一種控制水稻株高或葉片直立性發(fā)育的基因及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種控制水稻株高或葉片直立性發(fā)育的基因及其應(yīng)用，本發(fā)明的公開的基因RLA1在水稻油菜素甾醇的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中起重要作用，其CDS序列為SEQ ID NO.1所示，編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO.2所示。利用RNA干擾技術(shù)特異性的將野生型日本晴的RLA1基因敲除掉，所獲得的轉(zhuǎn)基因系均表現(xiàn)為莖葉夾角比野生型要小，株高變矮，因此通過基因工程技術(shù)提高或減弱RLA1基因的表達量能夠控制植物株型發(fā)育，從而改善植物株高和種植密度。
【專利說明】
一種控制水稻株高或葉片直立性發(fā)育的基因及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體涉及一種控制水稻植株高矮及葉片直立性發(fā)育的基因，采用正向遺傳學(xué)的方法，一個直立矮化的突變體出發(fā)，構(gòu)建分離群體進行圖位克隆獲得相關(guān)基因RLAl (0s05g32270)，并且轉(zhuǎn)基因驗證發(fā)現(xiàn)過表達和RNA干擾RLAl均證明RLAl控制水稻株型或葉片直立性發(fā)育。本發(fā)明還涉及含有該基因或其同源基因的載體和涉及利用該基因或其功能類似物調(diào)控植物株高和葉片直立性在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]作物的株型發(fā)育是高產(chǎn)育種的關(guān)鍵性狀。植株的高矮和葉片直立性(莖葉夾角的大小)是株型發(fā)育的重要性狀，較矮的株型抗倒伏，合適的莖葉夾角能使我們通過提高作物的田間種植密度，進而促進光能利用率，增加作物產(chǎn)量(Sakamoto et al.,2006；Sinclairet al.，1999)。因此，發(fā)現(xiàn)和利用影響植株高矮及葉片直立性(莖葉夾角大小)的關(guān)鍵基因的最終目是改進水稻株型，促進分子設(shè)計育種，提高水稻單位面積產(chǎn)量。
[0003]油菜素留醇的合成和信號通路在調(diào)控單子葉植物植株的高矮和莖葉夾角發(fā)育中具有重要而獨特的作用，但其下的細胞學(xué)和分子機制還不清楚。已報道的BR合成相關(guān)的突變體d2、dwarf4、，dll和brd2均表現(xiàn)為植株矮小，莖葉夾角變小，葉片直立(Li et al.，2013；Hong et al.,2003,2005；Tanabe et al.，2005) AR信號通路中的正調(diào)控因子的缺失突變體也表現(xiàn)為莖葉夾角變小，葉片直立。如突變體d61，dlt，dl和tudl(Yamamuro et al.，2000； Tong et al.，2012;0ki et al.,2009； Hu et al.，2013)。利用同源克隆的方法得到的0sBAKl、0sGSK2的轉(zhuǎn)基因植株的莖葉夾角大小也發(fā)生變化(Li et al2009 ； Tong etal.，2012)。利用RNA干擾技術(shù)抑制水稻BR信號通路下游的正調(diào)節(jié)因子OsBZRl基因的表達，也會促進葉片直立(Bai et al.，2007)。而BR信號通路的負調(diào)節(jié)因子LIC的功能獲得型突變體Iic-1也表現(xiàn)為莖葉夾角變小，葉片直立(Zhang et al.，2012)。而被OsBZRl調(diào)節(jié)的ILIl的功能獲得型突變體i Ii 1-D，由于BR信號被放大，則表現(xiàn)為葉夾角增大(Zhang et al.，2009)。另外，水稻OsBZRl的靶基因OsIBHl也直接參與了對水稻葉片直立性的調(diào)節(jié)(Zhanget al.,2009);外施BR處理導(dǎo)致野生型和BR合成途徑突變體的葉片傾角變大，而BR信號突變體如受體突變體d61的葉片傾角幾乎不受外源BR的影響。
