一種辛可耐因Ib的制備方法及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種辛可耐因Ib的制備方法，所述方法以薔薇科植物、葡萄科葡萄屬植物和菝契科植物的根、果實(shí)、莖和/或葉的醇提物為原料，通過(guò)多次液相色譜分離富集和精制得到純度較高的辛可耐因Ib。本發(fā)明還提供了辛可耐因Ib在制備用于防治糖尿病或糖尿病血管并發(fā)癥的藥物中的應(yīng)用，以及含有辛可耐因Ib的藥物組合物。辛可耐因Ib具有降低糖尿病大鼠血脂的功效，對(duì)控制糖尿病血管并發(fā)癥的進(jìn)展也有很好的協(xié)同作用，有助于防治代謝綜合癥，使其在防治糖尿病血管并發(fā)癥方面的優(yōu)勢(shì)更加明顯，高效無(wú)毒，安全性極高，因此在臨床防治糖尿病血管并發(fā)癥中具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】
_種辛可耐因 I b的制備方法及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種辛可耐因 lb的制備方法，以及辛可耐因 lb在制備用于防治糖尿病 及其血管并發(fā)癥的藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 糖尿病是一種由于胰島素分泌缺陷或胰島素作用障礙所致的以高血糖為特征的 代謝性疾病。最近的流行病調(diào)查證實(shí)，我國(guó)的糖尿病患病率高達(dá)11.6%，在糖尿病人口絕對(duì) 數(shù)方面已成為全球之冠。此外，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，糖尿病并發(fā)癥高達(dá)100多種，是目前已 知并發(fā)癥最多的一種疾病。而糖尿病的危害主要來(lái)自糖尿病血管并發(fā)癥，長(zhǎng)期血糖增高會(huì) 誘發(fā)大血管、微血管受損并危及心、腦、腎、周圍神經(jīng)、眼睛、足等。因此對(duì)糖尿病血管并發(fā)癥 的防治研究極為迫切。糖尿病個(gè)體體內(nèi)蛋白質(zhì)發(fā)生非酶糖基化致使非酶糖基化代謝產(chǎn)物增 多，是導(dǎo)致糖尿病血管并發(fā)癥的重要原因之一。非酶糖基化代謝產(chǎn)物增多，可引發(fā)心肌細(xì)胞 代謝紊亂、心肌細(xì)胞鈣轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷，導(dǎo)致心肌細(xì)胞功能異常；同時(shí)，非酶糖基化代謝產(chǎn)物能使 腎小球合成IV型膠原，內(nèi)皮、系膜和平滑肌細(xì)胞增殖。因此，糖尿病高糖狀態(tài)下非酶糖基化 代謝產(chǎn)物過(guò)多是糖尿病心肌疾病和糖尿病腎病等糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展的共同誘因 之一。
[0003] 自由基清除劑可以顯著抑制非酶糖基化代謝產(chǎn)物的形成，糖尿病時(shí)增強(qiáng)的氧化應(yīng) 激可以加速非酶糖基化代謝產(chǎn)物的形成，進(jìn)而促進(jìn)糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)展。因此，抑制非 酶糖基化反應(yīng)，降低非酶糖基化代謝產(chǎn)物生成是防治糖尿病血管并發(fā)癥的重要策略。
[0004] 辛可耐因 lb是一種具有抗氧化作用的化合物，最早在薔薇科植物枇杷中分離獲 得，后來(lái)陸續(xù)在薔薇科枇杷屬的山茶和紅樹(shù)科的秋茄以及菝契科粗莖菝契等植物中被發(fā) 現(xiàn)。辛可耐因 lb是一種黃烷3-醇類的鞣質(zhì)類成分，結(jié)構(gòu)式如式I所示。該化合物是通過(guò)C3-C6 連接構(gòu)成，顯著區(qū)別于通過(guò)C4-C8或者C4-C6的連接方式構(gòu)成的原花青素類成分。該化合物 具有很強(qiáng)的抗氧化作用，可有效清除DPPH自由基。目前尚沒(méi)有關(guān)于辛可耐因 lb如何在植物 中高效提取的記載，也沒(méi)有將其應(yīng)用在藥物中的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)了辛可耐因 lb存在于蘋果的果實(shí)中，并且在進(jìn)一步的 研究中發(fā)現(xiàn)辛可耐因 lb能夠降低大鼠的血糖濃度，同時(shí)能夠抑制糖尿病大鼠體內(nèi)非酶糖基 化反應(yīng)。因而，本發(fā)明的目的在于提供一種辛可耐因 lb的制備方法，同時(shí)還提供了辛可耐因 在制備用于防治糖尿病及糖尿病血管并發(fā)癥的藥物中的應(yīng)用。
[0007] 一種辛可耐因 lb的制備方法，所述方法包括：
[0008] 1)提供粗提物，常溫下將所述粗提物溶于水中得到粗提物水溶液;其中，所述粗提 物為植物的根、果實(shí)、莖和/或葉的醇提物，所述植物選自薔薇科植物、紅樹(shù)科植物、葡萄科 葡萄屬植物和菝契科植物中的一種或多種;優(yōu)選地，將所述粗提物以質(zhì)量比1:10的比例溶 于水中；
