提高香蕉耐冷性的基因片段、方法及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種提高香蕉耐冷性的基因片段、方法及應(yīng)用。該基因片段的堿基組成如SEQ ID No.1所示，或基因片段為SEQ ID No.1的同義突變序列。本發(fā)明提供的針對大蕉的耐冷基因的完整開放閱讀框片段，利用重組表達(dá)載體將其在香蕉中表達(dá)后，能夠顯著提高香蕉植株中的耐冷基因表達(dá)量，伴隨著耐冷基因表達(dá)量的提高，香蕉植株對低溫脅迫的耐受能力顯著增強。因此本發(fā)明的針對大蕉的耐冷基因的完整開放閱讀框片段可應(yīng)用于香蕉的基因工程遺傳育種，培育耐冷香蕉新品種，減輕低溫對香蕉產(chǎn)業(yè)帶來的危害，并可擴大香蕉種植區(qū)域。
【專利說明】
提高香蕉耐冷性的基因片段、方法及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種生物工程領(lǐng)域，尤其是涉及一種提高香蕉耐冷性的基因片段、方 法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 香蕉和大蕉（Musa spp.)屬于色蕉科色蕉屬，是多年生大型草本單子葉植物。香 蕉和大蕉是南美、中美、亞洲和撒哈拉沙漠以南的非洲等地區(qū)4億多人的主食，也是全世界 最受歡迎的水果之一。我國的香蕉種植主要分布于廣東、臺灣、海南、廣西、福建等南亞熱帶 地區(qū)。然而香蕉性不耐寒，在南亞熱帶北緣地區(qū)冬春季節(jié)頻繁發(fā)生的寒潮使其極易遭受寒 害威脅。近五六年中，僅廣東省就遭受了 2008、2011年兩次特大凍害，大量蕉園被毀，產(chǎn)量 急劇下降，造成經(jīng)濟損失估計超過200億元，因此，香蕉的耐冷品種選育已成為目前香蕉產(chǎn) 業(yè)發(fā)展中急需解決的問題。
[0003] 不同種類品種的香蕉和大蕉，其耐冷性差異明顯。在生產(chǎn)實踐中發(fā)現(xiàn)：通常大蕉抗 寒力較強，其次是粉蕉和龍牙蕉，最不耐冷的是目前商業(yè)化規(guī)模種植、風(fēng)味佳的香蕉。大蕉 能耐受0-4°C低溫，但香蕉則不能承受如此溫度。
[0004] 對于香蕉耐冷性機理，前人從生理、生化等角度進(jìn)行了大量的研究，如外施一些過 氧化氫、鈣離子、水楊酸、油菜素內(nèi)酯或者甲基茉莉酸等化學(xué)試劑可提高冷敏感香蕉幼苗的 抗寒性，并緩解冷脅迫造成的傷害，但未見其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中大規(guī)模應(yīng)用。從分子生物學(xué)角度 進(jìn)行的研究報道較少，目前僅見比利時魯汶大學(xué)熱帶作物改良實驗室通過T-DNA tagging 和實時檢測技術(shù)，在香蕉中分離和鑒定出來了一個新的低溫響應(yīng)啟動子。中山大學(xué)基因工 程實驗室通過抑制性縮減雜交方法，從大蕉中鑒定出來一個耐冷相關(guān)基因MpRCI，在煙草中 超表達(dá)這個冷誘導(dǎo)的膜蛋白基因，能增強轉(zhuǎn)基因煙草的耐冷性。
[0005] 研究發(fā)現(xiàn)，大蕉在冷脅迫早期，細(xì)胞的細(xì)胞膜會發(fā)生相變，這種相變會導(dǎo)致肌動蛋 白骨架的改變，進(jìn)而啟動Ca 2+和磷酸化信號通路，比冷敏感香蕉更早地激活I(lǐng)CE1-CBF-C0R 耐冷代謝途徑，在冷脅迫后期，大蕉ICE1和CBF的表達(dá)量下調(diào)，而MYBS3的表達(dá)量迅速恢復(fù) 性上調(diào)，與多基因協(xié)調(diào)表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控如氧化還原過程、oxylipin生物合成過程、光合作用、 光呼吸、糖酵解、三羧酸循環(huán)、碳水化合物代謝過程，脂肪酸生物合成和0 _氧化等代謝過 程，增強對冷脅迫的適應(yīng)性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 基于此，有必要提供一種提高香蕉耐冷性的基因片段、方法及應(yīng)用。
