用于治療肺動脈高血壓的材料和方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微小RNA 96及其前體和模擬物用于抑制血管細(xì)胞增殖和/或血管重塑，以及用于治療相關(guān)醫(yī)學(xué)病況，如肺動脈高血壓(PAH)的用途。
【專利說明】用于治療肺動脈高血壓的材料和方法 發(fā)明領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及微小RNA 96及其前體和模擬物用于抑制血管細(xì)胞增殖和/或血管重 塑，以及用于治療相關(guān)醫(yī)學(xué)病況，如肺動脈高血壓(PAH)的用途。
[0002] 發(fā)明背景
[0003] 肺動脈高血壓(PAH)是一種以重度肺動脈重塑和閉塞性肺血管損傷，從而導(dǎo)致右 心室衰竭為特征的破壞性疾病。最近的流行病學(xué)研究報(bào)告了疾病的發(fā)生在女性中較大;根 據(jù)疾病分類，女性與男性比率可以大到4:1、
[0004] PAH具有每年影響2-3/百萬的不良預(yù)后；PAH患者分別具有68%、48%和34%的1 年、3年和5年存活率。依靠目前的療法不能顯著增加存活，并且對新的治療方法有迫切的需 要。
[0005] 遺傳性PAH與BMPR2的基因中的突變有關(guān)，所述BMPR2經(jīng)由smadl/ID途徑進(jìn)行信號 傳導(dǎo) 2。5_羥色胺也通過促進(jìn)PASMC增殖和收縮在PAH的形成中發(fā)揮關(guān)鍵作用。這可以藉由其 通過色氨酸羥化酶1 (TPH1)合成34，通過經(jīng)由5-羥色胺轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SERT)進(jìn)入細(xì)胞中和/或通 過活化5HT1B受體 3'6一13。
[0006] 我們已證明了，在僅雌性形成肺性高血壓(PH)的PH的三種動物模型（SERT+小鼠1Q、 mtsl過表達(dá)小鼠 14和經(jīng)右芬氟拉明（dexfenf luramine)處理的小鼠15)中，PH的形成可以是 5-羥色胺依賴性的，并且依賴于內(nèi)源雌激素和/或雌激素代謝15~。這提示了性別、雌激素和 5-羥色胺是PH中的相互作用風(fēng)險(xiǎn)因素。
[0007] 微小RNA(miR)是小的非編碼RNA，其經(jīng)由阻抑翻譯（經(jīng)由抑制翻譯或誘導(dǎo)mRNA降 解)而對細(xì)胞功能具有實(shí)質(zhì)性影響。微小RNA源自由RNA pol II合成的初級RNA轉(zhuǎn)錄物(pri-miRNA)，其長度可以是幾千個(gè)核苷酸。單一 pri-miRNA轉(zhuǎn)錄物可以引起超過一種活性miRNA。
[0008] 在核中，酶III類RNA酶Drosha將pri-miRNA轉(zhuǎn)錄物加工成由莖-環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)組成 的前體miRNA(pre-miRNA)，長度通常為70至100個(gè)左右的核苷酸。然后，將pre-miRNA轉(zhuǎn)運(yùn)到 胞質(zhì)，在那里它被RNA酶Dicer進(jìn)一步加工，除去環(huán)，并且產(chǎn)生成熟雙鏈miRNA分子，其具有與 完全或部分互補(bǔ)的"過客"鏈雜交的活性"引導(dǎo)"鏈(長度通常為15至25個(gè)核苷酸）。
[0009] 然后，成熟的雙鏈miRNA被摻入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物中，在那里指導(dǎo)鏈與祀mRNA 中的結(jié)合位點(diǎn)雜交。
[0010] 指導(dǎo)鏈可以不與靶結(jié)合位點(diǎn)完全互補(bǔ)。然而，稱作"種子"序列的指導(dǎo)鏈的區(qū)域通 常與靶結(jié)合位點(diǎn)的相應(yīng)序列完全互補(bǔ)。種子序列通常是2至8個(gè)核苷酸的長度，并且位于指 導(dǎo)鏈的5 '端處或附近(在5 '端的1或2個(gè)核苷酸內(nèi)）。
[0011] 認(rèn)為單一未配對的指導(dǎo)鏈也可以能夠被摻入RISC中。還認(rèn)為阻礙過客鏈對RISC的 摻入的對過客鏈(例如對糖、堿基或主鏈結(jié)構(gòu)）的修飾也可以提高通過雙鏈miRNA進(jìn)行的靶 物抑制的效率。
[0012] 先前已經(jīng)顯示了某些miR調(diào)節(jié)影響PAH的基因18-2Q。
[0013] 發(fā)明概述
[0014]在其最廣泛的形式中，本發(fā)明涉及微小RNA 96(miR-96)及其前體、模擬物和激動 劑用于抑制血管細(xì)胞增殖和/或血管重塑，以及用于治療相關(guān)醫(yī)學(xué)病況，如PAH的用途。 [0015] 不希望被理論束縛，認(rèn)為在表達(dá)5-HT1B受體的細(xì)胞中提高miR-96表達(dá)或活性可以 是特別有效的。祀細(xì)胞包括血管細(xì)胞和與血管系統(tǒng)有關(guān)的細(xì)胞。
[0016] 本發(fā)明提供了用于抑制血管細(xì)胞增殖和/或血管重塑的方法，包括對靶細(xì)胞遞送， 或?qū)κ茉囌呤┯茫?br>[0017] (a)miR-96、其模擬物、或任一者的前體;或
[0018] (b)編碼miR-96、其模擬物、或任一者的前體的核酸。
[0019] 本發(fā)明還提供了用于預(yù)防或治療肺性高血壓的方法，包括對靶細(xì)胞遞送，或?qū)κ?試者施用：
[0020] (a)miR-96、其模擬物、或任一者的前體;或
[0021 ] (b)編碼miR-96、其模擬物、或任一者的前體的核酸。
[0022] 本發(fā)明還提供了 miR-96、其模擬物、或任一者的前體，其用于抑制血管細(xì)胞增殖 和/或血管重塑的方法中。
[0023] 本發(fā)明還提供了 miR-96、其模擬物、或任一者的前體，其用于預(yù)防或治療肺性高血 壓，尤其是肺動脈高血壓的方法中。
[0024] 本發(fā)明還提供了 miR-96、其模擬物、或任一者的前體在制備用于抑制血管細(xì)胞增 殖和/或血管重塑的藥物中的用途。
[0025] 本發(fā)明還提供了 miR-96、其模擬物、或任一者的前體在制備用于預(yù)防或治療肺性 高血壓，尤其是肺動脈高血壓的藥物中的用途。
[0026] 本發(fā)明還提供了編碼miR-96、其模擬物、或任一者的前體的核酸，其用于抑制血管 細(xì)胞增殖和/或血管重塑的方法中。
[0027] 本發(fā)明還提供了編碼miR-96、其模擬物、或任一者的前體的核酸，其用于預(yù)防或治 療肺性高血壓，尤其是肺動脈高血壓的方法中。
[0028] 本發(fā)明還提供了編碼miR-96、其模擬物、或任一者的前體的核酸在制備用于抑制 血管細(xì)胞增殖和/或血管重塑的藥物中的用途。
[0029] 本發(fā)明還提供了編碼miR-96、其模擬物、或任一者的前體的核酸在制備用于預(yù)防 或治療肺性高血壓，尤其是肺動脈高血壓的藥物中的用途。
[0030] 在所有方面中，本發(fā)明本質(zhì)上牽涉提高靶細(xì)胞中的miR-96活性。
[0031 ] 這可以通過對革E細(xì)胞直接遞送miR-96，通過遞送miR-96模擬物，或者通過遞送在 靶細(xì)胞內(nèi)加工成活性miR-96或miR-96模擬物的前體分子而實(shí)現(xiàn)。
[0032]或者，它可通過對靶細(xì)胞遞送編碼miR-96、其模擬物、或任一者的前體的核酸，使 得在靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá)活性miR-96或miR-96模擬物、或任一者的前體而實(shí)現(xiàn)。
[0033] 靶細(xì)胞通常表達(dá)5-HT1B受體。靶細(xì)胞可以是血管細(xì)胞，如血管平滑肌細(xì)胞(VSMC) 或血管內(nèi)皮細(xì)胞。具體地，它可以是肺動脈平滑肌細(xì)胞(PASMC)或肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞?；蛘?，它 可以是與血管系統(tǒng)有關(guān)的細(xì)胞。與血管系統(tǒng)有關(guān)的細(xì)胞是位于血管內(nèi)，或管壁中的細(xì)胞，包 括內(nèi)皮、平滑肌或外膜。血管系統(tǒng)可以是肺血管系統(tǒng)。血管系統(tǒng)可以是動脈，如肺動脈。因 此，與血管系統(tǒng)有關(guān)的細(xì)胞包括外膜成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞，例如淋巴細(xì)胞(尤其是T淋巴 細(xì)胞）、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞。
[0034]可以在體外、在體內(nèi)或離體進(jìn)行牽涉遞送到靶細(xì)胞的方法。
[0035] 可以與合適的載體分子，如藥學(xué)可接受脂質(zhì)或聚合物結(jié)合(例如與所述合適的載 體分子復(fù)合或由合適的載體分子包囊)遞送miR-96、模擬物或前體。
[0036] 可以以裸核酸遞送編碼miR-96、模擬物或前體的核酸?；蛘?，它可以與合適的載體 分子，如藥學(xué)可接受脂質(zhì)或聚合物結(jié)合(例如與所述合適的載體分子復(fù)合或由合適的載體 分子包囊)而遞送。在任一種情況中，核酸通常是DNA。
[0037] 載體分子可以進(jìn)一步包含能夠結(jié)合于靶細(xì)胞表面的靶向劑。
[0038] 或者，可以經(jīng)由病毒載體遞送編碼miR-96、模擬物或前體的核酸。
[0039] 可以采用任何合適類型的病毒載體，包括腺病毒、腺伴隨病毒(AAV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒 (尤其是慢病毒)和皰疹病毒載體。腺病毒和慢病毒可以是特別優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兙哂性诓?活躍分裂的細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)遞送的基因的表達(dá)的能力。
[0040] miR-96及其前體
[0041 ]術(shù)語"miR-96"在本說明書中用于指由以下序列組成的RNA寡核苷酸：
[0042] UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU〇
[0043] 這是大多數(shù)哺乳動物中的成熟miR-96的序列，包括人、大猩猩(gorilla)、黑猩猩 (chimpanzee)、猩猩（orang-utan)、獼猴(macaque)、狨猴(marmoset)、小鼠、大鼠、兔、牛、 豬、馬和犬。
[0044] 成熟序列的核苷酸2至7稱作"種子"區(qū)，其結(jié)合祀mRNA，并且具有序列：
[0045] UUGGCA。
[0046] 活性miR-96寡核苷酸(或"指導(dǎo)鏈"）可以是單鏈的，或者它可以與第二個(gè)RNA寡核 苷酸(稱為"過客鏈"）雜交。指導(dǎo)鏈和過客鏈在雜交的復(fù)合物中彼此反平行運(yùn)行，所述雜交 的復(fù)合物可以稱為"雙鏈miR-96"。指導(dǎo)鏈在以分離形式存在時(shí)可以稱為"單鏈miR-96"。
[0047] 過客鏈和指導(dǎo)鏈可以含有許多錯配，因此并非一條或兩條鏈中的所有核苷酸與另 一條鏈中的互補(bǔ)核苷酸雜交。因此，雙鏈miR-96可以含有一個(gè)或多個(gè)凸起(凸起是僅一條鏈 中的未配對的核苷酸，或多個(gè)連續(xù)的未配對的核苷酸)或內(nèi)部環(huán)(兩條鏈中的對向的未配對 的核苷酸）。末端的一個(gè)或多個(gè)核苷酸也可以是未配對的。
