一種水楊酸二乙胺的藥物組合物及其醫(yī)藥用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種水楊酸二乙胺的藥物組合物及其醫(yī)藥用途，本發(fā)明提供的水楊酸二乙胺的藥物組合物中含有水楊酸二乙胺和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物化合物(Ⅰ)，水楊酸二乙胺、化合物(Ⅰ)單獨(dú)作用時(shí)，對(duì)佝僂病具有治療作用；水楊酸二乙胺和化合物(Ⅰ)聯(lián)合作用時(shí)，對(duì)佝僂病的治療效果進(jìn)一步提高，可以開發(fā)成治療佝僂病的藥物，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步。
【專利說明】
一種水楊酸二乙胺的藥物組合物及其醫(yī)藥用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及水楊酸二乙胺的新用途，具體涉及水楊酸二乙胺 的藥物組合物及其在佝僂病中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 水楊酸二乙胺為消炎鎮(zhèn)痛藥，用于風(fēng)濕及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。
[0003] 迄今為止，尚未見水楊酸二乙胺及其藥物組合物與佝僂病的相關(guān)性報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種水楊酸二乙胺的藥物組合物，該藥物組合物中含有水 楊酸二乙胺和一種天然產(chǎn)物，水楊酸二乙胺和該天然產(chǎn)物可以協(xié)同治療佝僂病。
[0005] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：
[0006] 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，
[0008] -種水楊酸二乙胺的藥物組合物，包括水楊酸二乙胺、如權(quán)利要求1所述的化合物 (I)和藥學(xué)上可以接受的載體，制備成需要的劑型。
[0009] 進(jìn)一步地，藥學(xué)上可以接受的載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、 崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體或潤(rùn)滑劑。
[0010] 進(jìn)一步地，所述劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、 膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。
[0011] 上述化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將芫花粉碎，用70~80%乙醇 熱回流提取，合并提取液，濃縮至無(wú)醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取， 分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中正丁醇萃取物用 大孔樹脂除雜，先用15 %乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用70 %乙醇洗脫10個(gè)柱體積，收集70 %洗 脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分 離，依次用體積比為80:1、30:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；（d)步 驟(c)中組分3用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為25:1、15:1和2:1的二氯甲烷-甲醇 梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積 百分濃度為72 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到 純的化合物(I)。
[0012] 進(jìn)一步地，化合物（I)的制備方法中，所述大孔樹脂為D101型大孔吸附樹脂。
[0013] 上述化合物(I)在制備治療佝僂病的藥物中的應(yīng)用。
[0014] 上述水楊酸二乙胺的藥物組合物在制備治療佝僂病的藥物中的應(yīng)用。
[0015] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0016] 本發(fā)明提供的水楊酸二乙胺的藥物組合物中含有水楊酸二乙胺和一種結(jié)構(gòu)新穎 的天然產(chǎn)物，水楊酸二乙胺、化合物（I)單獨(dú)作用時(shí)，對(duì)佝僂病具有治療作用;水楊酸二乙胺 和化合物（I)聯(lián)合作用時(shí)，對(duì)佝僂病的治療效果進(jìn)一步提高，可以開發(fā)成治療佝僂病的藥 物。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì) 本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。
[0018] 實(shí)施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0019] 試劑來(lái)源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購(gòu)自上海凌峰化 學(xué)試劑有限公司，甲醇，分析純，購(gòu)自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。
