誘變后高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種誘變后高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選方法，其中包括：誘變后的菌株篩選步驟，將經(jīng)過誘變處理的第一代菌株進(jìn)行篩選步驟，包括初篩子步驟及復(fù)篩子步驟，其中復(fù)篩子步驟的進(jìn)行同初篩方式的篩選，得到第二代誘變的出發(fā)菌株，再次進(jìn)行誘變及篩選步驟，第二代、第三代至第n代的篩選方法同第一代，至選育出符合要求的高產(chǎn)淀粉菌株。采用了該發(fā)明中的誘變后高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選方法，誘變處理后的出發(fā)菌株通過再一次的初篩與復(fù)篩可以得到第二代的出發(fā)菌株，篩選過程簡便易操作，可以在短時(shí)間內(nèi)得到高產(chǎn)淀粉酶菌株，整個(gè)篩選過程投資小靶向高，可以定向地得到高酶活的淀粉酶菌株，具有大規(guī)模的推廣價(jià)值。
【專利說明】
誘變后高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物學(xué)領(lǐng)域，尤其涉及菌株篩選方法，具體是指一種誘變后高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選方法。
【背景技術(shù)】
[0002]淀粉酶是指能夠水解淀粉、糖原和有關(guān)多糖中的O-葡萄糖鍵的酶。一般情況下指做用于可溶性淀粉、直鏈淀粉、糖元等α-1，4_葡聚糖且水解α-1，4_糖苷鍵的酶。淀粉酶根據(jù)作用方式可分為兩種:α -淀粉酶(EC3.2.1.1.)與β -淀粉酶(EC3.2.1.2.)。α -淀粉酶廣泛分布于動(dòng)物(唾液、胰臟等)、植物(麥芽、山崳菜)及微生物。其中微生物的酶大多都是分泌性的。淀粉酶以Ca2+為其必需因子和作為穩(wěn)定因子，既作用于直鏈淀粉，亦作用于支鏈淀粉，同功能的切斷α-1，4_鏈。因此，其反應(yīng)具有明顯現(xiàn)象:為底物溶液粘度的快速下降和碘反應(yīng)消失。我國是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國，淀粉資源非常豐富，淀粉酶應(yīng)用范圍廣泛，但是我國的淀粉酶生產(chǎn)狀況卻不容樂觀。
[0003]從自然界中篩選高產(chǎn)淀粉酶菌株是解決這個(gè)難題的關(guān)鍵，這種方法的有力之處在于實(shí)施起來方便簡單，資本投入較小。但它的缺點(diǎn)就在于隨機(jī)性很大，很多時(shí)候不能篩選出理想的菌體。平板菌落透明圈法是現(xiàn)有篩選經(jīng)誘變后高產(chǎn)淀粉酶菌株的常規(guī)方法，但透明圈直徑/菌落直徑與其搖瓶酶活的相關(guān)度特異性較差，而且這個(gè)方法也費(fèi)時(shí)費(fèi)力。因此，探索一種可實(shí)現(xiàn)簡便篩選經(jīng)誘變后的高產(chǎn)淀粉酶菌株的方法十分必要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是克服了上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供了一種能夠快速誘變后高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選方法。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的誘變后高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選方法具有如下構(gòu)成:
[0006]該誘變后高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選方法，其主要特點(diǎn)是，所述的篩選方法包括下述步驟:
[0007]誘變后的菌株篩選步驟:將經(jīng)過誘變處理的第一代菌株進(jìn)行篩選步驟，包括初篩子步驟及復(fù)篩子步驟，其中:
[0008](I)初篩子步驟包括:將直徑3?6mm的圓濾紙片放置在淀粉瓊脂平皿上，每平皿4?8個(gè)，分別吸取等量培養(yǎng)液點(diǎn)到濾紙片上，65°C干燥2h，用碘液檢測并比較透明圈的直徑，挑選透明圈直徑大的30?50株進(jìn)行復(fù)篩；