[0048]過客鏈可以與指導(dǎo)鏈的種子序列是100%互補(bǔ)的。
[0049] 雙鏈miR-96的一條鏈或兩條鏈可以包含3'突出端，例如1、2或3個(gè)核苷酸的3'突出 端。也就是說，在鏈的3'端的核苷酸延伸出互補(bǔ)鏈的最5'的核苷酸(包括未配對的末端核苷 酸），并且因此在互補(bǔ)鏈中沒有相應(yīng)的核苷酸。例如，兩條鏈都包含1、2或3個(gè)核苷酸的3'突 出端?；蛘?，復(fù)合物在一個(gè)或兩個(gè)末端可以是平端的。在一些實(shí)施方案中，過客鏈與指導(dǎo)鏈 是相同的長度，或者長度上相差例如多達(dá)5個(gè)核苷酸或甚至更多，這取決于兩條鏈之間的錯 配程度和任何3'突出端的長度。
[0050] 成熟的天然miR-96過客鏈具有序列：
[0051 ] 5' -AAUCAUGUGCAGUGCCAAUAUG-3'，并且認(rèn)為如下與指導(dǎo)鏈配對：
指導(dǎo)?：
[0052] 過客：
[0053]因此，過客鏈具有3'未配對的核苷酸和3個(gè)核苷酸的3'突出端。指導(dǎo)鏈具有3個(gè)核 苷酸的3'突出端。雜交的復(fù)合物具有以指導(dǎo)鏈中的一個(gè)凸起和內(nèi)部環(huán)分開的三個(gè)互補(bǔ)性區(qū) 域(它們之一包含整個(gè)種子序列）。
[0054] miR-96的前體包括pre-mir-96和pri-mir-96，以及其可以被加工為成熟miR-96 (無論單鏈還是雙鏈)的片段和變體。
[0055] 術(shù)語"pre-mir-96"用于指由任何全長哺乳動物pre-mir-96序列組成的RNA寡核苷 酸，或其包含通過環(huán)序列與相應(yīng)的過客序列連接的成熟miR-96指導(dǎo)序列的片段或變體，所 述過客序列與指導(dǎo)序列完全或部分互補(bǔ)，并且其中寡核苷酸能夠形成其中指導(dǎo)序列和過客 序列彼此雜交的莖-環(huán)結(jié)構(gòu)(或"發(fā)夾"）。
[0056] pre-mir-96能夠充當(dāng)雙鏈RNA特異性核糖核酸酶(RNA酶III型酶)Dicer的底物，由 此它被加工為成熟的雙鏈miR-96。
[0057] 全長哺乳動物pre-mir-96序列包含人序列(hsa-pre-mir-96):
[0061 ]在這兩種情況中，（指導(dǎo)鏈的)成熟序列加下劃線。
[0062] 與顯示的序列相比，pre-mir-96可以擁有成熟序列外部的一個(gè)或多個(gè)修飾。
[0063] 例如，成熟序列上游(5'）的序列可以與相應(yīng)的人或鼠序列具有至少50%同一性、 至少55%同一性、至少60%同一性、至少65%同一性、至少70%同一性、至少75%同一性、至 少80 %同一,性、至少85%同一,性、至少90 %同一,性、至少91 %同一,性、至少92 %同一,性、至少 93 %同一,性、至少94%同一,性、至少95%同一,性、至少96 %同一,性、至少97 %同一,性、至少 98%同一性、或至少99%同一性。例如，上游序列在與5'人序列最佳比對時(shí)可以與其相差1、 2、3或4個(gè)核苷酸，或者在與5'鼠序列最佳比對時(shí)可以與其相差1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11 個(gè)核苷酸。
[0064] 例如，成熟序列下游(3'）的序列可以與相應(yīng)的人或鼠序列具有至少50%同一性、 至少55%同一性、至少60%同一性、至少65%同一性、至少70%同一性、至少75%同一性、至 少80 %同一,性、至少85%同一,性、至少90 %同一,性、至少91 %同一,性、至少92 %同一,性、至少 93 %同一,性、至少94%同一,性、至少95%同一,性、至少96 %同一,性、至少97 %同一,性、至少 98%同一性、或至少99%同一性。例如，下游序列在與3'人序列最佳比對時(shí)可以與其相差多 達(dá)5、多達(dá)10、多達(dá)15或多達(dá)20個(gè)核苷酸，或者在與3'鼠序列最佳比對時(shí)可以與其相差多達(dá) 5、多達(dá)10、多達(dá)15、多達(dá)20、多達(dá)25或多達(dá)30個(gè)核苷酸。
[0065] 術(shù)語"pri-mir-96"用于指由任何長度的哺乳動物pri-mir-96序列組成的RNA寡核 苷酸，或者其包含pre-mir-96序列并且能夠被雙鏈RNA特異性核糖核酸酶(RNA酶III型酶） Drosha加工成pre-mir-96序列的片段或變體。
[0066] 全長哺乳動物pri-mir-96序列包括人序列(hsa-pri-mir-96):
[0070] 再一次，成熟序列加下劃線。
[0071] 與顯示的序列相比，pri-mir-96可以擁有成熟序列外部或天然pre-mir-96序列外 部的一個(gè)或多個(gè)修飾。
[0072] 例如，成熟序列上游(5'）的序列可以與相應(yīng)的人或鼠序列具有至少50%同一性、 至少55%同一性、至少60%同一性、至少65%同一性、至少70%同一性、至少75%同一性、至 少80 %同一,性、至少85%同一,性、至少90 %同一,性、至少91 %同一,性、至少92 %同一,性、至少 93 %同一,性、至少94%同一,性、至少95%同一,性、至少96 %同一,性、至少97 %同一,性、至少 98 %同一性、或至少99 %同一性。
[0073] 例如，pre-mir-96序列上游(5'）的序列可以與相應(yīng)的人或鼠序列具有至少50%同 一*性、至少55 %同一,性、至少60%同一,性、至少65 %同一,性、至少70%同一,性、至少75 %同一 性、至少80 %同一,性、至少85%同一,性、至少90 %同一,性、至少91 %同一,性、至少92%同一 性、至少93 %同一,性、至少94%同一,性、至少95 %同一,性、至少96 %同一,性、至少97 %同一 性、至少98 %同一性、或至少99 %同一性。
[0074] 例如，成熟序列下游(3'）的序列可以與相應(yīng)的人或鼠序列具有至少50%同一性、 至少55%同一性、至少60%同一性、至少65%同一性、至少70%同一性、至少75%同一性、至 少80 %同一,性、至少85%同一,性、至少90 %同一,性、至少91 %同一,性、至少92 %同一,性、至少 93 %同一,性、至少94%同一,性、至少95%同一,性、至少96 %同一,性、至少97 %同一,性、至少 98 %同一性、或至少99 %同一性。
[0075] 例如，天然pre-mir-96序列下游（3'）的序列可以與相應(yīng)的人或鼠序列具有至少 50 %同一1性、至少55 %同一1性、至少60%同一1性、至少65 %同一1性、至少70 %同一1性、至少 75 %同一,性、至少80 %同一,性、至少85%同一,性、至少90 %同一,性、至少91 %同一,性、至少 92 %同一,性、至少93 %同一,性、至少94%同一,性、至少95 %同一,性、至少96 %同一,性、至少 97 %同一性、至少98 %同一性、或至少99 %同一性。
[0076] miR-96前體可以是任何合適的長度，只要它可以被加工為成熟的miR-96(無論是 單鏈還是雙鏈）。因此，前體的長度是至少23個(gè)核苷酸，并且長度可以是至少25、至少30、至 少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至 少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少200、至少250、 至少300、至少350、至少400、至少450、至少500、至少1000、至少1500或至少2000個(gè)核苷酸。
[0077] 或者，前體的長度可以是25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、 100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400、450、500、1000、1500、2000 或 2500個(gè)核 苷酸的最大值。
[0078] 應(yīng)當(dāng)注意到，術(shù)語"寡核苷酸"并不意圖暗示任何具體的長度，并且僅僅用于指連 接的核苷酸的任何單一連續(xù)鏈。
[0079] miR-96模擬物及其前體
[0080] miR-96模擬物是與天然存在的miR-96相比具有結(jié)構(gòu)或序列中的一個(gè)或多個(gè)修飾， 但是保留與由miR-96調(diào)節(jié)的mRNA中的miR-96結(jié)合位點(diǎn)雜交，并且抑制5-HT1B受體表達(dá)的能 力的寡核苷酸。由miR-96調(diào)節(jié)的mRNA包括通過miR-96的結(jié)合抑制其翻譯或加速其降解的那 些mRNA(如5-HT1B mRNA)。
[0081 ] miR-96結(jié)合位點(diǎn)的一個(gè)例子是存在于Htrlb mRNA(即編碼5HT1B受體的基因）中的 序列 TGTGCTAGTGCCAAA。
[0082] miR-96模擬物寡核苷酸的長度通常是15-25個(gè)核苷酸，例如長度為18至25、20至 25，例如20至23、例如20、21、22或23個(gè)核苷酸。
[0083]與miR-96相比，miR-96模擬物可以在堿基序列、核苷酸結(jié)構(gòu)、和/或主鏈連接上有 所不同。
[0084] miR-96模擬物通常包含與天然種子序列相同的種子序列:UUGGCA。
[0085] miR-96模擬物可以包含具有成熟天然序列的寡核苷酸或者由具有成熟天然序列 的寡核苷酸組成：
[0086] UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU [0087](其中種子序列加下劃線）。
[0088] miR-96模擬物可以與種子序列外部的成熟天然序列不同。例如，它可以在1、2、3、 4、5、6、7、8、9或10個(gè)位置(它們都必須位于種子序列外部)處與成熟的天然序列不同。
[0089] miR-96模擬物可以與第二寡核苷酸雜交。與天然的miR-96-樣，活性寡核苷酸可 以稱為"指導(dǎo)鏈"，并且結(jié)合的寡核苷酸稱為"過客鏈"。雜交的復(fù)合物可以稱為雙鏈miR-96 模擬物。
[0090]模擬物過客鏈的序列可以與天然過客鏈的序列相同或者可以在一個(gè)或多個(gè)位置 處與天然過客鏈不同。例如，模擬物過客鏈的序列可以在不超過10個(gè)位置、不超過9個(gè)位置、 不超過8個(gè)位置、不超過7個(gè)位置、不超過6個(gè)位置、不超過5個(gè)位置、不超過4個(gè)位置、不超過3 個(gè)位置、不超過2個(gè)位置或不超過1個(gè)位置處與天然過客鏈的序列不同。優(yōu)選地，過客鏈與指 導(dǎo)鏈的種子序列是100%互補(bǔ)的，并且模擬物序列和天然序列之間的任何序列差異在與種 子序列互補(bǔ)的區(qū)域外部發(fā)生。
[0091 ]雙鏈miR-96模擬物的一條或兩條鏈可以含有3 '突出端，例如1、2或3個(gè)核苷酸的3 ' 突出端。例如，兩條鏈都可以包含3個(gè)核苷酸的3'突出端。或者，復(fù)合物可以在一個(gè)或兩個(gè)末 端是平端的。過客鏈和指導(dǎo)鏈可以含有一個(gè)或多個(gè)錯配。在一些實(shí)施方案中，過客鏈與指導(dǎo) 鏈?zhǔn)窍嗤L度，或者在長度上相差多達(dá)5個(gè)核苷酸。
[0092] miR-96模擬物的前體是可以通常通過酶Dicer的作用或者通過酶Drosha和Dicer 的序貫作用在靶細(xì)胞內(nèi)被加工成miR-96模擬物的任何分子。
[0093] 因此，前體可以具有模擬物序列上游(5'）和/或下游(3'）的額外寡核苷酸序列。
