一種他克莫司浸提方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及從一種鏈霉菌菌體中流化床浸提他克莫司的新工藝，包括發(fā)酵液的預(yù)處理、板框過濾菌體的收集、閃蒸干燥、菌體流化床浸提。利用本發(fā)明流化床方法浸提他克莫司，提取收率最高可達(dá)94％以上，溶劑使用量少。且本發(fā)明工藝設(shè)備投資少，操作步驟簡單，浸提得到的他克莫司有助于后續(xù)工藝的純化，該方法通用性強，易推廣，可以進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】
_種他克莫司浸提方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種他克莫司浸提方法。
【背景技術(shù)】
[0002]他克莫司是微生物的次級代謝產(chǎn)物，具有選擇性較好的強免疫抑制作用，主要用于器官移植后的抗排斥用藥，他克莫司和孢菌素A的發(fā)現(xiàn)極大推動了器官移植的發(fā)展。
[0003]他克莫司由日本藤澤公司研發(fā)，作用機(jī)制和環(huán)孢菌素相同，抑制T細(xì)胞活化基因的產(chǎn)生(對γ-干擾素和白細(xì)胞介素-2等淋巴因子的mRNA轉(zhuǎn)錄有抑制作用)，同時還抑制白細(xì)胞介素-2受體的表達(dá)，但不影響抑制型T細(xì)胞的活化。其口服制劑于1994年在美國首次上市。本品有如下特點:①該藥的免疫抑制作用無論在體外還是在體內(nèi)試驗都是環(huán)孢菌素的數(shù)十倍到數(shù)百倍，在臨床上本品的有效濃度極低;②以往以環(huán)孢菌素為基礎(chǔ)的免疫抑制方案中，不可逆的慢性排斥反應(yīng)問題依然存在，增加劑量雖然有進(jìn)一步效果，但會帶來嚴(yán)重的不良反應(yīng)，而他克莫司可減少肝腎移植受體的急、慢性排斥反應(yīng)，其中用于腎移植后的急性排斥率只有14%，低于環(huán)孢菌素(32%)。③用他克莫司的患者，細(xì)菌和病毒感染率也較環(huán)孢菌素治療者的低，尤其對肝移植的功效高100倍，因而大大降低了臨床使用劑量，治療費用可降至原來的1/3?1/2，同時不良反應(yīng)也明顯降低，此外它還具有低死亡率、高移植存活率、移植物具有良好成功率及對類留醇的相對非依賴性等優(yōu)點。
[0004]他克莫司除了在抑制器官移植排斥反應(yīng)方面具有顯著療效外，還廣泛應(yīng)用于斑禿、牛皮癬、銀肩病、魚鱗病、糖尿病、白塞氏病、變應(yīng)性皮炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及多發(fā)性硬化病等自身免疫疾病的治療。
[0005]目前，在他克莫司發(fā)酵液的浸提階段存在兩個主要難題:一是他克莫司浸提溶劑用量大，成本高;二是浸提收率普遍不高，均在90 %以下。
[0006]專利CN102936253A公開了一種浸提他克莫司的方法，發(fā)酵液預(yù)處理后直接采用中等極性的溶媒浸提，由于菌餅含水量高，勢必造成溶媒用量大且后續(xù)回收困難。
[0007]專利CN101481715B公開了他克莫司的提取方法，發(fā)酵液利用板框壓濾機(jī)過濾，收集菌體，將濾餅轉(zhuǎn)入提取罐，使用丙酮等溶液作為浸提溶劑，浸提一次后收集濾液，再將濾渣使用上述方法進(jìn)行二次浸提，收集二次浸提后的濾餅并將濾渣繼續(xù)循環(huán)上述步驟，總浸提3-4次后合并每次浸提得到濾液。但是采用上述方法一方面浸提工序復(fù)雜，勞動強度大，浸提周期長，生產(chǎn)效率低。另一方面浸提方法所用有機(jī)溶劑使菌體脫水，容易結(jié)塊，他克莫司溶出不均勻，且浸提量較少，浸提收率不理想。
