一種新型香豆素類生物硫醇熒光探針及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于特異性識(shí)別小分子生物硫醇的熒光探針及其制備方法。該探針由2,3,6,7?四氫?10?羥基?1H,5H?喹嗪并(9,1?GH)香豆素和2,4?二硝基苯磺酰氯反應(yīng)得到的。在乙醇/PBS緩沖體系中，該探針選擇性地與小分子生物硫醇作用，釋放出強(qiáng)熒光物質(zhì)2,3,6,7?四氫?10?羥基?1H,5H?喹嗪并(9,1?GH)香豆素，使反應(yīng)體系在波長(zhǎng)為517nm處有強(qiáng)熒光信號(hào)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該探針能夠特異性識(shí)別生物硫醇，并且具有檢測(cè)限低（僅為16.9nM）、Stokes位移大（122nm）等特點(diǎn)，運(yùn)用其對(duì)生物硫醇的熒光增強(qiáng)響應(yīng)可以實(shí)現(xiàn)生物硫醇的定性定量檢測(cè)。該探針可經(jīng)化學(xué)合成獲得，合成工藝簡(jiǎn)單易行，并且檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、選擇性好，使得該類探針在生物領(lǐng)域具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說明】
一種新型香豆素類生物硫醇熒光探針及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于香豆素類結(jié)構(gòu)的生物硫醇熒光探針的制備及其對(duì)生物硫醇 的選擇性熒光檢測(cè)，屬于有機(jī)小分子熒光探針領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 生物體中小分子生物硫醇例如半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hey)和還原型谷胱 甘肽(GSH)，其作用是參與氧化還原反應(yīng)過程，調(diào)節(jié)生化途徑中的細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞代謝。半 胱氨酸(Cys)和同型半胱氨酸(Hey)在生物體細(xì)胞和組織的生長(zhǎng)中是必不可少的生物分子。 半胱氨酸(Cys)的缺乏會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)遲緩、毛發(fā)色素脫失、嗜睡、肝臟和皮膚損傷以及脂肪的 損失。人體血漿中，同型半胱氨酸(Hey)含量的增加是導(dǎo)致阿爾茲海默病、心血管疾病、炎癥 性腸病以及骨質(zhì)疏松的一個(gè)重要的危險(xiǎn)因素。作為最豐富的細(xì)胞內(nèi)的非蛋白硫醇，谷胱甘 肽(GSH)以氧化還原調(diào)節(jié)器的角色，在維持細(xì)胞還原環(huán)境的過程中發(fā)揮著重要作用，包括保 持蛋白質(zhì)中的半胱氨酸(Cys)處于還原狀態(tài)以及通過捕獲容易損傷DNA和RNA的自由基來保 護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激影響。因此，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的硫醇對(duì)細(xì)胞功能的研究具有重要意義。與其 他檢測(cè)技術(shù)相比，熒光探針檢測(cè)法具有操作簡(jiǎn)單、高靈敏度、高選擇性的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)受到廣 泛關(guān)注。