[0094] 前體可以含有通過環(huán)序列與同指導(dǎo)序列完全或部分互補(bǔ)的相應(yīng)過客序列連接的 miR-96模擬物指導(dǎo)序列，并且其中寡核苷酸能夠形成莖-環(huán)結(jié)構(gòu)(或"發(fā)夾"），其中指導(dǎo)序列 和過客序列彼此雜交。此類寡核苷酸可以被認(rèn)為pre-mir-96模擬物，并且能夠充當(dāng)用于雙 鏈RNA特異性核糖核酸酶(RNA酶III型酶)Dicer的底物，由此它被加工成包含分開的指導(dǎo)鏈 和過客鏈的雙鏈miR-96模擬物。
[0095] 例如，成熟序列上游(5'）的序列可以與相應(yīng)的人或鼠序列具有至少50%同一性、 至少55%同一性、至少60%同一性、至少65%同一性、至少70%同一性、至少75%同一性、至 少80 %同一,性、至少85%同一,性、至少90 %同一,性、至少91 %同一,性、至少92 %同一,性、至少 93 %同一,性、至少94%同一,性、至少95%同一,性、至少96 %同一,性、至少97 %同一,性、至少 98 %同一性、或至少99 %同一性。
[0096] 例如，成熟序列下游(3'）的序列可以與相應(yīng)的人或鼠序列具有至少50%同一性、 至少55%同一性、至少60%同一性、至少65%同一性、至少70%同一性、至少75%同一性、至 少80 %同一,性、至少85%同一,性、至少90 %同一,性、至少91 %同一,性、至少92 %同一,性、至少 93 %同一,性、至少94%同一,性、至少95%同一,性、至少96 %同一,性、至少97 %同一,性、至少 98 %同一性、或至少99 %同一性。
[0097]或者，前體可以是pri-mir-96模擬物（即，它具有pre-mir-96模擬物序列上游(5'） 和/或下游(3'）的額外的寡核苷酸序列），并且能夠被雙鏈RNA特異性核糖核酸酶(RNA酶III 型酶)Drosha加工成pre-mir-96模擬物序列。
[0098] 例如，成熟miR-96模擬物序列上游(5'）的序列可以與相應(yīng)的天然的人或鼠序列具 有例如至少50 %同一,性、至少55 %同一,性、至少60 %同一,性、至少65 %同一,性、至少70 %同 一*性、至少75 %同一,性、至少80%同一,性、至少85 %同一,性、至少90%同一,性、至少91 %同一 性、至少92 %同一,性、至少93%同一,性、至少94%同一,性、至少95 %同一,性、至少96%同一 性、至少97 %同一1性、至少98 %同一1性、或至少99 %同一1性。
[0099] 例如，pre-mir-96模擬物序列上游(5'）的序列可以與相應(yīng)的人或鼠序列具有至少 50 %同一1性、至少55 %同一1性、至少60%同一1性、至少65 %同一1性、至少70 %同一1性、至少 75 %同一,性、至少80 %同一,性、至少85%同一,性、至少90 %同一,性、至少91 %同一,性、至少 92 %同一,性、至少93 %同一,性、至少94%同一,性、至少95 %同一,性、至少96 %同一,性、至少 97 %同一性、至少98 %同一性、或至少99 %同一性。
[0100] 例如，成熟miR-96模擬物序列下游(3'）的序列可以與相應(yīng)的人或鼠序列具有至少 50 %同一1性、至少55 %同一1性、至少60%同一1性、至少65 %同一1性、至少70 %同一1性、至少 75 %同一,性、至少80 %同一,性、至少85%同一,性、至少90 %同一,性、至少91 %同一,性、至少 92 %同一,性、至少93 %同一,性、至少94%同一,性、至少95 %同一,性、至少96 %同一,性、至少 97 %同一性、至少98 %同一性、或至少99 %同一性。
[0101] 例如，pre-mir-96模擬物序列下游(3'）的序列可以與相應(yīng)的人或鼠序列具有至少 50 %同一1性、至少55 %同一1性、至少60%同一1性、至少65 %同一1性、至少70 %同一1性、至少 75 %同一,性、至少80 %同一,性、至少85%同一,性、至少90 %同一,性、至少91 %同一,性、至少 92 %同一,性、至少93 %同一,性、至少94%同一,性、至少95 %同一,性、至少96 %同一,性、至少 97 %同一性、至少98 %同一性、或至少99 %同一性。
[0102] miR-96模擬物前體可以是任何合適的長度，只要它可以被加工為成熟的miR-96模 擬物(無論是單鏈還是雙鏈）。因此，前體的長度是至少23個(gè)核苷酸，并且長度可以是至少 25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少 80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少 200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450、至少500、至少1000、至少1500或至少 2000個(gè)核苷酸。
[0103]或者，前體的長度可以是25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、 100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400、450、500、1000、1500、2000 或 2500個(gè)核 苷酸的最大值。
[0104] 結(jié)構(gòu)修飾
[0105] 在上文討論的序列修飾外，或者作為上文討論的序列修飾的備選，與RNA寡核苷酸 相比，miR-96模擬物或其前體可以包含一個(gè)或多個(gè)結(jié)構(gòu)修飾。
[0106] miR-96模擬物或前體可以包含一個(gè)或多個(gè)包含經(jīng)修飾的糖殘基（即核糖殘基之外 的糖殘基)的核苷酸。
[0107] 經(jīng)修飾的糖殘基包括碳環(huán)糖或無環(huán)糖、在其2'、3'或4'位置的一處或多處具有取 代基基團(tuán)的糖和具有替換糖的一個(gè)或多個(gè)氫原子的取代基的糖。
[0108]合適的經(jīng)修飾的糖可以擁有糖取代基基團(tuán)，其選自：〇H;F;〇-、S-、或N-烷基;0-、 S-、或N-烯基;0-、S-或N-炔基;或0-烷基-0-烷基。烷基、烯基和炔基可以是經(jīng)取代的或未取 代的C1至C10烷基或C 2至C10烯基和炔基。在一些實(shí)施方案中，這些基團(tuán)可選自：0(CH2) x〇ch3、0 (( ch2 ) x0) yCH3、0 ( ch2 ) xNH2、0 ( ch2 ) xCH3、0 ( ch2 ) x〇nh2、和0 ( ch2 ) x〇n (( ch2 ) xCH3 ) 2，其中 X 和y是1至10。
[0109] 糖取代基基團(tuán)可以包括&至&〇低級烷基、經(jīng)取代的低級烷基、烯基、炔基、烷芳基、 芳烷基、0-烷芳基或 0-芳烷基、SH、SCH3、Cl、Br、CN、OCN、CF3、0CF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、N〇2、 N 3、NH2、雜環(huán)烷基、雜環(huán)烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基和經(jīng)取代的甲硅烷基。
[0110] 其它取代基基團(tuán)包括2'-甲氧基乙氧基和2'-二甲基氨基乙氧基乙氧基、烯丙基(_ CH2 _CH=CH2)、_0_稀丙基(_0_CH2 _CH=CH2)、甲氧基_0_CH3)、氛基丙氧基(-OCH2CH2CH2NH2)、 和氟(F)。
[0111] 2'位置(2'_)上的糖取代基基團(tuán)可以在阿拉伯糖（上)位置或核糖（下）位置中。一 種2'-阿拉伯糖修飾是2'-F。也可以在寡聚體化合物上的其它位置處，特別是3'端核苷上的 糖的3'位置處或者在2'-5'連接的寡核苷酸和5'端核苷酸的5'位置中做出其它類似的修 飾。
[0112]經(jīng)修飾的糖殘基的例子包括2'-0_甲基核糖、2'-0_甲氧基乙基核糖、2'-氟-核糖 和4-硫代-核糖。
[0113]也可以使用二環(huán)糖，并且它通常包含具有將環(huán)約束成C3'內(nèi)向構(gòu)型的2'，4'橋(例 如亞甲基橋)的呋喃糖基環(huán)。含有二環(huán)糖的核苷酸經(jīng)常稱為鎖核酸（"LNA"）殘基。
[0114] miR-96模擬物或前體可以獨(dú)立含有任何或所有這些類型的經(jīng)修飾的糖殘基的一 種或多種。
[0115] 另外/或者，miR-96模擬物或前體可以包含一個(gè)或多個(gè)主鏈修飾，例如經(jīng)修飾的核 苷間連接。
[0116] 因此，可以經(jīng)由備選的連接模塊替換磷酸酯模塊連接一個(gè)或多個(gè)相鄰的核苷酸。
[0117] 可以特別期望經(jīng)修飾的核苷間連接存在于miR-96模擬物的一個(gè)或兩個(gè)末端，即在 5 '端核苷酸和相鄰的核苷酸之間，和/或在3 '端核苷酸和相鄰的核苷酸之間。
[0118] 適合于用作核苷間連接的模塊包括硫代磷酸酯、嗎啉代和膦酰羧酸酯 (phosphonocarboxylate )模塊，以及硅氧烷、硫化物、亞砜、砜、乙?；⒓柞Ｒ阴；?(formacetyl )、硫代甲酰乙?；╰hioformacetyl )、亞甲基甲酰乙?；╩ethylene formacety 1)、硫代甲酰乙?；?、烯基、氨基磺酸酯（sulphamate )、亞甲基亞胺基 (11161：11716116；[111；[110)、亞甲基餅基（11161：11716116117(^&2；[110)、橫酸酯（811]^11011&七6)和橫胺 (sulphonamide)模塊。
[0119] 在硫代磷酸酯模塊中，非橋接氧原子被硫原子替換。硫代磷酸酯基團(tuán)可以促進(jìn)血 清蛋白質(zhì)結(jié)合，并且因此可以改善模擬物的體外分布和生物利用度。這在模擬物要對接受 者系統(tǒng)性施用時(shí)可以是期望的。
[0120] 另外/或者，miR-96模擬物或前體可以包含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的堿基作為天然存 在的腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤和尿嘧啶的備選。此類經(jīng)修飾的堿基包括5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羥甲基胞嘧啶、黃嘌呤、次黃嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鳥嘌呤的6-甲基和其它烷 基衍生物、腺嘌呤和鳥嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和 2_硫代胞嘧啶（2-thiocytosine)、5-鹵代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶和嘧 啶堿基的其它炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶）、4_硫 尿嘧啶、8-鹵代、8-氨基、8-硫代、8-硫代烷基、8-羥基和其它8-取代的腺嘌呤和鳥嘌呤、5-鹵代(包括5-溴、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶）、7_甲基鳥嘌呤和7-甲基腺 嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮雜鳥嘌呤和8-氮雜腺嘌呤、7-脫氮鳥嘌呤和7-脫氮 腺嘌呤和3-脫氮鳥嘌呤和3-脫氮腺嘌呤。
[0121] 遞送miR-96、模擬物和前體
[0122] 可以提供組合物，其中miR-96、模擬物和前體與合適的載體結(jié)合(例如與合適的載 體復(fù)合或由合適的載體包囊，或共價(jià)附接于合適的載體）。
[0123] 合適的載體包括藥學(xué)可接受的脂質(zhì)和聚合物及其組合。例如，組合物可以具有脂 質(zhì)體、脂囊泡、脂質(zhì)復(fù)合物或聚合物復(fù)合物的形式。
[0124] 例如，脂囊泡和脂質(zhì)體是具有含有寡核苷酸負(fù)載(cargo)的水性核心的脂質(zhì)雙層 顆粒。