[0004]除了油菜素留醇途徑，其他信號途徑也參與了莖葉夾角的調(diào)控。雖然BR相關(guān)途徑基因在參與調(diào)控水稻葉片傾角變化方面具有顯著作用，但是還存在其它獨立途徑參與此生物性狀的調(diào)控。負調(diào)控赤霉素(GAs)信號的基因SPINDLY (SPY)的表達量下降后莖葉夾角增大(Shimada et al.，2006)。而生長素信號途徑負調(diào)節(jié)因子Aux/IAA家族成員OsIAAl過表達植株莖葉片夾角變大(Song et al.，2009)。調(diào)控生長素體內(nèi)平衡的編碼生長素偶聯(lián)氨基酸的合成酶基因LCl通過調(diào)節(jié)葉枕部位細胞伸長決定水稻葉夾角大小(Zhao et al.，2013)。水稻rice leaf incl inat1n2(LC2)，一個VIN3-類似蛋白，突變后也能使莖葉夾角變大(Zhao et &1.，2010)。嫩?1(1?家族(:組成員的基因11^1在葉枕的維管束中高表達，其基因1'-DNA插入突變引起葉枕部位細胞壁主要成分纖維素和木聚糖含量下降，從而導(dǎo)致葉枕部位機械強度降低，葉夾角增大(Ning et al.，2011)。水稻中Loose Plant Architecturel(LPAl)基因的突變體Ipal表現(xiàn)為株型松散，其分蘗角和莖葉夾角均增大(Wu et al.,2013)o
[0005]育種實踐證明，水稻莖葉夾角與產(chǎn)量密切相關(guān)。利用BR相關(guān)途徑的基因作為改良水稻株型的靶基因，在生產(chǎn)上具有廣闊的應(yīng)用前景。例如，Morinaka等(2006)利用共抑制的策略，通過導(dǎo)入水稻肌動蛋白啟動子驅(qū)動的OsBRI I的胞內(nèi)區(qū)(OsACTIN:: OsBRI 1-KD)，部分抑制水稻內(nèi)源OsBRIl的表達，從而在后代中分離出直葉型的轉(zhuǎn)基因系；據(jù)估算它們通過密植可分別增產(chǎn)約35%和26%。Sakamoto等(2006)通過田間實驗證實合理密植水稻BR合成途徑0sDWARF4的突變體可增產(chǎn)達32%。通過對劍葉角度與主穗產(chǎn)量進行遺傳剖析，應(yīng)用244個珍汕97B/密陽46RIL群體，在1、3、5和11染色體上共檢測到5個控制劍葉角度的QTL，其中在第I染色體RM24-RM294A區(qū)間同時檢測到了控制劍葉角度(FLA)和結(jié)實率(SF)的QTL，且加性效應(yīng)方向相反，表明劍葉角度與產(chǎn)量呈負相關(guān)，適當(dāng)減小水稻劍葉夾角有利于結(jié)實率的提尚，并最終提尚廣量(zhang et al., 2008) ο

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種控制水稻植株高矮或葉片直立性發(fā)育的基因RLAl，該基因從水稻矮化直立突變體rial中鑒定并分離克隆，該基因包含SEQ ID N0.1所示的⑶S序列，該基因編碼SEQ.1D.N0.2所示的氨基酸序列。
[0007]本發(fā)明的另一個目的是提供RLAl基因在控制水稻株高或葉片直立性中的應(yīng)用，通過RNA干擾技術(shù)特異性的抑制RLAl基因的表達可減小莖葉夾角或株高，或同時減小水稻莖葉夾角和株高，從而改善水稻品種的株型和提高單位面積的種植密度。
[0008]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施:
[0009]—種控制水稻葉片直立性發(fā)育的基因RLAl，以日本晴⑶NA為模板，通過下述引物擴增得到:
[0010]RLAl-F: CGGGATCCATGCCGCCCTGCGCCGCC (加 BamHI 位點)
[0011 ] RLA1-R:GCTCTAGACTCTTGACCATGGAATGGATCAC(加 XBaI 位點)