[0008]當(dāng)代流化床技術(shù)應(yīng)用范圍非常的廣泛，在生物方面主要有污水處理、蛋白分離、以及植物、微生物中有效成分的提取分離。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]為了解決他克莫司浸提收率不高及提純過程中溶媒用量大，工藝步驟繁瑣的缺陷，浸提收率低等缺點，發(fā)明人經(jīng)過大量的試驗，提供了一種流化床浸提他克莫司浸提新工藝。具體包括發(fā)酵液的預(yù)處理、菌餅閃蒸干燥、菌體流化床浸提。
[0010]菌粉加入流化介質(zhì)如石英砂、陶瓷球、高鋁礬土，在溶劑作用下，這些介質(zhì)與菌體絮凝成一定密度的顆粒，在一定條件下，能夠達(dá)到流化床的狀態(tài)，因為石英砂、高招鞏土、超瓷球，都能起著很好絮凝作用，從而可以增加菌體的密度，不至于菌體漂浮在床層上面而流出，以保證流出浸提液澄清。在流化床下部通入向上流動的有機(jī)溶劑，增加溶劑流速，使菌體顆粒床高度不斷膨脹，直到達(dá)到一定的膨脹比例而處于穩(wěn)定分層狀態(tài)，這種狀態(tài)更有利于從菌體中浸提他克莫司，研究發(fā)現(xiàn)菌體在流化狀態(tài)下比在攪拌浸提狀態(tài)下浸提效果好，流化床浸提收率可達(dá)94%以上;并且流化床浸提是采用循環(huán)浸提，這樣就可以節(jié)省大量的溶劑，縮短浸提時間?？傊?，相比較多次浸提而言流化床浸提更有效率。
[0011 ]本發(fā)明的技術(shù)方案包括如下步驟:
[0012]a.發(fā)酵液預(yù)處理及菌體收集:微生物發(fā)酵液是鏈霉菌發(fā)酵得到的發(fā)酵液;將鏈霉菌發(fā)酵液預(yù)處理后，用板框壓濾機(jī)過濾得到菌體；
[0013]b.閃蒸干燥:將菌體送入閃蒸干燥機(jī)進(jìn)行干燥，制成含他克莫司的菌粉；
[0014]c.流化床的浸提:按重量比向菌粉中加入一定量的流化床介質(zhì)混合均勻，裝流化床層析柱，用有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑和水的混合溶液循環(huán)浸提流化床菌體物，循環(huán)一定時間后，再用有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑和水的混合溶液置換出流化床里的他克莫司，最終得含他克莫司浸提液。所述有機(jī)溶劑和水的混合溶液都是新配置的。
[0015]本發(fā)明對步驟a中菌種進(jìn)行了篩選，篩選后的菌株是吸水鏈霉菌(ACCC N0.40417)菌株。其他菌株在使用本發(fā)明方法時，也可以顯著提高收率。
[0016]本發(fā)明對步驟a中發(fā)酵液的預(yù)處理工藝進(jìn)行了優(yōu)選，優(yōu)選地，發(fā)酵預(yù)處理液工藝為按質(zhì)量kg體積L比計，加入I %的氯化鈣，再加入I %的硫酸鋅，攪拌I小時。
[0017]本發(fā)明對步驟b中閃蒸干燥制備菌粉的工藝進(jìn)行了優(yōu)選，優(yōu)選地，閃蒸干燥制備的菌粉含水量為3%?10 %。
[0018]本發(fā)明對步驟c中浸提所用有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、丙酮或叔丁基甲基醚中的一種。所用有機(jī)溶劑與水的混合溶液為以體積比計，含水量少于20%的下列混合溶液中的一種:甲醇和水的混合溶液、乙醇和水的混合溶液、丙酮和水的混合溶液、叔丁基甲基醚和水的混合溶液;進(jìn)一步優(yōu)選為含水量10%的甲醇和水的混合溶液，含水量5 %的乙醇和水的混合溶液，含水量8 %的丙酮和水的混合溶液，含水量8 %的叔丁基甲基醚和水的混合溶液。
