量。因此，還提供了根據(jù)本發(fā)明的方法，該方法包括：向所述兔B細(xì)胞提供編碼Bcl2家族的抗凋亡基因的至少一種核酸分子，該Bcl2家族的抗凋亡基因優(yōu)選選自由此1_xL、Mcl-l、BCl-2、Al、Bcl-W、BC12L10,及它們的兔同源物，及它們功能部分和功能衍生物所組成的組。在一個實(shí)施方式中，所述核酸分子是組成性活化的，這意味著所述核酸分子被持續(xù)表達(dá)。在另一實(shí)施方式中，所述核酸分子是誘導(dǎo)性的，這意味著它的表達(dá)受到至少一種誘導(dǎo)因子和/或阻抑因子的調(diào)節(jié)。前文中描述了本領(lǐng)域已知的誘導(dǎo)性核酸表達(dá)系統(tǒng)的非限制性實(shí)例。[0046]在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述抗凋亡的核酸分子編碼Bcl-xL或Mcl-1，或其兔同源物，或其功能部分或功能衍生物。根據(jù)本發(fā)明，Bel-6和Bcl-xL的組合能特別好地增加兔B細(xì)胞的復(fù)制壽命，從而形成得到的漿母細(xì)胞樣B細(xì)胞的長期培養(yǎng)物。這同樣也適用于Bel-6和Mcl-1的組合。最優(yōu)選地，所述抗凋亡的核酸編碼Bcl-xL，或其功能部分或功能衍生物。[0047]與天然的此1-6、8(3111、]\^1-1、8(31-2、六1、8(311或此12110或其兔同源物相比，8〇1-6、8(3111、1^1-1、8(31-2^1、8(31-?或此12110或其兔同源物的功能部分是蛋白質(zhì)類分子，分別具有在性質(zhì)上，而不一定在量上，增加兔B細(xì)胞的復(fù)制壽命的相同的能力。這樣的功能部分例如缺乏那些不參與或僅非常少地參與該能力的氨基酸。[0048]例如，在本文中，8(3111^、1(：1-1、8(31-2^1、8(311和此12110，或其兔同源物的功能部分分別被定義為此1-^〇1-1、8〇1-2)1、8(31-?和此12110，或其兔同源物的片段，所述片段分別保留了與全長此111^1^1-1、8〇1-2^1、8〇1-?和此12110，或其兔同源物(在性質(zhì)上，而不一定在量上)相同性質(zhì)的抗凋亡特性。Bcl-xL、Mcl-l、Bcl-2、Al、Bcl-wSBcl2L10，或其兔同源物的功能部分通常分別是此111^1(：1-1、8(31-2)1、8(31-?或此12110，或其兔同源物的較短片段，所述較短片段能夠延遲和/或阻止兔B細(xì)胞中的凋亡。這樣的功能部分例如沒有不顯著有助于Bcl-xL、Mcl-l、Bcl-2、Al、Bcl-w和Bcl2L10的抗凋亡活性的序列。Bcl-6或其兔同源物的功能部分通常是Bcl-6或其兔同源物的較短片段，這些較短片段能夠增加兔B細(xì)胞的復(fù)制壽命。[0049]8(31-6、8(3111、1^1-1、8(：1-2^1、8(311或此12110，或其兔同源物的功能衍生物分別被定義為:8(31-6、8(：131、]\^1-1、8(31-2^1、8(311或此12110蛋白或其兔同源物，其已經(jīng)被改變但仍然具有(在性質(zhì)上，而不一定在量上)增加兔B細(xì)胞的復(fù)制壽命的能力。以很多方式，例如通過保守氨基酸置換來提供功能衍生物，在該保守氨基酸置換中，一個氨基酸被另一個通常具有類似性質(zhì)(大小、疏水性等)的氨基酸置換，這樣整體的功能不被嚴(yán)重影響?；蛘?，功能衍生物例如包括融合蛋白，該融合蛋白具有可檢測的標(biāo)記或具有誘導(dǎo)性化合物。[0050]本發(fā)明的另一方面解決了以下問題:將感興趣的核酸分子有效地引入到兔B細(xì)胞中。常規(guī)使用的雙嗜性(ampho)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體適用于感染嚙齒類細(xì)胞(諸如鼠科細(xì)胞），因此預(yù)期該雙嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體也能轉(zhuǎn)導(dǎo)兔B細(xì)胞，但與預(yù)期相反，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了雙嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒載體顯示出不能有效地轉(zhuǎn)導(dǎo)兔B細(xì)胞;在兔B細(xì)胞中，雙嗜性載體在轉(zhuǎn)導(dǎo)后4天的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率顯示低于1%。因此，本發(fā)明人不得不尋找其它的基因遞送工具。令人驚奇地是，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)包括長臂猿白血病病毒(GALV)包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的基因遞送工具，能夠高效率地轉(zhuǎn)導(dǎo)兔B細(xì)胞，在轉(zhuǎn)導(dǎo)后3~5天的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率通常為80%~90%。這一性質(zhì)是相當(dāng)出乎意料的，因?yàn)殚L臂猿白血病病毒天然不感染兔。因此，并沒有預(yù)期兔細(xì)胞含有GALV包膜蛋白的受體；目前的發(fā)現(xiàn)僅是巧合。值得注意的是，盡管人類B細(xì)胞是靈長類細(xì)胞，含GALV包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的載體對人類B細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，在轉(zhuǎn)導(dǎo)后4天通常為60%~70%，這常常低于該載體對兔B細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。這是令人驚訝的，因?yàn)樵骋彩庆`長類，因此與兔的細(xì)胞相比，預(yù)期含GALV類包膜蛋白的載體能更好地感染靈長類細(xì)胞。值得注意的是，使用包括GALV包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的載體確實(shí)不能有效轉(zhuǎn)導(dǎo)鼠科的B細(xì)胞，這與長臂猿白血病病毒不感染小鼠的事實(shí)一致。[0051]現(xiàn)在，本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)提供了可以使用GALV包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一個功能部分來有效轉(zhuǎn)導(dǎo)兔B細(xì)胞，并且轉(zhuǎn)導(dǎo)效率甚至高于人類B細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，從而可以提供新的應(yīng)用?，F(xiàn)在，可以將感興趣的核酸分子高效率地引入到兔B細(xì)胞中，這對于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的離體兔B細(xì)胞培養(yǎng)物是特別有利的。因此，本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式提供了增加兔B的細(xì)胞的復(fù)制壽命的方法，該方法包括：[0052]-在兔B細(xì)胞中，誘導(dǎo)、增強(qiáng)和/或維持Bcl-6或其兔同源物的表達(dá)；以及[0053]-在所述B細(xì)胞中，誘導(dǎo)、增強(qiáng)和/或維持至少一種抗凋亡的核酸的表達(dá)，[0054]其特征在于，經(jīng)由基因遞送工具的轉(zhuǎn)導(dǎo)，向所述兔B細(xì)胞提供編碼Bcl-6的核酸分子，或編碼其兔同源物的核酸分子，或編碼其功能部分或功能衍生物的核酸分子，和/或提供至少一種抗凋亡的核酸分子;所述基因遞送工具包括:長臂猿白血病病毒(GALV)包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域，或所述胞外結(jié)構(gòu)域的至少一個功能部分，或與所述GALV包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域具有至少70%序列同一性的蛋白，或與所述GALV包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一個功能部分具有至少70%序列同一性的蛋白。在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，所述胞外結(jié)構(gòu)域是GALV毒株SEAT0的包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域。所述胞外結(jié)構(gòu)域優(yōu)選包括序列MVLLPGSMLLTSNLHHLRHQMSPGSWKRLIILLSCVFGGGGTSLQNKNPHQPMTLTffQVLSQTGDVVffDTKAVQPPffTffffPTLKPDVCALAASLESWDIPGTDVSSSKRVRPPDSDYTAAYKQITWGAIGCSYPRARTRMASSTFYVCPRDGRTLSEARRCGGLESLYCKEWDCETTGTGYffLSKSSKDLITVKffDQNSEffTQKFQQCHQTGffCNPLKIDFTDKGKLSKDffITGKTWGLRFYVSGHPGVQFTIRLKITNMPAVAVGPDLVLVEQGPPRTSLALPPPLPPREAPPPSLPDSNSTALATSAQTPTVRKTIVTLNTPPPTTCDRLFDLVQGAFLTLNATNPGATESCWLCLAMGPPYYEAIASSGEVAYSTDLDRCRWGTQGKLTLTEVSGHGLCIGKVPFTHQHLCNQTLSINSSGDHQYLLPSNHSffffACSTGLTPCLSTSVFNQTRDFCIQVQLIPRIYYYPEEVLLQAYDNSHPRTKREAVSLTLAVLLGLGITAGIGTGSTALIKGPIDLQQGLTSLQIAIDADLRALQDSVSKLEDSLTSLSEVVLQNRRGLDLLFLKEGGLCAALKEECCFYIDHSGAVRDSMKKLKEKLDKRQLERQKSQNWYEGWFNNSPWFTTLL。