[0009] 2)將所述粗提物水溶液經(jīng)HP20型大孔樹(shù)脂吸附，然后以乙醇水溶液梯度洗脫，收 集富含辛可耐因 lb的洗脫液，合并所述洗脫液，減壓濃縮，得辛可耐因 lb的初級(jí)富集物；
[0010] 3)將步驟2)得到的初級(jí)富集物溶于等質(zhì)量的甲醇，得到初級(jí)富集物的甲醇溶液， 將所述初級(jí)富集物的甲醇溶液與60~100目的硅膠粉混合，減壓拌樣至干，干法上樣，以二 氯甲烷-甲醇為洗脫液過(guò)硅膠色譜柱梯度洗脫分離，收集并合并富含辛可耐因 lb的洗脫液， 減壓濃縮至干，得辛可耐因 lb的次級(jí)富集物;其中，所述硅膠粉的質(zhì)量為所述初級(jí)富集物質(zhì) 量的1.5~2.5倍;所述硅膠色譜柱中硅膠質(zhì)量為所述初級(jí)富集物質(zhì)量的10~20倍；
[0011] 4)將所述次級(jí)富集物溶解于2倍質(zhì)量的水中得到次級(jí)富集物的水溶液，將所述次 級(jí)富集物的水溶液以甲醇水溶液為梯度洗脫液通過(guò)大孔聚合物填料色譜柱分離，收集并合 并富含辛可耐因 lb的洗脫液，減壓濃縮至干，得辛可耐因 lb的三級(jí)富集物;優(yōu)選地，所述大 孔聚合物填料色譜柱為Toyopearl HW-40柱；
[0012] 5)將4)得到的三級(jí)富集物以50 %甲醇水溶液為洗脫液通過(guò)C18柱精制，在254nm檢 測(cè)收集辛可耐因 lb的色譜峰，收集洗脫液，減壓濃縮，冷凍干燥得到辛可耐因 lb;優(yōu)選地，所 述C18柱為Cosmosil 0DS柱。
[0013]在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述薔薇科植物為薔薇科蘋果屬植物。
[0014] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述粗提物為蘋果多酚。
[0015] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟2)中梯度洗脫的順序?yàn)樗?、體積百分比濃 度分別為10%、30%、50 %、70%、95%的乙醇水溶液;優(yōu)選地，每半個(gè)柱床體積作為一個(gè)接 收體積檢測(cè)洗脫樣品。
[0016] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟3)中所述梯度洗脫的二氯甲烷-甲醇體積 比梯度依次為95: 5、93:7、92: 8、91:10;優(yōu)選地，每半個(gè)柱床體積作為一個(gè)接收體積檢測(cè)洗 脫樣品。
[0017] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟4)中所述梯度洗脫的甲醇水溶液中甲醇與 水的體積比梯度依次為10%、15 %、20 %、25 % ;優(yōu)選地，每四分之一個(gè)柱床體積作為一個(gè)接 收體積檢測(cè)洗脫樣品。
[0018] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟1)~5)中通過(guò)薄層層析方法并結(jié)合分析型 HPLC檢測(cè)洗脫樣品是否含有辛可耐因 lb。
[0019] 在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟1)~5)中減壓濃縮的條件為溫度<60°C， 真空度為〇 · 06~0 · 08Mpa。
[0020] 本發(fā)明還提供了通過(guò)上述的方法制備的辛可耐因 lb在制備用于防治糖尿病或糖 尿病血管并發(fā)癥的藥物中的應(yīng)用。
[0021] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種用于防治糖尿病或糖尿病血管并發(fā)癥的藥物組合物，所 述藥物組合物包含辛可耐因 lb。
[0022]另一方面，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0023]本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)辛可耐因 lb能夠降低大鼠的血糖濃度，同時(shí)能夠抑制糖尿病 大鼠體內(nèi)非酶糖基化反應(yīng)，可以通過(guò)辛可耐因 lb的抗氧化能力和抑制非酶糖基化代謝產(chǎn)物 的形成，在實(shí)現(xiàn)控制糖尿病血管并發(fā)癥同時(shí)其還可以降低糖尿病大鼠血脂，對(duì)控制糖尿病 血管并發(fā)癥的進(jìn)展有很好的協(xié)同作用，有助于防治代謝綜合癥。辛可耐因 lb高效無(wú)毒，安全 性極高，在臨床防治糖尿病血管并發(fā)癥中具有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[0024]圖1為檢測(cè)辛可耐因 lb的液相色譜峰。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解，實(shí)施例僅用于進(jìn)一步說(shuō)明和闡釋 本發(fā)明，并非用于限制本發(fā)明。