[0012]最終獲得包含有SEQ ID N0.1所述核苷酸的基因序列，該基因編碼的蛋白質(zhì)為SEQID N0.2所示。
[0013]本發(fā)明的保護內(nèi)容還包括SEQID N0.2所示氨基酸序列對應(yīng)的核苷酸序列，還包括SEQ ID N0.2所示序列經(jīng)過改造修飾的具有相同功能的蛋白。
[0014]RLAl基因在控制水稻株高或葉片直立性中的應(yīng)用，包括:RLA1基因在控制水稻株高中的應(yīng)用，或RLAl基因在控制水稻葉片直立性中的應(yīng)用，或RLAI基因在控制水稻株高和葉片直立性中的應(yīng)用。
[0015]以上所述應(yīng)用中，通過抑制RLAl基因的表達以實現(xiàn)對水稻葉片直立性或水稻株高的控制的應(yīng)用過程包括:
[0016]將RLAl特異序列作為靶點構(gòu)建RNA干擾片段并連到PTCK303上，轉(zhuǎn)入日本晴中，所獲得的轉(zhuǎn)基因系均表現(xiàn)為莖葉夾角比野生型(日本晴)變小，因此可通過該方法減小莖葉夾角，以提高種植密度。RNA干擾針對的片段為RLAl的CDS的第845-1044堿基。此段在水稻中無同源序列。引物如下:
[0017]正序R1-RLAl-1FGGGGTACCTGCAAAGAGCTCCATAC(加KPnI位點)
[0018]R1-RLA1-1RCCCTCGAGCTCTTGACCATGGAATG(加XHOI位點)
[0019]反序R1-RLAl-lFCGGGATCCCTCTTGACCATGGAATG(加 BamHI 位點)
[0020]R1-RLA1-1RGCTCTAGATGCAAAGAGCTCCATAC(加XBaI位點)
[0021 ]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
[0022]URLAl是一個改變株高和莖葉夾角大小的有效基因，它可以通過調(diào)控油菜素甾醇信號，進而改變作物的株高和莖葉夾角大小。
[0023]2、目前，水稻中油菜素留醇信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并不完善，該基因的發(fā)現(xiàn)進一步完善了此通路的作用機制。
【附圖說明】
[0024]圖1為RNA干擾RLAl轉(zhuǎn)基因植株的表型。
[0025]圖2為RealtimeqRT-PCT驗證RNA干擾轉(zhuǎn)基因植株RLAl的表達量。
【具體實施方式】
[0026]本發(fā)明所述技術(shù)方案，如未特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方案，所述試劑或生物材料，如未特別說明，均已公開。
[0027]實施例1:
[0028]一種控制水稻葉片直立性發(fā)育的基因RLAl的獲得:
[0029]發(fā)明人發(fā)現(xiàn)了一個矮化直立的突變體rial，構(gòu)建F2分離群體之后進行圖位克隆得到相關(guān)基因RLA1，通過反向遺傳學(xué)的方法，利用RNA干擾技術(shù)抑制RLAl的表達得到了矮化直立表型的轉(zhuǎn)基因植株，利用real-time qRT_PCR驗證了RLAl確實被抑制。
[0030]具體如下:
[0031 ] 一種控制水稻植株高矮和葉片直立性發(fā)育的基因RLAl，利用下述方法得到:
[0032]發(fā)明人在突變體庫里發(fā)現(xiàn)了一株矮化直立的突變體rial。通過BR敏感性檢測發(fā)現(xiàn)其確實對BR不敏感確定了它是一個BR相關(guān)的突變體。為了獲得相關(guān)基因，首先我們把rial與野生型日本晴進行回交，F(xiàn)l代顯示野生型表型，F(xiàn)2代野生型與突變體表型比例3:1，說明這是一個單基因控制的隱性突變。進一步我們將突變體與另外一種秈稻9311雜交獲得了F2代，取樣突變體表型的進行圖位克隆獲得了導(dǎo)致突變的基因RLA1。我們將野生型的RLAl轉(zhuǎn)化到突變體rial中，突變體表型得到了回復(fù)，證明我們克隆到了相關(guān)基因。此基因的序列由以下方法獲得:
[0033]反應(yīng)體系的總體積為50μ1，模板為日本晴CDNAIul (約50ng)、10 X KOD酶反應(yīng)緩沖液5μ1、25πιΜ MgCL2 2yl、5mM dNTP 5μ1、5uM引物5μ1 (每條引物均為2.5μ1)、Ιμ? KOD酶，加ddH20(無菌去離子水)至50μ1。
[0034]反應(yīng)程序為:94°(:變性5111丨11，941€308、55°(:1111丨11、68°(:111^1135cycles，68°C 延伸1min0
[0035]所述引物為:
[0036]RLAl-F: CGGGATCCATGCCGCCCTGCGCCGCC (加 BamHI 位點)
[0037]RLA1-R:GCTCTAGACTCTTGACCATGGAATGGATCAC(加XBaI位點)
[0038]最終獲得包含有SEQ ID N0.1所述的基因序列，該基因編碼的蛋白質(zhì)為SEQ IDN0.2所示ο
[0039]實施例2:
[0040]RLAl基因在控制水稻植株高矮或葉片直立性中的應(yīng)用，應(yīng)用過程如下:
[0041 ] I)植物表達載體RNA1-RLAl的構(gòu)建
[0042]將RLAl(845-1044bp)利用 Kpnl/XHOl 和 BamHI/Xbal 酶切位點克隆到 RNAi 載體PTCK303上，轉(zhuǎn)入日本晴中。引物如下:
[0043]正序R1-RLA1-1F:GGGGTACCTGCAAAGAGCTCCATAC(加 KPnI 位點)
[0044 ] R1-RLA1-1R:CCCTCGAGCTCTTGACCATGGAATG(加XHOI位點)
[0045]反序R1-RLAl-1F: CGGGATCCCTCTTGACCATGGAATG (加 BamHI 位點)
[0046]R1-RLA1-1R:GCTCTAGATGCAAAGAGCTCCATAC(加XbaI位點)
[0047]2)水稻遺傳轉(zhuǎn)化
[0048]步驟I)中的水稻轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，具體如下:
[0049]①愈傷誘導(dǎo)。將水稻種子去殼，取飽滿清亮的籽粒先用70%乙醇浸泡lmin，無菌水沖洗1-2次;再用含2%活性氯的NaClO溶液(40ml含>5.2%活性氯的NaClO溶液加60ml水)，加1-3滴Tween 20，浸泡30min以上(一般40min，最長可至Ih)。不時搖動，然后用無菌水沖洗4-5次。倒在滅菌的平板和濾紙上吸干，約Ih左右。將之置入N6D固體培養(yǎng)基上(10粒/25ml/瓶)，種胚朝上或接觸培養(yǎng)基，28°C，暗培養(yǎng)25?30cLN6D2培養(yǎng)基:N6鹽分和維生素，0.5g/l酪蛋白水解物，30g/l鹿糖，2mg/l 2,4-D,2.5g/l Phytagel(Sigma)，ρΗ5.8。
[0050]②農(nóng)桿菌的培養(yǎng)及其與水稻愈傷組織的共培養(yǎng)。取滅菌小勺刮取農(nóng)桿菌，用勺背面將菌體貼在管壁輕輕拍散，0D600 = 0.8?1.0。將前培養(yǎng)的愈傷在無菌濾紙上晾一下，然后集中至一個平皿一次性轉(zhuǎn)入菌液中，輕輕轉(zhuǎn)動離心管使菌液均勻分布，靜置時間約15?20min。將菌液倒出，愈傷在無菌濾紙上放約1.5h，保證菌液吸干，接至1/2N6D AS中，20 °C、暗培養(yǎng)2?3天，看到愈傷與培養(yǎng)基接觸部分有菌膜，就可以除菌了。1/2N6D AS培養(yǎng)基:N6D2，10g/l葡萄糖，100?400μπιΟ1/1乙酰丁香酮(用時現(xiàn)加)，ρΗ5.2。
[0051]③農(nóng)桿菌的去除。將共培養(yǎng)的愈傷裝入50ml的離心管，用無菌水清洗3次以上，至液體比較清亮。倒出無菌水，N6D+Cn500mg/L(或AP500ml/L)，10rpm, 15-20min，2_3次。將愈傷倒在無菌濾紙上吸干2h左右，視情況而定。將干燥的愈傷轉(zhuǎn)入N6D-AS中，加頭孢霉素Cn250mg/L，28°C，暗培養(yǎng)7?10d。