優(yōu)選地，所述序列同一性是至少75%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少81%、更優(yōu)選至少82%、更優(yōu)選至少83%、更優(yōu)選至少84%、更優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少86%、更優(yōu)選至少86%、更優(yōu)選至少87%、更優(yōu)選至少88%、更優(yōu)選至少89%、更優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少91%、更優(yōu)選至少92%、更優(yōu)選至少93%、更優(yōu)選至少94%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少96%、更優(yōu)選至少97%、更優(yōu)選至少98%、更優(yōu)選至少99%、更優(yōu)選100%。[0055]如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的，所述胞外結(jié)構(gòu)域優(yōu)選也位于基因遞送工具的表面(包膜)處，用于轉(zhuǎn)導(dǎo)兔B細(xì)胞，其中胞外結(jié)構(gòu)域位于野生型長臂猿白血病病毒的表面(包膜）處以便可結(jié)合宿主細(xì)胞。在一個特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，所使用的載體或其它基因遞送工具包括包膜蛋白，該包膜蛋白含胞外結(jié)構(gòu)域和GALV包膜蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域，或其功能部分，該跨膜結(jié)構(gòu)域與雙嗜性包膜蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域融合。如在實(shí)施例中所示，這樣允許對兔B細(xì)胞進(jìn)行特別有效的轉(zhuǎn)導(dǎo)。[0056]如本文所使用的，"GALV包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的功能部分"指所示胞外結(jié)構(gòu)域中仍然能夠結(jié)合兔B細(xì)胞，從而介導(dǎo)兔B細(xì)胞的感染和/或轉(zhuǎn)導(dǎo)的部分。這樣的功能部分可能缺少一個或多個氨基酸殘基，所述氨基酸殘基對于兔B細(xì)胞的結(jié)合、感染和/或轉(zhuǎn)導(dǎo)不是必需的。[0057]當(dāng)然，由于提供本發(fā)明的發(fā)現(xiàn)，因此可使用GALV包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一個功能部分，向兔B細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)任意感興趣的核酸分子。因此，進(jìn)一步提供了與GALV包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合的分離或重組的兔B細(xì)胞，或與所述胞外結(jié)構(gòu)域的至少一個功能部分結(jié)合的分離或重組的兔B細(xì)胞，或與GALV包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一個功能部分具有至少70%序列同一性的蛋白結(jié)合的分離或重組的兔B細(xì)胞。本文還提供了如下的分離或重組的兔B細(xì)胞，該分離或重組的兔B細(xì)胞經(jīng)由GALV包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一個功能部分，或經(jīng)由與GALV包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一個功能部分具有至少70%序列同一性的蛋白，與基因遞送工具結(jié)合。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述胞外結(jié)構(gòu)域是GALV毒株SEAT0的包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域。所述胞外結(jié)構(gòu)域優(yōu)選包括序列MVLLPGSMLLTSNLHHLRHQMSPGSWKRLIILLSCVFGGGGTSLQNKNPHQPMTLTffQVLSQTGDVVffDTKAVQPPffTffffPTLKPDVCALAASLESWDIPGTDVSSSKRVRPPDSDYTAAYKQITWGAIGCSYPRARTRMASSTFYVCPRDGRTLSEARRCGGLESLYCKEWDCETTGTGYffLSKSSKDLITVKffDQNSEffTQKFQQCHQTGffCNPLKIDFTDKGKLSKDffITGKTWGLRFYVSGHPGVQFTIRLKITNMPAVAVGPDLVLVEQGPPRTSLALPPPLPPREAPPPSLPDSNSTALATSAQTPTVRKTIVTLNTPPPTTCDRLFDLVQGAFLTLNATNPGATESCWLCLAMGPPYYEAIASSGEVAYSTDLDRCRWGTQGKLTLTEVSGHGLCIGKVPFTHQHLCNQTLSINSSGDHQYLLPSNHSffffACSTGLTPCLSTSVFNQTRDFCIQVQLIPRIYYYPEEVLLQAYDNSHPRTKREAVSLTLAVLLGLGITAGIGTGSTALIKGPIDLQQGLTSLQIAIDADLRALQDSVSKLEDSLTSLSEVVLQNRRGLDLLFLKEGGLCAALKEECCFYIDHSGAVRDSMKKLKEKLDKRQLERQKSQNWYEGWFNNSPWFTTLL。再次，所述序列同一性優(yōu)選是至少75%、更優(yōu)選至少80%、更優(yōu)選至少81%、更優(yōu)選至少82%、更優(yōu)選至少83%、更優(yōu)選至少84%、更優(yōu)選至少85%、更優(yōu)選至少86%、更優(yōu)選至少86%、更優(yōu)選至少87%、更優(yōu)選至少88%、更優(yōu)選至少89%、更優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少91%、更優(yōu)選至少92%、更優(yōu)選至少93%、更優(yōu)選至少94%、更優(yōu)選至少95%、更優(yōu)選至少96%、更優(yōu)選至少97%、更優(yōu)選至少98%、更優(yōu)選至少99%、更優(yōu)選100%。所述基因遞送工具優(yōu)選包括感興趣的核酸分子，優(yōu)選編碼Bcl-6、或其兔同源物、或其功能部分或功能衍生物的核酸序列，和/或抗凋亡的核酸序列。使用這樣的基因遞送工具，可產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明的穩(wěn)定的兔B細(xì)胞培養(yǎng)物。所述抗凋亡的核酸序列優(yōu)選是Bcl2家族的抗凋亡基因，最優(yōu)選選自由Bcl-xL、Mcl-l、Bcl-2、Al、Bcl-w、Bcl2L10,及其兔同源物，及其功能部分和功能衍生物所組成的組。[0058]本文還提供了GALV包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域，或其能結(jié)合兔B細(xì)胞的至少一個功能部分在將感興趣的核酸分子引入到兔B細(xì)胞中的應(yīng)用，以及與GALV包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一個功能部分有至少7〇%序列同一性的蛋白在將將感興趣的核酸分子引入到兔B細(xì)胞中的應(yīng)用。進(jìn)一步提供了包括GALV包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一個功能部分的基因遞送工具，或包括與GALV包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一個功能部分具有至少70%序列同一性的蛋白的基因遞送工具在增加兔B細(xì)胞的復(fù)制壽命中的應(yīng)用，所述基因遞送工具進(jìn)一步包括編碼Bcl-6、或其兔同源物、或其功能部分或功能衍生物的核酸序列，和至少一種抗凋亡的核酸序列。在一個優(yōu)選實(shí)施方式中，所述胞外結(jié)構(gòu)域是GALV毒株SEAT0的包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域。所述胞外結(jié)構(gòu)域優(yōu)選包括序列MVLLPGSMLLTSNLHHLRHQMSPGSWKRLIILLSCVFGGGGTSLQNKNPHQPMTLTffQVLSQTGDVVffDTKAVQPPffTffffPTLKPDVCALAASLESWDIPGTDVSSSKRVRPPDSDYTAAYKQITWGAIGCSYPRARTRMASSTFYVCPRDGRTLSEARRCGGLESLYCKEWDCETTGTGYffLSKSSKDLITVKffDQNSEffTQKFQQCHQTGffCNPLKIDFTDKGKLSKDffITGKTWGLRFYVSGHPGVQFTIRLKITNMPAVAVGPDLVLVEQGPPRTSLALPPPLPPREAPPPSLPDSNSTALATSAQTPTVRKTIVTLNTPPPTTCDRLFDLVQGAFLTLNATNPGATESCWLCLAMGPPYYEAIASSGEVAYSTDLDRCRWGTQGKLTLTEVSGHGLCIGKVPFTHQHLCNQTLSINSSGDHQYLLPSNHSffffACSTGLTPCLSTSVFNQTRDFCIQVQLIPRIYYYPEEVLLQAYDNSHPRTKREAVSLTLAVLLGLGITAGIGTGSTALIKGPIDLQQGLTSLQIAIDADLRALQDSVSKLEDSLTSLSEVVLQNRRGLDLLFLKEGGLCAALKEECCFYIDHSGAVRDSMKKLKEKLDKRQLERQKSQNWYEGWFNNSPffFTTLLo[0059]圖9中示出了在實(shí)施例中也使用的優(yōu)選的嵌合包膜蛋白。