緊密連接免疫原多肽及其用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種緊密連接免疫原多肽，屬于抗癌疫苗領(lǐng)域。具體涉及用作抗癌疫苗的緊密連接免疫原的優(yōu)化多肽，增強(qiáng)T細(xì)胞免疫應(yīng)答。該氨基酸序列為全新的序列，采用化學(xué)合成所述的多肽；或者采用基因重組的方法，表達(dá)能夠編碼所述多肽的多核苷酸，得到所述多肽。本發(fā)明的緊密連接免疫原多肽用于卵巢癌腫瘤免疫細(xì)胞技術(shù)中的免疫原，增強(qiáng)T細(xì)胞免疫應(yīng)答。本發(fā)明的有益效果在于為全新的序列，可用于卵巢癌腫瘤免疫細(xì)胞技術(shù)中的免疫原，能（1）促進(jìn)T細(xì)胞，（2）促進(jìn)CD8+免疫應(yīng)答，（3）能與T細(xì)胞表面的MHC有效的特異性結(jié)合，（4）在荷瘤小鼠體內(nèi)，能抑制卵巢癌腫瘤的生長(zhǎng)。作為細(xì)胞療法的靶標(biāo)分子，應(yīng)用于CAR?T等細(xì)胞療法。
【專利說(shuō)明】
緊密連接免疫原多肽及其用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明是有關(guān)抗癌疫苗領(lǐng)域。具體來(lái)說(shuō)，本發(fā)明涉及用作抗癌疫苗的緊密連接免 疫原的優(yōu)化多肽，增強(qiáng)T細(xì)胞免疫應(yīng)答。
【背景技術(shù)】
[0002] 卵巢惡性腫瘤是女性生殖器官常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子 宮體癌而列居第三位。但卵巢上皮癌死亡率卻占各類婦科腫瘤的首位。卵巢惡性腫瘤中以 上皮癌最多見。目前，卵巢惡性腫瘤因病理類型不同而治療方案不同，多用手術(shù)治療聯(lián)合化 療等綜合治療。但對(duì)于中、晚期的患者，療效欠佳。
[0003] 腫瘤細(xì)胞免疫治療是一種新興的、具有顯著療效的腫瘤治療模式，是一種自身免 疫抗癌的新型治療方法。它是運(yùn)用生物技術(shù)和生物制劑對(duì)從病人體內(nèi)采集的免疫細(xì)胞進(jìn)行 體外培養(yǎng)和擴(kuò)增后回輸?shù)讲∪梭w內(nèi)的方法，來(lái)激發(fā)，增強(qiáng)機(jī)體自身免疫功能，從而達(dá)到治療 腫瘤的目的。腫瘤細(xì)胞免疫療法是繼手術(shù)、放療和化療之后的第四大腫瘤治療技術(shù)。
[0004] Claudin蛋白是細(xì)胞間緊密連接的骨架蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，claudin-4在原發(fā)性卵巢 癌中呈顯著高表達(dá)，其升高的程度與卵巢癌組織分級(jí)和臨床分期呈正相關(guān)。Claudin-4在卵 巢上皮性癌和黏液性囊腺癌等主要的卵巢癌中表達(dá)均上調(diào)，但在正常卵巢細(xì)胞和卵巢囊腺 瘤中無(wú)過(guò)表達(dá)，表明它的表達(dá)與惡性腫瘤相關(guān)，并且它的高表達(dá)與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)。 claudin-4是惡性卵巢癌的標(biāo)記物，可以作為腫瘤疫苗的特異性免疫原。然而，claudin-4由 209個(gè)氨基酸殘基組成，分子量較大，較難得到純度高的claudin-4。這樣，不僅會(huì)給后期的 特異性T細(xì)胞免疫帶來(lái)困難，而且會(huì)導(dǎo)致患者的自身免疫。因此，本發(fā)明提供了一種特異性 強(qiáng)，純度較高的小分子多肽作為免疫原。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 發(fā)明目的
[0006] 本發(fā)明提供一種緊密連接免疫原多肽，可用于腫瘤細(xì)胞免疫的免疫原，增強(qiáng)T細(xì)胞 免疫應(yīng)答，具有分子量小、特異性免疫原性強(qiáng)的特點(diǎn)。
[0007] 技術(shù)方案
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案在于提供一種緊密連接免疫原多肽，序列
