一種兩棲類動(dòng)物來源緩激肽及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是一種海南湍蛙緩激肽bradykinin?AH及其應(yīng)用。海南湍蛙緩激肽bradykinin?AH為直鏈多肽，分子量1269.4Da，等電點(diǎn)9.6。本發(fā)明克隆得到海南湍蛙緩激肽bradykinin?AH的編碼基因，并利用化學(xué)合成的方法合成了bradykinin?AH。該緩激肽具有極強(qiáng)的促進(jìn)離體豚鼠回腸肌收縮的活性。
【專利說明】
一種兩棲類動(dòng)物來源緩激肽及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是一種海南端娃緩激肽bradykinin-AH 及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 緩激肽是激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)中一種主要的激肽類物質(zhì)，在體內(nèi)參與多系統(tǒng)器 官的功能調(diào)節(jié)和病理生理過程，如心血管、腎臟、中樞神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，葡萄糖代謝、細(xì)胞增 殖、平滑肌收縮、炎癥、疼痛休克和組織損傷等過程。人體中緩激肽為一種血管活性九肽，由 激肽釋放酶直接降解激肽原或者由賴氨酰舒緩激肽轉(zhuǎn)變而來。緩激肽通過與靶細(xì)胞緩激肽 受體結(jié)合發(fā)揮作用。人體中緩激肽受體有B1和B2兩種，B1受體在正常生理情況下不存在，但 在炎癥和組織損傷后可誘發(fā)表達(dá)，參與炎癥過程。B2受體在外周分布較廣，血管/非血管平 滑肌及心肌細(xì)胞上均有分布，緩激肽與B2受體的結(jié)合能夠促進(jìn)平滑肌收縮，促進(jìn)血管擴(kuò)張， 降血壓。
[0003] 兩棲類動(dòng)物皮膚中含有豐富的激肽類物質(zhì)，目前為止從兩棲類動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)多種均 有緩激肽功能的多肽。雖然與哺乳動(dòng)物緩激肽結(jié)構(gòu)差異較大，但兩棲動(dòng)物緩激肽同樣具有 促進(jìn)平滑肌收縮和降血壓的功能，具有一定的藥物開發(fā)潛力。
[0004] 海南端娃(Amolops hainanensis)屬于兩棲綱無尾目娃科端娃屬，主要分布于海 南省。到目前為止尚無關(guān)于海南湍蛙緩激肽的相關(guān)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種海南端娃緩激肽bradykinin-AH及其應(yīng)用。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0007] -種海南端娃緩激肽bradykinin-AH，海南端娃緩激肽bradykinin-AH為直鏈多 肽，分子量1269.4Da，等電點(diǎn)9.6。
[0008] 所述海南端娃緩激肽bradykinin-AH氨基酸序列為：
[0009] Arg1 Ala2 Asp3 Gly4 Pro5 Pro6 Gly7 Phe8 Ser9 Pro10 Leu11 Arg12。
[0010] 所述編碼海南端娃緩激肽bradykinin-AH前體為SEQ ID No. 1所示堿基序列。
[0011] 所述編碼海南湍蛙緩激肽bradykinin-AH前體的基因由303個(gè)核苷酸組成，自5 '端 至3'端序列為：
[0018] -種海南端娃緩激肽bradykinin-AH的應(yīng)用，其特征在于：所述海南端娃緩激肽 bradykinin-AH在用于制備促血管擴(kuò)張和降血壓藥物中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明所具有的優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明克隆得到海南端娃緩激肽bradykinin-AH的編碼基 因，并利用化學(xué)合成的方法合成了bradykinin-AH。該緩激肽具有極強(qiáng)的促進(jìn)離體豚鼠回腸 肌收縮的活性。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例提供的不同濃度bradykinin-AH促進(jìn)離體豚鼠回腸肌收縮的 作用曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
[0021 ]下面用實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于 此。
[0022] 實(shí)施例1
[0023] 海南端娃緩激肽bradykinin-AH基因克?。?br>[0024] 1)海南湍蛙皮膚總RNA提取：
[0025]①取300mg海南湍蛙皮膚組織，放入研缽中加入液氮研磨成粉末，轉(zhuǎn)移到EP管中， 加入lml總RNA提取緩沖液（Trizol，美國Invitrogen公司產(chǎn)品），充分混勻，而后于4°C， 12000rpm離心 1 Omin。