[0009](2)復(fù)篩子步驟包括:將30?50株初篩菌株，每種菌株3?5瓶，再次進(jìn)行同(1.D初篩方式的篩選，取3?5株作為第二代誘變的出發(fā)菌株，再次進(jìn)行誘變及篩選步驟，第二代、第三代至第η代的篩選方法同第一代，至選育出高產(chǎn)淀粉菌株。
[0010]優(yōu)選地，所述的誘變后的菌株來自于下述步驟:
[0011](a)第一代出發(fā)菌株的篩選步驟:包括初篩步驟及復(fù)篩步驟，其中初篩步驟為碘染法，挑出滴加碘液產(chǎn)生透明圈的菌落進(jìn)行復(fù)篩步驟，所述的復(fù)篩步驟為曲利苯藍(lán)顯色法，挑出產(chǎn)生透明圈的菌落；
[0012](b)第一代出發(fā)菌株的誘變步驟:通過所述的曲利苯藍(lán)顯色法挑選出的產(chǎn)生透明圈的菌落進(jìn)行誘變處理；
[0013]更優(yōu)選地，所述的(a)第一代出發(fā)菌的篩選步驟具體包括下述子步驟:
[0014](a-a)稱取樣品0.5g并編號(hào)，用無菌水充分稀釋溶解，然后取等量轉(zhuǎn)接至200mL富集液體培養(yǎng)基，于37 °C培養(yǎng)箱中100?200r/min培養(yǎng)；
[0015](a-b) 24h后，用無菌水對(duì)各樣品進(jìn)行10倍梯度稀釋，吸取濃度為10 6的培養(yǎng)液100 μ L均勻涂布于篩選平板上，于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)45?50h ；
[0016](a-c)加入碘液，觀察標(biāo)出有明顯水解圈的菌落，從中選取染色圈直徑與菌落直徑比值大的單菌落編號(hào)并保存；
[0017](a-d)將挑選出的單菌落37°C培養(yǎng)箱中100?200r/min培養(yǎng)24h，依次進(jìn)行12倍、13倍、10 4倍稀釋，分別取10?100 μ L涂平板，37°C培養(yǎng)24小時(shí)，加入曲利苯藍(lán)，觀察測量透明圈大小，從中選取染色圈直徑與菌落直徑比值最大的單菌落編號(hào)并保存。
[0018]進(jìn)一步地，所述的樣品取自土壤中，具體為:采用五點(diǎn)法采集土壤樣本，選取2mX2m的樣方進(jìn)行對(duì)角線連線，在對(duì)角線中心樣點(diǎn)處及與中心樣點(diǎn)距離相等的四個(gè)點(diǎn)作為樣點(diǎn)取樣。
[0019]更近一步地，所述的樣品取回后進(jìn)行初篩前還包括富集培養(yǎng)過程，所述的富集培養(yǎng)過程采用碘染法。
[0020]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的(I)初篩子步驟具體包括:
[0021]將每菌株I?2瓶菌液分別在搖床以100?200r/min培養(yǎng)50h，將直徑4mm的圓濾紙片放置在淀粉瓊脂平皿上，每平皿6個(gè)，分別吸取等量培養(yǎng)液點(diǎn)到濾紙片上，65°C干燥2h，用碘液檢測并比較透明圈的直徑，挑選透明圈直徑大的30?50株進(jìn)行復(fù)篩。
[0022]更近一步地，所述的淀粉瓊脂平皿為1.8%淀粉，1.4%瓊脂，2毫米厚度的淀粉瓊脂平皿。
[0023]更進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的誘變后篩選高產(chǎn)菌株步驟還包括處理子步驟，具體為:
[0024]將進(jìn)行過誘變的菌株分離到平皿上，打瓊脂塊菌落1000?3000塊，檢定板上挑取5%?10%透明圈的菌落，用于進(jìn)行(I)初篩子步驟。
[0025]最優(yōu)選地，所述的菌落培養(yǎng)使用的固體培養(yǎng)基均為在40?50°C下無菌操作倒出的無菌培養(yǎng)基。
[0026]采用了該發(fā)明中的誘變后高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選方法，其技術(shù)效果在于，樣本初篩時(shí)采用碘染法可以快速大量的篩選出需要的菌株，且篩選成本低，在復(fù)篩時(shí)采用曲利笨藍(lán)顯色法，利用曲利苯藍(lán)的特性，不僅可以篩選出產(chǎn)生透明圈的菌落，且其本身對(duì)微生物的生長沒有抑制作用，可以準(zhǔn)確篩選并不對(duì)目標(biāo)菌落造成傷害。誘變處理后的出發(fā)菌株通過再一次的初篩與復(fù)篩可以得到第二代的出發(fā)菌株，篩選過程簡便易操作，在酶活性最高的時(shí)間段進(jìn)行可以在短時(shí)間內(nèi)得到復(fù)合生產(chǎn)要求的高產(chǎn)淀粉酶菌株，整個(gè)篩選過程投資小靶向高，可以定向地得到高酶活的淀粉酶菌株，具有大規(guī)模的推廣價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0027]為了能夠更清楚地描述本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容，下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)行進(jìn)一步的描述。