[0007] -種可提高香蕉耐冷性的基因片段，所述基因片段的堿基組成如SEQ ID No. 1所 示，或所述基因片段為SEQ ID No. 1的同義突變序列。
[0008] -種重組表達(dá)載體，包括表達(dá)載體及插入在所述表達(dá)載體中的上述可提高香蕉耐 冷性的基因片段。
[0009] 在其中一個實施例中，所述表達(dá)載體為病毒載體或細(xì)菌質(zhì)粒載體。
[0010] 在其中一個實施例中，所述表達(dá)載體為pOX超表達(dá)載體，且在所述重組表達(dá)載體 中，所述基因片段的啟動子為玉米泛素啟動子。
[0011] -種細(xì)胞，含有上述可提高香蕉耐冷性的基因片段。
[0012] 在其中一個實施例中，所述細(xì)胞為細(xì)菌細(xì)胞或植物細(xì)胞。
[0013] 在其中一個實施例中，所述植物細(xì)胞為香蕉植株細(xì)胞。
[0014] 上述任一實施例所述的重組表達(dá)載體或上述任一實施例所述的細(xì)胞在培育耐冷 香蕉品種中的應(yīng)用。
[0015] -種重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法，包括將上述可提高香蕉耐冷性的基因片段插入空 的表達(dá)載體上，得到所述重組表達(dá)載體。
[0016] -種提高香蕉耐冷性的方法，對香蕉植株進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理，使所述香蕉品種含有上 述可提高香蕉耐冷性的基因片段，并表達(dá)所述基因片段。
[0017] 通過從耐冷大蕉中克隆出耐冷基因片段，該耐冷基因片段是耐冷大蕉應(yīng)答低溫脅 迫的關(guān)鍵基因，通過對該耐冷基因片段進(jìn)行研究，對于全面理解植物中冷響應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途 徑具有重要的意義。香蕉是全球性重要的水果和糧食作物，低溫是其最主要的非生物逆境 脅迫之一，耐冷基因片段的克隆和生物學(xué)功能的驗證，不但具有重要的理論意義，而且還有 很強的生產(chǎn)實用價值，對于培育耐冷香蕉新品種具有重要的實際意義。
[0018] 本發(fā)明針對耐冷大蕉克隆出耐冷基因片段，并利用重組表達(dá)載體將其在香蕉中表 達(dá)后，能夠顯著提高香蕉植株中耐冷基因的表達(dá)量，伴隨著耐冷基因表達(dá)量的提高，香蕉植 株對低溫脅迫的耐受能力顯著增強。因此本發(fā)明的針對耐冷大蕉的耐冷基因片段可應(yīng)用于 香蕉的基因工程遺傳育種，培育耐冷香蕉新品種，減輕低溫對香蕉產(chǎn)業(yè)帶來的危害，并可擴 大香蕉種植區(qū)域。
【附圖說明】
[0019] 圖1為一實施方式的重組表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0020] 圖2為耐冷大蕉的葉片總RNA電泳圖；
[0021] 圖3為耐冷基因開放閱讀框的PCR擴增產(chǎn)物電泳圖，其中，M為DL2000DNA分子量 標(biāo)準(zhǔn)；
[0022] 圖4A為耐冷基因的染色體定位，圖4B為耐冷基因表達(dá)的蛋白的結(jié)構(gòu)域，圖4C為 耐冷基因表達(dá)的蛋白的三維結(jié)構(gòu)圖；
[0023] 圖5為各個物種ICE1氨基酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹同源性分析，其中，大蕉（MpICEl， KM379133)、小果野蕉（MalCEl，GSMUA_Achrl0P12060)、葡萄（ValCEl，AGP04217 ;VaICE2， AGP04218 ；VaICE14, ADY17816) ^ V. vinifera(VvICEl, AFI49627 ；VvICElb, AGQ03811), V. riparia(VrICEl, AGG34704 ；VrICE2, AIA58705 ；VrICE3, AIA58706 ；VrICE4, AIA58707), 擬南芥（厶《〇￡1，即_189309 