[0125] 脂質(zhì)復(fù)合物（或"脂復(fù)合物（lipoplexes)"）和聚合物復(fù)合物（"聚復(fù)合物 (polyplexes)"）通常含有帶正電荷的脂質(zhì)或聚合物，其與帶負(fù)電荷的寡核苷酸相互作用以 形成復(fù)合物。
[0126] 陽離子聚合物或脂質(zhì)也可以與靶細(xì)胞表面上的帶負(fù)電荷的分子相互作用。通過脂 質(zhì)和端基(head group)的適當(dāng)選擇，可以剪裁(tailor)復(fù)合物以促進(jìn)與祀細(xì)胞的質(zhì)膜或與 選定的內(nèi)膜(如內(nèi)體膜或核膜)融合以促進(jìn)遞送寡核苷酸負(fù)載到合適的亞細(xì)胞區(qū)室。通過脂 復(fù)合物和聚復(fù)合物進(jìn)行的基因遞送例如由Tros de Ilarduya等在Eur.J.Pharm.Sci.40 (2〇10)159_1 7〇 中綜述。
[0127] 也可使用中性脂質(zhì)乳劑與具有納米級的直徑的miRNA形成顆粒復(fù)合物。
[0128] 根據(jù)應(yīng)用、負(fù)載和靶細(xì)胞，技術(shù)人員可以選擇合適的脂質(zhì)?？梢允褂脝我恢|(zhì)或 者，更通常為，脂質(zhì)的組合。
[0129] 合適的脂質(zhì)記載于例如W02011/088309及其中引用的參考文獻(xiàn)，且包括：
[0130]-中性脂質(zhì)和磷脂，如鞘磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰 肌醇、磷脂酸（phosphatidic acid)、棕櫚酰油酰基磷脂酰膽堿（palmitoyloleoy 1 phosphatdylchol ine)、溶血磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二油酰 基磷脂酰膽堿、二硬脂酰磷脂酰膽堿、二亞油酰磷脂酰膽堿、磷脂酰膽堿(PC)、1，2_二油酰 基-sn-甘油-3-磷酸膽堿(D0PC)、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺(PE)、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇 胺、鞘磷脂（sphinogomyelin, SM)、心磷脂、磷脂酸(phosphosphatidic acid)、1，2-二硬脂 酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DSPC)、1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1-棕櫚酰- 2- 油?；?sn-甘油-3-磷酸膽堿(P0PC)、1，2-二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DLPC)、1，2-二豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DMPC)、1，2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(DPPC)、1，2-二豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、1，2-二油?；?sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、 二棕櫚油?；鵡^((11。31111；[1:0106071-?￡)、二植燒酰-?￡((11。115^311071-?￡)、03?￡、二反油酰 基-?￡((116131(1071-?￡)、二亞油酰-3]\1、和二亞油酰-?￡;
[0131] -固醇，例如膽固醇，
[0132] -聚合物修飾的脂質(zhì)，例如聚乙二醇(PEG)修飾的脂質(zhì)，包括PEG修飾的磷脂酰乙醇 胺和磷脂酸、PEG-神經(jīng)酰胺綴合物、PEG-修飾的二烷基胺和PEG-修飾的1，2_二?；趸? 3- 0安（PEG-modif ied 1，2-diacyloxypropan-3_amines)。特別合適的是PEG修飾的二酰甘油 和二烷基甘油，例如PEG-二豆蔻酰甘油（PEG-didimyristoyl glycerol)(PEG-DMG)PEG-二 苯乙烯基甘油(PEG-DSG)和PEG-氨甲酰基-1，2-二豆蔻酰氧基丙胺(PEG-cDMA);
[0133] -陽離子脂質(zhì)，如N，N-二油?；?N，N-二甲基氯化銨（"D0DAC"）； N-(2，3-二油?；?氧基）丙基-N，N-N-三乙基氯化銨（"D0TMA"）；N，N-二硬脂酰-N，N-二甲基溴化銨（"DDAB"）； N-(2，3-二油酰基氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化鈉（"D0TAP"）； 1，2-二油?；趸?3-三甲 基氨基丙烷氯化物鹽（"D0TAP.C1"）；3P-(N-(N'，N'_二甲基氨基乙烷)-氨甲?；?膽固醇 ("DC-Cho 1"），N-(1 -(2，3-二油酰基氧基)丙基)-N-2-(精胺甲酰胺基）乙基)-N，N-二甲基三 氣乙酸銨（"D0SPA"）、雙十八烷基酰氨基甘氨酰駿基精胺（"DOGS"）、1，2-二油?；?sn_3_磷 酸乙醇胺（"DOPE"）、1，2-二油?；?3-二甲基銨丙烷（"D0DAP"）、N，N-二甲基-2，3-二油?；?氧基）丙胺（"D0DMA"）、N-(1，2_二肉豆蔻基氧基丙-3-基）-N，N-二甲基-N-羥乙基溴化銨 ("DMRIE"）、1，2_二亞油基氧基-3-二甲基氨基丙烷（1，2-(111111〇16 71(^7-3-dimethylaminopropane) (DLinDMA) 1，2-二亞油?；鵢3_二甲基氨基丙烷（DLinDAP)、1-亞油 ?；?2-亞油基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1，2-二亞油基氨基甲酰基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、l，2-二亞油基硫代-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、和2， 2-二亞油基-4-10二甲基氨基甲基-[1，3]_二氧戊烷(DLin-K-DMA)。陽離子脂質(zhì)的商業(yè)制劑 包括Lipofectin?(其包含D0TMA和DOPE，可獲自Gibco/BRL)，和Lipofectamine?(其包含 DOSPA和DOPE，可獲自 Gibco/BRL)。
[0134] -陰離子脂質(zhì)，包括磷脂酰甘油、心磷脂、二?；字＝z氨酸、二?；字?、N-十二烷酰磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰磷脂酰乙醇胺和賴氨酰磷脂酰 甘油（lysylphosphatidylglycerol) 〇
[0135] W0/0071096描述了不同的配制劑，如D0TAP:膽固醇或膽固醇衍生物配制劑，其可 以有效用于寡核苷酸遞送。
[0136] 能夠?qū)Ψ螌?shí)現(xiàn)良好的miRNA遞送的商業(yè)上可得到的組合物是中性脂質(zhì)乳劑 MaxSuppressor in vivo RNALancerII(BI00 Scientific,Austin,TX)，其由1，2_二油酰 基-sn-甘油-3-磷酸膽堿、藍(lán)稀油、Polysorbate 20和抗氧化劑組成。在與合成miRNA的復(fù)合 中，它形成納米直徑范圍中的納米顆粒。
[0137] 合適的聚合物包括組蛋白和魚精蛋白（和其它DNA結(jié)合蛋白）、聚（乙烯亞胺） (PEI)、陽離子樹枝狀聚合物，如聚酰胺胺(polyamidoamine) (PAMAM)樹枝狀聚合物、2-二甲 基(氨基乙基）甲基丙烯酸酯(PDMAEM)、聚(L-賴氨酸）（PLL)、基于碳水化合物的聚合物，如 殼聚糖（。11；[1:08&11)等。關(guān)于綜述，參見1'1'08(16 11&1(1115^等于￡111'.]\?11&1'111.3。;[.40(2010) 159-17?？梢允褂玫鞍踪|(zhì)和肽，如端膠原(atellocollagen)。端膠原是一種由蛋白酶處理產(chǎn) 生的水溶形式的膠原，特別是經(jīng)胃蛋白酶處理的來自小牛真皮的I型膠原。
[0138] 環(huán)糊精也可以用于遞送。
[0139] 另外/或者，miR-96模擬物或前體可以包含膜轉(zhuǎn)運(yùn)模塊，以促進(jìn)運(yùn)送穿過靶細(xì)胞的 質(zhì)膜。此模塊可以是合適的脂質(zhì)或其它脂肪模塊，包括但不限于膽固醇和硬脂酰模塊。其它 膜轉(zhuǎn)運(yùn)模塊包括細(xì)胞穿透肽（"CPP"，如來自HIV-1的TAT和MPG、穿透蛋白（penetratin)、聚 精氨酸）和融合肽(fusogenic peptide)(例如流感融合肽(diINF-7)或HIV-1包膜(HGP)的 內(nèi)域衍生物）。可將膜運(yùn)送模塊與載體分子綴合，所述載體分子與miR-96模擬物或前體自身 非共價(jià)結(jié)合?；蛘?，可以將膜運(yùn)送模塊與miR-96模擬物或前體自身綴合?？梢詫⒛K與指導(dǎo) 鏈或過客鏈綴合，盡管過客鏈?zhǔn)莾?yōu)選的，從而不損害指導(dǎo)鏈功能。在5'或3'端的綴合可以是 優(yōu)選的，盡管與內(nèi)部殘基的綴合也是可能的。
[0140] 為了避免疑義，當(dāng)與膜運(yùn)送模塊連接時(shí)可以認(rèn)為miR-96分子(即，非以其它方式具 有與天然分子的任何結(jié)構(gòu)或序列差異)是miR-96模擬物或前體。
[0141] 靶細(xì)胞
[0142] 要提高miR-96活性的祀細(xì)胞通常是血管細(xì)胞，或與血管系統(tǒng)有關(guān)的細(xì)胞。
[0143] 與血管系統(tǒng)有關(guān)的細(xì)胞是位于血管內(nèi)，或者在血管壁，包括內(nèi)皮、平滑肌或外膜 (adventitia)中的細(xì)胞。
[0144] 通常，血管系統(tǒng)是肺血管系統(tǒng)，尤其是肺動脈。
[0145] 因此，血管平滑肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞是靶細(xì)胞，尤其是肺血管平滑肌細(xì)胞和肺 血管內(nèi)皮細(xì)胞，特別是肺動脈平滑肌細(xì)胞和肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞。
[0146] 盡管可以在高血壓條件下，或者在有助于高血壓形成的條件下調(diào)控，例如提高表 達(dá)，但靶細(xì)胞通常組成性表達(dá)5-HT1B受體。
[0147] 5HT1B受體在許多在免疫應(yīng)答和炎癥中發(fā)揮作用的細(xì)胞，包括T-淋巴細(xì)胞和單個(gè) 核細(xì)胞(monoclear cells)，如單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞上表達(dá)(22-24)。牽涉T淋巴細(xì)胞和炎性 細(xì)胞的功能障礙性免疫系統(tǒng)促成PAH發(fā)病機(jī)制（25,26)。另外，5-羥色胺經(jīng)由5-111'18受體刺 激成纖維細(xì)胞中的DNA合成，并且這與PAH模型中的成纖維細(xì)胞的增殖有關(guān)(27，28)。
[0148] 因此，表達(dá)5-HT1B受體的外膜成纖維細(xì)胞和免疫細(xì)胞也代表靶細(xì)胞，包括T淋巴細(xì) 胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞。
[0149] 靶向劑