[0019]本發(fā)明對步驟c浸提所用流化床介質(zhì)進(jìn)行了優(yōu)選，優(yōu)選自石英砂、陶瓷球、高鋁礬土中的一種。
[0020]本發(fā)明對步驟c中浸提所用流化床介質(zhì)用量進(jìn)行了優(yōu)選，優(yōu)選地，菌粉浸提所用流化床介質(zhì)用量為菌體的質(zhì)量的15%?25%。
[0021 ] 優(yōu)選地，步驟c中流化床的浸提溶劑應(yīng)從柱底部進(jìn)入，從上端流出。
[0022]步驟c中流化床，其載體為兩端可封閉并且耐受有機(jī)溶劑的圓柱形層析柱；
[0023]優(yōu)選地，所述流化床層析柱的高度和直徑之比應(yīng)在2-8之間；
[0024]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述流化床其介質(zhì)在層析柱中的裝量應(yīng)不低于層析柱總體積的三分之二。
[0025]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下突出的優(yōu)點:
[0026]①溶劑用量少，步驟簡單，易于操作；
[0027]②他克旲司浸提收率尚，有利于后續(xù)廣品的純化；
[0028]③設(shè)備投資少，環(huán)境污染少，符合清潔生產(chǎn)的要求。
【具體實施方式】
[0029]以下通過具體實施例進(jìn)一步描述本發(fā)明，但本發(fā)明所要保護(hù)的技術(shù)方案不僅僅限于以下實施例。
[0030]實施例1:
[0031]取吸水鏈霉菌(ACCC N0.40417)菌株他克莫司發(fā)酵液100L，其中發(fā)酵單位350mg/L(HPLC測定)，分別加入Ikg氯化鈣、Ikg硫酸鋅，攪拌I小時，經(jīng)板框壓濾機(jī)過濾，收集菌餅;將菌餅送入閃蒸干燥機(jī)進(jìn)行干燥，得含他克莫司的菌粉I lkg，含水量為3%。向菌粉中加入2.75kg石英砂，混勻，干法裝入兩端可封閉并且耐受有機(jī)溶劑的圓柱形層析柱內(nèi)，從層析柱底閥向上通入新配置的含水量5%的乙醇和水混合溶液，控制適當(dāng)?shù)牧魉?，使床層翻騰起來，浸提循環(huán)I小時，停止循環(huán)。換用新配置的含水量5%的乙醇和水混合溶液置換出層析柱內(nèi)含有他克莫司的溶液，共收集浸提液95L。浸提液經(jīng)HPLC檢測他克莫司含量，收率為97.3%。有機(jī)溶劑總用量在100L左右即可，不需要過多加入，根據(jù)流化床和菌粉因素綜合考慮加入量即可。
[0032]實施例2:
[0033]取吸水鏈霉菌(ACCC N0.40417)菌株他克莫司發(fā)酵液100L，其中發(fā)酵單位340mg/L(HPLC測定)，分別加入Ikg氯化鈣、Ikg硫酸鋅，攪拌I小時，經(jīng)板框壓濾機(jī)過濾，收集菌餅;將菌餅送入閃蒸干燥機(jī)進(jìn)行干燥，得含他克莫司的菌粉15kg，含水量為6%。向菌粉中加入2.25kg陶瓷球，混勻，干法裝入兩端可封閉并且耐受有機(jī)溶劑的圓柱形層析柱內(nèi)，從層析柱底閥向上通入新配置的含水量20 %的甲醇和水混合溶液，控制適當(dāng)?shù)牧魉伲勾矊臃v起來，浸提循環(huán)I小時，停止循環(huán)。換用新配置的含水量20%的甲醇和水混合溶液置換出層析柱內(nèi)含有他克莫司的溶液，共收集乙醇浸提液98L ο浸提液經(jīng)HPLC檢測他克莫司含量，收率為 94.6%0