[0003] 目前許多生物硫醇熒光探針存在的主要問題是反應(yīng)條件苛刻，檢測(cè)所需時(shí)間長(zhǎng)， 選擇性差等，比如Wang J, Zhou C, Zhang J, et al. A new fluorescence turn-〇n probe for biothiols based on photo induced electron transfer and its application in living cells [J]. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2016， 166: 31-37；Zhang ff, Yin C， Zhang Y, et al. A turn-〇n fluorescent probe based on 2， 4-dinitrosulfonyl functional group and its application for bioimaging [J]. Sensors and Actuators B: Chemical, 2016， 233: 307-313；Liao Y C， Venkatesan P， Wei L F， et al. A coumarin-based fluorescent probe for thiols and its application in cell imaging [J]. Sensors and Actuators B: Chemical，2016，232: 732-737。所以開發(fā)反應(yīng)迅速、高靈敏性、高選 擇性的生物硫醇熒光探針具有重要價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 一種基于2,3,6,7-四氫-10-羥基-1扎5!1-喹嗪并(9，1-6!〇香豆素結(jié)構(gòu)的生物硫醇 熒光探針，其結(jié)構(gòu)如下
該探針的制備方法如下： 第一步：以2，3，6，7-四氫-10-氨基-1H，5H-喹嗪并(9，1-GH)香豆素為原料，在鹽酸水溶 液中加熱至l〇〇°C合成2,3,6,7_四氫-10-羥基-1H，5H-喹嗪并(9，1-GH)香豆素。其中鹽酸水 溶液為濃度為2~5mol/L;反應(yīng)時(shí)間為0.5~4小時(shí)，再用堿中和，堿選用氨水、碳酸氫鈉或氫 氧化鈉。反應(yīng)方程式：
第二步：以2，3，6，7-四氫-10-羥基-1H，5H-喹嗪并(9，1-GH)香豆素、2，4-二硝基苯磺酰 氯為原料，在有機(jī)溶劑中經(jīng)堿催化合成探針1。其中2，3，6，7-四氫-10-羥基-1H，5H-喹嗪并 (9，1-GH)香豆素與2,4_二硝基苯磺酰氯的摩爾比為1:1~1:1.5;溶劑選用二氯甲烷或乙 腈;所用的堿為三乙胺或碳酸鉀;反應(yīng)溫度為室溫;反應(yīng)時(shí)間為3~8小時(shí)。反應(yīng)方程式：
本發(fā)明的生物硫醇熒光探針具有以下顯著優(yōu)點(diǎn)：（1)具有新穎的結(jié)構(gòu)；（2)可以在緩沖 體系中特異性地檢測(cè)生物硫醇；（3)檢測(cè)限低(僅為16.9nM)、Stokes位移較大（122nm);(3) 與生物硫醇反應(yīng)表現(xiàn)為熒光增強(qiáng)，可以對(duì)生物硫醇進(jìn)行定性定量檢測(cè)；（4)可用于細(xì)胞內(nèi)生 物硫醇的檢測(cè)；（5)該制備方法原料易得，產(chǎn)品易于分離、純化。
【附圖說明】
[0005] 圖1為實(shí)施例4制得的熒光探針1的乙醇/ros(1 OmM，pH=7.4)溶液（乙醇與PBS體積 比為2:8,探針濃度為ΙΟμΜ)及探針溶液與各種分析物混合后的熒光發(fā)射圖譜（半胱氨酸 Cys、同型半胱氨酸Hey和還原型谷胱甘肽GSH濃度為50μΜ;其他氨基酸濃度為200μΜ，包括纈 氨酸Val、谷氨酸Glu、亮氨酸Leu、甲硫氨酸Met、天冬酰胺Asn、丙氨酸Ala、組氨酸His、色氨 酸Trp、苯丙氨酸Phe、絲氨酸Ser、精氨酸Arg、賴氨酸Lys、谷氨酰胺Gin、天門冬氨酸Asp、異 亮氨酸lie、蘇氨酸Thr、酪氨酸Tyr、脯氨酸Pro、甘氨酸Gly)，縱坐標(biāo)表示熒光強(qiáng)度，橫坐標(biāo) 表不波長(zhǎng)。
[0006] 圖2為實(shí)施例4制得的熒光探針1的乙醇/roS(10mM，pH=7.4)溶液（乙醇與PBS體積 比為2:8，探針濃度為ΙΟμΜ)對(duì)不同分析物（纈氨酸Val、谷氨酸Glu、亮氨酸Leu、甲硫氨酸 Met、天冬酰胺Asn、丙氨酸Ala、組氨酸His、色氨酸Trp、苯丙氨酸Phe、絲氨酸Ser、精氨酸 Arg、賴氨酸Ly s、谷氨酰胺Gin、天門冬氨酸Asp、異亮氨酸I le、蘇氨酸Thr、酪氨酸Tyr、脯氨 酸Pro、甘氨酸Gly、半胱氨酸Cys，其中半胱氨酸Cys的濃度為50μΜ，其他氨基酸濃度為200μ Μ)在517nm處的溶液熒光強(qiáng)度對(duì)比圖，激發(fā)波長(zhǎng)為395nm。在圖2中，縱坐標(biāo)表示熒光強(qiáng)度，橫 坐標(biāo)表示不同分析物;左起第一個(gè)柱表示不加任何分析物；后面每組柱左邊表示只有該被 分析物存在下的溶液熒光強(qiáng)度，右邊表示200μΜ該被分析物和50μΜ半胱氨酸Cys同時(shí)存在下 的溶液熒光強(qiáng)度;最后一個(gè)柱表示50μΜ半胱氨酸Cys存在時(shí)溶液的熒光強(qiáng)度。