[0150] 載體分子也可攜帶能夠結(jié)合靶細(xì)胞表面的靶向劑。例如，靶向劑可為特異性結(jié)合 配偶體，其能夠特異性結(jié)合在靶細(xì)胞，例如血管平滑肌細(xì)胞(例如肺動脈平滑肌細(xì)胞）、血管 內(nèi)皮細(xì)胞(例如肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞）、外膜成纖維細(xì)胞或免疫細(xì)胞(例如T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、 巨噬細(xì)胞或肥大細(xì)胞）的表面上表達(dá)的分子。合適的結(jié)合配偶體包括針對細(xì)胞表面分子的 抗體等，或者對于這些細(xì)胞類型上的此類細(xì)胞表面分子的配體或受體。細(xì)胞表面分子可為 相關(guān)細(xì)胞類型的特異性標(biāo)志物。或者，靶向劑可具體為5-HT1B受體自身的結(jié)合配偶體。
[0151] 術(shù)語"特異性結(jié)合對"用于描述包含彼此具有特定的特異性并且在正常條件中優(yōu) 先于結(jié)合其它分子而彼此結(jié)合的特異性結(jié)合成員（sbm)和其結(jié)合配偶體(bp)的分子對。特 異性結(jié)合對的例子是抗體及其關(guān)聯(lián)表位/抗原、配體(如激素等)和受體、親合素/鏈霉親合 素和生物素、凝集素和碳水化合物、和互補(bǔ)的核苷酸序列。
[0152] 公知的是，全抗體的片段可以執(zhí)行結(jié)合抗原的功能。功能性結(jié)合片段的例子是（i) 由VL、VH、CL和CH1域組成的Fab片段；（ii)由VH和CH1域組成的Fd片段；（iii)由單一抗體的 VL和VH域組成的Fv片段；（iv)由VH域組成的dAb片段(Ward，E ? S ?等，Nature 341，544-546 (1989)); (v)分離的CDR區(qū)；（vi)F(ab'）2片段，一種包含兩個(gè)連接的Fab片段的二價(jià)片段， (vii)單鏈Fv分子(scFv)，其中通過肽接頭連接VH域和VL域，所述肽接頭容許兩個(gè)域結(jié)合以 形成抗原結(jié)合位點(diǎn)（Bird等，Science，242，423-426，1988;Huston等，？嫩3 1^4,85,5879-5883，1988);(￥丨^)雙特異性單鏈?￥二聚體(？(^/1^92/09965)和（11)"雙抗體"，通過基因 融合構(gòu)建的多價(jià)或多特異性片段(W094/13804;P. Ho 11 iger等Proc. Nat 1. Acad. Sci . USA 90 6444-6448,1993)〇
[0153] 由于可以以多種方式修飾抗體，因此術(shù)語"抗體"應(yīng)當(dāng)解釋為涵蓋具有有需要的特 異性的結(jié)合域的任何特異性結(jié)合物質(zhì)。因此，此術(shù)語涵蓋上文描述的抗體片段，及抗體的衍 生物、功能等同物和同源物，包括包含免疫球蛋白結(jié)合域的任何多肽，無論是天然的還是合 成的。因此，包括嵌合分子，該嵌合分子包含與另一種多肽融合的免疫球蛋白結(jié)合域或等同 物。嵌合抗體的克隆和表達(dá)描述于EP-A-0120694和EP-A-0125023。
[0154] 抗體的備選是越來越可用的。可為了針對特定靶物的親和力而常規(guī)剪裁所謂的 "親和性蛋白"或"工程化蛋白質(zhì)支架"。它們通?；诰哂袠?gòu)象上穩(wěn)定或剛性核心的非免疫 球蛋白支架蛋白，其已經(jīng)被修飾而對靶物具有親和力。修飾可包括在支架蛋白的表面替換 一個(gè)或多個(gè)表面殘基，和/或插入一個(gè)或多個(gè)殘基。例如，可將對靶物具有親和力的肽插入 支架蛋白的表面環(huán)中或可替換支架蛋白的部分或整個(gè)表面環(huán)。合適的支架及其工程化等同 物包括：
[0155] -BPTI、LAC-DI、ITI-D2(Kunitz 域支架）；
[0156] -ETI-IKAGRP(Knottin)；
[0157] -硫氧還蛋白（肽適體）；
[0158] -Fn3(AdNectin)；
[0159] -脂籠蛋白（BBP)(Anticalin);
[0160] -錨蛋白重復(fù)(DARPin);
[0161] -蛋白A的Z域(Affibody);
[0162] - 晶體蛋白/泛素(Affilin);
[0163] -LDLR-A-域（Avimer)。
[0164] 參見例如Gebauer，M和Skerra，A，Current Op ? Chem. Biol ? 2009，13 : 245-255及 Friedman,M和Stahl，S，Biotechnol .Appl .Biochem. (2009)53:1-29及其中引用的參考文 獻(xiàn)。
[0165] 編碼miR-96、模擬物和前體的核酸
[0166] 作為將miR-96寡核苷酸、模擬物和前體直接遞送到靶細(xì)胞的備選，有可能將編碼 miR-96寡核苷酸、其模擬物、或任一者的前體的核酸遞送到靶細(xì)胞，使得在靶細(xì)胞內(nèi)表達(dá) miR-96寡核苷酸、模擬物或前體。此類方法可視為"基因療法"。
[0167] 對于技術(shù)人員會容易顯而易見的是，可以僅使用核酸以編碼由RNA構(gòu)成（即，由RNA 的4種天然存在的核苷酸組分構(gòu)成，而沒有經(jīng)修飾的堿基、糖或核苷間連接)的miR-96、其模 擬物和前體。
[0168] 核酸通常包含表達(dá)構(gòu)建體，其包含與適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)序列可操作連接以促進(jìn)表達(dá)的編 碼miR-96寡核苷酸、模擬物或前體的核酸序列。調(diào)節(jié)序列可以根據(jù)靶細(xì)胞選擇，但是通常會 包含合適的啟動子和任選的指導(dǎo)通過RNA聚合物II的轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)子，以及轉(zhuǎn)錄終止子(通常 包含多聚腺苷酸化信號）。
[0169] 啟動子可以是組織特異性啟動子，其與其它細(xì)胞或組織類型相比優(yōu)先或?qū)ｉT驅(qū)動 在靶細(xì)胞或組織中轉(zhuǎn)錄。
[0170] 例如，啟動子可以是優(yōu)先或?qū)ｉT驅(qū)動在血管細(xì)胞中或在如本說明書中的別處定義 的與血管系統(tǒng)有關(guān)的細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄的啟動子。因此，啟動子可以優(yōu)先或?qū)ｉT在肺血管細(xì)胞中， 例如在血管平滑肌細(xì)胞中和/或在血管上皮細(xì)胞(包括肺動脈平滑肌細(xì)胞和上皮細(xì)胞）、外 膜成纖維細(xì)胞、或免疫細(xì)胞，如T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中有活性。
[0171] 將核酸遞送到靶細(xì)胞
[0172]可以通過任何方便的路徑遞送編碼miR-96、模擬物和前體的核酸。
[0173]用于在體外將核酸遞送到細(xì)胞的方法包括磷酸鈣沉淀、DEAE-右旋糖酐、電穿孔、 顯微注射、加載有DNA的脂質(zhì)體、超聲處理和使用經(jīng)核酸涂覆的微粒(例如金或鎢微珠)的轟 擊。已經(jīng)成功使這些技術(shù)中的多種適于在體內(nèi)或離體使用。
[0174]因此，核酸可以以裸露形式施用，與合適的載體如聚合物或脂質(zhì)（如本說明書中別 處描述)結(jié)合(例如與合適的載體復(fù)合或由合適的載體包囊)施用，或涂覆到顆粒表面上施 用。在此類實(shí)施方案中，核酸通常是DNA。也可以適當(dāng)?shù)厥惯@些方法之任一種適于遞送 miR96、前體和模擬物自身。
[0175]核酸通常采取表達(dá)載體的形式。技術(shù)人員會能夠設(shè)計(jì)適合于治療用途(及本說明 書中描述的其它用途)的核酸表達(dá)載體。載體通常會含有表達(dá)構(gòu)建體，所述表達(dá)構(gòu)建體包含 與合適的調(diào)節(jié)序列(包括啟動子序列和轉(zhuǎn)錄終止序列)可操作連接，根據(jù)具體的應(yīng)用任選地 與增強(qiáng)子序列、標(biāo)志物基因和其它序列組合的編碼miR-96、模擬物或前體的核酸序列。載體 可意圖整合入宿主細(xì)胞染色體，或者可獨(dú)立于宿主染色體作為附加體(例如質(zhì)粒)存在并復(fù) 制。
[0176] 或者，可以使用病毒載體遞送核酸。
[0177] 可以采用任何合適的病毒載體類型作為基因遞送媒介物。這些包括腺病毒、腺伴 隨病毒(AAV)、逆轉(zhuǎn)錄病毒(尤其是慢病毒)和皰疹病毒載體。腺病毒和慢病毒可以是特別優(yōu) 選的，因?yàn)樗鼈兙哂袑?shí)現(xiàn)在不活躍分裂的細(xì)胞中遞送的基因的表達(dá)的能力。
[0178] 病毒載體通常包含病毒結(jié)構(gòu)蛋白和核酸有效負(fù)載，其包含對于在靶細(xì)胞或組織中 表達(dá)基因功能性的形式的期望的表達(dá)構(gòu)建體。因此，基因通常與啟動子和其它合適的轉(zhuǎn)錄 調(diào)節(jié)信號可操作連接。
[0179]在腺病毒載體中，核酸有效負(fù)載通常是雙鏈DNA(dsDNA)分子。在逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 中，它通常是單鏈RNA。
[0180] 核酸有效負(fù)載通常含有對于它被包裝到基因遞送媒介物中并且在靶細(xì)胞或組織 中適當(dāng)加工需要的其它元件。
[0181] 對于腺病毒載體，這些可以包括腺病毒反向末端重復(fù)（ITR)序列和合適的包裝信 號。
[0182] 對于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，這些包括特征性末端序列(所謂的"R-U5"和"U3-R"序列)和 包裝信號。末端序列使得能夠在源自逆轉(zhuǎn)錄的原病毒的任一端產(chǎn)生直接重復(fù)序列（"長末端 重復(fù)"或"LTR"），其然后促進(jìn)原病毒整合到宿主細(xì)胞基因組中并且指導(dǎo)隨后的表達(dá)。
[0183] 核酸有效負(fù)載也可以含有選擇標(biāo)志物，即編碼容許經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的迅速檢測的產(chǎn) 物的基因。例子包括熒光蛋白（例如GFP)、產(chǎn)生可見反應(yīng)產(chǎn)物的酶(例如半乳糖苷酶，螢光 素酶)的基因和抗生素抗性基因。
[0184] 病毒載體通常沒有復(fù)制能力。也就是說，核酸有效負(fù)載不含病毒復(fù)制必需的所有 病毒基因（和其它遺傳元件）。不過，病毒載體會含有對于將有效負(fù)載導(dǎo)入宿主細(xì)胞中及對 于適當(dāng)加工有效負(fù)載，使得可以表達(dá)編碼的miR-96、模擬物或前體需要的所有結(jié)構(gòu)蛋白和 酶活性。在這些不由核酸有效負(fù)載編碼的情況下，它們通常會由包裝細(xì)胞系供應(yīng)。技術(shù)人員 會完全知道可以用于產(chǎn)生合適的病毒遞送媒介物的合適的細(xì)胞系。
[0185] 因此，對于腺病毒載體，核酸有效負(fù)載通常缺乏一個(gè)或多個(gè)來自El、E2、E3或E4區(qū) 的功能性腺病毒基因?？梢詫⑦@些基因缺失或以其它方式失活，例如通過插入包含異源基 因或選擇標(biāo)志物的轉(zhuǎn)錄單元進(jìn)行。
[0186] 在一些實(shí)施方案中，核酸不含功能性病毒基因。因此，對于腺病毒載體，存在的唯 一病毒組分可以是ITR和包裝信號。