[0034]實施例3:
[0035]取吸水鏈霉菌(ACCC N0.40417)菌株他克莫司發(fā)酵液100L，其中發(fā)酵單位336mg/L(HPLC測定)，分別加入Ikg氯化鈣、Ikg硫酸鋅，攪拌I小時，經(jīng)板框壓濾機(jī)過濾，收集菌餅;將菌餅送入閃蒸干燥機(jī)進(jìn)行干燥，得含他克莫司的菌粉10kg，含水量為3%。向菌粉中加入
2.0kg高鋁礬土，混勻，干法裝入兩端可封閉并且耐受有機(jī)溶劑的圓柱形層析柱內(nèi)，從層析柱底閥向上通入丙酮，控制適當(dāng)?shù)牧魉?，使床層翻騰起來，浸提循環(huán)I小時，停止循環(huán)。再用丙酮置換出層析柱內(nèi)含有他克莫司的溶液，共收集浸提液92L。浸提液經(jīng)HPLC檢測他克莫司含量，收率為96.2%。
[0036]實施例4:
[0037]取吸水鏈霉菌(ACCC N0.40417)菌株他克莫司發(fā)酵液100L，其中發(fā)酵單位302mg/L(HPLC測定)，分別加入Ikg氯化鈣、Ikg硫酸鋅，攪拌I小時，經(jīng)板框壓濾機(jī)過濾，收集菌餅;將菌餅送入閃蒸干燥機(jī)進(jìn)行干燥，得含他克莫司的菌粉12kg，含水量為1 %。向菌粉中加入
2.4kg陶瓷球，混勻，干法裝入兩端可封閉并且耐受有機(jī)溶劑的圓柱形層析柱內(nèi)，從層析柱底閥向上通入新配置的含水量8%的叔丁基甲基醚與水的混合溶液，控制適當(dāng)?shù)牧魉?，使床層翻騰起來，浸提循環(huán)I小時，停止循環(huán)。換用新配置的含水量8%的叔丁基甲基醚與水的混合溶液置換出層析柱內(nèi)含有他克莫司的溶液，共收集浸提液96L ο浸提液經(jīng)HPLC檢測他克莫司含量，收率為97.4%。
[0038]實施例5:
[0039]取吸水鏈霉菌(ACCC N0.40417)菌株他克莫司發(fā)酵液100L，其中發(fā)酵單位321mg/L(HPLC測定)，分別加入Ikg氯化鈣、Ikg硫酸鋅，攪拌I小時，經(jīng)板框壓濾機(jī)過濾，收集菌餅;將菌餅送入閃蒸干燥機(jī)進(jìn)行干燥，得含他克莫司的菌粉17kg，含水量為1 %。向菌粉中加入3.06kg石英砂，混勻，干法裝入兩端可封閉并且耐受有機(jī)溶劑的圓柱形層析柱內(nèi)，從層析柱底閥向上通入新配置的含水量10%的甲醇和水的混合溶液，控制適當(dāng)?shù)牧魉?，使床層翻騰起來，浸提循環(huán)I小時，停止循環(huán)。換用新配置的含水量10%的甲醇和水的混合溶液置換出流化床里含有他克莫司的溶液，共收集浸提液93L。浸提液經(jīng)HPLC檢測他克莫司含量，收率為97.1% 0
[0040]實施例6:
[0041 ] 取吸水鏈霉菌(ACCC N0.40417)菌株他克莫司發(fā)酵液100L，其中發(fā)酵單位347mg/L(HPLC測定)，分別加入Ikg氯化鈣、Ig硫酸鋅，攪拌I小時，經(jīng)板框壓濾機(jī)過濾，收集菌餅;將菌餅送入閃蒸干燥機(jī)進(jìn)行干燥，得含他克莫司的菌粉15kg，含水量為8%。向菌粉中加入3.45kg高鋁礬土，混勻，干法裝入兩端可封閉并且耐受有機(jī)溶劑的圓柱形層析柱內(nèi)，從層析柱底閥向上通入新配置的含水量8%的丙酮和水的混合溶液，控制適當(dāng)?shù)牧魉?，使床層翻騰起來，浸提循環(huán)I小時，停止循環(huán)。換用新配置的含水量8%的丙酮和水的混合溶液置換出層析柱內(nèi)含有他克莫司的溶液，共收集浸提液94L。浸提液經(jīng)HPLC檢測他克莫司含量，收率為96.7%。