[0026]②離心取上清，加入0.2ml氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置10分鐘，而后以4°C， 12000rpm離心10分鐘，棄除沉淀。
[0027]③上清加入等體積的異丙醇，室溫放置10分鐘，以4°C，12000rpm離心10分鐘，收集 沉淀用75 % (V/V)乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即為海南湍蛙皮膚總RNA。
[0028] 2)海南湍蛙皮膚cDNA文庫構(gòu)建：采用CL0NTECH公司In-Fusion SMARTer ? Directional cDNA Library Construction Kit。
[0029] (1)CDNA第一鏈合成(mRNA反轉(zhuǎn)錄）：
[0030] ①經(jīng)DEPC處理(DEPC處理是在含0.1%(V/V)DEPC的水浸泡過夜，高壓滅菌，烘干） 的離心管中加入ΙμL海南湍蛙皮膚總RNA、lyl 3'端一鏈合成引物（3'In-Fusion SMARTer CDS Primer)和2.5μ1經(jīng)DEPC處理(DEPC處理是將含0.1 % (V/V)DEPC的水，放置過夜，高壓滅 菌）的水使總體積達(dá)到4.5μ1，混勻后短暫離心（2000rpm，30s)，離心后于72°C保溫3分鐘;保 溫后再將離心管在42 °C孵育2分鐘。
[0031] ②在上述離心管中加入以下試劑（均為CL0NTECH公司In-Fusion SMARTer ? Directional cDNA Library Construction Kit建庫試劑盒中配備），2 · 0μ1 5 X 第一鏈緩 沖液、0·25μ1 100mM DTT、1.0yl 10mM dNTP Mix、1.0yl SMARTer V Oligonucleotide、 0·25μ1 RNase Inhibitor和1·0μ1 SMARTScribe Reverse Transcriptase反轉(zhuǎn)錄酶，混合 離心管中試劑并短暫離心（2000rpm，30s)，在42°C保溫90min，然后68°C保溫10min。保溫處 理后將離心管置于冰上中止第一鏈的合成。從離心管取2μ1所合成的cDNA第一鏈備用。
[0032] (2)采用長末端聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（LD-PCR)方法擴(kuò)增第二鏈（所用試劑均為 CL0NTECH公司In-Fusion SMARTer ? Directional cDNA Library Construction Kit建庫 試劑盒中配備）
[0033] ①將2μ1 cDNA第一鏈(mRNA反轉(zhuǎn)錄）、80μ1 去離子水、10μ1 10 X Advantage 2PCR緩 沖液、2μ1 50XdNTP混合物、2μ1 5'PCR引物、2μ1 CDS III/3'PCR引物以及2μ1 50X Advantage 2Polymerase Mix在95°C預(yù)熱的PCR管中進(jìn)行混合。
[0034] ②在 PCR 儀中按以下程序擴(kuò)增：95°(：，1111丨11;18個(gè)循環(huán)：95°(：，1586(3,65°(：，3〇86(3,68 °C，6min。循環(huán)結(jié)束后，將離心管中合成的cDNA雙鏈一80 °C保存。
[0035] (3)海南端娃緩激肽bradykinin-AH基因克隆篩選：
[0036]根據(jù)蛙科緩激肽編碼基因信號(hào)肽區(qū)保守序列設(shè)計(jì)正向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其序列 為5 '-CCAAAGATGTTCACCTTGAAG-3 '，PCR另一擴(kuò)增引物為CL0NTECH公司 In-Fus ion SMARTer ? Directional cDNA Library Construction Kit中的3'_PCR引物，其序列為5'-CGGGGTACGATGAGACACCAT-3' ICR反應(yīng)在如下條件下進(jìn)行：94°C4min，94°C30sec，57°C30sec 和72°Clmin，30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增完成后用膠回收試劑盒(天根生物)進(jìn)行目的片段回收。將回收 的目的片段連接到PMD19-T載體(Takara，大連），轉(zhuǎn)化進(jìn)CaCl 2-MgCl2法制備好的DH5a感受態(tài) 細(xì)胞。涂板并進(jìn)行氨芐青霉素和藍(lán)白斑雙重篩選，挑取單菌落用M13引物PCR檢測插入片段 大小。挑取陽性菌落，搖菌提取質(zhì)粒，使用Applied Biosystems DNA sequencer,model ABI PRISM 377進(jìn)行核苷酸測序。
[0037]測定結(jié)果：
[0038] 編碼海南湍蛙緩激肽bradykinin-AH前體的基因自5'端至3'端序列SEQ ID No.l 所示：
[0045] (a)序列特征：
[0046] *長度:303堿基對(有效長度為130-165堿基對）
[0047] *類型：核苷酸
[0048] *鏈型:單鏈
[0049] *拓?fù)浣Y(jié)構(gòu):直鏈狀
[0050] (b)分子類型：cDNA
[0051] (c)假設(shè):否
[0052] ⑷反義:否
[0053] (e)最初來源:海南端娃