[0187] 沒有功能性病毒基因的核酸可以是優(yōu)選的，因?yàn)樗鼈兘档陀捎诓《镜鞍缀铣舍槍?經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的靶細(xì)胞或組織產(chǎn)生的宿主免疫應(yīng)答的風(fēng)險(xiǎn)。
[0_ 治療的受試者
[0189] 本發(fā)明的方法可以用于治療或預(yù)防肺動脈高血壓(PAH)。預(yù)防性使用不必暗示完 全預(yù)防疾病，但是涵蓋延遲疾病的發(fā)作和/或降低癥狀的嚴(yán)重性，無論在發(fā)作時(shí)還是后來。 因此，受試者可以患有PAH，或可處于產(chǎn)生PAH風(fēng)險(xiǎn)。
[0190] 肺動脈高血壓牽涉血管到肺的血管收縮和肺內(nèi)的血管的血管收縮。它以重度肺動 脈重塑和閉塞性肺血管損傷，導(dǎo)致右心室衰竭為特征。它是患有系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)的患 者中的死亡率的重大原因。因此，本發(fā)明涵蓋在SLE患者中以及在不受SLE影響的患者中預(yù) 防或治療PAH的方法。
[0191] PAH包括特發(fā)性PAH和遺傳性PAH(又稱為家族性PAH)。因此，受試者可以具有使他 們有形成PAH的素因的突變。例如，這可以是BMPR2基因（用于骨形態(tài)發(fā)生蛋白途徑的II型受 體）中的突變。此類突變包括引入提前終止密碼子的R899X和N903S。其它素因性突變包括 KCNK3基因（鉀通道亞家族K，成員3)中的功能喪失突變。
[0192] 先前可以已經(jīng)對受試者測試了 PAH的遺傳素因。本發(fā)明還提供了預(yù)防或治療PAH的 方法，其包括測定受試者的基因組中PAH的遺傳素因的存在或缺乏，并且若鑒定出此類素 因，則對受試者規(guī)定或施用：
[0193] (a)miR_96、其模擬物、或任一者的前體;或
[0194] (b)編碼miR-96、其模擬物、或任一者的前體的核酸。
[0195] 受試者可以患有或有風(fēng)險(xiǎn)形成特發(fā)性PAH。已知的風(fēng)險(xiǎn)因素包括女性性別，和厭食 藥物，如芬氟拉明（fenfluramine)/芬特明（phentermine)( "fen-phen"）的服用史。
[0196] 本發(fā)明可以特別適用于治療女性受試者，但是治療男性受試者也可以是有益的， 并且是本發(fā)明的范圍內(nèi)涵蓋的。
[0197] 雖然用于治療的最常見的受試者會是人，但是本發(fā)明的方法可以延伸到任何其它 哺乳動物，包括其它靈長類（尤其是大型猿（great apes)，如大猩猩（gorilla)、黑猩猩 (chimpanzee)和猩猩(orang utan)，而且還有舊世界和新世界猴）以及嗤齒類(包括小鼠和 大鼠），和其它常見的實(shí)驗(yàn)室、家養(yǎng)和農(nóng)業(yè)動物(包括但不限于兔、犬、貓、馬、牛、綿羊、山羊 等)。
[0198] 藥物組合物和治療方法
[0199] 可以將本文中描述的分子配制為藥物組合物。除了上述物質(zhì)之一外，這些組合物 可以包含藥學(xué)可接受賦形劑、載體、緩沖劑、穩(wěn)定劑或本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其它材料。此 類材料應(yīng)當(dāng)是無毒的，并且不應(yīng)干擾活性成分的效力。載體或其它材料的精確性質(zhì)可以取 決于施用路徑，例如口服、靜脈內(nèi)、皮膚或皮下、鼻、肌肉內(nèi)和腹膜內(nèi)路徑。Esseku和Adeyeye (2011)及Van den Mooter G. (2006)中提供了合適的組合物和施用方法的例子。
[0200] 用于口服施用的藥物組合物可以為片劑、膠囊、粉末或液體形式。片劑可以包含固 體載體，如明膠或佐劑。液體藥物組合物一般包含液體載體，如水、石油、動物油或植物油、 礦物油或合成油?？梢园ㄉ睇}水溶液、右旋糖或其它糖溶液或二醇（glycols)，如乙二 醇、丙二醇或聚乙二醇。
[0201] 對于靜脈內(nèi)、皮膚或皮下注射，或痛苦部位處的注射，活性成分可以為胃腸外可接 受的水溶液形式，其是無熱原的，并且具有合適的PH、等張性和穩(wěn)定性。本領(lǐng)域相關(guān)技術(shù)人 員完全能夠使用例如等張媒介物，如氯化鈉注射液、林格(Ringer)氏注射液、乳酸林格氏注 射液制備合適的溶液。根據(jù)需要可以包括防腐劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、抗氧化劑和/或其它添加 劑。
[0202] 無論要對個(gè)體給予的活性劑(例如根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞、多肽、核酸分子、其它藥學(xué) 有用的藥劑）的性質(zhì)如何，優(yōu)選以"預(yù)防有效量"或"治療有效量"（根據(jù)具體情況而定，盡管 可以認(rèn)為預(yù)防是療法)施用，這足以顯示對個(gè)體的益處。施用的實(shí)際量，和施用的速率和時(shí) 間過程會取決于所治療(情況）的性質(zhì)和嚴(yán)重性。治療的處方，例如對劑量的決定等在一般 從業(yè)者和其他醫(yī)學(xué)醫(yī)生的職責(zé)內(nèi)，并且通?？紤]要治療的病癥、個(gè)體患者的狀況、遞送的部 位、施用方法和從業(yè)者已知的其它因素。上文提及的技術(shù)和方案的例子可以參見 Remington's Pharmaceutical Sciences,^2〇Hix,2000,pub.Lippincott,ffil 1 iams& Wilkins。
[0203] 現(xiàn)在將參考附圖和實(shí)施例，通過實(shí)例而非限制更為詳細(xì)地描述本發(fā)明。
[0204] 附圖簡述
[0205] 圖1 :PASMC中的性別間的微小RNA的差異表達(dá)
[0206] 在雌性和雄性WT和BMPR2R899X+aPASMC中通過定量PCR對微小RNA表達(dá)的分析顯示性 別可以影響表達(dá)概貌。結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化至U6,并且表示為雌性WT值的倍數(shù)變化。數(shù)據(jù)表示為均值 土 5已]?。？〈0.05*，口〈0.01**(雌性對雄性）和口〈0.05+印〈0.01++，口〈0.001 +++(耵對810^2[?8995( +/-)。
[0207] 圖2:miR-96的表達(dá)在肺中最高
[0208] 在小鼠組織中通過定量-PCR對miR-96表達(dá)的全局分析顯示了水平在肺中顯著較 高。（RV，右心室）。結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化至U6,并且表示為肺數(shù)值的倍數(shù)變化。數(shù)據(jù)表示為均值土SEM。 卩〈0.01**和卩〈0.001***。
[0209] 圖3:5-HT1B受體作為miR-96靶物的確認(rèn)
[0210] (A)和(B)25nM濃度的Pre-miR-96降低螢光素酶活性，但是對假(mock)對照載體沒 有影響。（C)與對照和混雜miR相比，Pre-miR-96轉(zhuǎn)染提高成熟的miR-96水平。結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化至 U6，并且表示為對照數(shù)值的倍數(shù)變化。數(shù)據(jù)表示為均值土 SEMK0.05*和P〈0.01**。
[0211]圖 4:雌性 BMPR2R899X+/-PASMC 中增加的靶 5-HT1B 表達(dá)
[0212 ] 來自WT和BMPR2R899X+/-小鼠的雌性和雄性PASMC中的5-HT1B (A)蛋白和(B )mRNA表達(dá) 的分析。與雌性WT相比，雌性BMPR2R899X+/TASMC展現(xiàn)出增加的5-HT1B蛋白和mRNA表達(dá)。小鼠 PASMC中的5-HT1B蛋白表達(dá)的代表性免疫印跡（C)。將結(jié)果分別標(biāo)準(zhǔn)化至a-微管蛋白和 GATOH，并且表示為倍數(shù)變化。數(shù)據(jù)表示為均值土 SEMK0.05*，p〈0.01**(雌性對雄性)和口〈 0.05+，p〈0.〇r+，p〈0.0〇r ++(FD^+/-)。
[0213] 圖5: BMP4刺激挽救缺陷雌性BMPR2R899X+/-PASMC中的miR-96表達(dá)
[0214] 來自雌性BMPR2R899X+/1、鼠的小鼠PASMC在用InM BMP4刺激時(shí)展現(xiàn)出miR-96水平的 試驗(yàn)性升高。結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化至U6，并且表示為倍數(shù)變化。數(shù)據(jù)表示為均值± SEM。
[0215] 圖6:SMAD1的缺陷展現(xiàn)出與BMPR2R899X+/-類似的miR-96表達(dá)概貌。
[0216] 來自具有受損的SMAD1表達(dá)(+/-)的雌性小鼠的小鼠PASMC顯示了與雌性WT相比 miR-96表達(dá)的降低(A)。在整個(gè)肺組織中，相對于雌性WT在雌性SMAD1+/-小鼠中有miR-96水 平下降的趨勢，而雄性之間沒有變化(B)。結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化至U6,并且表示為倍數(shù)變化。數(shù)據(jù)表示 為均值土SEMKO.Ol**。
[0217] 圖7:人PAH對miR-96和5-HT1B表達(dá)的影響
[0218] 與非PAH對照相比，女性患者PASMC具有mir-96表達(dá)的降低(A)。與非PAH對照相比， 5-HT1B受體表達(dá)在女性患者PASMC中增加(B)，在具有BMPR2突變的HPAH患者內(nèi)發(fā)現(xiàn)miR-96 的低表達(dá)和5-HT1B的高表達(dá)。結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化至RNU48,并且表示為女性對照值的倍數(shù)變化。數(shù) 據(jù)表示為均值。R899X，N903S: BMPR2突變。HPAH:遺傳性PAH。IPAH:特發(fā)性PAH。
[0219] 圖8:雌激素的耗盡(depletion)僅在雌性小鼠中提高miR-96表達(dá)并且減少靶物5-HT1B。
[0220] 與媒介物對照相比，用芳香酶抑制劑阿那曲挫(anas traz〇 1 e)處理的雌性小鼠具 有增加的miR-96表達(dá)(A)和減少的5-HT1B表達(dá)(B)，而雄性小鼠在miR-96(C)或5_HT1B(D)的 表達(dá)上沒有展現(xiàn)出變化。結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化至U6,并且表示為對照值的倍數(shù)變化。數(shù)據(jù)表示為均值 土 SEMKO ? 05*和 P〈0 ? 01**。
[0221] 圖9:雌激素在調(diào)節(jié)miR-96中的作用
[0222] 用InM雌激素(E2)刺激72小時(shí)的人PASMC顯示miR-96表達(dá)的降低(p = 0.0512)(A) 和5-HT1B受體表達(dá)增加的相應(yīng)趨勢(B)。結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化至RNU48,并且表示為對照值的倍數(shù)變 化。數(shù)據(jù)表示為均值土SEM。
[0223] 圖10:mir-96模擬物預(yù)防小鼠中的缺氧誘導(dǎo)的肺性高血壓(PH)。一周一次靜脈注 射（i . v.)施用1.5mg/kg的mir-96模擬物達(dá)2周，在此期間將小鼠暴露于缺氧(hypoxia)。 miR-96模擬物防止右心室收縮壓的上升(A)、右心室肥大(B)和肺血管重塑(〇。*?〈0.05，** ?〈0.01，*樸〈0.001，*#樸〈0.0001 ;1-因素厶從^厶，接著是圖基(1\11?^)事后檢驗(yàn)。