洫《〇￡2，即_172746)，油菜（8111〇￡1，厶￡133687)，菜心（811〇￡1， 八〇870963)，薺菜（〇31〇￡1，厶厶579350)，茶樹化81〇￡，厶(^90640)，赤桉伍(3 1〇￡1，厶0￥68776)， 藍(lán)桉（EgICEl，AEF33833)，Eutrema salsugineum(EsICE，ACT683l7)，大豆（GmICEl， ACJ39211)，大麥（HvICE2, ABA25896)，蘋果（MdbHLHl，ABS50251)，西伯利亞白楊（PsICEl， ABF48720)，歐洲大葉楊（PtrICEl，ABN58427)，蘿卜（RsICEl，ADY68771)，小麥（TaICE41， ACB69501 ;TaICE87, ACB69502)，玉米（ZmICE2, ACG46593)，分析用 ClustalX 2. 0 比對；
[0024] 圖6為耐冷基因表達(dá)的蛋白與其他相關(guān)蛋白氨基酸全長序列的同源性分析，包括 大蕉（Musa spp.Dajiao，ABB 型）MpICEl、小果野蕉（Musa spp.DH_Pahang，AA 型）MalCEl、 葡萄V. amurensis(VaICEl，2)和擬南芥（AtICEl，2)的氨基酸序列比對；
[0025] 圖7為耐冷基因的重組表達(dá)載體的雙酶切驗證電泳圖，其中，M為DL2000Plus DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)；
[0026] 圖8為熒光實時PCR檢測轉(zhuǎn)基因香蕉中耐冷基因的相對表達(dá)量，其中，CK為親本 Grande Naine ;DX-3、DX-5、DX-9和DX-12分別為轉(zhuǎn)基因香蕉的不同株系；
[0027] 圖9為在人工氣候室處理8天后親本和轉(zhuǎn)基因香蕉的表型圖，其中，CK為親本 Grande Naine ;DX為轉(zhuǎn)基因香蕉株系；
[0028] 圖10為在廣州2014年12月冬季低溫處理2周后親本和轉(zhuǎn)基因香蕉的表型圖，其 中，CK為親本Grande Naine ;DX-3和DX-9分別為轉(zhuǎn)基因香蕉的不同株系。
【具體實施方式】
[0029] 下面主要結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明的提高香蕉耐冷性的基因片段、方法及 應(yīng)用作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0030] 本實施方式提供了一種可提高香蕉耐冷性的基因片段，其序列為序列表中SEQ ID No. 1所示的序列或其同義突變序列。同時，本發(fā)明還提供了一種提高香蕉耐冷性的方法，包 括對香蕉植株進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理，使香蕉植株含有上述基因片段，并能完整的表達(dá)該基因片段。 該基因片段存在于耐冷大蕉基因組中，其編碼的耐冷蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No. 2所示。
[0031] 本實施方式還提供了一種重組表達(dá)載體，其含有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序 列或其同義突變序列。該重組表達(dá)載體可以為病毒載體或細(xì)菌質(zhì)粒載體，如在一實施方式 中，采用P〇X超表達(dá)載體，將上述耐冷基因序列或其同義突變序列正向插入在pOX載體的 Spe I與BamH I等酶切位點之間，并采用玉米泛素（ubiquitin)啟動子作為耐冷基因序列 或其同義突變序列的啟動子，構(gòu)成超表達(dá)載體。本實施方式的重組表達(dá)載體可廣泛應(yīng)用在 培育耐冷香蕉品種的過程中，并可轉(zhuǎn)化細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞或香蕉植株等植物細(xì)胞，構(gòu)建含有 該耐冷基因序列或其同義突變序列的細(xì)胞，