該嵌合包膜蛋白含有GALV包膜蛋白非胞外結(jié)構(gòu)域（具有序列MVLLPGSMLLTSNLHHLRHQMSPGSWKRLIILLSCVFGGGGTSLQNKNPHQPMTLTffQVLSQTGDVVffDTKAVQPPffTffffPTLKPDVCALAASLESWDIPGTDVSSSKRVRPPDSDYTAAYKQITWGAIGCSYPRARTRMASSTFYVCPRDGRTLSEARRCGGLESLYCKEWDCETTGTGYffLSKSSKDLITVKffDQNSEffTQKFQQCHQTGffCNPLKIDFTDKGKLSKDffITGKTWGLRFYVSGHPGVQFTIRLKITNMPAVAVGPDLVLVEQGPPRTSLALPPPLPPREAPPPSLPDSNSTALATSAQTPTVRKTIVTLNTPPPTTCDRLFDLVQGAFLTLNATNPGATESCWLCLAMGPPYYEAIASSGEVAYSTDLDRCRWGTQGKLTLTEVSGHGLCIGKVPFTHQHLCNQTLSINSSGDHQYLLPSNHSffffACSTGLTPCLSTSVFNQTRDFCIQVQLIPRIYYYPEEVLLQAYDNSHPRTKREAVSLTLAVLLGLGITAGIGTGSTALIKGPIDLQQGLTSLQIAIDADLRALQDSVSKLEDSLTSLSEVVLQNRRGLDLLFLKEGGLCAALKEECCFYIDHSGAVRDSMKKLKEKLDKRQLERQKSQNWYEGWFNNSPWFTTLL，在圖9中以粗體所示）和GALV包膜蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域（具有序列STIAGPLLLLLLLLILGPCII，在圖9中以下劃線所示），與雙嗜性包膜蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(具有序列NRLVQFVKDRISVVQALVLTQQYHQLKPIEYEP，在圖9中以斜體和點(diǎn)下劃線所示)融合。包括該優(yōu)選的嵌合包膜蛋白的載體或其它基因遞送工具能特別有效地將感興趣的核酸分子引入到兔B細(xì)胞中。[0060]因此，進(jìn)一步提供了一種分離或重組的兔B細(xì)胞，該分離或重組的兔B細(xì)胞與圖9所示的嵌合包膜蛋白結(jié)合，或與包括圖9所示的嵌合包膜蛋白的蛋白結(jié)合，或與圖9所示的嵌合包膜蛋白具有至少70%序列同一性的蛋白結(jié)合。本文還提供了一種分離或重組的兔B細(xì)胞，該分離或重組的兔B細(xì)胞經(jīng)由圖9所示的嵌合包膜蛋白，或經(jīng)由包括圖9所示的嵌合包膜蛋白的蛋白，或經(jīng)由與圖9所示的嵌合包膜蛋白具有至少70%序列同一性的蛋白與載體或其它基因遞送工具結(jié)合。[0061]這樣的載體或其它基因遞送工具特別適用于使用感興趣的核酸分子轉(zhuǎn)導(dǎo)兔B細(xì)胞。因此，進(jìn)一步提供了圖9所示的嵌合包膜蛋白，或包括圖9所示的嵌合包膜蛋白的蛋白，或與圖9所示的嵌合包膜蛋白具有至少70%序列同一性的蛋白，在將感興趣的核酸分子引入到兔B細(xì)胞中的應(yīng)用。[0062]這樣的載體或其它基因遞送工具特別適用于增加兔B細(xì)胞的復(fù)制壽命。因此，進(jìn)一步提供了一種增加兔B細(xì)胞的復(fù)制壽命的方法，該方法包括：[0063]-在兔B細(xì)胞中，誘導(dǎo)、增強(qiáng)和/或維持Bcl-6或其兔同源物的表達(dá);以及[0064]-在所述B細(xì)胞中，誘導(dǎo)、增強(qiáng)和/或維持至少一種抗凋亡的核酸的表達(dá)，[0065]其特征在于，經(jīng)由載體或其它基因遞送工具的轉(zhuǎn)導(dǎo)，向所述兔B細(xì)胞提供編碼Bcl-6、或其兔同源物、或其功能部分或功能衍生物的核酸分子，和/或至少一種抗凋亡的核酸分子;所述載體或其它基因遞送工具包括圖9所示的嵌合包膜蛋白，或包括圖9所示的嵌合包膜蛋白的蛋白，或與圖9所示的嵌合包膜蛋白具有至少70%序列同一性的蛋白。[0066]還提供了基因遞送工具在增加兔B細(xì)胞的復(fù)制壽命中的應(yīng)用，所述基因遞送工具包括圖9所示的嵌合包膜蛋白，或包括圖9所示的嵌合包膜蛋白的蛋白，或與圖9所示的嵌合包膜蛋白具有至少70%序列同一性的蛋白，所述基因遞送工具進(jìn)一步包括編碼Bcl-6、或其兔同源物、或其功能部分或功能衍生物的核酸序列，以及至少一種抗凋亡的核酸分子。[0067]要強(qiáng)調(diào)的是，盡管基于GALV的基因遞送工具非常適于使用一種或多種感興趣的核酸分子，諸如Bcl-6和抗凋亡的核酸分子，來有效轉(zhuǎn)導(dǎo)兔B細(xì)胞，但是基于GALV的基因遞送工具對于獲得具有20小時或更短的短倍增時間的兔B細(xì)胞并不是強(qiáng)制性的。也可使用其它基因遞送工具將Bcl-6和抗凋亡的核酸分子引入到兔B細(xì)胞中（盡管效率常常較低），以產(chǎn)生具有小于20小時或更短的倍增時間的兔B細(xì)胞。只要Bcl-6和抗凋亡的核酸分子被引入到兔B細(xì)胞中，就可獲得快速生長的B細(xì)胞培養(yǎng)物，但較低量的初始轉(zhuǎn)導(dǎo)的兔B細(xì)胞長起來可能花費(fèi)較長時間。使用能有效轉(zhuǎn)導(dǎo)兔B細(xì)胞的基因遞送工具(諸如本文所述的基于GALV的基因遞送工具）的優(yōu)點(diǎn)在于，會轉(zhuǎn)導(dǎo)較高比例的初始分離的B細(xì)胞，這樣由此獲得的B細(xì)胞存在于得到的B細(xì)胞培養(yǎng)物中。與其中使用轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較低的基因遞送工具的情況相比，使用能有效轉(zhuǎn)導(dǎo)兔B細(xì)胞的基因遞送工具在B細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)得到B細(xì)胞的更高的多樣性，因?yàn)樵谑褂棉D(zhuǎn)導(dǎo)效率較低的基因遞送工具的情況中，轉(zhuǎn)導(dǎo)了較低比例的初始B細(xì)胞。在得到的B細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)存在B細(xì)胞的更高的多樣性，改進(jìn)了分離出具有期望性質(zhì)的一個或多個B細(xì)胞的可能性。因此，原則上講，基因遞送工具的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率越高，得到的B細(xì)胞培養(yǎng)物內(nèi)的B細(xì)胞的多樣性就越尚。[0068]為了誘導(dǎo)兔B細(xì)胞中的表達(dá)，感興趣的核酸分子優(yōu)選與啟動子可操作地連接。非限制性實(shí)例包括CMV啟動子和CAG啟動子。在一個方面，這樣的啟動子是誘導(dǎo)性的，這意味著它的活性受到至少一種化合物的影響，諸如轉(zhuǎn)錄因子。[0069]如本文所使用的，術(shù)語"基因遞送工具"指能夠?qū)⒑怂岱肿愚D(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中的任意化合物?；蜻f送工具的非限制性實(shí)例包括(病毒)載體和質(zhì)粒。術(shù)語"包括GALV包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一個功能部分的基因遞送工具"指包括GALV包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一部分的基因遞送工具，其中，所述胞外結(jié)構(gòu)域或其一部分能夠結(jié)合兔B細(xì)胞，以便核酸可被引入到所述兔B細(xì)胞中。如前文所述，所述胞外結(jié)構(gòu)域或其一部分優(yōu)選位于基因遞送工具的表面，以便它可結(jié)合兔B細(xì)胞上的受體。同樣，如果根據(jù)本發(fā)明的基因遞送工具包括與GALV包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一個功能部分有至少70%序列同一性的蛋白，則所述蛋白優(yōu)選位于所述基因遞送工具的表面，以便它可結(jié)合兔B細(xì)胞上的受體。[0070]氨基酸或核酸序列的同一性的百分比，或術(shù)語"％序列同一性"在本文中被定義為:在比對兩條序列并且引入空位(如果需要）以實(shí)現(xiàn)最大的同一性百分比之后，在候選氨基酸或核酸序列中與參照序列中的殘基相同的殘基的百分比。用于進(jìn)行比對的方法和計(jì)算機(jī)程序在本領(lǐng)域中是公知的，例如"Align2"。[0071]GALV包膜蛋白是在長臂猿白血病病毒的病毒包膜中天然存在的并且參與宿主細(xì)胞感染的蛋白。靶點(diǎn)特異性通常由包膜蛋白來確定。在一個實(shí)施方式中，所述包膜蛋白是GALV毒株SEAT0的包膜蛋白。含GALV包膜蛋白的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體在本領(lǐng)域中是已知的，并且可使用分子生物學(xué)領(lǐng)域中常用的程序來產(chǎn)生，例如參見Lametal.、1996。[0072]術(shù)語"與啟動子可操作地連接"指感興趣的核酸序列與啟動子足夠接近，以便啟動子可影響感興趣的核酸序列的表達(dá)。