[0007] 圖3為不同濃度的Cys加到探針1的乙醇/^3(1〇11^，？!1=7.4)(乙醇與？83體積比為 2:8，探針濃度為ΙΟμΜ)溶液后，溶液在517nm處熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化圖，縱坐標(biāo)表示熒光 強(qiáng)度，橫坐標(biāo)表示時(shí)間。
[0008] 圖4為熒光探針1的乙醇/PBS( 10mM，pH=7.4)(乙醇與ros體積比為2:8，探針濃度 為1〇μΜ)溶液，加入不同濃度的Cys后50分鐘時(shí)熒光響應(yīng)光譜圖，其中Cys的濃度為0~80μΜ， 縱坐標(biāo)表示熒光強(qiáng)度，橫坐標(biāo)表示波長(zhǎng)。
[0009] 圖5為圖4中517nm處的溶液熒光強(qiáng)度隨著CyS濃度(0~80μΜ)變化的散點(diǎn)圖，縱坐 標(biāo)表示熒光強(qiáng)度，橫坐標(biāo)表示Cys濃度。
[0010] 圖6為焚光探針1的乙醇/PBS( 10mM，pH=7.4)(乙醇與roS體積比為2:8，探針濃度 為1〇μΜ)溶液在不同pH條件與SOyMCys作用50分鐘后，在517nm處的熒光強(qiáng)度變化圖，縱坐標(biāo) 表示熒光強(qiáng)度，橫坐標(biāo)表示pH。 圖7為熒光探針1(濃度為ΙΟμΜ)用于細(xì)胞中生物硫醇的熒光檢測(cè)。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 2，3，6，7-四氫-10-羥基-1Η，5Η-喹嗪并(9，1-GH)香豆素結(jié)構(gòu)的生物硫醇熒光探針 的合成： 實(shí)施例1: 2，3，6，7-四氫-10-羥基-1Η，5Η-喹嗪并(9，1-GH)香豆素的合成。將100.Omg (0.39mmol) 2，3，6，7-四氫-10-氨基-1H,5H-喹嗪并(9，1-GH)香豆素溶于3mL濃度為2mol/L 鹽酸中，升溫至100°C，TLC跟蹤反應(yīng)，4小時(shí)反應(yīng)完全，冷卻至室溫，用25%氨水調(diào)至中性，每 次用15mL二氯甲烷萃取，萃取三次，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾，蒸除溶劑，硅膠柱層析 分離提純得到淡黃色固體86.7mg，收率86.5%.咕匪R (400 MHz, CDC13): δ 7.01(s, lH),6.82(s, 1H), 5.76 (s, 1H), 3.23 (q, J = 4.8 Hz, 4H), 2.90 (t, J = 6.4 Hz, 2H), 2.79 (t，J=6.4 Hz，2H)，2.03(q，J=6.4 Hz，4H).13C NMR (100 Hz，DMS0):Sl60.79， 46.50,2.92,35.46,23.16,19.02,,15.78,108.51,107.15,49.49,49.11,26.94,21.15, 20.31,20.02。
[0012] 實(shí)施例2:2,3,6,7-四氫-10-羥基-1!1，5!1-喹嗪并（9，1-6!1)香豆素的合成。將 100·0mg(0·39mmol) 2，3，6，7-四氫-10-氨基-1H,5H-喹嗪并(9，1-GH)香豆素溶于3mL 濃度 為4mo 1/L鹽酸中，升溫至100 °C，TLC跟蹤反應(yīng)，0.5小時(shí)反應(yīng)完全，冷卻至室溫，用25%氨水調(diào) 至中性，每次用15mL二氯甲烷萃取，萃取三次，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓蒸除溶 劑，硅膠柱層析分離提純得到黃綠色固體90.2mg，收率90.0%。