[0032] 進(jìn)一步，本實施方式還提供了一種重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其通過在空載體中 插入如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列或其同義突變序列實現(xiàn)。如在一實施方式中，將擴 增得到的可提高香蕉耐冷性的基因片段經(jīng)Spel和BamH I雙酶切后插入到同樣雙酶切的 P〇X空載體上，得到含上述基因片段的重組表達(dá)載體，結(jié)構(gòu)如圖1所示，該基因片段的啟動 子為玉米泛素啟動子，可以轉(zhuǎn)化進(jìn)相應(yīng)的細(xì)胞中，在細(xì)胞中進(jìn)行超表達(dá)，得到大量的耐冷蛋 白。可理解，在其他實施方式中，載體也可以采用其他細(xì)菌質(zhì)粒載體或病毒載體等，啟動子 也不限于玉米泛素啟動子，也可以為其他超表達(dá)啟動子。
[0033] 在構(gòu)建得到重組表達(dá)載體之后，本實施方式的構(gòu)建方法還包括對構(gòu)建的重組表達(dá) 載體進(jìn)行篩選驗證的步驟，如可以將構(gòu)建的P〇X載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌T0P10,挑選單菌落提取 質(zhì)粒，采用Spel和BamH I雙酶切驗證提取的質(zhì)粒，篩選正確插入的質(zhì)粒。
[0034] 通過從耐冷大蕉中克隆出耐冷基因片段，該耐冷基因片段是耐冷大蕉應(yīng)答低溫脅 迫的關(guān)鍵基因，通過對該耐冷基因片段進(jìn)行研究，對于全面理解植物中冷響應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途 徑具有重要的意義。香蕉是全球性重要的水果和糧食作物，低溫是其最主要的非生物逆境 脅迫之一，耐冷基因片段的克隆和生物學(xué)功能的驗證，不但具有重要的理論意義，而且還有 很強的生產(chǎn)實用價值，對于培育耐冷香蕉新品種具有重要的實際意義。
[0035] 本發(fā)明針對耐冷大蕉克隆出耐冷基因片段，并利用重組表達(dá)載體將其在香蕉中表 達(dá)后，能夠顯著提高香蕉植株中耐冷基因的表達(dá)量，伴隨著耐冷基因表達(dá)量的提高，香蕉植 株對低溫脅迫的耐受能力顯著增強。因此本發(fā)明的針對耐冷大蕉的耐冷基因片段可應(yīng)用于 香蕉的基因工程遺傳育種，培育耐冷香蕉新品種，減輕低溫對香蕉產(chǎn)業(yè)帶來的危害，并可擴 大香蕉種植區(qū)域。
[0036] 以下為具體實施例部分：
[0037] 實施例1大蕉耐冷基因的克隆及其同源性分析
[0038] (1)以大蕉品種"廣西靈川大蕉"（Musa spp. Dajiao, ABB 型，"Guangxi Lingchuan Dajiao"）的葉片為試驗材料，植物材料在廣州國家香蕉種質(zhì)資源圃正常條件下生長，冬季 取樣。
[0039] (2) RNA提?。河弥参颮NA OUT試劑盒（購自北京天恩澤基因科技有限公司）進(jìn)行 試驗材料的總RNA提取，RNA變性膠電泳檢測如圖2所示。從圖2可以看出，提取的RNA完 整，并未降解，利用紫外分光光度計測量其濃度和純度，0D260/0D280 = 1.98,符合實驗要 求。
[0040] (3)采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶（購自Promega公司）逆轉(zhuǎn)錄總RNA中的mRNA成cDNA 第一條鏈。以序列表中SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的序列為引物序列（F:5'-CGCACT AGTCCGTCTTCTGTCTTCTTCTG-3'，R :5' -GTGGGATCCAATTTCTGATTCTCCTCG-3'），以合成的 cDNA 第一條鏈為模板鏈，特異性PCR擴增耐冷基因的開放閱讀框，電泳結(jié)果如圖3所示，PCR擴 增產(chǎn)物大小與預(yù)期吻合。擴增過程中，采用K0D Plus Polymerase高保真酶（T0Y0B0公司） 進(jìn)行PCR擴增，PCR反應(yīng)程序為：94°C預(yù)變性4min，94°C變性45s，58°C退火30s，68°C延伸 lmin，共進(jìn)行28個循環(huán)；68°C延伸5min。