通常，這樣的啟動子誘導(dǎo)或增加所述感興趣的核酸的表達(dá)。術(shù)語"表達(dá)活性"指上述表達(dá)的誘導(dǎo)或增強(qiáng)。[0073]如前文所提到的，本發(fā)明提供了如下發(fā)現(xiàn):可獲得平均倍增時間比目前已知的人類或鼠科B細(xì)胞培養(yǎng)物短的離體兔B細(xì)胞培養(yǎng)物。這是更令人吃驚的，因?yàn)樵诒景l(fā)明的實(shí)施例中使用了非兔化合物，諸如人類Bcl-6核酸序列、鼠科IL21和人類CD40L。如實(shí)施例中所不，本發(fā)明人使用含人類Bcl-6核酸序列和人類Bcl-xL或Mcl-1序列的核酸分子，轉(zhuǎn)導(dǎo)了兔B細(xì)胞。即使使用人類序列，并且在鼠科IL21和人類CD40L的存在下培養(yǎng)兔細(xì)胞，兔B細(xì)胞令人吃驚地表現(xiàn)出比人類或鼠科的B細(xì)胞更塊的增殖，并且生產(chǎn)出更多的抗體。[0074]因此，根據(jù)本發(fā)明，使用人類和鼠科的化合物，兔B細(xì)胞增殖非常好。在這些反應(yīng)條件下，兔B細(xì)胞的增殖甚至比人類和鼠科的B細(xì)胞還好。除其它事項(xiàng)外，這具有以下優(yōu)點(diǎn)：不必對目前使用的用于人類B細(xì)胞的反應(yīng)條件進(jìn)行調(diào)整，以使其適用于兔B細(xì)胞。無需獲得兔IL21、兔CD40,或兔的編碼Bcl-6的核酸序列或抗凋亡基因。而是可使用目前可獲得的人類或鼠科的化合物。因此，本發(fā)明的一個方面提供了一種增加兔B細(xì)胞的復(fù)制壽命的方法，該方法包括：[0075]-在兔B細(xì)胞中，誘導(dǎo)、增強(qiáng)和/或維持Bcl-6或其兔同源物的表達(dá);以及[0076]-在所述B細(xì)胞中，誘導(dǎo)、增強(qiáng)和/或維持抗凋亡的核酸的表達(dá)，[0077]其特征在于，向所述兔B細(xì)胞提供選自由以下分子組成的組中的至少一種核酸分子：[0078]*編碼非兔的Bcl-6或其功能部分或功能衍生物的核酸分子;和[0079]*非兔的抗凋亡的核酸分子。[0080]優(yōu)選地，所述非兔的核酸分子是人類核酸分子，因?yàn)槿祟怋cl-6和人類抗凋亡序列似乎在兔B細(xì)胞中提供了特別好的結(jié)果。在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，向兔B細(xì)胞提供編碼人類Bcl-6的核酸分子以及人類抗凋亡的核酸分子，優(yōu)選人類Bcl-xL或人類Mcl-1或人類Bcl-2或人類A1或人類Bcl-w或人類Bcl2L10。[0081]進(jìn)一步地，提供了根據(jù)本發(fā)明的方法，該方法進(jìn)一步包括向所述兔B細(xì)胞提供IL21和⑶40L。優(yōu)選地，使用非兔IL21和/或非兔⑶40L。優(yōu)選地，所述IL21是鼠科或人類IL21，最優(yōu)選鼠科IL21。在另一優(yōu)選的實(shí)施方式中，所述CD40L是鼠科或人類CD40L，最優(yōu)選人類CD40L。[0082]除了增加Bcl-6的表達(dá)和抗凋亡的核酸分子的表達(dá)之外，還有利地誘導(dǎo)、增強(qiáng)和/或維持兔B細(xì)胞中的Blimp-1或其兔同源物的表達(dá)。這增強(qiáng)了所述B細(xì)胞的抗體生產(chǎn)。因此，一個方面提供了根據(jù)本發(fā)明的方法，其中，該方法進(jìn)一步包括在所述兔B細(xì)胞中，誘導(dǎo)、增強(qiáng)和/或維持Blimp-1或其兔同源物的表達(dá)。[0083]通過多種方式，調(diào)節(jié)兔B細(xì)胞中的Blimp-1或其兔同源物的表達(dá)程度。在一個實(shí)施方式中，向兔B細(xì)胞提供能直接或間接增加Blimp-1表達(dá)或其兔同源物表達(dá)的化合物。此外，或可替代的，在能直接或間接增加Blimp-1表達(dá)或其兔同源物表達(dá)的化合物的存在下，培養(yǎng)兔B細(xì)胞。因此，進(jìn)一步提供了根據(jù)本發(fā)明的方法，該方法進(jìn)一步包括：[0084]-向所述兔B細(xì)胞提供能直接或間接增加Blimp-1表達(dá)或其兔同源物表達(dá)的化合物;和/或[0085]-在能直接或間接增加Blimp-1表達(dá)或其兔同源物表達(dá)的化合物的存在下，培養(yǎng)兔B細(xì)胞。[0086]能增加Blimp-1的表達(dá)或其兔同源物的表達(dá)的所述化合物最優(yōu)選包括IL21。因此，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方式中，至少在部分培養(yǎng)時間的過程中，在IL21的存在下，培養(yǎng)兔B細(xì)胞。[0087]在另一實(shí)施方式中，能增加Blimp-1表達(dá)的所述化合物包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3(STAT3)蛋白或其功能部分或功能衍生物，和/或編碼STAT3蛋白或其功能部分或功能衍生物的核酸分子。STAT3是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，參與B細(xì)胞的發(fā)育和分化。STAT3能夠上調(diào)Blimp-1的表達(dá)。在一個優(yōu)選的實(shí)施方式中，向兔B細(xì)胞提供編碼STAT3或其功能部分或功能衍生物的核酸分子，其中，所述核酸分子的表達(dá)受到阻抑因子的外源性誘導(dǎo)因子的調(diào)節(jié)，以便對STAT3的表達(dá)程度進(jìn)行隨意調(diào)節(jié)。例如，使用之前提到的誘導(dǎo)性表達(dá)系統(tǒng)中的一種。在一個實(shí)施方式中，使用包括STAT3或其功能部分或功能衍生物與ER的融合產(chǎn)物。例如，向兔B細(xì)胞提供編碼雌激素受體(ER)和STAT3作為融合蛋白ER-STAT3的核酸分子。該融合蛋白是沒有活性的，因?yàn)樗c細(xì)胞質(zhì)中的熱休克蛋白形成復(fù)合體。這樣，STAT3不能到達(dá)細(xì)胞核，因此不增強(qiáng)Blimp-1的表達(dá)。當(dāng)給予外源性誘導(dǎo)因子4羥基三苯氧胺（4HT)時，融合蛋白ER-STAT3與熱休克蛋白解離，以便STAT3能進(jìn)入細(xì)胞核并且活化Blimp-1的表達(dá)。[0088]如本文所使用的，STAT3的功能部分被定義為與天然STAT3相比，在性質(zhì)上，而不一定在量上，具有相同的增加Blimp-1或其兔同源物表達(dá)能力的STAT3片段。這樣的功能部分例如沒有不參與或僅非常少地參與所述能力的氨基酸。[0089]STAT3的功能衍生物被定義為STAT3蛋白，該STAT3蛋白已經(jīng)被改變了，但仍然維持了它（在性質(zhì)上，而不一定在量上)增加Blimp-1或其兔同源物表達(dá)的能力。以很多方式，例如通過保守氨基酸置換來提供功能衍生物，在該保守氨基酸置換中，一個氨基酸被另一個通常具有類似性質(zhì)（大小、疏水性等）的氨基酸置換，這樣不嚴(yán)重影響整體的功能?；蛘?，功能衍生物例如包括融合蛋白，該融合蛋白具有可檢測的標(biāo)記或具有誘導(dǎo)性化合物。[0090]因?yàn)镾TAT3能夠增加B1imp-1的表達(dá)，或增加它的兔同源物的表達(dá)，因此還可以通過給予能增加STAT3的活性和/或表達(dá)的化合物，來間接增加Blimp-1或其兔同源物的表達(dá)。在一個實(shí)施方式中，向兔B細(xì)胞提供能增強(qiáng)STAT3活性的化合物，以便間接增強(qiáng)Blimp-1或其兔同源物的表達(dá)。[0091]以很多方式來活化STAT3。優(yōu)選地，通過向兔B細(xì)胞提供細(xì)胞因子，來活化STAT3。天然參與B細(xì)胞分化的細(xì)胞因子在調(diào)節(jié)STAT蛋白中是非常有效的。STAT3的非常有效的活化因子是IL21和IL6,但是還已知112、117、1110、1115和1127活化31413。此外，參與天然免疫的Toll樣受體(TLR)也能活化STAT3。因此，一個實(shí)施方式提供了根據(jù)本發(fā)明的方法，其中，在1121、112、116、117、1110、1115和/或1127的存在下，培養(yǎng)所述兔8細(xì)胞。最優(yōu)選使用1121，因?yàn)镮L21特別適用于增強(qiáng)根據(jù)本發(fā)明的兔B細(xì)胞培養(yǎng)物的抗體生產(chǎn)。甚至當(dāng)BCL6阻礙Blimp-1表達(dá)時，IL21也能上調(diào)Blimp-1的表達(dá)。[0092]進(jìn)一步地，或可替代地，使用突變的Janus激酶(JAK)或JAK的突變的兔同源物，來活化STAT3。在JAK自身被至少一種細(xì)胞因子活化之后，JAK天然能使STAT3磷酸化。能不依賴于細(xì)胞因子的存在而活化STAT3的突變的Janus激酶或JAK的突變的兔同源物，特別適用于根據(jù)本發(fā)明的方法中。[0093]在又一實(shí)施方式中，通過向兔B細(xì)胞提供細(xì)胞因子信號傳導(dǎo)抑制因子(S0CS)蛋白或其兔同源物，和/或通過活化所述細(xì)胞內(nèi)的S0CS蛋白或其兔同源物，來增加Blimp-1或其兔同源物的表達(dá)。可替代地，或進(jìn)一步地，使用E蛋白E47、E12、E2-2和HEB中的至少一種，來增加Blimp-1或其兔同源物的表達(dá)。E47是屬于螺旋-環(huán)-螺旋蛋白家族的轉(zhuǎn)錄因子，被命名為E蛋白。有四種E蛋白，E12、E47、E2-2和HEB，參與淋巴細(xì)胞發(fā)育。E12和E47由一個基因（被命名為E2A)編碼，該基因進(jìn)行不同的剪接。E蛋白已經(jīng)被描述為腫瘤抑制因子。E47的特異性靶點(diǎn)之一是Socsl和Socs3基因。