[0020] 分離方法：（a)將芫花（2kg)粉碎，用75 %乙醇熱回流提取（20L X 3次），合并提取 液，濃縮至無(wú)醇味（4L)，依次用石油醚(4L X 3次）、乙酸乙酯（4L X 3次）和水飽和的正丁醇 (4LX3次）萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中 正丁醇萃取物用D101型大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用70%乙醇洗脫10 個(gè)柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫 濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1 (8個(gè)柱體積）、30:1 (8個(gè)柱體積）、15:1 (8個(gè)柱 體積)和5:1(10個(gè)柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；（d)步驟(c)中組分3用 正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為25:1 (8個(gè)柱體積）、15:1 (10個(gè)柱體積)和2:1 (5個(gè)柱 體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的 反相硅膠分離，用體積百分濃度為72%的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個(gè)柱體積洗脫 液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)(純度大于98% )。
[0021] 結(jié)構(gòu)確證:冊(cè)431-]\^顯示[]\?1]+為111/2 247.1281，結(jié)合核磁特征可得分子式為 C15H18〇3，不飽和度為7。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δΗ( ΡΡπι，CDC13，500MHz): H-1 (2 · 98，d，J = 4 · 6Hz)， H-2(3.63，dd，J = 4.6,8.7Hz)，H-3(5.27，d，J = 8.7Hz)，H-5(2.61，d，J = ll ·7Ηζ)，H-6 (3.93，dd，J=11.7，lO.6Hz)，H-7(2.54，dt，J = 3.2，lO.6Hz)，H-8a(2.O5，m)，H-80(1.65， ddt，J=12.3,3.6,13.2Hz)，H-9a(1.63，dt，J = 4.1，13.2Hz)，Η-9β(1.47,dt，J=13.2， 3.6Hz)，H-13(5.79，d，J = 3.1Hz)，H-13(6.08，d，J = 3.1Hz)，H-14(0.95，s)，H-15(1.93，d，J =1.1Hz);核磁共振碳譜數(shù)據(jù)Sc(ppm，CDCl3,125MHz) :78.4(CH，1-C)，54.1(CH，2-C)，122.1 (CH，3-C)，135.5(C，4-C)，53.6(CH，5-C)，80.6(CH，6-C)，49.4(CH，7-C)，20.9(CH 2,8-C)， 34.7(CH2,9-C)，39.4(C，10-C)，138.3(C，11-C)，170.3(C，12-C)，117.9(CH 2，13-C)，18.2 (CH3，14-C)，23.8(CH3，15-C)。紅外波譜中的1716cm- 1吸收帶與UV譜中的236nm吸收帶表明 該化合物含有a，β_不飽和γ -內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步并通過分析13C_匪R譜中的δ。80.6，49.4， 138.3，170.3，117.9的碳信號(hào)可知存在環(huán)外亞甲基γ-內(nèi)酯結(jié)構(gòu)。 13C-NMR、DEPT和HSQC譜中 顯示有15個(gè)碳信號(hào)，包括兩個(gè)甲基，三個(gè)亞甲基(一個(gè)烯烴碳），六個(gè)次甲基(三個(gè)連氧碳和 一個(gè)烯烴碳），以及四個(gè)季碳(兩個(gè)烯烴碳和一個(gè)羰基碳）。以上功能結(jié)構(gòu)再結(jié)合不飽和數(shù)表 明該化合物為四環(huán)結(jié)構(gòu)。1H-NMR譜結(jié)合HSQC譜顯示兩個(gè)甲基質(zhì)子信號(hào)δ Η〇.95(3Η，8)、1.93 (3!1，(1，1 = 1.1泡），一對(duì)端烯烴質(zhì)子信號(hào)6116.08(1!1，(1，1 = 3.1?。┡c5.79(1!1，(1，了 = 3.1泡），三個(gè)連氧次甲基質(zhì)子信號(hào)5[12.98(1!1，(1，1 = 4.6抱）、3.63(1!1，(1(1，了 = 4.6,8.7!^) 與3.93(1!1，(1(1，1=11.7，10.6!^)，一個(gè)烯烴質(zhì)子信號(hào)5[15.27(1!1，(1，1 = 8.7抱）。通過1!1-1!1 COSY譜中Η-1/Η-2/Η-3與Η-5/Η-6/Η-7/Η-8/Η-9相關(guān)信號(hào)，以及HMBC譜中顯示的Η-1 與C-2、 C-3和C-10，H-2與C-l、C-3和C-4，H-3與C-l、C-2、C-4和C-5，H-5與C-6和C-10，H-6與C-7、C-8、C-11 和 C-12，H-7 與 06、011、012和(：-13，!1-13與(：-7和(：-12，!1-14與(：-10相關(guān)信號(hào)，可以 構(gòu)建該化合物的連接方式，并且上述波譜數(shù)據(jù)表明該化合物為桉葉烷型倍半萜，并且存在 環(huán)外亞甲基γ -內(nèi)酯結(jié)構(gòu)。