[0041] (4)擴增獲得的完整開放閱讀框序列（即耐冷大蕉的耐冷基因片段）如SEQ ID No. 1所示，開放閱讀框序列的長度為1680bp，編碼一個由559個氨基酸組成的蛋白質(zhì)， 如SEQ ID No. 2所示，推測分子量為59kD，pi = 5. 09。如圖4A所示，通過與小果野蕉 (Musa spp. DH-Pahang, AA型）的基因組比對發(fā)現(xiàn)，耐冷基因序列定位在10號染色體，跨越 3253bp。如圖4B所示，結(jié)構(gòu)特征分析表明，耐冷基因序列編碼的蛋白含有一個保守的bHLH 區(qū)域、一個ACT-like區(qū)域以及包含MYC類轉(zhuǎn)錄因子相似的bHLH結(jié)構(gòu)域。圖4C顯示的是預(yù) 測的耐冷基因表達(dá)的蛋白三維結(jié)構(gòu)。如圖5所示，氨基酸序列同源性及系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā) 現(xiàn)：耐冷基因序列與小果野蕉ICE1和葡萄VtICEl和VtICE4蛋白的同源性最高，另外，擬南 芥ICE1含有一個SUM0修飾位點和與磷酸化相關(guān)的富絲氨酸結(jié)構(gòu)域在耐冷基因表達(dá)的蛋白 結(jié)構(gòu)中也被發(fā)現(xiàn)。如圖6所示，擬南芥ICE1中第403位的色氨酸，被丙氨酸取代后不能被 泛素化，提高了抗寒性，在耐冷基因表達(dá)的蛋白中也存在此泛素化位點。
[0042] 實施例2大蕉耐冷基因的超表達(dá)載體的構(gòu)建和遺傳轉(zhuǎn)化
[0043] 實施例2的超表達(dá)載體骨架是pOX載體（由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院劉耀光研 究員惠贈），在此基礎(chǔ)上構(gòu)建大蕉耐冷基因的超表達(dá)載體p〇x-ubi-可提高香蕉耐冷性的基 因片段，結(jié)構(gòu)如圖1所示。該超表達(dá)載體的構(gòu)建步驟如下：將擴增得到的耐冷基因的PCR產(chǎn) 物和pOX空載體經(jīng)過Spe I和BamH I雙酶切，連接到pOX載體上，再經(jīng)轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP 10， 挑單菌落提質(zhì)粒，雙酶切驗證重組質(zhì)粒，結(jié)果如圖7所示，經(jīng)測序鑒定正確后，形成如圖1所 示的超表達(dá)載體。該轉(zhuǎn)基因超表達(dá)載體是將如SEQ ID NO. 1所示的序列，正向插入表達(dá)載 體pOX載體的酶切位點Spe I和BamH I之間，在宿主細(xì)胞中，該耐冷基因在玉米泛素啟動 子驅(qū)動下，組成性表達(dá)大蕉的耐冷基因。
[0044] 實施例3凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105
[0045] 取2 y 1超表達(dá)載體加入至100 y 1的農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細(xì)胞中，混勻后，冰浴 30min。于液氮中速凍lmin，立即轉(zhuǎn)入37°C水浴3~5min，待細(xì)胞融化后，加入lml LB液 體培養(yǎng)基（胰蛋白胨1(^/1、酵母提取物58/1及氯化鈉1(^/1)，28°(：，180印111搖2~411。 6000rpm離心5min，留下約100 y 1的上清重新懸浮細(xì)胞，并將其涂布于含有50mg/L Kan的 LB平板上，28°C培養(yǎng)2~3天，挑單菌落進(jìn)行PCR檢測，將陽性菌液于-70°C保存?zhèn)溆谩?br>[0046] 在后續(xù)轉(zhuǎn)化之前，將凍存的陽性菌液取出，解凍后，將其涂布于含有50mg/LLB平 板上，于28°C恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至長出單菌落。