[0094]因此，一個方面提供了根據(jù)本發(fā)明的方法，該方法通過向兔B細(xì)胞提供能直接或間接增加Blimp-1或其兔同源物表達(dá)的化合物，和/或在能直接或間接增加Blimp-1或其兔同源物表達(dá)的化合物存在下培養(yǎng)所述B細(xì)胞，來進(jìn)一步增加兔B細(xì)胞中的Blimp-1或其兔同源物的表達(dá)，其中所述化合物包括：[0095]-STAT3，或其功能部分或功能衍生物，和/或[0096]_能活化STAT3的化合物，和/或[0097]_能增強(qiáng)STAT3表達(dá)的化合物，和/或[0098]-比21、112、116、117、1110、1115、1127、50〇5蛋白、￡蛋白￡47、￡12、￡2-2或冊8之一、突變的Janus激酶、和/或編碼STAT3或其兔同源物或功能部分或功能衍生物的核酸序列。[0099]最優(yōu)選地，所述化合物是IL21。[0100]本發(fā)明進(jìn)一步提供了根據(jù)本發(fā)明的方法可獲得的分離或重組的兔B細(xì)胞。上述分離或重組的兔B細(xì)胞優(yōu)選包括外源性抗凋亡的核酸序列，以及編碼Bcl-6或其兔同源物或功能部分或功能衍生物的外源性核酸序列。因此，進(jìn)一步提供了分離或重組的兔B細(xì)胞，該分離或重組的兔B細(xì)胞包括編碼Bcl-6或其兔同源物或功能部分或功能衍生物的外源性核酸序列，以及外源性抗凋亡的核酸序列。如之前所述，所述外源性核酸分子含有在兔B細(xì)胞中不是天然出現(xiàn)的核酸序列，或者含有天然兔B細(xì)胞核酸序列的額外的拷貝。Bcl-XL、Mcl-l、8(31-2^1、8〇1-?和此121^10，及其兔同源物是優(yōu)選的抗凋亡的核酸分子。因此，一個優(yōu)選方面提供了分離或重組的兔B細(xì)胞，該分離或重組的兔B細(xì)胞包括:編碼Bcl-6或其兔同源物或其功能部分或功能衍生物的外源性核酸序列;和，編碼Bcl-xL或Mcl-1或Bcl-2或A1或Bcl-w或Bcl2L10,或其兔同源物，或其功能部分或功能衍生物的外源性核酸序列。[0101]所述編碼Bcl-6或其兔同源物或其功能部分或功能衍生物的核酸序列，和所述外源性抗凋亡的核酸序列可存在于一個核酸分子上?；蛘?，這些序列存在于至少兩個不同的核酸分子上。[0102]如之前所述，優(yōu)選使用非兔的序列。因此，優(yōu)選實(shí)施方式提供了分離或重組的兔B細(xì)胞，該分離或重組的兔B細(xì)胞包括:非兔的抗凋亡的核酸序列，和編碼Bcl-6或其兔同源物或其功能部分或功能衍生物的非兔的核酸序列。所述非兔的核酸序列優(yōu)選含有人類序列。[0103]在特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，提供了分離或重組的兔B細(xì)胞，該分離或重組的兔B細(xì)胞包括：[0104]-編碼人類Bcl-6或其功能部分或功能衍生物的核酸序列，和[0105]-人類抗凋亡的核酸序列，該人類抗凋亡的核酸序列優(yōu)選編碼人類Bcl-xL或人類Mcl-1或人類Bcl-2或人類A1或人類Bcl-w或人類Bcl2L10,或其功能部分或功能衍生物。再次，所述編碼Bcl-6或其功能部分或功能衍生物的核酸序列，和所述抗凋亡的核酸序列可存在于一個核酸分子上，或可替代的，這些序列可存在于至少兩個不同的核酸分子上。[0106]本發(fā)明還提供了通過本發(fā)明的方法可獲得的離體兔B細(xì)胞培養(yǎng)物。重要的優(yōu)點(diǎn)在于以下事實(shí):現(xiàn)在獲得的離體B細(xì)胞培養(yǎng)物具有短的平均倍增時間。因此提供了具有20小時或更短的平均倍增時間的離體兔B細(xì)胞培養(yǎng)物。進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方式提供了離體兔B細(xì)胞培養(yǎng)物，該離體兔B細(xì)胞培養(yǎng)物包括根據(jù)本發(fā)明的兔B細(xì)胞。所述兔B細(xì)胞優(yōu)選包括:編碼人類Bcl-6或其功能部分或功能衍生物的核酸序列，和抗凋亡的核酸序列。還提供了離體兔B細(xì)胞培養(yǎng)物，該離體兔B細(xì)胞培養(yǎng)物包括在非兔IL21和/或非兔CD40L的存在下的兔B細(xì)胞。優(yōu)選地，所述IL21是鼠科或人類IL21，最優(yōu)選是鼠科IL21。在另一優(yōu)選實(shí)施方式中，所述⑶40L是鼠科或人類⑶40L，最優(yōu)選是人類⑶40L。[0107]還提供了通過本發(fā)明的方法獲得的抗體，以及由根據(jù)本發(fā)明的兔B細(xì)胞生產(chǎn)的抗體，或由根據(jù)本發(fā)明的離體兔B細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)的抗體。上述抗體尤其可用于治療或診斷應(yīng)用。優(yōu)選地，所述抗體是單克隆抗體。[0108]在下面的實(shí)施例中，對本發(fā)明進(jìn)行了進(jìn)一步的解釋。這些實(shí)施例并不限制本發(fā)明的范圍，僅用于闡明本發(fā)明。【具體實(shí)施方式】[0109]實(shí)施例[0110]實(shí)施例1[0111]B細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)[0112]通過傳統(tǒng)方法，如磷酸鈣沉淀、脂質(zhì)體形成或電穿孔，將基因轉(zhuǎn)移到淋巴細(xì)胞中是效率低的，但更重要的是，常常缺少穩(wěn)定的基因整合。然而，如果選擇了適當(dāng)?shù)牟《景?，病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)直接導(dǎo)致基因穩(wěn)定地整合到靶細(xì)胞的基因組中，并且效率非常高。逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)都適用于有效的基因轉(zhuǎn)移。雖然逆轉(zhuǎn)錄病毒整合依賴于細(xì)胞分裂，慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)也可用于不分裂的細(xì)胞，如血漿B細(xì)胞。重組的逆轉(zhuǎn)錄病毒的大規(guī)模制備可以很容易地通過使用穩(wěn)定的生產(chǎn)細(xì)胞系，諸如Phoenix表達(dá)平臺（KinsellaandNolan,1996)來實(shí)現(xiàn)。高滴度的慢病毒的生產(chǎn)傾向于更加繁瑣，這主要是因?yàn)楸磉_(dá)的病毒蛋白和包膜的毒性。[0113]對于本實(shí)施例，我們使用了基于莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)的平臺，該平臺使用雙嗜性或表達(dá)長臂猿白血病病毒(GALV)包膜的生產(chǎn)細(xì)胞(Wilsonetal.，1995)。在我們的基于GALV的載體中，GALV毒株SEAT0包膜蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域與兩性包膜蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域融合(圖9)。[0114]建立轉(zhuǎn)移載體，以便Bcl-6、Bcl-XL和綠色熒光蛋白（GFP)標(biāo)記物蛋白從同一病毒RNA同時翻譯出來（圖8)。通過使"自剪切的"2A肽序列（Szymczaketal.,2004)位于BCL-6和BCL-xL編碼區(qū)之間，并且使內(nèi)部核糖體進(jìn)入序列（IRES)位于GFP報(bào)告基因上游，來實(shí)現(xiàn)該多順反子途徑。病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)效率是高且無偏向性的。[0115]永生化兔B細(xì)胞的生成[0116]使用如Kwakkenbosetal.,2010和專利申請W02007/067046所述的BCL-6/Bcl-xL技術(shù)，使人類記憶B細(xì)胞永生化。簡單來講，使用聚蔗糖(fico11)密度梯度從兔血液中分離出PBMC，并且使用識別Ig(IgGH+L:IgG重鏈和k和A輕鏈）的抗體，有時與IgM特異性抗體組合，對Ig表達(dá)進(jìn)行染色。使用FACS分選儀分離出（Ig陽性，或Ig陽性+IgM陰性)B細(xì)胞，并且在穩(wěn)定表達(dá)⑶40L(⑶40L-L細(xì)胞，105細(xì)胞/ml)的y輻照(50Gy)的小鼠L細(xì)胞成纖維細(xì)胞上，與重組的小鼠白介素（IU-21-起刺激36~48小時。收獲細(xì)胞，并且使用沒有FCS的培養(yǎng)基進(jìn)行沖洗，然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至Retronectin?(Takara，Shiga，日本)包被的組織培養(yǎng)板，在該組織培養(yǎng)板上，使用含BCL-6、Bcl-xL和作為報(bào)告蛋白的GFP的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)這些細(xì)胞?？商娲?，使用含BCL-6、Mcl-l和GFP的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。使用表達(dá)⑶40配體的L細(xì)胞和IL-21，維持轉(zhuǎn)導(dǎo)的B細(xì)胞的培養(yǎng)。在圖1中，對比了在轉(zhuǎn)導(dǎo)后4天時，GALV和雙嗜型逆轉(zhuǎn)錄病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。與GALV型逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后80%的細(xì)胞被轉(zhuǎn)導(dǎo)相比，使用雙嗜型逆轉(zhuǎn)錄病毒僅0.8%的細(xì)胞被轉(zhuǎn)導(dǎo)了。很明顯，對于轉(zhuǎn)導(dǎo)兔B細(xì)胞，GALV型逆轉(zhuǎn)錄病毒比雙嗜型逆轉(zhuǎn)錄病毒優(yōu)秀。