[0052 ]④愈傷組織的篩選。挑出沒被農(nóng)桿菌污染的愈傷，第一次加Cn250mg/L和Hn (50mg/L)，15?20d。第二次同上，不加Cn，加潮霉素Hn，把所有的愈傷全部再轉(zhuǎn)一次，15?20d。第三次選出新的愈傷，用Hn篩選，15?20d。次數(shù)部用一定按上述安排，但應(yīng)保證愈傷在Hn上篩選的時間至少4 5 d以上，第三次挑出的新長出的愈傷最好篩選2 O d。N 6 D篩選培養(yǎng)基:N 6 D+Cn250mg/L+Hn50mg/L，PH=5.8?5.9。
[0053]⑤分化和生根。將第四次篩選的全部愈傷組織移入MS中，Hn 50mg/L，暗培養(yǎng)，預(yù)分化(PH5.9)12?15d。選出長勢好的新鮮的愈傷，移入MS(PH 6.0)中，光培養(yǎng)15?20d，可看到有綠芽長出，一般15d換一次培養(yǎng)基。選長出Icm以上的綠芽，剝?nèi)ブ車嘤嗟挠鷤?，剪去?可留約0.5cm長)移入試管中，1/2MS生根培養(yǎng)。MS分化培養(yǎng)基:MS鹽分和維生素，2g/l酪蛋白水解物，30g/1鹿糖，25g/L山梨醇，2mg/1 6-BA，0.5mg/1 NAA，0.2mg/l玉米素(Zeatin)，0.5mg/l KT,3.0g/1 Phytagel，pH5.8，50mg/l潮霉素B，200mg/l頭孢霉素；1/2MS生根培養(yǎng)基:1/2MS鹽分，MS維生素，30g/l蔗糖，lmg/1 多效唑，0.5mg/l NAA，50mg/l潮霉素，2.5g/lPhytagel，pH5.8。
[0054]3)移栽、表達量鑒定和表型分析。
[0055]將生根的轉(zhuǎn)基因植株每個遺傳構(gòu)建30個系，移栽溫室，取葉片進行realtimeqRT-PCR表達量鑒定。RNA1-RLAl:F-CTCTTCCGTGGTCCTATC，R-GGTAACTGTCTTTCCTTCATC。
[0056]4)結(jié)果:
[0057](I)將RLAl(845-1044bp)克隆到RNAi載體pTCK303上，在水稻日本晴中做RNAi(RNAinterference)實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)成功被RNAi的轉(zhuǎn)基因水稻的莖葉夾角均比野生型(日本晴)小，(圖1)，被RNAi的轉(zhuǎn)基因水稻的株高也比野生型小(圖1)，并做了表達量鑒定(圖2)。
[0058]圖1中WT為日本晴野生型，RLAl-R1-1和RLAl-R1-1為成功被RNAi的轉(zhuǎn)基因水稻，從圖1和圖2中可以看出，抑制RLAl的表達可以減小水稻莖葉夾角，或減小水稻株高，或同時減小水稻莖葉夾角和株高。
【主權(quán)項】
1.一種分離的蛋白，其序列為SEQID N0.2所示。2.編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其序列為SEQID N0.1所示。4.權(quán)利要求1所述蛋白或權(quán)利要求2所述基因在控制水稻株高中的應(yīng)用。5.權(quán)利要求1所述蛋白或權(quán)利要求2所述基因在控制水稻莖葉夾角中的應(yīng)用。6.權(quán)利要求1所述蛋白或權(quán)利要求2所述基因在同時控制水稻株高和莖葉夾角中的應(yīng)用。7.—種分離的基因，其具有SEQID N0.1所示核苷酸序列至少50%同源性的序列。8.—種分離的蛋白質(zhì)，其具有與SEQID N0.2所示氨基酸序列至少50%同源性的序列。
【文檔編號】A01H5/00GK106046129SQ201610506115
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月1日
【發(fā)明人】王學(xué)路, 孫世勇, 喬勝龍
【申請人】華中農(nóng)業(yè)大學(xué)