[0042]對比實施例1:
[0043]取吸水鏈霉菌(ACCC N0.40417)菌株他克莫司發(fā)酵液100L，其中發(fā)酵單位332mg/L(HPLC測定)，分別加入Ikg氯化鈣、Ikg硫酸鋅，攪拌I小時，經(jīng)板框壓濾機(jī)過濾，收集菌餅;將菌餅送入閃蒸干燥機(jī)進(jìn)行干燥，得含他克莫司的菌粉13kg，含水量為6%。向菌粉中加入
3.9kg陶瓷球，混勻，干法裝入兩端可封閉并且耐受有機(jī)溶劑的圓柱形層析柱內(nèi)，從層析柱底閥向上通入新配置的含水量為30%的乙醇和水的混合溶液，控制適當(dāng)?shù)牧魉?，使床層翻騰起來，浸提循環(huán)I小時，停止循環(huán)。換用新配置的含水量為30%的乙醇和水的混合溶液置換出層析柱內(nèi)含有他克莫司的溶液，共收集浸提液98L。浸提液經(jīng)HPLC檢測他克莫司含量，收率為81.2%。
[0044]對比實施例2:
[0045]取吸水鏈霉菌(ACCC N0.40417)菌株他克莫司發(fā)酵液100L，其中發(fā)酵單位318mg/L(HPLC測定)，分別加入Ikg氯化鈣、Ikg硫酸鋅，攪拌I小時，經(jīng)板框壓濾機(jī)過濾，收集菌餅;將菌餅送入閃蒸干燥機(jī)進(jìn)行干燥，得含他克莫司的菌粉12kg，含水量為13 %。向菌粉中加入
1.2kg高鋁礬土，混勻，干法裝入兩端可封閉并且耐受有機(jī)溶劑的圓柱形層析柱內(nèi)，從層析柱底閥向上通入新配置的含水量40%的甲醇和水的混合溶液，控制適當(dāng)?shù)牧魉?，使床層翻騰起來，浸提循環(huán)I小時，停止循環(huán)。換用新配置的含水量40%的甲醇和水的混合溶液置換出層析柱內(nèi)含有他克莫司的溶液，共收集浸提液96L。浸提液經(jīng)HPLC檢測他克莫司含量，收率為78.5%。
[0046]對比實施例3:
[0047]取吸水鏈霉菌(ACCC N0.40417)菌株他克莫司發(fā)酵液100L，其中發(fā)酵單位319mg/L(HPLC測定)，分別加入Ikg氯化鈣、Ikg硫酸鋅，攪拌I小時，經(jīng)板框壓濾機(jī)過濾，收集菌餅;得到19.6kg菌絲體。在此菌絲體中加入196L的乙酸乙酯，浸泡、攪拌Ih后經(jīng)板框壓濾機(jī)過濾；重復(fù)浸提兩次，并收集他克莫司浸提液380L。浸提液經(jīng)HPLC檢測他克莫司含量，收率為88.0%。
[0048]對比實施例4:
[0049]取吸水鏈霉菌(ACCC N0.40417)菌株他克莫司發(fā)酵液100L，其中發(fā)酵單位322mg/L(HPLC測定)，分別加入Ikg氯化鈣、Ikg硫酸鋅，攪拌I小時，經(jīng)板框壓濾機(jī)過濾，收集菌餅;得到19.8kg菌絲體。在此菌絲體中加入50L的乙酸乙酯，浸泡、攪拌Ih后經(jīng)板框壓濾機(jī)過濾;重復(fù)浸提兩次，并收集他克莫司浸提液102L。浸提液經(jīng)HPLC檢測他克莫司含量，收率為70.0%。
[0050]總有機(jī)溶劑用量與本申請實施例1-6基本相同的情況下，單純使用極性溶劑浸提，收率只有70%左右。
[0051 ] 對比實施例5:
[0052]取吸水鏈霉菌(ACCC N0.40417)菌株他克莫司發(fā)酵液100L，其中發(fā)酵單位345mg/L(HPLC測定)，加入珍珠巖適量，攪拌30min，經(jīng)板框過濾機(jī)過濾，收集菌餅，加2倍體積丙酮浸提攪拌3h，離心；菌絲體如上方法再提取兩次，收集每次所得丙酮浸提液共176L。浸提液經(jīng)HPLC檢測他克莫司含量，收率為72.4%。
【主權(quán)項】