[0117]實(shí)施例2[0118]細(xì)胞培養(yǎng)[0119]我們將B細(xì)胞(2X105細(xì)胞/ml)維持在含8%FBS和青霉素-鏈霉素(Roche)，且補(bǔ)充有重組的小鼠白介素21(IL-21)(50ng/ml)的伊氏改良的杜氏培養(yǎng)基（Iscove'smodifiedDulbecco'smedium，Gibco)中，并且將它們培養(yǎng)在穩(wěn)定表達(dá)⑶40L的y福照（50Gy)的小鼠L細(xì)胞成纖維細(xì)胞(CD40L-L細(xì)胞，105細(xì)胞/ml)上。為了確定細(xì)胞的倍增時間，將細(xì)胞以50~100.000細(xì)胞/孔的密度，與⑶40L-L細(xì)胞和IL-21-起培養(yǎng)在24孔板中。每3~4天對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并且將50~100.000個細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的孔。圖2中，示出了來自兩位人類供體(89和93)的B細(xì)胞、一個美洲鴕B細(xì)胞樣品（美洲鴕)和一個轉(zhuǎn)導(dǎo)有GALV型逆轉(zhuǎn)錄病毒的兔B細(xì)胞樣品（Rb6XL)的生長曲線，該GALV型逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶含人類Bcl-6序列和人類Bcl-xL的核酸分子。另外，示出了一個轉(zhuǎn)導(dǎo)有GALV型逆轉(zhuǎn)錄病毒的兔樣品（Rb6M)的生長曲線，該GALV型逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶含人類Bcl-6序列和人類Mcl-1的核酸分子。轉(zhuǎn)導(dǎo)的兔B細(xì)胞具有19小時的平均倍增時間，因此生長的比人類或美洲鴕的B細(xì)胞快，其中人類或美洲鴕的B細(xì)胞的倍增時間在26小時至32小時之間。通過確定B細(xì)胞在數(shù)個3~4天的時間間隔中的增加，并且將獲得的結(jié)果進(jìn)行平均，來初始計(jì)算這些平均倍增時間。隨后，計(jì)算在整個培養(yǎng)期的過程中的總平均倍增時間。這樣得到轉(zhuǎn)導(dǎo)的兔B細(xì)胞的平均倍增時間為18小時，轉(zhuǎn)導(dǎo)的人類B細(xì)胞的平均倍增時間為25~29小時，以及轉(zhuǎn)導(dǎo)的美洲鴕B細(xì)胞的平均倍增時間為27小時。這樣證明了我們的觀察，即我們的方法產(chǎn)生具有20小時或更短的平均倍增時間的兔B細(xì)胞培養(yǎng)物，而人類、鼠科和美洲鴕的B細(xì)胞通常具有在25小時至36小時之間的倍增時間。[0120]實(shí)施例3[0121]B細(xì)胞受體的表達(dá)和抗原特異性染色[0122]永生化的人類B細(xì)胞表達(dá)B細(xì)胞受體。該特性使得能夠?qū)細(xì)胞進(jìn)行抗原特異性染色和分選。為了確定B細(xì)胞受體是否也在轉(zhuǎn)導(dǎo)的兔B細(xì)胞上表達(dá)，使用與兔IgG、兔IgM或兔IgA特異性反應(yīng)的熒光標(biāo)記的抗體，對B細(xì)胞克隆進(jìn)行染色。將B細(xì)胞在冷(4°C)的細(xì)胞培養(yǎng)基中進(jìn)行沖洗，并且在冰上、黑暗中與含免疫熒光標(biāo)記的抗體孵育，該含免疫熒光標(biāo)記的抗體對兔的IgG、IgM、IgA或標(biāo)記的抗原具有特異性。之后，沖洗掉多余的標(biāo)記的抗體或抗原，并且在FACS分析儀(Guavaeasycyte(Mi11ipore)或FACSAria3(BD))上，分析B細(xì)胞受體的表達(dá)。[0123]圖3中，使用特異性識別兔抗體同種型IgG、IgA或IgM的熒光標(biāo)記的抗體，對不同同種型的三種不同B細(xì)胞克隆進(jìn)行染色。很明顯，對于不同的兔抗體同種型，可對B細(xì)胞受體進(jìn)行有效染色。因此，我們總結(jié)出，永生化的兔B細(xì)胞也表達(dá)B細(xì)胞受體。[0124]此外，還使用熒光標(biāo)記的流感蛋白，對來自已用人類流感疫苗免疫的兔或未經(jīng)處理的對照兔的流感特異性的B細(xì)胞進(jìn)行染色（圖4)。使用熒光標(biāo)記的H1、H3或流感B對兔B細(xì)胞進(jìn)行染色，并且使用FACS分選儀以每孔1個細(xì)胞進(jìn)行分選。[0125]實(shí)施例4[0126]-個細(xì)胞來源的克隆性兔B細(xì)胞培養(yǎng)物的發(fā)育。[0127]使用FACS分選儀以每孔一個細(xì)胞分選轉(zhuǎn)導(dǎo)的B細(xì)胞，并且在穩(wěn)定表達(dá)CD40L(CD40L-L細(xì)胞，105細(xì)胞/ml)的y輻照（50Gy)的小鼠L細(xì)胞成纖維細(xì)胞與重組的小鼠白介素(IL)-21的存在下進(jìn)行培養(yǎng)。每3~4天，添加新鮮的CD40L-L細(xì)胞和IL-21。在接種細(xì)胞(每孔一個細(xì)胞)后9天開始，在ELISA中分析上清液的兔免疫球蛋白G(IgG)的產(chǎn)生。為了進(jìn)行對比，還平行分析了在人類B細(xì)胞克隆的上清液中的人類IgG。[0128]圖7中，描繪了從起始一個細(xì)胞培養(yǎng)后的9天開始，上清液中的抗體濃度隨時間的變化。確定了以下樣品的抗體濃度:兩位人類供體;和一個轉(zhuǎn)導(dǎo)有GALV型逆轉(zhuǎn)錄病毒的兔B細(xì)胞樣品，該GALV型逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶含人類Bcl-6序列和人類Bcl-xL的核酸分子；以及一個轉(zhuǎn)導(dǎo)有GALV型逆轉(zhuǎn)錄病毒的兔B細(xì)胞樣品，該GALV型逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶含人類Bcl-6序列和人類Mcl-1的核酸分子。來自兔的B細(xì)胞克隆在較短的時間段(分別為13~18天和15~20天）內(nèi)產(chǎn)生30ng/ml和100ng/ml的IgG濃度。這提供了重要的優(yōu)點(diǎn)，即與人類B細(xì)胞克隆相比，它允許更早地篩選兔B細(xì)胞克隆的感興趣的抗體。[0129]實(shí)施例5[0130]兔的免疫。[0131]使用在完全氟氏佐劑中的含15ugHlNl、15ugH3N2和15uginflB的人類流感疫苗，對兩只新西蘭白兔進(jìn)行免疫。三周后，使用在不完全氟氏佐劑中的相同的疫苗對兔進(jìn)行增強(qiáng)。在增強(qiáng)后五天，從兔取血，從血液中分離出B細(xì)胞，并且使用GALV型逆轉(zhuǎn)錄病毒(含有與雙嗜性包膜蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域融合的，GALV毒株SEATO包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域和跨膜結(jié)構(gòu)域)進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中GALV型逆轉(zhuǎn)錄病毒攜帶含人類Bcl-6序列和人類Bcl-xL的核酸分子。將轉(zhuǎn)導(dǎo)的B細(xì)胞以不同的細(xì)胞密度接種到培養(yǎng)板中，并且如實(shí)施例4中所述進(jìn)行培養(yǎng)。另外，使用疫苗的熒光標(biāo)記的組分H1、H3或流感B對轉(zhuǎn)導(dǎo)的B細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，并且使用FACS分選儀以每孔一個細(xì)胞進(jìn)行分選，并且如實(shí)施例4中所述進(jìn)行培養(yǎng)。分析培養(yǎng)細(xì)胞的上清液與完整疫苗或與它的各組分的結(jié)合。結(jié)果示于圖4~圖6中，并且示出：可通過以不同密度接種細(xì)胞(圖5)，在來自接種的兔的B細(xì)胞庫中鑒定出抗原特異性B細(xì)胞;并且，也可使用標(biāo)記的抗原對細(xì)胞進(jìn)行分選（圖4和圖6)，以非常有效地在來自接種的兔的B細(xì)胞庫中鑒定出抗原特異性B細(xì)胞。[0132]實(shí)施例6[0133]通過使用雙嗜型逆轉(zhuǎn)錄病毒引入基因Bcl-6和Bcl-xl，使兔B細(xì)胞永生化。[0134]可通過使用不同類型的載體，諸如實(shí)施例1中所示的GALV和雙嗜型逆轉(zhuǎn)錄病毒引入基因Bcl-6和Bcl-xl，實(shí)現(xiàn)兔B細(xì)胞的永生化。進(jìn)一步追蹤轉(zhuǎn)導(dǎo)有雙嗜型逆轉(zhuǎn)錄病毒的B細(xì)胞的生長，以證實(shí)通過雙嗜型逆轉(zhuǎn)錄病毒引入Bcl-6和Bcl-xl也導(dǎo)致兔B細(xì)胞的永生化。與使用GALV型逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)后的80%的細(xì)胞被轉(zhuǎn)導(dǎo)相比，使用雙嗜型逆轉(zhuǎn)錄病毒0.8%的細(xì)胞被轉(zhuǎn)導(dǎo)了（圖1和圖10)。轉(zhuǎn)導(dǎo)后十天，94%的轉(zhuǎn)導(dǎo)有雙嗜型逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞是GFP陽性的，這證明轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞比非轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞長的快(圖10)。[0135]為了確定細(xì)胞倍增時間，如實(shí)施例2中，將細(xì)胞以50~100.000細(xì)胞/孔的密度，與⑶40L-L細(xì)胞和IL-21-起培養(yǎng)在24孔板中。