[0026]實(shí)施例1辛可耐因 lb的液相檢測(cè)方法
[0027] 色譜柱：C-18 250X4.6mm
[0028] 檢測(cè)波長(zhǎng)：280nm
[0029] 流速：l.〇ml/min
[0030] 流動(dòng)相:A: 1 %磷酸
[0031] B:乙腈:水= 40:60
[0032]檢測(cè)辛可耐因 lb的液相色譜峰如圖1所示。
[0033]實(shí)施例2由蘋果多酚提取辛可耐因 lb
[0034] l)200g蘋果多酚（天津市尖峰天然產(chǎn)物研究研究開(kāi)發(fā)有限公司提供，多酚含量 80% )中加入2000mL的水常溫?cái)嚢枞芙?，備用?br>[0035] 2)大孔樹(shù)脂吸附分離:將1)中蘋果多酚溶液經(jīng)HP20型大孔樹(shù)脂吸附，用水、體積百 分比濃度為10 %、30 %、50%、70%、95%的乙醇水溶液梯度洗脫，每半個(gè)柱床體積作為一個(gè) 接收體積，通過(guò)薄層層析方法并結(jié)合分析型HPLC檢測(cè)，收集富含辛可耐因 lb的組分，將其合 并，在溫度<60°C，真空度為0.06~0.08MPa減壓濃縮，糖度為40，得辛可耐因 lb的初級(jí)富集 物；
[0036] 3)硅膠柱分離:大孔樹(shù)脂吸附分離后得到的辛可耐因 lb的初級(jí)富集物用等倍量的 甲醇溶解以1.5-2.5倍量比例加入60-100目硅膠減壓拌樣至干，干法上樣，用10-20倍量的 硅膠柱色譜分離，用二氯甲烷-甲醇體積比為95 :5,93:7,92:8,91:10梯度洗脫，半個(gè)柱床體 積作為一個(gè)接收體積，通過(guò)薄層層析方法并結(jié)合分析型HPLC檢測(cè)，收集富含辛可耐因 lb的 組分，將其合并，在溫度彡60°C，真空度為0.06~O.OSMpa減壓濃縮至干，得辛可耐因 lb的次 級(jí)富集物，含量為32.1%;
[0037] 4)Toyopearl HW-40分離：將辛可耐因 lb次級(jí)富集物用2倍水溶解，經(jīng)Toyopearl HW-40柱色譜分離，用甲醇-水的體積比為10%，15%，20%，25%梯度洗脫，每四分之一個(gè)柱 床體積作為一個(gè)接收體積，通過(guò)薄層層析方法并結(jié)合分析型HPLC檢測(cè)，收集富含辛可耐因 lb的組分，將其合并，在溫度<60°C，真空度為0.06~0.08MPa減壓濃縮，糖度為20，得辛可 耐因 lb的三級(jí)富集物，含量為67.2% ;
[0038] 5)制備液相色譜精制:將(4)中辛可耐因 lb的三級(jí)富集物利用制備液相色譜精制， Cosmosil 0DS柱（511，10\25〇111111)25411111檢測(cè)，50%甲醇水分離，收集辛可耐因113的色譜峰， 并將其在溫度彡60°C，真空度為0.06~0.08MPa減壓濃縮，糖度為16，冷凍干燥得到辛可耐 因 Ib(460mg)。
[0039] 利用E SI -MS、匪R和13C-NMR等光譜手段并于文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)照，鑒定了根據(jù)上 述方法分離得到的辛可耐因 lb的結(jié)構(gòu)。在此基礎(chǔ)上利用HPLC的面積歸一化進(jìn)行標(biāo)定，辛可 耐因 lb含量為97%。辛可耐因 lb為淡黃色粉末，聚酰胺薄膜以正丁醇-醋酸-水(4:1:3)展 開(kāi)，Rf為0.4,5%三氯化鐵乙醇溶液顯單一藍(lán)色斑點(diǎn)。HR ESI-MS: (negative)m/z:451.0986 [Μ-ΗΓ，計(jì)算值(451.1035)，可以確定該化合物的分子量為452。結(jié)合氫譜碳譜給出的信息， 確定其分子式為C 24H2Q09，計(jì)算其不飽和度為15。其1H-NMR( 300MHz，在DMS0中）中信號(hào)交疊較 嚴(yán)重，其13C-NMR(75MHz，在DMS0中）中信號(hào)清晰，與文獻(xiàn)相對(duì)照進(jìn)行了全歸屬，鑒定為辛可耐 因 Ib，結(jié)果見(jiàn)表1。
[0040] 表1本發(fā)明中化合物的1H，13C-NMR數(shù)據(jù)
[0042]實(shí)施例3由葡萄藤中提取辛可耐因 lb
[0043] l)20kg葡萄藤用60%乙醇8倍量、6倍量連續(xù)回流提取2次，合并提取液，減壓濃縮 至糖度40，加入2倍量水分散，備用。
[0044] 2)大孔樹(shù)脂吸附分離：將1)中獲取的葡萄藤提取溶液經(jīng)HP20型大孔樹(shù)脂吸附，用 水、體積百分比濃度為10%、30%、50 %、70%、95%的乙醇水溶液梯度洗脫，每半個(gè)柱床體 積作為一個(gè)接收體積，通過(guò)薄層層析方法并結(jié)合分析型HPLC檢測(cè)，收集富含辛可耐因 lb的 組分，將其合并，在溫度<60°C，真空度為0.06~0.08MPa減壓濃縮，糖度為40，得辛可耐因 lb的初級(jí)富集物，含量為8.2% ;