[0028]本發(fā)明中的誘變后高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選方法有如下優(yōu)選的具體實(shí)施例，其中未做限制與描述的操作步驟以現(xiàn)行的微生物常規(guī)操作為準(zhǔn)。
[0029]實(shí)施例1:
[0030]I 土壤采樣
[0031 ] 應(yīng)用五點(diǎn)采樣法采集樣本。在目的地選取具有代表性的土壤，選取面積為2mX 2m。首先把對(duì)角線的中點(diǎn)作為中心抽樣點(diǎn)，然后在對(duì)角線上選擇四個(gè)與中心樣點(diǎn)距離0.5m的點(diǎn)作為樣點(diǎn)。
[0032]2菌種初篩與復(fù)篩
[0033]用碘染法對(duì)采樣土壤中的菌落進(jìn)行富集培養(yǎng)和初步篩選。
[0034]淀粉酶產(chǎn)生菌可以產(chǎn)生淀粉酶排出體外，在菌落周圍分解淀粉。而碘液遇淀粉顯藍(lán)色。當(dāng)所篩菌落是淀粉酶產(chǎn)生菌時(shí)，周圍淀粉被分解，滴加碘液不顯色，這樣就會(huì)在菌落周圍產(chǎn)生明顯的透明圈。
[0035]步驟:
[0036](I)分別稱取各樣品0.5g并編號(hào)，用無菌水充分稀釋溶解，然后取等量轉(zhuǎn)接至200mL富集液體培養(yǎng)基，于37 (±0.5) °(:培養(yǎng)箱中150r/min培養(yǎng)；
[0037](2)24h后，用無菌水對(duì)各樣品進(jìn)行10倍梯度稀釋，吸取濃度為10 6的培養(yǎng)液100 μ L均勻涂布于篩選平板上，于37 (±0.5) °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h ；
[0038](3)加入碘液，觀察標(biāo)出有明顯水解圈的菌落，從中選取染色圈直徑與菌落直徑比值大的150個(gè)單菌落編號(hào)并保存。
[0039]復(fù)篩采用曲利笨藍(lán)顯色法。
[0040]在篩選淀粉酶產(chǎn)生菌時(shí)，用碘液染色很直觀，但是碘液具有殺菌作用，水解圈出來了，菌也可能被殺死，對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生影響。曲利苯藍(lán)對(duì)微生物生長沒有明顯的抑制作用，從這一點(diǎn)來說勝過了用碘液篩菌。
[0041]曲利苯藍(lán)是一種非特異性染料，也叫錐蟲藍(lán)。曲利苯藍(lán)和淀粉由于靜電非特異性吸附結(jié)合后使淀粉呈穩(wěn)定的藍(lán)色，當(dāng)?shù)矸郾坏矸勖杆夂笠蚍肿幼冃∥搅p弱，而讓曲利苯藍(lán)游離出來，游離的曲利苯藍(lán)被周圍未水解的淀粉吸附而使顏色加深，淀粉水解區(qū)則形成無色、透明的水解圈。
[0042]步驟:
[0043](I)取已滅菌的固體培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿，將培養(yǎng)基溶解，待溫度降到45°C則在無菌操作臺(tái)倒平板；
[0044](2)挑選出的單菌落37 (±0.5) °(:培養(yǎng)箱中150r/min培養(yǎng)24h，依次進(jìn)行100倍、1000倍、10000倍稀釋，分別取10 μ I涂平板;
[0045](3)37(±0.5) °C培養(yǎng)24小時(shí)，加入曲利苯藍(lán)，觀察測量透明圈大小，從中選取染色圈直徑與菌落直徑比值最大的150個(gè)單菌落編號(hào)并保存。
[0046]3出發(fā)菌株誘變處理后初篩與復(fù)篩
[0047]將第一代出發(fā)菌株進(jìn)行誘變處理，分離到平皿上，打瓊脂塊菌落1000塊，檢定板上挑取10%透明圈的菌落；初篩子步驟:將菌株(I瓶/菌株)分別搖床50小時(shí)，將直徑4毫米的小圓濾紙片，放于淀粉瓊脂平皿上(1.8%淀粉，1.4%瓊脂，2毫米厚度)，每平皿6個(gè)，分別吸取等量培養(yǎng)液點(diǎn)到濾紙片上，放65 (± I) °(:干燥箱中2小時(shí)(這個(gè)時(shí)間之內(nèi)酶的穩(wěn)定性較好，酶活與透明圈大小呈正相關(guān))，用碘液檢測，比較透明圈的直徑，挑選透明圈直徑大的30株進(jìn)行復(fù)篩；復(fù)篩子步驟:利用初篩子步驟的方法，將30株初篩菌株(5瓶/菌株)進(jìn)行篩選，選取3株做為第二代誘變的出發(fā)菌株；第二代、第三代……至第η代篩選方法同第一代，直到選育到高產(chǎn)淀粉酶菌株。