該化合物中的C-l、C-2、C-5、C-6、C-7和C-10為手性碳，通過N0ESY 試驗(yàn)與Η-Η偶合常數(shù)確認(rèn)了相對(duì)構(gòu)型。N0ESY譜中Η-6/Η-8β、Η-6/Η-14以及Η-8β/Η-14的相關(guān) 信號(hào)表明這些氫處在同一側(cè)，另Η-5/Η-7、Η-5/Η-9α、Η-7/Η_9α的相關(guān)信號(hào)表明這些氫處在 同一側(cè)，這些相關(guān)信號(hào)與相關(guān)偶合常數(shù)的結(jié)果一致，并且也表明Α/Β與B/C環(huán)反式連接。此 外，C-1與C-2的Η-Η偶合常數(shù)為J 1>2 = 4.6Hz，因此以上相關(guān)信號(hào)可以表明該化合物的01、0 2、05、06、07和(：-10構(gòu)型為15、21?、55、65、75和101?。綜合氫譜、碳譜、腿8(：譜和~(^5￥譜，以 及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如下所示，立體構(gòu)型進(jìn)一步通過ECD試 驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基本一致。
[0022]該化合物化學(xué)式及碳原子編號(hào)如下：
[0024] 實(shí)施例2:藥理作用
[0025]本實(shí)施例使用喂以缺Vit D飼料和純凈水并避光喂養(yǎng)制備佝僂病大鼠模型，觀察 藥物促進(jìn)鈣吸收，增加佝僂病大鼠模型的鈣含量，改善佝僂病大鼠血生化紊亂狀況等方面 的抗佝僂病的作用。
[0026] 1、材料與方法
[0027] 1.1動(dòng)物
[0028] 選用華西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的Wistar種子鼠在同期配種、受孕，同期出 生;飼養(yǎng)21d，幼鼠斷乳，對(duì)反應(yīng)佳、進(jìn)食好、外觀無(wú)異常幼鼠。相同溫度、濕度下，每天定時(shí)定 量投食，每次每鼠20g，顆粒飼料附加10g新鮮麥芽，每周測(cè)體重一次，觀察生長(zhǎng)、活動(dòng)。
[0029] 1.2試劑與樣品
[0030]水楊酸二乙胺購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所?；衔铮↖)自制，制備方法見實(shí)施例 1?；A(chǔ)飼料配方（％ 玉米粉30、麥麩35、魚粉8、豆餅20、酵母粉5、骨粉1、鹽0.5、蛋氨酸 0.1、AD30.1、多種維生素0.2，含鈣量達(dá)1.18%。模型組飼料配方主要采用美國(guó)Numerof的 USPNo2缺D飼料配方，主要成分有:玉米粉76%，麥麩20%，碳酸鈣3%，含碘食鹽1%，賴氨酸 0.5%及各種B族維生素。另附加新鮮麥芽每天每鼠投給10g，經(jīng)HPLC法(Waters)UV264nm檢 測(cè):維生素 D含量未檢出，媽含量1.1%，磷含量0.6%。
[0031] 1.3儀器
[0032] 美國(guó)MET-ASCA全自動(dòng)生化分析儀。
[0033] 1.4大鼠分組及模型制備
[0034]大鼠隨機(jī)分為5組，每組12只，雌雄各半。分別為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、水楊酸 二乙胺組（80mg · kg-3、化合物（I)組（80mg · kg-4、水楊酸二乙胺與化合物（I)組合物組 【40mg · kg^1水楊酸二乙胺+40mg · kg^1化合物（I)】。正常對(duì)照組喂基礎(chǔ)飼料和自來(lái)水。實(shí)驗(yàn) 組喂以缺Vit D飼料和純凈水并避光喂養(yǎng)30d。佝僂病X線診斷標(biāo)準(zhǔn)的主要標(biāo)準(zhǔn):先期鈣化帶 模糊，干骺端毛糙，凹陷杯口及毛刷狀改變，診斷以主要標(biāo)準(zhǔn)為依據(jù)。實(shí)驗(yàn)第30d，處死正常 對(duì)照組和模型對(duì)照組，其余組按照上述劑量灌胃給藥。實(shí)驗(yàn)第60d處死動(dòng)物，從心臟抽血 2.0mL檢測(cè)血清Ca、P、ALP(堿性磷酸酶)各項(xiàng)指標(biāo)，同時(shí)檢測(cè)體重。
[0035] 1 · 5血清Ca2+測(cè)定實(shí)驗(yàn)
[0036] 血清Ca2+測(cè)定用鄰甲酚酞洛和酮法(0CPC)。
[0037] 1.6血清P3-測(cè)定實(shí)驗(yàn)
[0038]血P用紫外分光光度法。
[0039] 1.7血八1^測(cè)定實(shí)驗(yàn)
[0040] 血ALP用磷酸對(duì)硝基苯基動(dòng)力學(xué)法。
[0041] 1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0042]實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(X土s)表示，應(yīng)用SPSS18.0版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差 分析和t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0043] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0044] 2.1對(duì)佝僂病模型大鼠體重的影響