[0045] 3)硅膠柱分離:大孔樹(shù)脂吸附分離后得到的辛可耐因 lb的初級(jí)富集物用等倍量的 甲醇溶解以1.5-2.5倍量比例加入60-100目硅膠減壓拌樣至干，干法上樣，用10-20倍量的 硅膠柱色譜分離，用二氯甲烷-甲醇體積比為95:5,93:7,92:8,91:10梯度洗脫，半個(gè)柱床體 積作為一個(gè)接收體積，通過(guò)薄層層析方法并結(jié)合分析型HPLC檢測(cè)，收集富含辛可耐因 lb的 組分，將其合并，在溫度彡60°C，真空度為0.06~O.OSMpa減壓濃縮至干，得辛可耐因 lb的次 級(jí)富集物，含量為28.4%;
[0046] 4)Toyopearl HW-40分離：將辛可耐因 lb次級(jí)富集物用2倍水溶解，經(jīng)Toyopearl HW-40柱色譜分離，用甲醇-水的體積比為10%，15%，20%，25%梯度洗脫，每四分之一個(gè)柱 床體積作為一個(gè)接收體積，通過(guò)薄層層析方法并結(jié)合分析型HPLC檢測(cè)，收集富含辛可耐因 lb的組分，將其合并，在溫度<60°C，真空度為0.06~0.08MPa減壓濃縮，糖度為20，得辛可 耐因 lb的三級(jí)富集物，含量為63.7% ;
[0047] 5)制備液相色譜精制:將(4)中辛可耐因 lb的三級(jí)富集物利用制備液相色譜精制， Cosmosil 0DS柱（511，10\25〇111111)25411111檢測(cè)，50%甲醇水分離，收集辛可耐因113的色譜峰， 并將其在溫度彡60°C，真空度為0.06~0.08MPa減壓濃縮，糖度為16，冷凍干燥得到辛可耐 因 Ib(235mg)。
[0048] 實(shí)施例4由紅樹(shù)科植物秋茄中提取辛可耐因 lb
[0049] l)20kg秋茄莖、葉，破碎后用60%乙醇8倍量、6倍量連續(xù)回流提取2次，合并提取 液，減壓濃縮至糖度40，加入2倍量水分散，備用。
[0050] 2)大孔樹(shù)脂吸附分離:將1)中獲取的秋茄提取溶液經(jīng)HP20型大孔樹(shù)脂吸附，用水、 體積百分比濃度為10%、30%、50%、70%、95%的乙醇水溶液梯度洗脫，每半個(gè)柱床體積作 為一個(gè)接收體積，通過(guò)薄層層析方法并結(jié)合分析型HPLC檢測(cè)，收集富含辛可耐因 lb的組分， 將其合并，在溫度彡60°C，真空度為0.06~0.08MPa減壓濃縮，糖度為40，得辛可耐因 lb的初 級(jí)富集物，含量為6.3%;
[0051] 3)硅膠柱分離:大孔樹(shù)脂吸附分離后得到的辛可耐因 lb的初級(jí)富集物用等倍量的 甲醇溶解以1.5~2.5倍量比例加入60-100目硅膠減壓拌樣至干，干法上樣，用10-20倍量的 硅膠柱色譜分離，用二氯甲烷-甲醇體積比為95 :5,93:7,92:8,91:10梯度洗脫，半個(gè)柱床體 積作為一個(gè)接收體積，通過(guò)薄層層析方法并結(jié)合分析型HPLC檢測(cè)，收集富含辛可耐因 lb的 組分，將其合并，在溫度彡60°C，真空度為0.06~O.OSMpa減壓濃縮至干，得辛可耐因 lb的次 級(jí)富集物，含量為27.9%;
[0052] 4)Toyopearl HW-40分離：將辛可耐因 lb次級(jí)富集物用2倍水溶解，經(jīng)Toyopearl HW-40柱色譜分離，用甲醇-水的體積比為10%，15%，20%，25%梯度洗脫，每四分之一個(gè)柱 床體積作為一個(gè)接收體積，通過(guò)薄層層析方法并結(jié)合分析型HPLC檢測(cè)，收集富含辛可耐因 lb的組分，將其合并，在溫度<60°C，真空度為0.06~0.08MPa減壓濃縮，糖度為20，得辛可 耐因 lb的三級(jí)富集物，含量為71.3%;
[0053] 5)制備液相色譜精制:將(4)中辛可耐因 lb的三級(jí)富集物利用制備液相色譜精制， Cosmosil 0DS柱（511，10\25〇111111)25411111檢測(cè)，50%甲醇水分離，收集辛可耐因113的色譜峰， 并將其在溫度彡60°C，真空度為0.06~0.08MPa減壓濃縮，糖度為16，冷凍干燥得到辛可耐 因 Ib(176mg)。
[0054] 實(shí)施例5由菝契中提取辛可耐因 lb
[0055] l)20kg菝契莖和葉，破碎后用60%乙醇8倍量、6倍量連續(xù)回流提取2次，合并提取 液，減壓濃縮至糖度40，加入2倍量水分散，備用。
[0056] 2)大孔樹(shù)脂吸附分離:將1)中獲取的菝契提取溶液經(jīng)HP20型大孔樹(shù)脂吸附，用水、 體積百分比濃度為10%、30%、50%、70%、95%的乙醇水溶液梯度洗脫，每半個(gè)柱床體積作 為一個(gè)接收體積，通過(guò)薄層層析方法并結(jié)合分析型HPLC檢測(cè)，收集富含辛可耐因 lb的組分， 將其合并，在溫度彡60°C，真空度為0.06~0.08MPa減壓濃縮，糖度為40，得辛可耐因 lb的初 級(jí)富集物，含量為9.6%;