[0048]實(shí)施例2:
[0049]I 土壤采樣
[0050]應(yīng)用五點(diǎn)采樣法采集樣本。在目的地選取具有代表性的土壤，選取面積為2mX 2m。首先把對(duì)角線的中點(diǎn)作為中心抽樣點(diǎn)，然后在對(duì)角線上選擇四個(gè)與中心樣點(diǎn)距離Im的點(diǎn)作為樣點(diǎn)。
[0051]2菌種初篩與復(fù)篩
[0052]用碘染法對(duì)采樣土壤中的菌落進(jìn)行富集培養(yǎng)和初步篩選:
[0053](I)分別稱取各樣品0.5g并編號(hào)，用無菌水充分稀釋溶解，然后取等量轉(zhuǎn)接至200mL富集液體培養(yǎng)基，于37 °C培養(yǎng)箱中200r/min培養(yǎng)；
[0054](2)24h后，用無菌水對(duì)各樣品進(jìn)行10倍梯度稀釋，吸取濃度為10 6的培養(yǎng)液100 μ L均勻涂布于篩選平板上，于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)45h ；
[0055](3)加入碘液，觀察標(biāo)出有明顯水解圈的菌落，從中選取染色圈直徑與菌落直徑比值大的200個(gè)單菌落編號(hào)并保存。
[0056]復(fù)篩采用曲利笨藍(lán)顯色法:
[0057](I)取已滅菌的固體培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿，將培養(yǎng)基溶解，待溫度降到42°C則在無菌操作臺(tái)倒平板；
[0058](2)挑選出的單菌落37°C培養(yǎng)箱中200r/min培養(yǎng)24h，依次進(jìn)行200倍、2000倍、20000倍稀釋，分別取20 μ I涂平板；
[0059](3)37°(:培養(yǎng)24(±1)小時(shí)，加入曲利苯藍(lán)，觀察測量透明圈大小，從中選取染色圈直徑與菌落直徑比值最大的200個(gè)單菌落編號(hào)并保存。
[0060]3出發(fā)菌株誘變處理后初篩與復(fù)篩
[0061]將第一代出發(fā)菌株進(jìn)行誘變處理，分離到平皿上，打瓊脂塊菌落2000塊，檢定板上挑取8%透明圈的菌落；初篩子步驟:將菌株(2瓶/菌株)分別搖床50小時(shí)，將直徑3毫米的小圓濾紙片，放于淀粉瓊脂平皿上(1.8%淀粉，1.4%瓊脂，2毫米厚度)，每平皿8個(gè)，分別吸取等量培養(yǎng)液點(diǎn)到濾紙片上，放65°C干燥箱中2小時(shí)，用碘液檢測，比較透明圈的直徑，挑選透明圈直徑大的40株進(jìn)行復(fù)篩；復(fù)篩子步驟:利用初篩子步驟的方法，將40株初篩菌株(4瓶/菌株)進(jìn)行篩選，選取4株做為第二代誘變的出發(fā)菌株；第二代、第三代……至第η代篩選方法同第一代，直到選育到高產(chǎn)淀粉酶菌株。
[0062]實(shí)施例3:
[0063]I 土壤采樣
[0064]應(yīng)用五點(diǎn)采樣法采集樣本。在目的地選取具有代表性的土壤，選取面積為2mX 2m。首先把對(duì)角線的中點(diǎn)作為中心抽樣點(diǎn)，然后在對(duì)角線上選擇四個(gè)與中心樣點(diǎn)距離2m的點(diǎn)作為樣點(diǎn)。
[0065]2菌種初篩與復(fù)篩
[0066]用碘染法對(duì)采樣土壤中的菌落進(jìn)行富集培養(yǎng)和初步篩選:
[0067](I)分別稱取各樣品0.5g并編號(hào)，用無菌水充分稀釋溶解，然后取等量轉(zhuǎn)接至200mL富集液體培養(yǎng)基，于37 (± I) °(:培養(yǎng)箱中100r/min培養(yǎng)；
[0068](2)24h后，用無菌水對(duì)各樣品進(jìn)行10倍梯度稀釋，吸取濃度為10 6的培養(yǎng)液100 μ L均勻涂布于篩選平板上，于37 (± I) °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)50h ；
[0069](3)加入碘液，觀察標(biāo)出有明顯水解圈的菌落，從中選取染色圈直徑與菌落直徑比值大的100個(gè)單菌落編號(hào)并保存。
[0070]復(fù)篩采用曲利笨藍(lán)顯色法:
[0071](I)取已滅菌的固體培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿，將培養(yǎng)基溶解，待溫度降到50°C則在無菌操作臺(tái)倒平板；