每3~4天對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，并且將50~100.000個細(xì)胞轉(zhuǎn)移至新的孔。圖11中，描繪了轉(zhuǎn)導(dǎo)有雙嗜性病毒的兔B細(xì)胞的生長曲線。計(jì)算的倍增時間是19小時，這與轉(zhuǎn)導(dǎo)有GALV型逆轉(zhuǎn)錄病毒的兔B細(xì)胞（18小時)相當(dāng)?？傊M管轉(zhuǎn)導(dǎo)效率比基于GALV的載體低很多，但通過雙嗜性逆轉(zhuǎn)錄病毒將Bcl-6和Bcl-xl引入到兔B細(xì)胞中，也得到兔B細(xì)胞的永生化?！靖綀D說明】[0136]圖1.[0137]兔記憶B細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)?；贗g的表達(dá)，從PBMC中分離出兔B細(xì)胞。在⑶40LL細(xì)胞上，同時使用rm-IL-21，使細(xì)胞活化36~40小時。使用含BCL6和Bcl-xL的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。對GALV型逆轉(zhuǎn)錄病毒和雙嗜型逆轉(zhuǎn)錄病毒都進(jìn)行了測試。然后，在重組的小鼠IL-21的存在下，將轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)在CD40L-L細(xì)胞上。在培養(yǎng)四天后，基于GFP的表達(dá)確定轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。GALV型逆轉(zhuǎn)錄病毒示出比雙嗜型(0.8%)逆轉(zhuǎn)錄病毒優(yōu)秀(80%)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。[0138]圖2.[0139]分析兔B細(xì)胞的生長曲線，該兔B細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)有含BCL6和Bcl-xL的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或含BCL6和Mcl-1的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。為了進(jìn)行對比，平行分析了來自美洲駝細(xì)胞和來自兩位不同供體的人類細(xì)胞的B細(xì)胞的生長曲線，這些B細(xì)胞都轉(zhuǎn)導(dǎo)有相同的含BCL6和Bcl-xL的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。[0140]圖3.[0141]使用FACS，對三種不同的轉(zhuǎn)導(dǎo)Bcl-6Bcl-xL的兔B細(xì)胞克隆，檢測了IgG、IgM和IgA表面免疫球蛋白表達(dá)。[0142]圖4.[0143]在具有不同特異性的兔B細(xì)胞庫內(nèi)，鑒定抗原特異性兔B細(xì)胞。[0144]圖5.[0145]獲得針對含15ugHlNl、15ugH3N2和15uginflB的人類流感疫苗的不同組分的抗原特異性兔抗體。使用人類流感疫苗對兔進(jìn)行免疫和增強(qiáng)。使B細(xì)胞永生化，并且在重組的小鼠IL-21的存在下，以不同密度接種在384孔板中的CD40L-L細(xì)胞上。在ELISA中，篩選兔B細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中存在的抗體的流感特異性。針對疫苗所有組分，觀察抗原特異性抗體。[0146]圖6.[0147]使用熒光標(biāo)記的流感蛋白，對來自兔的永生化B細(xì)胞進(jìn)行染色，其中兔經(jīng)過含15ugHlNl、15ugH3N2和15uginflB的人類流感疫苗的免疫。使用FACSAria分選儀，將示出與流感蛋白結(jié)合的B細(xì)胞以每孔一個細(xì)胞的密度分選在384孔板中，在重組的小鼠IL-21的存在下的CD40L-L細(xì)胞上。為了流感特異性抗體，而在ELISA中對上清液進(jìn)行篩選。高頻率地觀察到針對用于抗原特異性分選的疫苗組分的抗原特異性抗體。[0148]圖7.[0149]在不同時間點(diǎn)，克隆B細(xì)胞的上清液中的抗體濃度。在輻照的⑶40L-L細(xì)胞并且補(bǔ)充有小鼠IL-21的存在下，將人類、美洲駝和兔的轉(zhuǎn)導(dǎo)的B細(xì)胞以每孔一個細(xì)胞的密度進(jìn)行接種。每3~4天，補(bǔ)充⑶40L-L細(xì)胞和IL-21。在培養(yǎng)過程中的不同時間點(diǎn)，在ELISA中分析各細(xì)胞的IgG濃度。每一測量在不同孔中進(jìn)行。兔B細(xì)胞經(jīng)含BCL6和Bcl-xL的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體或含BCL6和Mcl-1的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)。其它所有細(xì)胞(人類和美洲駝)都經(jīng)BCL6和Bcl-xL轉(zhuǎn)導(dǎo)。[0150]圖8.[0151]用于轉(zhuǎn)導(dǎo)兔和人類B細(xì)胞的載體的示意圖。[0152]圖9.[0153]與雙嗜性包膜蛋白的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域(斜體+點(diǎn)下劃線）融合的，GALVSEAT0包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的序列(粗體），和GALVSEAT0包膜蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域(下劃線）。[0154]圖10.[0155]兔記憶B細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)，和轉(zhuǎn)導(dǎo)有雙嗜型逆轉(zhuǎn)錄病毒的兔B細(xì)胞的生長物?；贗g的表達(dá)，從PBMC中分離出兔B細(xì)胞。在⑶40LL細(xì)胞上，同時使用rm-IL-21，使細(xì)胞活化36~40小時。使用含BCL6和Bcl-xL的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞。對GALV型逆轉(zhuǎn)錄病毒和雙嗜型逆轉(zhuǎn)錄病毒都進(jìn)行了測試。然后，在重組的小鼠IL-21的存在下，將轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)在CD40L-L細(xì)胞上。在培養(yǎng)四天后，基于GFP的表達(dá)確定轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。GALV型逆轉(zhuǎn)錄病毒示出比雙嗜型(0.8%)逆轉(zhuǎn)錄病毒優(yōu)秀(80%)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。轉(zhuǎn)導(dǎo)后10天，基于GFP的表達(dá)，94%的轉(zhuǎn)導(dǎo)有雙嗜型逆轉(zhuǎn)錄病毒的細(xì)胞是永生化的，這示出轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞比非轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞長的快。[0156]圖11.[0157]分析了兔B細(xì)胞的生長曲線，該兔B細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)有含BCL6和Bcl-xL的雙嗜型逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。[0158]參考文件[0159]Christopherson,K.S.etal.PNAS89,6314-8(1992)[0160]Guzman,L.M.etal.Bacteriol177,4121-4130(1995)[0161]T.M.Kinsella，G.P.Nolan，HumGeneTher7(1996)1405.[0162]Kwakkenbosetal.Generationofstablemonoclonalantibody-producingBcellreceptor-positivehumanmemoryBcellsbygeneticprogramming.NatureMedicine(2010)vol.l6(l)pp.123-8[0163]Lametal.Improvedgenetransferintohumanlymphocytesusingretroviruseswiththegibbonapeleukemiavirusenvelope.Humangenetherapy7(1996)1415-1422[0164]A.L.SzymczakjC.J.Workman,Y.Wang,K.M.Vignali,S.Dilioglou,E.F.Vanin,D.A.A.Vignali,NatBiotechnol22(2004)589.[0165]C.A.Wilson，M.V.Eiden，W.B.Anderson，C.Lehel，Z.01ah，JVirol69(1995)534.[0166]W02007/067046【主權(quán)項(xiàng)】1.兔B細(xì)胞在獲得具有20小時或更短的平均倍增時間的離體B細(xì)胞培養(yǎng)物中的應(yīng)用。2.-種獲得具有20小時或更短的平均倍增時間的離體B細(xì)胞培養(yǎng)物的方法，所述方法包括：在B細(xì)胞中，誘導(dǎo)、增強(qiáng)和/或維持Bcl-6或其兔同源物的表達(dá)；以及在所述B細(xì)胞中，誘導(dǎo)、增強(qiáng)和/或維持至少一種抗凋亡的核酸分子的表達(dá)，其特征在于，所述B細(xì)胞是兔B細(xì)胞。