[0009] NPLVASGQKRMMffffLLWAASGLLLLGGGLLCCNCPPRTDKPYSAKYSAA RSRGDSNYV(SEQ ID Ν0：1)〇
[0010] 有益效果
[0011] 本發(fā)明的緊密連接免疫原多肽，為全新的序列，可用于卵巢癌腫瘤免疫細(xì)胞技術(shù) 中的免疫原。有益效果在于（1)促進(jìn)T細(xì)胞，（2)促進(jìn)CD8+免疫應(yīng)答，（3)能與T細(xì)胞表面的MHC 有效的特異性結(jié)合，（4)在荷瘤小鼠體內(nèi)，能抑制卵巢癌腫瘤的生長(zhǎng)。作為細(xì)胞療法的靶標(biāo) 分子，應(yīng)用于CAR-T等細(xì)胞療法。
【具體實(shí)施方式】
[0012]所述的多肽由上海生工吉爾合成。
[0013] 實(shí)施例1
[0014] 用腫瘤模型檢測(cè)緊密連接免疫原多肽的體內(nèi)活力。
[0015] 6-8齡雌性C57BL/6小鼠，小鼠隨機(jī)分成4組，每組10只。⑴空白組；（2)多肽低劑量 組；（3)多肽中劑量組；（4)多肽高劑量組。建立卵巢癌腫瘤模型，在接種卵巢癌腫瘤細(xì)胞后 的第3、5、7天，分別進(jìn)行免疫。方案為:空白組加入相同體積的溶劑，實(shí)驗(yàn)組多肽設(shè)3個(gè)劑量： 5、10、20mg/Kg，在腫瘤周圍多點(diǎn)注射。21天后，觀察小鼠存活數(shù)量，計(jì)算存活率。結(jié)果顯示， 多肽可有效地保護(hù)小白鼠，提高荷瘤小鼠的生存率，生存率達(dá)到72.1 %。
[0016] 實(shí)施例2
[0017]應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性受體-配體親和法測(cè)試多肽與MH的結(jié)合能力：
[0018] 將多肽與HLA各型的結(jié)合能力由競(jìng)爭(zhēng)性受體-配體親和法判斷。將固定濃度為50μ mol/L的標(biāo)記1251的多肽以及不同濃度（l-5〇 ym〇l/L)的多肽加入反應(yīng)體系(磷酸鹽緩沖液和 MHC，所述的MHC試劑盒購(gòu)自上海泛柯生物科技有限公司，試劑盒內(nèi)有HLA-A1、Α2、Α3、Al 1和 Α24)，在反應(yīng)體系中形成兩種復(fù)合物，即待測(cè)多肽MHC復(fù)合物和1251標(biāo)記多肽復(fù)合物。待測(cè)多 肽與1251標(biāo)記多肽競(jìng)爭(zhēng)與MHC的結(jié)合。用超過(guò)濾(產(chǎn)品型號(hào)Microcon 30，Amicon公司）分離 游離多肽和多肽MHC復(fù)合物，然后測(cè)定多肽MHC復(fù)合物的1251放射量，將此放射量與沒(méi)有競(jìng) 爭(zhēng)性抑制的多肽MHC復(fù)合物（沒(méi)有加待測(cè)多肽的樣本）的放射量比較，求待測(cè)多肽在抑制 50%標(biāo)記多肽與腿(：結(jié)合時(shí)的濃度，8卩1050。由此得到，多肽對(duì)!11^-六1^2、六3、六11和厶24的 IC50值分別為彡ΙΟμΜ，具體為3.49、4.32、1.56、7.42和3.29以111〇1/1，均符合陽(yáng)性多肽的標(biāo) 準(zhǔn)。因此，多肽為具有有效結(jié)合能力的免疫原多肽。
[0019] 實(shí)施例3
[0020] Τ淋巴細(xì)胞的增殖作用:無(wú)菌取小鼠脾臟，1640培養(yǎng)基清洗3次，5ml注射器芯研磨， 200目篩網(wǎng)過(guò)濾，制成單細(xì)胞懸液，離心（1000r/min，5min)，棄上清，TriS-NH4CL破解紅細(xì) 胞，冰水浴靜置3_5min，離心（1000r/min，5min)，棄上清，用無(wú)菌冷roS洗滌細(xì)胞兩次。最后 加入10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液（5ml)懸浮細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5*106 個(gè)/ml，于96孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)。