[0057] 3)硅膠柱分離:大孔樹(shù)脂吸附分離后得到的辛可耐因 lb的初級(jí)富集物用等倍量的 甲醇溶解以1.5-2.5倍量比例加入60-100目硅膠減壓拌樣至干，干法上樣，用10-20倍量的 硅膠柱色譜分離，用二氯甲烷-甲醇體積比為95 :5,93:7,92:8,91:10梯度洗脫，半個(gè)柱床體 積作為一個(gè)接收體積，通過(guò)薄層層析方法并結(jié)合分析型HPLC檢測(cè)，收集富含辛可耐因 lb的 組分，將其合并，在溫度彡60°C，真空度為0.06~O.OSMpa減壓濃縮至干，得辛可耐因 lb的次 級(jí)富集物，含量為29.7%;
[0058] 4)Toyopearl HW-40分離：將辛可耐因 lb次級(jí)富集物用2倍水溶解，經(jīng)Toyopearl HW-40柱色譜分離，用甲醇-水的體積比為10%，15%，20%，25%梯度洗脫，每四分之一個(gè)柱 床體積作為一個(gè)接收體積，通過(guò)薄層層析方法并結(jié)合分析型HPLC檢測(cè)，收集富含辛可耐因 lb的組分，將其合并，在溫度<60°C，真空度為0.06~0.08MPa減壓濃縮，糖度為20，得辛可 耐因 lb的三級(jí)富集物，含量為70.5% ;
[0059] 5)制備液相色譜精制:將(4)中辛可耐因 lb的三級(jí)富集物利用制備液相色譜精制， Cosmosil 0DS柱（511，10\25〇111111)25411111檢測(cè)，50%甲醇水分離，收集辛可耐因113的色譜峰， 并將其在溫度彡60°C，真空度為0.06~0.08MPa減壓濃縮，糖度為16，冷凍干燥得到辛可耐 因 Ib(149mg)。
[0060]實(shí)施例6辛可耐因 lb降血糖及抑制非酶糖基化的活性測(cè)試 [0061 ] 1.試驗(yàn)材料:動(dòng)物:雄性Wista大鼠，北京動(dòng)物中心提供。試劑:辛可耐因 lb(天津市 科曼思特醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司自制，純度為98% );鏈尿佐菌素(STZ)、氨基胍(AG)均為美 國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；輕乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品，北京京科公司分裝； 儀器:DV650全自動(dòng)生化儀，SMMAZU 1601紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，微量移液器，電子分析天 平，旋渦混勻器。
[0062] 2.試驗(yàn)方法：（1)糖尿病動(dòng)物模型制備：180-220g雄性Wi star大鼠90只，適應(yīng)性喂 養(yǎng)三天，隨機(jī)選12只大鼠作為正常對(duì)照組。余78只大鼠空腹12h后左腹腔注射STZ60mg/kg， 注射后均給予正常飲食，12h后測(cè)大鼠空腹尾靜脈血糖，血糖>16.7mmol/L為糖尿病造模成 功。取造模成功者60只納入試驗(yàn)，余棄去。（2)動(dòng)物分組及喂養(yǎng):將糖尿病大鼠隨機(jī)分為5組， 空白對(duì)照組、AG治療組、辛可耐因 lb低、中和高劑量組，每組12只?？瞻讓?duì)照組用自來(lái)水灌 胃，AG治療組用150mg/kg · d的AG灌胃，辛可耐因 lb低、中和高劑量組分別用30、60、90mg/ (kg ·(!)的辛可耐因 lb進(jìn)行灌胃，每日下午4時(shí)灌胃1次，各組均給予標(biāo)準(zhǔn)飼料常規(guī)喂養(yǎng)，自 由進(jìn)食及飲水，不使用胰島素。在喂養(yǎng)過(guò)程中，各組大鼠均有正常死亡，試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)各組具 有12只大鼠，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各組均有10只大鼠。（3)標(biāo)本取材:喂養(yǎng)12周后，大鼠空腹6h，稱體 重，2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，挖眼球取血5ml備用。另剖腹取出大鼠雙腎，雙腎去除包膜稱 重。取部分腎臟置入液氮中冷凍。（4)腎皮質(zhì)中體內(nèi)非酶糖基化終產(chǎn)物(AGEs)的檢測(cè)：用熒 光法測(cè)AGEs。取腎皮質(zhì)0.5g，剪成小塊，加生理鹽水lml磨成勾衆(zhòng)，2500r/min離心10min，棄 上清，在沉淀中加入氯仿 -甲醇(2: l)5ml去脂，4°C振搖過(guò)夜。4000r/min離心15min，棄上清， 留沉淀，用2ml甲醇及0.5ml蒸餾水沖洗沉淀。3000r/min離心7min，重復(fù)沖洗3次。新鮮配置 0.1mol/L HEPES緩沖液：用總量為225ml的蒸餾水溶解NaCl 9.36g，KCl 0.433g，Na2HP〇4· 2H20 0·158g，葡萄糖l·17g，HEPES5·85g，用lmol/LNa0H調(diào)節(jié)pH值至7·05，再用蒸餾水定容 至250ml。將沉淀顆粒懸浮在含有2ml的HEPES緩沖液的試管中，每試管加入280uIV型膠原 酶，并作空白膠原酶對(duì)照管，37°C恒溫震蕩24h后，3500r/min離心15min，上清液即為被膠原 酶消化的腎皮質(zhì)膠原。用熒光光度計(jì)在激發(fā)波長(zhǎng)370nm、發(fā)射波長(zhǎng)440nm處測(cè)定熒光強(qiáng)度，其 數(shù)值用空白膠原酶校正。然后用氯胺T法測(cè)定消化液中的羥脯氨酸含量。AGEs含量以每毫克 羥脯氨酸(Hyp)所含熒光強(qiáng)度為一個(gè)單位(AU/mg Hyp)表示。（5)血糖的檢測(cè):取上述大鼠自 凝血2ml，利用全自動(dòng)生化儀測(cè)定血糖。