3.-種用于增加兔B細(xì)胞的復(fù)制壽命的方法，所述方法包括：在兔B細(xì)胞中，誘導(dǎo)、增強(qiáng)和/或維持Bcl-6或其兔同源物的表達(dá)；以及在所述B細(xì)胞中，誘導(dǎo)、增強(qiáng)和/或維持至少一種抗凋亡的核酸的表達(dá)，其特征在于，經(jīng)由基因遞送工具的轉(zhuǎn)導(dǎo)，向所述兔B細(xì)胞提供編碼Bcl-6、或其兔同源物、或其功能部分或功能衍生物的核酸分子，和/或提供至少一種抗凋亡的核酸分子;所述基因遞送工具包括長臂猿白血病病毒(GALV)包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一個功能部分，或與所述GALV包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一個功能部分具有至少70%序列同一性的蛋白。4.長臂猿白血病病毒(GALV)包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一個功能部分，或與所述GALV包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一個功能部分具有至少70%序列同一性的蛋白，在將感興趣的核酸分子引入到兔B細(xì)胞中的應(yīng)用。5.-種獲得抗體的方法，包括：在兔B細(xì)胞中，誘導(dǎo)、增強(qiáng)和/或維持Bcl-6或其兔同源物的表達(dá)；在所述B細(xì)胞中，誘導(dǎo)、增強(qiáng)和/或維持至少一種抗凋亡的核酸分子的表達(dá)；離體培養(yǎng)所述B細(xì)胞；以及在7~14天內(nèi)，優(yōu)選在9~12天內(nèi)，收獲由所述B細(xì)胞生產(chǎn)的抗體。6.根據(jù)權(quán)利要求2、3或5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，向所述兔B細(xì)胞提供：編碼非兔的Bcl-6，或其功能部分或功能衍生物的核酸分子，和/或至少一種非兔的抗凋亡的核酸分子。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中，所述非兔的核酸分子是人類的核酸分子。8.根據(jù)權(quán)利要求2~3或5~7中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述至少一種抗凋亡的核酸分子包括Bcl2家族的基因，所述Bcl2家族的基因優(yōu)選選自由Bcl-χL、Mcl-l、Bcl-2、Al、Bcl-w、BC12L10、及它們的兔同源物和它們的功能部分和它們的功能衍生物組成的組。9.根據(jù)權(quán)利要求2~3或5~8中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述方法還包括在所述兔B細(xì)胞中，誘導(dǎo)、增強(qiáng)和/或維持Blimp-Ι或其兔同源物的表達(dá)。10.根據(jù)權(quán)利要求2~3或5~9中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括向所述兔B細(xì)胞提供IL21和CD40L。11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中，所述IL21是小鼠或人類的IL21，和/或，其中，所述⑶40L是小鼠或人類的⑶40L。12.根據(jù)權(quán)利要求2~3或5~11中任一項(xiàng)所述的方法，包括：向所述兔B細(xì)胞提供能直接或間接增強(qiáng)Bcl-6的表達(dá)或其兔同源物的表達(dá)的化合物；和/或在能直接或間接增強(qiáng)Bcl-6的表達(dá)或其兔同源物的表達(dá)的化合物的存在下，培養(yǎng)所述兔B細(xì)胞。13.根據(jù)權(quán)利要求2~3或5~12中任一項(xiàng)所述的方法，包括：向所述兔B細(xì)胞提供能直接或間接增強(qiáng)Bcl-xL和/或Mcl-1和/或Bcl-2和/或A1和/或Bcl-w和/或Bcl2L10和/或其兔同源物的表達(dá)的至少一種化合物;和/或在能直接或間接增強(qiáng)Bcl-xL和/或Mcl-1和/或Bcl-2和/或A1和/或Bcl-w和/或Bcl2L10和/或其兔同源物的表達(dá)的至少一種化合物的存在下，培養(yǎng)所述兔B細(xì)胞。14.根據(jù)權(quán)利要求2~3或5~13中任一項(xiàng)所述的方法，進(jìn)一步包括：向所述兔B細(xì)胞提供能直接或間接增加Blimp-Ι的表達(dá)或Blimp-Ι的兔同源物的表達(dá)的至少一種化合物;和/或在能直接或間接增加Blimp-Ι的表達(dá)或Blimp-Ι的兔同源物的表達(dá)的至少一種化合物的存在下，培養(yǎng)所述兔B細(xì)胞。15.-種分離或重組的兔B細(xì)胞，所述分離或重組的兔B細(xì)胞與長臂猿白血病病毒(GALV)包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一個功能部分結(jié)合，或與所述GALV包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一個功能部分具有至少70%序列同一性的蛋白結(jié)合。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的兔B細(xì)胞，所述兔B細(xì)胞經(jīng)由GALV包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一個功能部分，或經(jīng)由與所述GALV包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一個功能部分具有至少70%序列同一性的蛋白，與基因遞送工具結(jié)合，其中所述基因遞送工具包括編碼Bcl-6，或其兔同源物，或其功能部分或功能衍生物的核酸分子，和/或抗凋亡的核酸序列。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的兔B細(xì)胞，其中，所述抗凋亡的核酸序列是編碼選自下組中的蛋白的核酸序列:8(31-6、8(3131^、]\^1-1、8(31-2^1、8(311、8(3121^10，它們的兔同源物，它們的功能部分，它們的功能衍生物，和它們的任意組合。18.-種分離或重組的兔B細(xì)胞，包括：非兔的抗凋亡的核酸分子，所述非兔的抗凋亡的核酸分子優(yōu)選編碼Bcl-xL或Mcl-1或Bcl-2或A1或Bcl-w或Bcl2L10或其功能部分或功能衍生物;和非兔的核酸分子，所述非兔的核酸分子編碼Bcl-6或其功能部分或功能衍生物。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的兔B細(xì)胞，其中，所述非兔的核酸序列是人類的核酸序列。20.-種離體的兔B細(xì)胞培養(yǎng)物，所述離體的兔B細(xì)胞培養(yǎng)物具有20小時或更短的平均倍增時間。21.-種離體的兔B細(xì)胞培養(yǎng)物，包括根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的兔B細(xì)胞。22.-種離體的兔B細(xì)胞培養(yǎng)物，所述離體的兔B細(xì)胞培養(yǎng)物通過根據(jù)權(quán)利要求2~3或5~14中任一項(xiàng)所述的方法獲得。23.-種抗體，所述抗體通過根據(jù)權(quán)利要求2~3或5~14中任一項(xiàng)所述的方法獲得。24.-種抗體，所述抗體由根據(jù)權(quán)利要求18或19所述的兔B細(xì)胞生產(chǎn)或由根據(jù)權(quán)利要求20~22中任一項(xiàng)所述的離體的兔B細(xì)胞培養(yǎng)物生產(chǎn)。25.-種基因遞送工具在增加兔B細(xì)胞的復(fù)制壽命中的應(yīng)用，其中所述基因遞送工具包括：長臂猿白血病病毒(GALV)包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一個功能部分，或與所述GALV包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的至少一個功能部分具有至少70%序列同一性的蛋白；以及，編碼Bcl-6或其兔同源物或其功能部分或功能衍生物的核酸序列，和/或至少一種抗凋亡的核酸序列。26.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，或根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，或根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的兔B細(xì)胞，或根據(jù)權(quán)利要求25所述的應(yīng)用，其中，所述胞外結(jié)構(gòu)域是GALV毒株SEATO的包膜蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域。27.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，或根據(jù)權(quán)利要求16所述的兔B細(xì)胞，或根據(jù)權(quán)利要求25所述的應(yīng)用，其中，所述基因遞送工具包括如圖9所示的嵌合包膜蛋白，或包括如圖9所示的嵌合包膜蛋白的蛋白，或與如圖9所示的嵌合包膜蛋白具有至少70%序列同一性的蛋白?！疚臋n編號】C12N15/867GK106029873SQ201480076247【公開日】2016年10月12日【申請日】2014年12月24日【發(fā)明人】保利娜·瑪麗亞·威爾荷米娜·范赫爾登,M·J·克瓦肯博斯,H·斯皮茨,T·博蒙特【申請人】埃姆醫(yī)療有限公司