[0224] 圖ll:mir-96模擬物反轉(zhuǎn)具有BMPR2突變(BMPR2R899X+/-)的小鼠中的肺性高血壓 (PH)。一周一次靜脈注射施用1.5mg/kg的mir-96模擬物達(dá)兩周，此后對小鼠評估PH的形成。 miR-96模擬物防止右心室收縮壓的上升（A)、右心室肥大（B)和肺血管重塑（〇。撲〈 0 ? 05，*#P〈0 ? 001，##P〈0 ? 0001; 1-因素AN0VA，接著是圖基事后檢驗(yàn)。
[0225] 發(fā)明詳述
[0226] 研究提示了微小RNA(miR)在肺動脈高血壓(PAH)的病理生物學(xué)中發(fā)揮至關(guān)重要的 作用。
[0227] 遺傳性PAH(hPAH)與骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體2(BMPR2)的基因中的突變有關(guān)。發(fā)明人 已經(jīng)研究了攜帶也在PAH患者中找到的突變的PAH的BMPR2小鼠模型，BMPR2 R899X+/1、鼠。
[0228] 在此模型中，性別作為肺動脈平滑肌細(xì)胞(PASMC)內(nèi)的miR的基礎(chǔ)表達(dá)的關(guān)鍵根本 調(diào)節(jié)因素出現(xiàn)。與雌性野生型(WT)相比，MiR-96在來自雌性BMPR2 R899X+A小鼠的PASMC中下 調(diào)，而雄性轉(zhuǎn)基因物與其WT對照之間的表達(dá)不變。全局表達(dá)分析顯示了肺內(nèi)的最高miR-96 表達(dá)。在mRNA和蛋白質(zhì)水平兩者上，5-HT1B受體的靶基因與雌性BMPR2 R899X+/TASMC內(nèi)的miR-96表達(dá)反相關(guān)。通過螢光素酶報(bào)告蛋白測定法確認(rèn)5HT1B基因?yàn)閙iR-96的靶物。
[0229] 發(fā)明人還確認(rèn)來自具有BMPR2突變的女性PAH患者的PASMC展現(xiàn)出低miR-96和高 5HT1B表達(dá)。
[0230] 這些結(jié)果提示了性激素如雌激素可在調(diào)節(jié)miR-96中發(fā)揮作用。與這一致，我們已 經(jīng)顯示了抑制內(nèi)源雌激素的體內(nèi)合成僅在雌性小鼠內(nèi)增加肺miR-96并且降低5-HT1B表達(dá)。 在人PASMC中用雌激素的直接刺激引起miR-96的減少和5-HT1B表達(dá)的增加。
[0231] 總之，miR-96的減少與增加的5HT1B表達(dá)有關(guān)。這提示了 miR-96模擬物/pre-miR-96策略可以是一種對于PAH的新的治療方法。支持此假設(shè)，臨床前研究確認(rèn)mir-96模擬物有 效預(yù)防或反轉(zhuǎn)肺性高血壓的小鼠模型中的肺性高血壓。 實(shí)施例
[0232] 材料和方法
[0233] 細(xì)胞培養(yǎng)
[0234] 鼠肺動脈平滑肌細(xì)胞
[0235] 源自BMPR2+AR899X小鼠和相應(yīng)的野生型對照小鼠的雌性和雄性肺動脈平滑肌細(xì)胞 (PASMC)由N. W. Morre 11教授(劍橋大學(xué)，劍橋，UK)提供。BMPR2v-R899X小鼠具有BMPR2基因的 雜合的敲入突變。小鼠類似于由West等（Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 295: L744-L755,2008)描述的那些小鼠。簡言之，在存在生長因子(上皮生長因子，堿性成纖維細(xì) 胞生長因子和胰島素）和抗生素（青霉素鏈霉素）的情況下在20 %FBS(胎牛血清）DMEM (Dulbecco氏改良的Eagle培養(yǎng)基）中培養(yǎng)PAMSC。利用傳代4-8的PASMC，并且細(xì)胞活力基于 獨(dú)特的平滑肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)。
[0236] 人肺動脈平滑肌細(xì)胞
[0237] 男性人PASMC由N ? W ? Morre 11教授(劍橋大學(xué)，劍橋，UK)提供。簡言之，從來自三名 PAH患者(兩名具有HPAH和一名具有IPAH)的肺血管組織的小遠(yuǎn)端肺動脈外植人PASMC。利用 源自非PAH受試者的PASMC作為對照。在存在抗生素抗真菌溶液(其含有青霉素、鏈霉素和兩 性霉素）的情況下在10 %FBS DMEM中培養(yǎng)人PASMC，并且在傳代4-8使用。經(jīng)由平滑肌細(xì)胞形 態(tài)學(xué)確認(rèn)PASMC表型。
[0238] RNA和蛋白質(zhì)分析
[0239] miRNA 和 mRNA 的 Taqman 定量 PCR 分析
[0240] 使用miRNeasy試劑盒(Qiagen)根據(jù)制造商的說明提取總RNA，并且使用NanoDrop- 1000分光光度計(jì)量化RNA純度。通過Taqman定量-PCR評估m(xù)iR和mRNA的表達(dá)，如先前描述 [17 ]。為了獲得倍數(shù)變化，將miR表達(dá)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化至U6 (對于小鼠）和RNU48 (對于人）。將mRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化至GAPDH。所有PASMC miRNA和mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)是n = 6，一式三份。
[0241 ] 蛋白質(zhì)的We stern印跡分析
[0242]使用RIPA裂解方法提取蛋白質(zhì)。給RIPA緩沖液補(bǔ)充蛋白酶抑制劑PMSF、大豆胰蛋 白酶抑制劑和過芐脒(benzamidine)。簡言之，將補(bǔ)充的RIPA緩沖液添加到PASMC，然后在冰 上攪拌10分鐘。經(jīng)由刮擦收集細(xì)胞裂解物。將蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化至a-微管蛋白，并且使 用密度測定(dens i tometry)量化。所有蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)據(jù)是n = 4，一式兩份。
[0243]微小RNA-96模擬物的體內(nèi)有效性
[0244] 為了評估m(xù)iR-96是否參與肺性高血壓的病理學(xué)，使用MaxSuppressor?體內(nèi)RNA- LANCEr II遞送方法一周一次經(jīng)由尾靜脈靜脈內(nèi)施用微小RNA-96模擬物（Applied Biosystems，撕 C10422,具有堿基序列UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU，與成熟小鼠和人 miR-96 相同）達(dá)2周。按照制造說明以每次注射1.5mg/kg的劑量，即每次注射每只小鼠約30ug在遞 送試劑中制備模擬物。使用經(jīng)陰性微小RNA模擬物(Applied Biosystems)和PBS給藥的動物 作為對照。
[0245] 慢性缺氧
[0246] 將2個(gè)月齡的雌性野生型(WT)C57/B1 (Charles River)小鼠暴露于14天低壓缺氧 (10%02,55011^〇，如先前描述（18)。研究在含氧量正常條件(21%0 2，100011^〇中維持的 小鼠作為對照。
[0247] PH的體內(nèi)評估
[0248] 進(jìn)行右心室收縮壓（RVSP)、右心室肥大（RVH)和肺血管重塑的測量，如先前描述 (3,4,10)〇
[0249] 靶物確認(rèn)
[0250] 螢光素酶報(bào)告物測定法
[0251] 利用psi-CHECK-2雙重螢光素酶報(bào)告物載體(Promega)進(jìn)行報(bào)告物測定法。簡言 之，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)從基因組小鼠 DNA產(chǎn)生5-HT1B報(bào)告物基因的3'UTR(非翻譯 區(qū)）的片段，并且經(jīng)由in-fusion克隆方法克隆入psi-CHECK-2載體的多克隆位點(diǎn)于Xhol和 Notl限制性位點(diǎn)處。然后，測序psi-CHECK-2 5-HT1B載體以確認(rèn)5-HT1B的3'UTR區(qū)內(nèi)沒有不 想要的突變。使用Lipofectamine 2000( Invitrogen)和0ptimem( Invitrogen)將lug psi-CHECK-2對照載體或psi-CHECK-2 5HT1B載體以及pre-miR-96(Ambion)或混雜miR(Ambion) 共轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞中，總共6小時(shí)，之后用10%FBS DMEM替換。將HeLa細(xì)胞保持48小時(shí)，并且 使用Dual-Glo螢光素酶測定系統(tǒng)(Promega)測量螢光素酶活性，并且通過發(fā)光計(jì)檢測。將花 蟲(renilla)螢光素酶活性標(biāo)準(zhǔn)化至內(nèi)部螢火蟲螢光素酶活性，并且數(shù)據(jù)表示為內(nèi)部對照 的百分比。
[0252] 數(shù)據(jù)的分析
[0253] 數(shù)值表示為均值土均值的標(biāo)準(zhǔn)差。在適當(dāng)?shù)那闆r下，進(jìn)行t-檢驗(yàn)或2-因素AN0VA及 接著是Bonferroni事后檢驗(yàn)以評估所有組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。p〈0.05的概率水平定義為統(tǒng) 計(jì)學(xué)顯著的。
[0254] 莖里
[0255] 圖1證明了許多miR受性別差別影響，并且miR-96相對于野生型對照在雌性 BMPR2 R899X+/-小鼠而非雄性中嚴(yán)重下調(diào)；相對于雄性BMPR2R899X+/-小鼠，miR-96水平在雌性 BMPR2 R899X+/1、鼠中更低。
[0256] 與其它組織水平相比，miR-96的肺表達(dá)極高，這會促進(jìn)肺的選擇性靶向（圖2)。我 們確認(rèn)了 5HT1B受體是使用螢光素酶報(bào)告物測定法的miR96的靶物（圖3)。
[0257] 降低的miR96表達(dá)與雌性BMPR2R899X+A小鼠中的5HT1B受體的靶基因的升高有關(guān)（圖 4)。通過BMP4刺激挽救降低的miR96表達(dá)(圖5)。在來自Smadl +/-小鼠的PASMC中觀察到相同 的表型（圖6)。
[0258] 已經(jīng)在人PASMC中確認(rèn)了結(jié)果（圖7)。特別感興趣的是在具有R899X突變的女性患 者中，5HT1B水平高，并且miR96表達(dá)極低（圖7)。
[0259] 我們還檢查了用芳香酶抑制劑阿那曲唑的雌激素耗盡對miR96和5HT1B受體兩者 的表達(dá)的影響。先前，我們已經(jīng)顯示了阿那曲唑反轉(zhuǎn)雌性小鼠和大鼠中、但非雄性中的PAH (未發(fā)表）。這里，我們顯示了用阿那曲唑在體內(nèi)耗盡雌激素在雌性小鼠肺而非雄性中提高 miR96表達(dá)，并且降低5HT1B表達(dá)(圖8)。
[0260] 與這一致，miR-96基因具有雌激素響應(yīng)區(qū)，并且雌激素自身降低miR-96的表達(dá)并 且提高5HT1B受體的表達(dá)(圖9)。
[0261] 圖10和11確認(rèn)miR-96模擬物可以在體內(nèi)在小鼠模型中既防止又反轉(zhuǎn)的實(shí)驗(yàn)性PH。 [0262] 討論