[0072](2)挑選出的單菌落37 (± I) °(:培養(yǎng)箱中100r/min培養(yǎng)24h，依次進(jìn)行500倍、5000倍、50000倍稀釋，分別取100 μ I涂平板；
[0073](3) 37 (± I) 0C培養(yǎng)24 (± 2)小時(shí)，加入曲利苯藍(lán)，觀察測量透明圈大小，從中選取染色圈直徑與菌落直徑比值最大的100個(gè)單菌落編號(hào)并保存。
[0074]3出發(fā)菌株誘變處理后初篩與復(fù)篩
[0075]將第一代出發(fā)菌株進(jìn)行誘變處理，分離到平皿上，打瓊脂塊菌落3000塊，檢定板上挑取5 % %透明圈的菌落；初篩子步驟:將菌株(2瓶/菌株)分別搖床50小時(shí)，將直徑6毫米的小圓濾紙片，放于淀粉瓊脂平皿上(1.8%淀粉，1.4%瓊脂，2毫米厚度)，每平皿4個(gè)，分別吸取等量培養(yǎng)液點(diǎn)到濾紙片上，放65°C干燥箱中2小時(shí)，用碘液檢測，比較透明圈的直徑，挑選透明圈直徑大的50株進(jìn)行復(fù)篩；復(fù)篩子步驟:利用初篩子步驟的方法，將50株初篩菌株(3瓶/菌株)進(jìn)行篩選，選取5株做為第二代誘變的出發(fā)菌株；第二代、第三代……至第η代篩選方法同第一代，直到選育到高產(chǎn)淀粉酶菌株。
[0076]采用了該發(fā)明中的誘變后高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選方法，其技術(shù)效果在于，樣本初篩時(shí)采用碘染法可以快速大量的篩選出需要的菌株，且篩選成本低，在復(fù)篩時(shí)采用曲利笨藍(lán)顯色法，利用曲利苯藍(lán)的特性，不僅可以篩選出產(chǎn)生透明圈的菌落，且其本身對(duì)微生物的生長沒有抑制作用，可以準(zhǔn)確篩選并不對(duì)目標(biāo)菌落造成傷害。誘變處理后的出發(fā)菌株通過再一次的初篩與復(fù)篩可以得到第二代的出發(fā)菌株，篩選過程簡便易操作，在酶活性最高的時(shí)間段進(jìn)行篩選可以在短時(shí)間內(nèi)得到復(fù)合生產(chǎn)要求的高產(chǎn)淀粉酶菌株，整個(gè)篩選過程投資小靶向高，可以定向地得到高酶活的淀粉酶菌株，具有大規(guī)模的推廣價(jià)值。
[0077]在此說明書中，本發(fā)明已參照其特定的實(shí)施例作了描述。但是，很顯然仍可以作出各種修改和變換而不背離本發(fā)明的精神和范圍。因此，說明書應(yīng)被認(rèn)為是說明性的而非限制性的。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種誘變后高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選方法，其特征在于，所述的篩選方法包括下述步驟: 誘變后的菌株篩選步驟:將經(jīng)過誘變處理的第一代菌株進(jìn)行篩選步驟，包括初篩子步驟及復(fù)篩子步驟，其中: (1)初篩子步驟包括:將直徑3?6mm的圓濾紙片放置在淀粉瓊脂平皿上，每平皿4?8個(gè)，分別吸取等量培養(yǎng)液點(diǎn)到濾紙片上，65°C干燥2h，用碘液檢測并比較透明圈的直徑，挑選透明圈直徑大的30?50株進(jìn)行復(fù)篩； (2)復(fù)篩子步驟包括:將30?50株初篩菌株，每種菌株3?5瓶，再次進(jìn)行同(I)初篩方式的篩選，取3?5株作為第二代誘變的出發(fā)菌株，再次進(jìn)行誘變及篩選步驟，第二代、第三代至第η代的篩選方法同第一代，至選育出高產(chǎn)淀粉菌株。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘變后高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選方法，其特征在于，所述的誘變后的菌株來自于下述步驟: (a)第一代出發(fā)菌株的篩選步驟:包括初篩步驟及復(fù)篩步驟，其中初篩步驟為碘染法，挑出滴加碘液產(chǎn)生透明圈的菌落進(jìn)行復(fù)篩步驟，所述的復(fù)篩步驟為曲利苯藍(lán)顯色法，挑出產(chǎn)生透明圈的菌落； (b)第一代出發(fā)菌株的誘變步驟:通過所述的曲利苯藍(lán)顯色法挑選出的產(chǎn)生透明圈的菌落進(jìn)行誘變處理。