[0063] 3.試驗(yàn)結(jié)果：（1)各組實(shí)驗(yàn)大鼠形態(tài)、腎重、體重及腎重/體重的比較:所有成模糖 尿病大鼠均出現(xiàn)多飲、多食、多尿的表現(xiàn)，由于消瘦及多食逐漸呈小頭大腹的形態(tài)，與正常 對(duì)照組相比，毛色暗淡無(wú)光澤，尾靜脈采血后傷口不易愈合。糖尿病大鼠12周時(shí)體重較正常 對(duì)照組顯著降低，腎重/體重比值明顯升高;AG治療組和辛可耐因 lb各劑量組的腎重/體重 比值比對(duì)照組低(P〈〇.01)，結(jié)果見(jiàn)表2。
[0064]表2各組大鼠體重、腎重、腎重/體重比較(X土 s)
[0066] 注:方差分析與t檢驗(yàn)，與正常對(duì)照組比較，*P〈0.05，#P〈0.01，與空白對(duì)照組比 較，均為p〈0.01。
[0067] (2)血清血糖及腎皮質(zhì)AGEs:試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各試驗(yàn)組血糖值僅辛可耐因 lb高劑量組 與空白對(duì)照組存在顯著性差異。同時(shí)AG治療組、辛可耐因 lb各劑量組與正常對(duì)照組、空白對(duì) 照組相比，大鼠腎皮質(zhì)AGEs均有非常顯著性差異(**P〈0.01)，AG治療組AGEs低于辛可耐因 lb低劑量組（ΛΡ〈0.05)，辛可耐因 lb高劑量組低于辛可耐因 lb低劑量組(#P〈0.01)，辛可耐 因 lb中、高劑量組之間以及與AG治療組相比較無(wú)顯著性。（見(jiàn)表3)。
[0068]表3各組大鼠的血糖及腎皮質(zhì)AGEs測(cè)定結(jié)果
[0070]結(jié)果顯示：辛可耐因 lb高劑量組具有一定的降血糖功效，同時(shí)高中低劑量組均能 抑制腎皮質(zhì)AGE的形成，從而抑制非酶糖基化，防治糖尿病血管綜合癥的發(fā)生。
[0071 ]實(shí)施例7辛可耐因 lb對(duì)胰島細(xì)胞的保護(hù)作用 [0072] 1.實(shí)驗(yàn)儀器
[0073] 超低溫冰箱（日本Sanyo公司）；全無(wú)氟冰箱（中國(guó)海爾公司）；電子恒溫水浴鍋(天 津市達(dá)北實(shí)驗(yàn)儀器廠）；精密電子天平(瑞士 Mettler公司）；倒置光學(xué)顯微鏡（日本Nikon公 司）；⑶2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司）；低溫高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司）；全波長(zhǎng)酶 標(biāo)儀(德國(guó)Tecan公司）；電熱鼓風(fēng)干燥箱(北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；恒溫振蕩器(太倉(cāng)市 實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）；塑料薄膜封口機(jī)(溫州正雄機(jī)械有限公司）；超純水系統(tǒng)(美國(guó)Minipore公司） 壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司） ；96wellS細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning，USA)微孔過(guò)濾器 (美國(guó)greiner公司）。
[0074] 2實(shí)驗(yàn)試劑
[0075]胎牛血清浙江四季青生物工程有限公司；RIPM 1640培養(yǎng)液北京索萊寶科技有限 公司;MTT試劑北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)公司；胰蛋白酶北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司；無(wú) 水乙醇和二甲基亞楓，分析純由天津市化學(xué)試劑三廠提供。
[0076] 磷酸鹽緩沖液（PBS):NaCl 8.0g，KCl 0.20g，Na2HP04 1.44g，KH2P04 0.20g，溶于 600ml純水，調(diào)節(jié)ρΗ7·2-7·4,定容至1L。
[0077] 0.25%胰蛋白酶溶液：Trypsin 2.5g，溶于600ml PBS中，調(diào)節(jié)pH至7.2-7.4,定容 至1匕4°(：放置過(guò)夜使胰酶充分溶解，然后在超凈工作臺(tái)中用無(wú)菌的0.22μπι微孔濾膜除菌過(guò) 濾，分裝后保存于_20°C，應(yīng)注意避免反復(fù)凍融；