用接種環(huán)挑取單菌落于含有50mg/ L Kan的LB液體培養(yǎng)基中，28°C，180rpm搖菌過夜。6000rpm離心5min，用新鮮LB液體培 養(yǎng)基（含有相同的抗生素濃度）重新懸浮，調(diào)節(jié)其0D600約為0. 2,以相同的條件搖菌至對 數(shù)生長期（0D600約為0. 6~0. 8)。6000rpm離心10min，收集菌體，用新鮮的M2液體培養(yǎng) 基（MS基本培養(yǎng)基，2, 4 - D 1. 0mg/L、生物素1. 0mg/L、肌醇100mg/L、谷氨酰胺100mg/L、麥 芽提取物l〇〇mg/L及45g/L蔗糖，pH 5. 3)重新懸浮菌體，再調(diào)整0D600約為0. 2,并加入乙 酰丁香酮至終濃度100 ymol/L，作為工程菌用于轉(zhuǎn)化。
[0047] 實施例4超表達(dá)載體對香蕉品種的轉(zhuǎn)化
[0048] 侵染和共培養(yǎng)
[0049] 取約 100mg 繼代 7d 的 Grande Naine (Musa spp. Cavendish, cv Grande Naine， AAA型）胚性懸浮細(xì)胞，轉(zhuǎn)入10ml的工程菌中，在黑暗條件下，28°C，45rpm振蕩侵染30min。 然后，去除農(nóng)桿菌，加入20ml M2液體培養(yǎng)基（MS基本培養(yǎng)基，2,4-D 1.0mg/L，生物素 1. 0mg/L，肌醇 100mg/L，谷氨酰胺 100mg/L，麥芽提取物 100mg/L，45g/L 鹿糖，pH 5. 3 ;含 100 ymol/L乙酰丁香酮）繼續(xù)在相同的條件下共培養(yǎng)24h。接著，將其轉(zhuǎn)入28°C，llOrpm， 黑暗的條件下進(jìn)行共培養(yǎng)3天，培養(yǎng)期間如果菌液濃度過大，則需要更換M2培養(yǎng)基以降低 農(nóng)桿菌濃度。
[0050] 抗性胚的篩選
[0051] 共培養(yǎng)之后，利用M2新鮮培養(yǎng)基沖洗侵染過的胚性懸浮細(xì)胞兩次，然后在20ml含 有400mg/L頭孢菌素和5mg/L潮霉素的M2液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)篩選1個月，每2周更換1次 培養(yǎng)基。液體篩選之后，又將胚性懸浮細(xì)胞轉(zhuǎn)至含有相同濃度的抗生素和篩選劑的M3固體 培養(yǎng)基上（含大量元素和微量元素及鐵鹽SH培養(yǎng)基（Schenk and Hildebrandt，1972)，MS 維生素（Murashige and Skoog, 1962)，生物素 lmg/L、谷氨酰胺 100mg/L、脯氨酸 230mg/L、 麥芽提取物l〇〇mg/L、NAA 0? 2mg/L、激動素0? lmg/L、肌醇lg/L、乳糖10g/L、蔗糖45g/L和 植物凝膠2. lg/L，pH 5. 8)進(jìn)行胚的誘導(dǎo)，培養(yǎng)2個月至胚的成熟。
[0052] 抗性胚萌發(fā)與植株再生
[0053] 挑出成熟的抗性胚并轉(zhuǎn)入M4胚萌發(fā)培養(yǎng)基中（MS基本培養(yǎng)基，6 - BAlmg/L、NAA 0. 2mg/L、蔗糖30g/L和植物凝膠2. lg/L，pH 5. 8)誘導(dǎo)胚的萌發(fā)，培養(yǎng)基中的抗生素和篩 選劑濃度適當(dāng)降低。1個月后，將健壯的萌發(fā)胚轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基RM中（MS基本培養(yǎng)基，NAA 0. lmg/L、蔗糖30g/L和植物凝膠2. lg/L，pH 5. 8)生根，獲得完整的擬轉(zhuǎn)基因植株，并于溫 室大棚內(nèi)盆栽。