[0013] 實(shí)施例3:2,3,6,7_四氫-10-羥基-1H，5H-喹嗪并（9，1-GH)香豆素的合成。將 100 · 0mg(0 · 39mmol) 2，3，6，7-四氫-10-氨基-1H，5H-喹嗪并（9，1-GH)香?素溶于3mL 4mol/L鹽酸中，升溫至100°C，TLC跟蹤反應(yīng)，0.5小時(shí)反應(yīng)完全，冷卻至室溫，用飽和碳酸氫 鈉溶液調(diào)至中性，每次用15mL二氯甲烷萃取，萃取三次，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾，減 壓蒸除溶劑，硅膠柱層析分離提純得到黃綠色固體84.7mg，收率84.5%。
[0014] 實(shí)施例4:探針 1的合成。將50.0mg(0.20 mmol) 2,3,6,7_四氫-10-羥基-1H，5H-喹 嗪并(9，1-GH)香豆素溶于3ml無水二氯甲燒中，加入55.0mg(0.38 mmol)K2C〇3、53.3mg(0.20 mmol) 2，4-二硝基苯磺酰氯，氮?dú)獗Ｗo(hù)，室溫反應(yīng)，TLC跟蹤反應(yīng)，3小時(shí)反應(yīng)完全，乙酸乙酯 萃取，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓除溶劑，硅膠柱層析分離提純得68.3mg紅棕色 固體，收率70.1%。咕 NMR (400 MHz, CDC13): δ 8.67(s, lH)，8.56(d，J = 8.8 Hz 1H)， 8.48(d，J = 8.8 Hz 1Η)，7·62 (s， 1H)， 6.93 (s，lH), 3.31 (d， J = 4.0 Hz, 4H)， 2.80 (d，J = 6.4 Hz，4H)，2.00 (d，J = 5.2 Hz，4H).13C 匪R (100Hz，DMS0):Sl56.97， 150.10,149.94,148.24,146.32,135.65,135.08,133.22,128.00,125.91，125.19,119.60， 119 · 33，106·26，105·70，49·58，49·15，26·95，20·66，19·74，19·67。
[0015]實(shí)施例5:探針 1的合成。將50.0mg(0.20 mmol) 2,3,6,7-四氫-10-羥基-1H，5H-喹 嗪并（9，1-GH)香?素溶于3ml無水乙臆中，加入0 · 06mL(0 · 40 mmol)Et3N、53 · 3mg(0 · 20 mmol) 2，4-二硝基苯磺酰氯，氮?dú)獗Ｗo(hù)，室溫反應(yīng)，TLC跟蹤反應(yīng)，5小時(shí)反應(yīng)完全，乙酸乙酯 萃取，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓除溶劑，硅膠柱層析分離提純得83.7mg紅棕色 固體，收率85.9%。
[0016]實(shí)施例6:探針 1的合成。將50.0mg(0.20 mmol) 2,3,6,7_四氫-10-羥基-1H，5H-喹 嗪并（9，1-GH)香?素溶于3ml無水乙臆中，加入0 · 06mL(0 · 40mmol)Et3N、80 · 0mg(0 · 30mmol) 2,4-二硝基苯磺酰氯，氮?dú)獗Ｗo(hù)，室溫反應(yīng)，TLC跟蹤反應(yīng)，3小時(shí)反應(yīng)完全，乙酸乙酯萃取， 有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾，減壓除溶劑，硅膠柱層析分離提純得84.6mg紅棕色固體， 收率86.8%。
[0017] 實(shí)施例7:基于2,3,6,7_四氫-10-羥基-1H，5H-喹嗪并(9，1-GH)香豆素結(jié)構(gòu)的熒光 探針1對(duì)生物硫醇的光物理檢測(cè)應(yīng)用研究 將實(shí)施例4制備的基于2，3，6，7-四氫-10-羥基-1H，5H-喹嗪并(9，1-GH)香豆素結(jié)構(gòu)的 生物硫醇熒光探針1溶于乙腈中，配制成濃度為ImM的儲(chǔ)備液，然后用乙醇/PBS(10mM，pH= 7.4)(乙醇與PBS體積比為2 :8)配制濃度為ΙΟμΜ探針測(cè)試溶液。探針溶液在395nm激發(fā)下， 517nm處有較弱的熒光發(fā)射，當(dāng)向探針溶液中加入生物硫醇(Cys，GSH，Hey )時(shí)，熒光強(qiáng)度明 顯增強(qiáng)，Stokes位移達(dá)到122nm;Cys加入量在0~ΙΟμΜ內(nèi)，探針溶液在517 nm處的熒光強(qiáng)度 與Cys濃度成較好的線性，且檢測(cè)限僅為16.9nM;加入其他常見氨基酸后，沒有引起探針溶 液的熒光強(qiáng)度顯著變化;當(dāng)其他氨基酸存在時(shí)，不影響該探針對(duì)生物硫醇的響應(yīng)。