[0078] 胎牛血清（FBS)滅活：取出胎牛血清，放置于4°C過(guò)夜，溶解后于56°C水浴滅活 30min。超凈工作臺(tái)中分裝并保存于-20°C。
[0079] MTT溶液:稱取50mg MTT粉末，溶于10ml 0.01M ρΗ7·4的roS中，混勻，在超凈工作 臺(tái)中用無(wú)菌的〇.22μπι微孔濾膜除菌過(guò)濾，分裝后避光保存于-20°C，4°C避光保存時(shí)間為一 周。
[0080] 辛可耐因 lb配制：稱取藥物，用DMS0將其充分溶解，-20 °C避光保存。給藥前，用培 養(yǎng)液稀釋至所需濃度。
[0081 ] 3、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞
[0082] RIN-m5F胰島辟田胞，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)藥物研究所提供。
[0083] 4.實(shí)驗(yàn)方法
[0084] (l)RIN-m5f細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)：
[0085] 胰島RIN-m5Fi3細(xì)胞使用RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。培養(yǎng)液含10%胎牛血清，50U/ml青 霉素和50yg/L的鏈霉素，在37 °C、5 %⑶2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)，使用3ml/次ros輕洗 細(xì)胞更換培養(yǎng)液。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%匯合以上，用PBS輕洗細(xì)胞，充分去除血清后，用3ml的 0.25%胰蛋白酶消化。在顯微鏡下觀察，約30s，細(xì)胞變圓后立即加入3ml完全培養(yǎng)液終止消 化。用5ml的槍輕輕吹打培養(yǎng)瓶壁，收集細(xì)胞。lOOOrpm離心5min，棄上清，用完全培養(yǎng)液吹懸 細(xì)胞，按照細(xì)胞多少傳代，隔天換液。
[0086] (2)Cinchonain lb對(duì)于胰島RIN-m5f細(xì)胞的促增殖作用。
[0087]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期胰島RIN_m5Fi3細(xì)胞，消化后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種于96孔板，每 孔?οομL細(xì)胞液，每孔細(xì)胞數(shù)為1.5X104個(gè)/孔。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)置5個(gè)復(fù) 孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。24h后按實(shí)驗(yàn)分組加入100μ1含不同濃度藥物的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24h，然 后加入20μ1 MTT溶液(5mg/ml)，孵育4h，吸去上清液，加入150μ1二甲基亞砜(DMS0)，震蕩 l〇min，用全波長(zhǎng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于490nm處檢測(cè)各孔吸光度值，考察單體化合物辛可耐因 lb各個(gè)濃度對(duì)胰島RIN-m5Fi3細(xì)胞增殖程度。
[0088] 5.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0089] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，辛可耐因 Ib( 10-immol/L、10-2mmol/L、10-3mmol/L) 均能特別顯著地促進(jìn)胰島RIN-m5Fi3細(xì)胞的增殖(P〈0.01)，結(jié)果見(jiàn)表4。
[0090] 表4不同濃度cinchonain lb對(duì)胰島β細(xì)胞增殖的影響(X土SD)
[0092] 注：與空白組相比，表示Ρ<0.01
[0093]根據(jù)上述體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，辛可耐因 lb對(duì)胰島RIN_m5Fi3細(xì)胞具有促增殖作用，提示 辛可耐因 lb具有促進(jìn)胰島細(xì)胞增殖，具有潛在的抗胰島細(xì)胞凋亡作用，從而進(jìn)一步推測(cè)其 具有保護(hù)胰島細(xì)胞，改善胰島細(xì)胞功能，具有潛在的降血糖活性。