1.一種他克莫司浸提方法，具體包括如下步驟: a.發(fā)酵液預(yù)處理及菌體收集:微生物發(fā)酵液是鏈霉菌培養(yǎng)得到的發(fā)酵液;將鏈霉菌發(fā)酵液預(yù)處理后，用板框壓濾機(jī)過濾得到菌體； b.閃蒸干燥:將菌體送入閃蒸干燥機(jī)進(jìn)行干燥，制成含他克莫司的菌粉； c.流化床的浸提:按重量比向菌粉中加入一定量的流化床介質(zhì)混合均勻，裝流化床柱，用有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑與水的混合溶液循環(huán)浸提流化床菌體物，循環(huán)一定時間后，再用有機(jī)溶劑或有機(jī)溶劑與水的混合溶液置換出流化床里含他克莫司的溶液，最終得含他克莫司的浸提液。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特在于，步驟a所述鏈霉菌是吸水鏈霉菌(ACCCN0.40417)菌株。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟a中發(fā)酵液預(yù)處理是按質(zhì)量kg/體積L計，加入I %的氯化鈣，再加入I %硫酸鋅，攪拌I小時。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟b中閃蒸干燥制備的菌粉含水量為3%?10%。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟c中浸提所用有機(jī)溶劑為甲醇、乙醇、丙酮或叔丁基甲基醚中的一種。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟c中浸提所用有機(jī)溶劑與水的混合溶液為以體積比計含水量少于20%的下列混合溶液中的一種:甲醇和水的混合溶液、乙醇和水的混合溶液、丙酮和水的混合溶液、叔丁基甲基醚和水的混合溶液;進(jìn)一步優(yōu)選為含水量10 %的甲醇和水的混合溶液，含水量5 %的乙醇和水的混合溶液，含水量8 %的丙酮和水的混合溶液，含水量8 %的叔丁基甲基醚和水的混合溶液。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟c中菌粉浸提所用流化床，其介質(zhì)選自石英砂、陶瓷球、高鋁礬土中的一種。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟c中菌粉浸提所用流化床介質(zhì)的質(zhì)量為菌體質(zhì)量的15%?25%。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟c中流化床的浸提溶劑應(yīng)從柱底部進(jìn)入，從上端流出。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟c中流化床，其載體為兩端可封閉并且耐受有機(jī)溶劑的圓柱形層析柱;優(yōu)選地，所述流化床層析柱的高度和直徑之比應(yīng)在2-8之間；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述流化床其介質(zhì)在層析柱中的裝量應(yīng)不低于層析柱總體積的三分之--O
【文檔編號】C07D498/18GK106046023SQ201610411370
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月10日
【發(fā)明人】張貴民, 李建濤, 孫穎, 馬魯南
【申請人】山東新時代藥業(yè)有限公司