[0018] 由圖1、圖2所示，熒光探針1對(duì)生物硫醇(Cys，GSH，Hey )有很高的選擇性。探針1的 溶液加入生物硫醇(CyS，GSH，Hcy)后熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，且熒光強(qiáng)度不受纈氨酸Val、谷氨 酸Glu、亮氨酸Leu、甲硫氨酸Met、天冬酰胺Asn、丙氨酸Ala、組氨酸His、色氨酸Trp、苯丙氨 酸Phe、絲氨酸Ser、精氨酸Arg、賴氨酸Lys、谷氨酰胺Gln、天門冬氨酸Asp、異亮氨酸lie、蘇 氨酸Thr、酪氨酸Tyr、脯氨酸Pro、甘氨酸Gly的影響。
[0019] 由圖3可知，不同濃度的生物硫醇Cys加到ΙΟμΜ探針溶液時(shí)，溶液的熒光強(qiáng)度都會(huì) 隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。
[0020] 由圖4、圖5可知，探針濃度為ΙΟμΜ時(shí)，隨著Cys濃度增大，熒光強(qiáng)度逐漸增大；當(dāng)Cys 加入量在0~ΙΟμΜ內(nèi)時(shí)，探針溶液在517nm處的熒光強(qiáng)度與Cys濃度成較好的線性。
[0021 ]由圖6可知，該探針對(duì)Cys的檢測(cè)具有明顯的pH依賴性。
[0022]由圖7可知，該探針可用于He la細(xì)胞中生物硫醇的檢測(cè)。
[0023]由此得出結(jié)論，本發(fā)明制備的基于2,3，6,7-四氫-10-羥基-1H，5H-喹嗪并（9,1-GH)香豆素結(jié)構(gòu)的生物硫醇熒光探針對(duì)生物硫醇具有很高的選擇性和靈敏性，且可用于生 物硫醇的定性定量檢測(cè)及細(xì)胞內(nèi)成像檢測(cè)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于香豆素結(jié)構(gòu)的生物硫醇熒光探針，其特征在于:所述熒光探針為2，3,6,7-四氫-10-羥基-1H，5H-喹嗪并(9，1-GH)香豆素衍生物，其結(jié)構(gòu)式如下：2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于2,3,6,7-四氫-10-羥基-1扎511-喹嗪并（9，1-61〇香 豆素結(jié)構(gòu)的熒光增強(qiáng)型生物硫醇熒光探針，其特征在于制備方法如下： 第一步，以2，3，6，7-四氫-10-氨基-1H，5H-喹嗪并(9，1-GH)香豆素為原料，在鹽酸水溶 液中加熱，再加堿中和，合成2，3，6，7-四氫-10-羥基-1H，5H-喹嗪并(9，1-GH)香豆素； 第二步，以2,3,6,7_四氫-10-羥基-1H，5H-喹嗪并(9，1-GH)香豆素、2,4_二硝基苯磺酰 氯為原料，在有機(jī)溶劑中經(jīng)堿催化制得結(jié)構(gòu)式(1)化合物。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物硫醇熒光探針的制備方法，其特征在于:第一步，選用的 鹽酸濃度為2~5mol/L;反應(yīng)溫度為100°C ;反應(yīng)時(shí)間0.5~4小時(shí);堿選用氨水、碳酸氫鈉或 氫氧化鈉。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物硫醇熒光探針的制備方法，其特征在于:第二步選用的2， 3,6,7_四氫-10-羥基-1H，5H-喹嗪并(9，1-GH)香豆素與2,4_二硝基苯磺酰氯的摩爾比為1: 1~1:1.5;溶劑選用無水乙腈或二氯甲烷;堿選用碳酸鉀或三乙胺；反應(yīng)溫度為室溫;反應(yīng) 時(shí)間3~8小時(shí)。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的2,3,6,7-四氫-10-羥基-1扎511-喹嗪并（9，1-61〇香豆素結(jié)構(gòu) 熒光探針的用途，其特征在于:能夠在生物體系里對(duì)生物硫醇進(jìn)行熒光檢測(cè)。
【文檔編號(hào)】G01N21/64GK106046012SQ201610530444
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年7月6日
【發(fā)明人】張大同, 王小波
【申請(qǐng)人】齊魯工業(yè)大學(xué)