[0045]與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠的體重顯著下降(P<0.01);與模型對(duì)照組比 較，水楊酸二乙胺與化合物（I)組合物組大鼠的體重顯著上升(p<0.01);與模型對(duì)照組比 較，水楊酸二乙胺組、化合物（I)組大鼠的體重上升(P<〇.05)。結(jié)果見表1。
[0046] 2.2對(duì)佝僂病模型大鼠血清〇8、？^1^含量的影響
[0047] 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠血清C a、P降低（P < 0.01)，血AL P升高（P < 〇.01)。與模型對(duì)照組比較，水楊酸二乙胺與化合物（I)組合物組大鼠血清Ca、p明顯升高(P <0.01)，血清ALP明顯降低(P<0.01);與模型對(duì)照組比較，水楊酸二乙胺組、化合物（I)組 血清Ca、P升高(Ρ<0·05)，血清ALP降低(Ρ<0·05)。結(jié)果見表1。
[0048]表1對(duì)佝僂病模型大鼠體重和血清Ca、P、ALP含量的影響
[0049]
[0050] 人體內(nèi)的鈣主要來(lái)自食物，但并不是食物中所有的鈣均能被人體吸收和利用。一 般情況下，人體對(duì)鈣的吸收率只有20%~30%。研究表明，食物中以復(fù)合形式存在的鈣在腸 道中的吸收過程主要發(fā)生在酸性強(qiáng)的小腸上部。腸鈣吸收過程是以主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)過程為主，這 是消耗能量的，而且是依賴于維生素 D及其代謝產(chǎn)物的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。此外，腸鈣的吸收還有被 動(dòng)擴(kuò)散過程。維生素 D缺乏性佝僂病是由于發(fā)育期動(dòng)物體內(nèi)維生素 D不足致使鈣磷代謝失常 的一種慢性營(yíng)養(yǎng)性疾病，可以看成是機(jī)體為維持血鈣水平而對(duì)骨骼造成的損害。
[0051 ]水楊酸二乙胺、化合物（I)單獨(dú)作用時(shí)，對(duì)佝僂病具有治療作用；水楊酸二乙胺和 化合物(I)聯(lián)合作用時(shí)，對(duì)佝僂病的治療效果進(jìn)一步提高，可以開發(fā)成治療佝僂病的藥物。
[0052]上述實(shí)施例的作用在于說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，2. -種水楊酸二乙胺的藥物組合物，其特征在于:包括水楊酸二乙胺、如權(quán)利要求1所 述的化合物(I)和藥學(xué)上可以接受的載體，制備成需要的劑型。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的水楊酸二乙胺的藥物組合物，其特征在于:藥學(xué)上可以接受的 載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附 載體或潤(rùn)滑劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的水楊酸二乙胺的藥物組合物，其特征在于：所述劑型包括片 劑、膠囊劑、□服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注 射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。5. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含以下操作步驟：（a)將芫 花粉碎，用70~80%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無(wú)醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯 和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步 驟(a)中正丁醇萃取物用大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用70%乙醇洗脫 10個(gè)柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中70%乙醇洗 脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1、30:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗 脫得到4個(gè)組分；（d)步驟(c)中組分3用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為25:1、15:1和 2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反 相硅膠分離，用體積百分濃度為72 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個(gè)柱體積洗脫液， 洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為D101型 大孔吸附樹脂。7. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)在制備治療佝僂病的藥物中的應(yīng)用。8. 權(quán)利要求2~4任一所述的水楊酸二乙胺的藥物組合物在制備治療佝僂病的藥物中 的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C07D493/04GK106046016SQ201610475600
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月24日
【發(fā)明人】周飛燕
【申請(qǐng)人】周飛燕