[0054] 本實施例在轉(zhuǎn)化過程中，采用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法（胡春華等，農(nóng) 桿菌介導(dǎo)的香蕉高效遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的建立.分子植物育種，2010, 8 (1) : 172-178)將上述超 表達(dá)載體導(dǎo)入Grande Naine香蕉品種，通過抗潮霉素篩選標(biāo)記基因HPT檢測，由此確定獲 得轉(zhuǎn)基因株系（擴增HPT基因片段所用引物：HPT-F:5'-CTGAACTCACCGCGACGTCTGTC-3'（如 SEQ ID No. 5 所示）；HPT-R :5' -TAGCGCGTCTGCTGCTCCATACA-3'（如 SEQ ID No. 6 所示））。
[0055] 實時定量PCR鑒定轉(zhuǎn)基因株系的耐冷基因表達(dá)量的程序如下：取經(jīng)過HPT檢測為 陽性的水稻幼苗生長至四葉一心，取葉片進(jìn)行總RNA的提取，采用的試劑為植物RNA OUT試 劑盒（購自北京天恩澤基因科技有限公司）進(jìn)行試驗材料的總RNA提取，整個操作過程嚴(yán) 格按照試劑盒的RNA提取流程說明。并用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測總RNA的 純度及量，取1 y g的總RNA做起始逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，所采用的逆轉(zhuǎn)錄酶為MMLV (Promega公司）， 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的步驟參考該逆轉(zhuǎn)錄酶的使用說明。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，采用引物RTICE1F 和RTICE1R引物對檢測耐冷基因的表達(dá)情況，采用香蕉持家基因25S ribosomal RNA基因 的25SF和25SR引物對檢測25S ribosomal RNA基因的表達(dá)作為內(nèi)參。引物序列如下：
[0056] RTICE1F :5' -TGGGTTTGCCATGGATGTTT-3'（如 SEQ ID No. 7 所示）
[0057] RTICE1R :5' -AGAACACCAGGGCCTTCCTT-3'（如 SEQ ID No. 8 所示）
[0058] 25SF :5' -ACAITGTCAGGTGGGGAGIT-3'（如 SEQ ID No. 9 所示）
[0059] 25SR :5' -CCTTTTGTTCCACACGAGATT-3'（如 SEQ ID No. 10 所示）
[0060] 如圖8所示，1個親本（CK)和4個超表達(dá)的轉(zhuǎn)基因香蕉株系（DX-3、DX-5、DX-9和 DX-12)進(jìn)行耐冷基因的檢測，25S ribosomal RNA基因的表達(dá)作為對照。結(jié)果表明，在持家 基因25S ribosomal RNA基因在5個檢測水稻株系的植株中表達(dá)一致的情況下，4個超表達(dá) 的轉(zhuǎn)基因香蕉株系的表達(dá)量明顯提高。
[0061] 實施例5試驗材料的低溫處理
[0062] 室內(nèi)人工氣候室評價：以轉(zhuǎn)基因香蕉及其親本作為試驗材料。選取高約30cm、生 長健壯、長勢一致的 Grande Naine (Musa spp. Cavendish, cv Grande Naine，AAA 型）和轉(zhuǎn) 基因香蕉的盆栽苗進(jìn)行試驗。采用隨機區(qū)組設(shè)計，設(shè)親本和轉(zhuǎn)基因香蕉2個處理，每3株為 一試驗單元。每處理設(shè)3次重復(fù)，在人工氣候室中進(jìn)行，人工降溫程序見表1，配合降溫的光 照條件為：6:00-20:00時：200 y mol/m2/s ;20:00至次日6:00時：黑暗，相對濕度為75 %。 采樣時間均為中午12:00點。
[0063] 表1.人工氣候室的降溫程序
[0064]