[0021] 實(shí)驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組、模型組（刀豆蛋白A)、多肽各劑量(5、10、20mg/ml)組。各組分 別加入脾臟淋巴細(xì)胞懸液1〇〇μ1/孔后，空白對(duì)照組加入1640培養(yǎng)液100μ1，模型組加入ConA (終濃度為5μg/ml)，多肽各劑量組在加入不同濃度的多肽基礎(chǔ)上加 ConA(終濃度為5yg/ ml)。37 °C細(xì)胞培養(yǎng)箱靜止培養(yǎng)48h，培養(yǎng)結(jié)束后每孔加入20μ1 MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h，最后棄掉 每孔所有溶液，每孔加入100ylDMS0，震蕩，用酶標(biāo)儀檢測(cè)570nm處0D值，每孔設(shè)5個(gè)平行。 [0022]表1多肽對(duì)T淋巴細(xì)胞的增殖作用
[0024] *P〈〇 · 05，#P〈0 · 01 與模型組相比。
[0025] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，與模型組比較，多肽能促進(jìn)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖，在劑量為5 ~20mg/ml的范圍呈現(xiàn)很好的劑量依賴關(guān)系，以20mg/ml的增殖率最高，為77.72%。
[0026] 實(shí)施例4
[0027] 緊密連接免疫原多肽的免疫原性測(cè)定:采用流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定免疫原多肽對(duì)CD8+ T細(xì)胞的影響。6-8齡雌性C57BL/6小鼠，小鼠隨機(jī)分成4組，每組10只。（1)空白組；（2)免疫原 多肽低劑量組；（3)免疫原多肽中劑量組；（4)多肽高劑量組。在試驗(yàn)的第0、7、14天，分別進(jìn) 行免疫。方案為：空白組加入相同體積的溶劑，實(shí)驗(yàn)組多肽設(shè)3個(gè)劑量:5、10、20mg/Kg，在小 鼠背部淋巴結(jié)附近多點(diǎn)注射。30天后，眼球取血0.8ml，肝素抗凝，將血離心后取血細(xì)胞層， 用紅細(xì)胞裂解液破解紅細(xì)胞，洗去裂解的紅細(xì)胞，再用熒光標(biāo)記的單克隆抗CD8+-FITC(購(gòu) 自北京華泰昕生物醫(yī)療技術(shù)有限公司）孵育、固定后，進(jìn)行流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定，評(píng)價(jià)免疫原 多肽對(duì)CD8+T細(xì)胞的影響。
[0028] 表2多肽對(duì)⑶8+T淋巴細(xì)胞的作用
[0030] *P〈0 · 05，#P〈0 · 01 與模型組相比。
[0031]實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2,與空白組比較，多肽能促進(jìn)小鼠 CD8+T淋巴細(xì)胞，在劑量為5~ 20mg/Kg的范圍呈現(xiàn)很好的劑量依賴關(guān)系，以20mg/Kg的增殖率最高，為66.82%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種緊密連接免疫原多肽，其特征在于:所述的多肽序列為SEQ ID NO: 1。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于:治療腫瘤藥物中的應(yīng)用。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的多肽，其特征在于:在制備用于腫瘤免疫細(xì)胞，增強(qiáng)T細(xì)胞免疫 應(yīng)答藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61P35/00GK106046141SQ201610438412
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年6月19日
【發(fā)明人】羅瑞雪
【申請(qǐng)人】蘇州普羅達(dá)生物科技有限公司