[0054] 實(shí)施例2
[0055] 海南端娃緩激肽bradykinin-AH的化學(xué)合成：
[0056] I、海南端娃緩激肽bradykinin-AH的化學(xué)合成方法:根據(jù)基因推導(dǎo)的成熟肽氨基 酸序列，用自動(dòng)多肽合成儀(433A,Applied Biosystems)合成其全序列，通過HPLC反相柱層 析脫鹽。
[0057] Π 、分子量測定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-T0F)。
[0058] ΙΠ 、純化的海南湍蛙緩激肽bradykinin-AH用高效液相色譜HPLC方法鑒定其純度， 分子量測定采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-T0F)，等電聚焦電泳測定等 電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測序儀測定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。
[0059] 海南湍蛙緩激肽bradykinin-AH是基因編碼的一種直鏈多肽，含有十二個(gè)氨基酸 殘基，1 269 . 4Da，等電點(diǎn)9 . 6。海南湍蛙緩激肽bradykinin-AH全序列為： ArgiAlalspMly^rc^Prc^GlytheSSei^Prc/QLeuHArg12。
[0060] 實(shí)施例3
[0061 ] 海南湍蛙緩激肽bradykinin-AH活性實(shí)驗(yàn)：
[0062] 1.海南湍蛙緩激肽bradykinin-AH促回腸肌收縮活性檢測：
[0063] 取豚鼠（體重在150-250g，性別隨機(jī)）約10cm長的末端回腸肌，迅速放入臺(tái)式液中 (臺(tái)式液為 137mM NaCl，2.7mM KCl，1.36mM CaCl2,0.49mM MgCl2,0.36mM NaH2P〇4，11.9mM NaHC03，5.04mM D-葡萄糖）。將離體豚鼠回腸肌在臺(tái)式溶液中切成2cm的片段，通入空氣，加 載1 g的砝碼，37 °C保溫，待肌肉收縮舒張穩(wěn)定后，加入終濃度為0、2、4、8、16、32ng/ml的 bradykinin-AH樣品經(jīng)信號(hào)處理系統(tǒng)測定離體豚鼠回腸肌收縮狀態(tài)(參見圖1)。信號(hào)收集與 處理采用北京微信斯達(dá)科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)的PcLab生物信號(hào)處理系統(tǒng)。
[0064]結(jié)果如圖1所示，bradykinin-AH具有極強(qiáng)的促進(jìn)離體豚鼠回腸肌收縮的活性，且 其活性具有濃度依賴性，隨著多肽濃度的升高，其活性逐漸增強(qiáng)。
[0065] 2.海南湍蛙緩激肽bradykinin-AH溶血活性測定：
[0066] 將離體人血與阿氏液按1:1混合抗凝得混合液，而后采用生理鹽水洗滌2次，并用 生理鹽水重懸上述抗凝的混合液成107-108cel Ι/ml的懸浮液。上述懸浮液(紅細(xì)胞懸液)與 溶解于生理鹽水的海南湍蛙緩激肽bradykinin-AH樣品混合，使樣品終濃度為200μg/ml，37 °C保溫30min，再于lOOOrpm離心5min，上清液于540nm測吸收值。陰性對照使用生理鹽水，陽 性對照使用T r i t ο η X -10 0，溶血百分比按以下公式計(jì)算：溶血百分比Η % = Affia-Ap朋》源/ 細(xì)麵X 100% 〇
[0067] 結(jié)果表明樣品濃度為200μg/ml時(shí)，bradykinin-AH的溶血百分比為4.5%，說明 bradykinin-AH具有極低的溶血活性，不會(huì)引起人體紅細(xì)胞破裂溶解而對人體產(chǎn)生傷害，因 此十分利于其在醫(yī)藥領(lǐng)域進(jìn)一步的開發(fā)應(yīng)用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種海南端娃緩激肽bradykinin-AH，其特征在于:海南端娃緩激肽bradykinin-AH 為直鏈多肽，分子量1269.4Da，等電點(diǎn)9.6。2. 按權(quán)利要求1所述海南端娃緩激肽bradykinin-AH，其特征在于:所述海南端娃緩激 肽bradykinin-AH氨基酸序列為： Arg1 Ala2 Asp3 Gly4 Pro5 Pro6 Gly7 Phe8 Ser9 Pro1。Leu11 Arg12。3. 按權(quán)利要求1或2所述海南端娃緩激肽bradykinin-AH，其特征在于:所述編碼海南端 娃緩激肽bradykinin-AH前體為SEQ ID No. 1所示堿基序列。4. 一種權(quán)利要求1所述的海南端娃緩激肽bradykinin-AH的應(yīng)用，其特征在于:所述海 南湍蛙緩激肽bradykinin-AH在用于制備促血管擴(kuò)張和降血壓藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P9/12GK106046122SQ201610380187
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月1日
【發(fā)明人】王愛麗
【申請人】濰坊科技學(xué)院