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的誘變后高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選方法，其特征在于，所述的(a)第一代出發(fā)菌的篩選步驟具體包括下述子步驟: (a-a)稱取樣品0.5g并編號(hào)，用無菌水充分稀釋溶解，然后取等量轉(zhuǎn)接至200mL富集液體培養(yǎng)基，于37 °C培養(yǎng)箱中100?200r/min培養(yǎng)； (a-b) 24h后，用無菌水對(duì)各樣品進(jìn)行10倍梯度稀釋，吸取濃度為10 6的培養(yǎng)液100 μ L均勻涂布于篩選平板上，于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)45?50h ; (a-c)加入碘液，觀察標(biāo)出有明顯水解圈的菌落，從中選取染色圈直徑與菌落直徑比值大的單菌落編號(hào)并保存； (a-d)將挑選出的單菌落37°C培養(yǎng)箱中100?200r/min培養(yǎng)24h，依次進(jìn)行12倍、103倍、14倍稀釋，分別取10?100 yL涂平板，37°C培養(yǎng)24小時(shí)，加入曲利苯藍(lán)，觀察測量透明圈大小，從中選取染色圈直徑與菌落直徑比值最大的單菌落編號(hào)并保存。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的誘變后高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選方法，其特征在于，所述的樣品取自土壤中。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的誘變后高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選方法，其特征在于，所述樣品自土壤采樣具體為:采用五點(diǎn)法采集土壤樣本，選取2mX2m的樣方進(jìn)行對(duì)角線連線，在對(duì)角線中心樣點(diǎn)處及與中心樣點(diǎn)距離相等的四個(gè)點(diǎn)作為樣點(diǎn)取樣。6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的誘變后高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選方法，其特征在于，所述的樣品取回后進(jìn)行初篩前還包括富集培養(yǎng)過程，所述的富集培養(yǎng)過程采用碘染法。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘變后高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選方法，其特征在于，所述的(I)初篩子步驟具體包括: 將每菌株I?2瓶菌液分別在搖床以100?200r/min培養(yǎng)50h，將直徑4mm的圓濾紙片放置在淀粉瓊脂平皿上，每平皿6個(gè)，分別吸取等量培養(yǎng)液點(diǎn)到濾紙片上，65°C干燥2h，用碘液檢測并比較透明圈的直徑，挑選透明圈直徑大的30?50株進(jìn)行復(fù)篩。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的誘變后高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選方法，其特征在于，所述的淀粉瓊脂平皿為1.8%淀粉，1.4%瓊脂，2毫米厚度的淀粉瓊脂平皿。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的誘變后高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選方法，其特征在于，所述的(I)誘變后篩選高產(chǎn)菌株步驟還包括處理子步驟，具體為: 將進(jìn)行過誘變的菌株分離到平皿上，打瓊脂塊菌落1000?3000塊，檢定板上挑取5%?10%透明圈的菌落，用于進(jìn)行(I)初篩子步驟。10.根據(jù)權(quán)利要求1?9任一項(xiàng)所述的誘變后高產(chǎn)淀粉酶菌株的篩選方法，其特征在于，所述的菌落培養(yǎng)使用的固體培養(yǎng)基均為在40?50°C下無菌操作倒出的無菌培養(yǎng)基。
【文檔編號(hào)】C12N1/02GK106047708SQ201510931049
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2015年12月15日
【發(fā)明人】金元昌, 凌玲, 吳銀亮, 蔡英桂, 蘇壬香, 張建賀
【申請(qǐng)人】湖南科技大學(xué)