[0094]盡管本發(fā)明已進(jìn)行了一定程度的描述，明顯地，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的 條件下，可進(jìn)行各個(gè)條件的適當(dāng)變化?？梢岳斫?，本發(fā)明不限于所述實(shí)施方案，而歸于權(quán)利 要求的范圍，其包括所述每個(gè)因素的等同替換。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種辛可耐因 lb的制備方法，其特征在于，所述方法包括： 1) 提供粗提物，常溫下將所述粗提物溶于水中得到粗提物水溶液;其中，所述粗提物為 植物的根、果實(shí)、莖和/或葉的醇提物，所述植物選自薔薇科植物、紅樹(shù)科植物、葡萄科葡萄 屬植物和菝契科植物中的一種或多種;優(yōu)選地，將所述粗提物以質(zhì)量比1:10的比例溶于水 中； 2) 將所述粗提物水溶液經(jīng)HP20型大孔樹(shù)脂吸附，然后以乙醇水溶液梯度洗脫，收集富 含辛可耐因 lb的洗脫液，合并所述洗脫液，減壓濃縮，得辛可耐因 lb的初級(jí)富集物； 3) 將步驟2)得到的初級(jí)富集物溶于等質(zhì)量的甲醇，得到初級(jí)富集物的甲醇溶液，將所 述初級(jí)富集物的甲醇溶液與60~100目的硅膠粉混合，減壓拌樣至干，干法上樣，以二氯甲 烷-甲醇為洗脫液過(guò)硅膠色譜柱梯度洗脫分離，收集并合并富含辛可耐因 lb的洗脫液，減壓 濃縮至干，得辛可耐因 lb的次級(jí)富集物;其中，所述硅膠粉的質(zhì)量為所述初級(jí)富集物質(zhì)量的 1.5~2.5倍;所述硅膠色譜柱中硅膠質(zhì)量為所述初級(jí)富集物質(zhì)量的10~20倍； 4) 將所述次級(jí)富集物溶解于2倍質(zhì)量的水中得到次級(jí)富集物的水溶液，將所述次級(jí)富 集物的水溶液以甲醇水溶液為梯度洗脫液通過(guò)大孔聚合物填料色譜柱分離，收集并合并富 含辛可耐因 lb的洗脫液，減壓濃縮至干，得辛可耐因 lb的三級(jí)富集物;優(yōu)選地，所述大孔聚 合物填料色譜柱為Toyopearl HW-40柱； 5) 將4)得到的三級(jí)富集物以50 %甲醇水溶液為洗脫液通過(guò)C18柱精制，在254nm檢測(cè)收 集辛可耐因 lb的色譜峰，收集洗脫液，減壓濃縮，冷凍干燥得到辛可耐因 lb;優(yōu)選地，所述 C18柱為Cosmosil 0DS柱。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述薔薇科植物為蘋果屬植物。3. 如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述粗提物為蘋果多酚。4. 如權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟2)中梯度洗脫的順序?yàn)樗?體積百分比濃度分別為10%、30%、50 %、70%、95%的乙醇水溶液;優(yōu)選地，每半個(gè)柱床體 積作為一個(gè)接收體積檢測(cè)洗脫樣品。5. 如權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟3)中所述梯度洗脫的二氯 甲烷-甲醇體積比梯度依次為95:5、93:7、92:8、91:10;優(yōu)選地，每半個(gè)柱床體積作為一個(gè)接 收體積檢測(cè)洗脫樣品。6. 如權(quán)利要求1~5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟4)中所述梯度洗脫的甲醇 水溶液中甲醇與水的體積比梯度依次為10%、15%、20%、25% ;優(yōu)選地，每四分之一個(gè)柱床 體積作為一個(gè)接收體積檢測(cè)洗脫樣品。7. 如權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟1)~5)中通過(guò)薄層層析方 法并結(jié)合分析型HPLC檢測(cè)洗脫樣品是否含有辛可耐因 lb。8. 如權(quán)利要求1~7中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，步驟1)~5)中減壓濃縮的條件 為溫度<60°C，真空度為0.06~0.08Mpa。9. 辛可耐因 lb在制備用于防治糖尿病或糖尿病血管并發(fā)癥的藥物中的應(yīng)用；優(yōu)選地， 所述辛可耐因 lb是通過(guò)權(quán)利要求1~8中任一項(xiàng)所述的方法制備的。10. -種用于防治糖尿病或糖尿病血管并發(fā)癥的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組 合物包含辛可耐因 lb;優(yōu)選地，所述辛可耐因 lb是通過(guò)權(quán)利要求1~8中任一項(xiàng)所述的方法 制備的。
【文檔編號(hào)】A61P9/00GK106046014SQ201610363764
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年5月26日
【發(fā)明人】劉岱琳, 宋光明, 趙艷敏, 郭敏娜
【申請(qǐng)人】天津市科曼思特醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司