[0263] 我們的結(jié)果提示了增加的雌激素和BMPR2單倍劑量不足(haploinsufficiency)與 降低的miR-96表達(dá)有關(guān)。
[0264] miR-96通常阻抑5HT1B的基因的翻譯，并且因此miR-96的減少誘導(dǎo)5HT1B表達(dá)的增 加。這促進(jìn)通過5-羥色胺的PASMC增殖和肺血管重塑，并且有助于PAH的形成。
[0265] 雖然已結(jié)合上文描述的例示性實(shí)施方案描述了本發(fā)明，但是當(dāng)給予本公開時(shí)，許 多等同修飾和變型對于本領(lǐng)域技術(shù)人員會是顯而易見的。因而，認(rèn)為列出的本發(fā)明的例示 性實(shí)施方案是例示性的而非限制性的?？梢詫γ枋龅膶?shí)施方案做出多種改變而不背離本發(fā) 明的精神和范圍。本申請中引用的所有文件通過提述明確并入。
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[0294] (28)Seuwen K,Magnaldo I,Pouyssegur J.Serotonin stimulates DNA synthesis in fibroblasts acting through 5-HT1B receptors coupled to a Gi_ protein.Nature 1988September 15；335(6187):254~6.
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于預(yù)防或治療肺性高血壓的方法，其包括對靶細(xì)胞遞送，或?qū)κ茉囌呤┯茫? (a) miR-96、其模擬物、或任一者的前體;或 (b) 編碼miR-96、其模擬物、或任一者的前體的核酸。2. -種用于抑制血管細(xì)胞增殖和/或血管重塑的方法，其包括對靶細(xì)胞遞送，或?qū)κ茉?者施用： (a) miR-96、其模擬物、或任一者的前體;或 (b) 編碼miR-96、其模擬物、或任一者的前體的核酸。3. 根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述肺性高血壓是肺動脈高血壓。4. 根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的方法，其中所述靶細(xì)胞表達(dá)5-HT1B受體。5. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的方法，其中所述靶細(xì)胞是血管細(xì)胞。6. 根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所述血管細(xì)胞是血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)或血管內(nèi)皮細(xì) 胞。7. 根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述血管細(xì)胞是肺動脈平滑肌細(xì)胞(PASMC)或肺動脈內(nèi) 皮細(xì)胞。8. 根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的方法，其中所述靶細(xì)胞是與血管系統(tǒng)有關(guān)的細(xì)胞。9. 根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述靶細(xì)胞是外膜成纖維細(xì)胞或免疫細(xì)胞。10. 根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述免疫細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞或肥 大細(xì)胞。11. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中miR-96的所述前體是pre-mir96。12. 根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述pre-mir96具有序列： UGGCCGAUUUUGGCACUAGCACAUUUUUGCUUGU⑶CUCUCCGCUCUGAGCAAUCAUGUGCAGUGCCAAUAUG GGAAA(hsa-pre-mir-96)或 CCAGUACCAUCUGCUUGGCCGAUUUUGGCACUAGCACAUUUUUGCUUGU⑶CUCUCCGCUGUGAGCAAUCAUG UGUAGUGCCAAUAUGGGAAAAGCGGGCUGCUGC(mmu-pre-mir-96), 其中成熟的miR-96序列是加下劃線的。13. 根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的方法，其中所述mi R-96的前體是pr i -mi R96。14. 根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的方法，其中所述miR-96模擬物包含指導(dǎo)鏈，所述指 導(dǎo)鏈具有序列： UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU (其中種子序列是加下劃線的） 或者所述指導(dǎo)鏈在所述種子序列外部的一個(gè)或多個(gè)位置處與所述序列不同。15. 根據(jù)權(quán)利要求1至10或14中任一項(xiàng)的方法，其中所述miR-96模擬物包含一個(gè)或多個(gè) 經(jīng)修飾的糖殘基。16. 根據(jù)權(quán)利要求1至10、14或15中任一項(xiàng)的方法，其中所述miR-96模擬物包含一個(gè)或 多個(gè)經(jīng)修飾的核苷間連接。17. 根據(jù)權(quán)利要求1至10或14至16中任一項(xiàng)的方法，其中所述miR-96模擬物包含一個(gè)或 多個(gè)經(jīng)修飾的堿基。18. 根據(jù)權(quán)利要求1至10或14至17中任一項(xiàng)的方法，其中所述miR-96、其模擬物或前體 與載體相結(jié)合。19. 根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述載體是藥學(xué)可接受脂質(zhì)或聚合物、或其組合。20. 根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的方法，其中以裸的DNA或與載體結(jié)合遞送所述核酸。21. 根據(jù)權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)的方法，其中經(jīng)由病毒載體遞送所述核酸。22. 根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其中所述病毒載體是腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。23. 根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是慢病毒載體。 24. miR-96、其模擬物、或任一者的前體，其用于抑制血管細(xì)胞增殖和/或血管重塑的方 法。 25. miR-96、其模擬物、或任一者的前體，其用于預(yù)防或治療肺性高血壓的方法。26. 根據(jù)權(quán)利要求25使用的miR-96、其模擬物、或任一者的前體，其中所述肺性高血壓 是肺動脈高血壓。27. 根據(jù)權(quán)利要求24至26中任一項(xiàng)使用的miR-96的前體，其中所述miR-96的前體是 pre_mir96〇28. 根據(jù)權(quán)利要求27使用的miR-96的前體，其中所述pre-mir96具有序列： UGGCCGAUUUUGGCACUAGCACAUUUUUGCUUGU⑶CUCUCCGCUCUGAGCAAUCAUGUGCAGUGCCAAUAUG GGAAA(hsa-pre-mir-96)或 CCAGUACCAUCUGCUUGGCCGAUUUUGGCACUAGCACAUUUUUGCUUGU⑶CUCUCCGCUGUGAGCAAUCAUG UGUAGUGCCAAUAUGGGAAAAGCGGGCUGCUGC(mmu-pre-mir-96), 其中成熟的miR-96序列是加下劃線的。29. 根據(jù)權(quán)利要求24至26中任一項(xiàng)使用的miR-96的前體，其中所述miR-96的前體是 pri-miR96〇30. 根據(jù)權(quán)利要求24至26中任一項(xiàng)使用的miR-96模擬物或其前體，其中所述miR-96模 擬物包含指導(dǎo)鏈，所述指導(dǎo)鏈具有序列： UUUGGCACUAGCACAUUUUUGCU 其中種子序列是加下劃線的， 或者所述指導(dǎo)鏈在所述種子序列外部的一個(gè)或多個(gè)位置處與所述序列不同。31. 根據(jù)權(quán)利要求24至26或權(quán)利要求30中任一項(xiàng)使用的miR-96模擬物或其前體，其中 所述miR-96模擬物包含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的糖殘基。32. 根據(jù)權(quán)利要求24至26、權(quán)利要求30或權(quán)利要求31中任一項(xiàng)使用的miR-96模擬物或 其前體，其中所述miR-96模擬物包含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的核苷間連接。33. 根據(jù)權(quán)利要求24至26或30至32中任一項(xiàng)使用的miR-96模擬物或其前體，其中所述 miR-96模擬物包含一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的堿基。34. 根據(jù)權(quán)利要求24至33中任一項(xiàng)使用的miR-96、其模擬物、或任一者的前體，其中所 述miR-96、其模擬物或前體與載體相結(jié)合。35. 根據(jù)權(quán)利要求34使用的miR-96、其模擬物、或任一者的前體，其中所述載體是藥學(xué) 可接受脂質(zhì)或聚合物、或其組合。36. 編碼miR-96、其模擬物、或任一者的前體的核酸，其用于抑制血管細(xì)胞增殖和/或血 管重塑的方法。37. 編碼miR-96、其模擬物、或任一者的前體的核酸，其用于預(yù)防或治療肺性高血壓的 方法。38. 根據(jù)權(quán)利要求37使用的核酸，其中所述肺性高血壓是肺動脈高血壓。39. 根據(jù)權(quán)利要求36至38中任一項(xiàng)使用的核酸，其中將所述核酸經(jīng)配制用于以裸的DNA 或與載體結(jié)合遞送。40. 根據(jù)權(quán)利要求36至39中任一項(xiàng)使用的核酸，其中以病毒載體的一部分提供所述核 酸。41. 根據(jù)權(quán)利要求40使用的核酸，其中所述病毒載體是腺病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。42. 根據(jù)權(quán)利要求41使用的核酸，其中所述逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是慢病毒載體。
【文檔編號】A61K31/713GK106029887SQ201480073780
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2014年12月1日
【發(fā)明人】M·R·麥克萊恩, E·華萊士, A·H·貝克
【申請人】格拉斯哥大學(xué)理事會