[0065] 冬季室外評價：以轉(zhuǎn)基因香蕉及其親本作為試驗材料。選取高約30cm、生長健壯、 長勢一致的 Grande Naine (Musa spp. Cavendish, cv Grande Naine，AAA 型）和轉(zhuǎn) MpICEl 的Grande Naine盆栽苗進(jìn)行試驗。采用隨機區(qū)組設(shè)計，設(shè)親本和轉(zhuǎn)基因香蕉2個處理，每 3株為一試驗單元。每處理設(shè)3次重復(fù)，在廣州冬季12月份進(jìn)行，地點：廣州國家香蕉種質(zhì) 資源圃，白天溫度12_15°C，夜晚溫度6-8°C，適度40-60%。
[0066] 結(jié)果如圖9和10所示，可以看出超表達(dá)耐冷基因的轉(zhuǎn)基因香蕉株系無論是在人工 氣候室還是冬季室外，其耐冷性都要強于香蕉親本植株。由此說明，耐冷基因是大蕉應(yīng)答 低溫脅迫的關(guān)鍵基因，是一種耐冷蛋白基因。并且表明，本發(fā)明的針對大蕉耐冷蛋白基因 MpICEl的超表達(dá)能夠成功的提高冷敏感香蕉的耐冷性，調(diào)節(jié)香蕉對低溫脅迫的適應(yīng)性。
[0067] 以上所述實施例的各技術(shù)特征可以進(jìn)行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實 施例中的各個技術(shù)特征所有可能的組合都進(jìn)行描述，然而，只要這些技術(shù)特征的組合不存 在矛盾，都應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是本說明書記載的范圍。
[0068] 以上所述實施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并 不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來 說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護 范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【主權(quán)項】
1. 一種可提高香蕉耐冷性的基因片段，其特征在于，所述基因片段的堿基組成如SEQ ID No. 1所示，或所述基因片段為SEQ ID No. 1的同義突變序列。2. -種重組表達(dá)載體，其特征在于，包括表達(dá)載體及插入在所述表達(dá)載體中的如權(quán)利 要求1所述的可提高香蕉耐冷性的基因片段。3. 如權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體為病毒載體或細(xì)菌 質(zhì)粒載體。4. 如權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體為pOX超表達(dá)載體， 且在所述重組表達(dá)載體中，所述基因片段的啟動子為玉米泛素啟動子。5. -種細(xì)胞，其特征在于，含有如權(quán)利要求1所述的可提高香蕉耐冷性的基因片段。6. 如權(quán)利要求5所述的細(xì)胞，其特征在于，所述細(xì)胞為細(xì)菌細(xì)胞或植物細(xì)胞。7. 如權(quán)利要求6所述的細(xì)胞，其特征在于，所述植物細(xì)胞為香蕉植株細(xì)胞。8. 如權(quán)利要求2~4中任一項所述的重組表達(dá)載體或如權(quán)利要求5~7中任一項所述 的細(xì)胞在培育耐冷香蕉品種中的應(yīng)用。9. 一種重組表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括將如權(quán)利要求1所述的可提高香 蕉耐冷性的基因片段插入空的表達(dá)載體上，得到所述重組表達(dá)載體。10. -種提高香蕉耐冷性的方法，其特征在于，對香蕉植株進(jìn)行轉(zhuǎn)化處理，使所述香蕉 品種含有如權(quán)利要求1所述的可提高香蕉耐冷性的基因片段，并表達(dá)所述基因片段。
【文檔編號】C12N15/66GK106032536SQ201510114678
【公開日】2016年10月19日
【申請日】2015年3月16日
【發(fā)明人】楊喬松, 易干軍, 竇同心
【申請人】廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所