一株戊糖片球菌及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于飼料用乳酸菌技術(shù)領(lǐng)域，具體公開了一株戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)R09，于2016年5月23日保藏在中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號為：12487，該菌株是是分離自健康豬腸道的乳酸菌，安全性高，該菌株可產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，能水解精氨酸，并能耐受動物常用藥物；本發(fā)明還公開了該菌株在微生物飼料添加劑方面的應(yīng)用，將生產(chǎn)的微生物飼料添加劑用于動物的日糧中，可增加動物機(jī)體腸道中的乳酸菌數(shù)量，降低動物糞便中的大腸桿菌數(shù)量，提高動物機(jī)體采食量，促進(jìn)動物生長發(fā)育。CGMCC No.1248720160523
【專利說明】
-株戊糖片球菌及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及飼料用乳酸菌技術(shù)領(lǐng)域，尤其設(shè)及一株戊糖片球菌及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 自20世紀(jì)中期開始，人們逐漸在動物的飼料中添加抗生素，用來預(yù)防機(jī)體感染疾 病，促進(jìn)動物快速地生長發(fā)育，使飼料的利用率提高，提高畜產(chǎn)品的產(chǎn)量等都起到了積極的 作用?？股剡^度使用而表現(xiàn)出來的弊端也日益明顯，例如，動物腸道內(nèi)的菌群處于動態(tài)平 衡的狀態(tài)，長期食用抗生素后會導(dǎo)致動物正常菌群失衡，且長期使用后容易對機(jī)體產(chǎn)生抗 藥性和藥物殘留等缺點(diǎn)，使機(jī)體的免疫力下降，從而降低了動物產(chǎn)品的質(zhì)量，如果人們食用 飼喂抗生素的動物，人類的健康也會受到威脅。人們對抗生素所帶來的弊端逐漸了解之后， 開發(fā)出能夠取代抗生素的新產(chǎn)品，首先開發(fā)的就是微生態(tài)制劑。微生態(tài)制劑又可稱為促生 素、益生素、活菌制劑等，微生態(tài)制劑是W微生態(tài)學(xué)理論為指導(dǎo)，采用單一菌種或很多菌種 復(fù)合培養(yǎng)，經(jīng)過發(fā)酵技術(shù)制備而成，微生態(tài)制劑具有高效、無殘留等特點(diǎn)，逐漸取代了抗生 素的位置。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一株戊糖片球菌及其應(yīng)用。
[0004] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案予W實現(xiàn)。
[0005] 一株戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus)R09,于2016年5月23日保藏在中國 微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，保藏號為:CGMCC No. 12487,保藏單位地址為 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，郵編為100101。
[0006] 所述戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)R09分離自健康豬腸道，其形態(tài)學(xué)特 征為:在MRS瓊脂培養(yǎng)基上呈現(xiàn)乳白色的圓形菌落，菌落表面濕潤無權(quán)皺，邊緣整齊，革蘭氏 染色為陽性。
[0007] 所述MRS瓊脂培養(yǎng)基包含:蛋白腺lOg/L，酵母膏5g/L，牛肉膏l(xiāng)Og/L，葡萄糖20g/L， 乙酸鋼5g/L，巧樣酸氨二錠2g/L，憐酸氨二鐘2g/L，硫酸儀0.58g/L，硫酸儘0.05g/L，吐溫 801mL/L，瓊脂 20g/L。
[000引所述戊糖片球菌(Pediococ州S pentosaceus)R09的葡萄糖、薦糖和乳糖發(fā)酵為陽 性，淀粉水解為陰性，明膠液化呈陽性，V-P試驗和M-時式驗呈陽性，硝酸鹽還原為陰性，能水 解精氨酸。
[0009] 所述MRS液體培養(yǎng)基包含:蛋白腺lOg/L，酵母膏5g/L，牛肉膏l(xiāng)Og/L，葡萄糖20g/L， 乙酸鋼5g/L，巧樣酸氨二錠2g/L，憐酸氨二鐘2g/L，硫酸儀0.58g/L，硫酸儘0.05g/L，吐溫 801mL/L〇
[0010] 所述戊糖片球菌（Pediococ州S pentosaceus)R09的 16S rDNA序列為沈Q ID N0:1 所示，具體為：
[0011] CATGCAAGTCGAACGAACTTCCGTTAATTGATTATGACGTACTTGTACTGATTGAGATTTTAACACGAAGTGAGTGG CGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCAGAAGTAGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGTATA ACAGAGAAAACCGCATGGTTTTCTTTTAAAAGATGGCTCTGCTATCACTTCTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTA GTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCAGTGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGA CACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCG TGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACGTGGGTAAGAGGAACTGTTTACCCAGTG ACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGo
[0012] 所述戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)R09產(chǎn)酸產(chǎn)氣，在MRS液體培養(yǎng)基上 37°C培養(yǎng)24小時后，有效活菌數(shù)為1.1 X lO^c化/mL，產(chǎn)酸量為151.8°T;
[0013] 所述戊糖片球菌(Pediococ州S pentosaceus)R09耐受動物常用藥物，所述動物常 用藥物包括四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、復(fù)方新諾明、先鋒嚷目虧、氣贓酸、氣嗦酸、頻特靈、鏈霉 素、卡那霉素、慶大霉素、萬古霉素、氨節(jié)青霉素、青霉素 G、先鋒V和利福平。
[0014] 所述戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus)R09在微生物飼料添加劑方面的應(yīng) 用。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0016] 本發(fā)明的戊糖片球菌R09是分離自健康豬腸道的乳酸菌，安全性高，培養(yǎng)基培養(yǎng)24 小時后，有效活菌數(shù)達(dá)到1.1 X lO^c化/mM同時，該菌的產(chǎn)酸量較高，培養(yǎng)24小時后，產(chǎn)酸量 為151.8° T，能水解精氨酸，是同型發(fā)酵乳酸菌。
[0017] 本發(fā)明的戊糖片球菌R09用于生產(chǎn)微生物飼料添加劑，將生產(chǎn)的微生物飼料添加 劑用于動物的日糧中，可增加動物機(jī)體腸道中的乳酸菌數(shù)量，降低動物糞便中的大腸桿菌 數(shù)量，提高動物機(jī)體采食量，促進(jìn)動物生長發(fā)育。
【附圖說明】
[0018] 下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0019] 圖1為本發(fā)明的一株戊糖片球菌R09在MRS瓊脂培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)圖；
[0020] 圖2為本發(fā)明的一株戊糖片球菌R09在100倍油鏡下的菌體特征圖；
[0021] 圖3為本發(fā)明的一株戊糖片球菌R09在掃描電鏡下的菌體特征圖；
[0022] 圖4為本發(fā)明的一株戊糖片球菌R09的系統(tǒng)發(fā)育樹。
【具體實施方式】
[0023] 下面將結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)描述。
[0024] 下述實施例中，所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0025] 實施例1
[00%]戊糖片球菌（Pediococ州S pentosaceus)R09的分離：
[0027]本發(fā)明的戊糖片球菌R09分離自健康豬腸道，分離采用平板稀釋法，分離用培養(yǎng)基 為含有2%化C〇3的化培養(yǎng)基，M17培養(yǎng)基和MRS瓊脂培養(yǎng)基。
[00%]其中，每升化培養(yǎng)基包括:酪蛋白水解物lOg，酵母提取物5g，巧樣酸二錠2g，乙酸 鋼25g，硫酸儀0.58g，瓊脂15g，葡萄糖20g，吐溫801.0ml，憐酸氨二鐘6g，硫酸亞鐵0.03g，硫 酸車孟0.15g，蒸饋水1000ml。
[0029] 每升M17培養(yǎng)基包括:植質(zhì)蛋白腺5. Og，酵母提取物5. Og，聚蛋白腺5. Og，抗壞血酸 〇.5邑，牛肉浸膏2.5邑，0-甘油憐酸二鋼19邑，瓊脂15邑，硫酸儀〇.58邑，蒸饋水1〇〇〇1111^。
[0030] 每升MRS瓊脂培養(yǎng)基包含：蛋白腺lOg，酵母膏5g，牛肉膏l(xiāng)Og，葡萄糖20g，乙酸鋼 5g，巧樣酸氨二錠2g，憐酸氨二鐘2g，硫酸儀0.58g，硫酸儘0.05g，吐溫80 ImL，瓊脂20g，蒸饋 水 lOOOmL。
[0031] 具體的分離過程按W下步驟進(jìn)行：
[0032] 在無菌室中稱取lOg健康豬腸道糞便樣品，放入裝有90mL無菌水的S角瓶中振蕩 化，用無菌水進(jìn)行稀釋，選i(T4、i(r5、i(r6稀釋度，每個稀釋度取1滴稀釋液分別涂布和傾注 在M17、MRS和化平板上，于37°C條件下恒溫培養(yǎng)4她，形成菌落后，觀察其形態(tài)，挑取有透明 巧溶圈的菌落到MRS平板，并對所獲得的菌株采用MRS瓊脂平板劃線法進(jìn)行純化，將純培養(yǎng) 的菌株接種到MRS瓊脂斜面培養(yǎng)基上，37°C恒溫培養(yǎng)4她后置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0033] 實施例2
[0034] 本發(fā)明戊糖片球菌R09的形態(tài)學(xué)鑒定按W下步驟進(jìn)行:將分離純化的菌株分別涂 布到MRS固體培養(yǎng)基，37 °C培養(yǎng)1~2d，觀察菌落特征，如圖1所示，其在MRS瓊脂培養(yǎng)基上呈 現(xiàn)乳白色的圓形菌落，菌落表面濕潤無權(quán)皺，邊緣整齊，革蘭氏染色為陽性;取典型菌落涂 片，并進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡下觀察其菌體形態(tài)，如圖2所示，戊糖片球菌R09的菌體呈桿狀， 無芽抱;掃描電鏡下觀察其菌體形態(tài)，如圖3所示，圖3為戊糖片球菌R09的菌體正在分裂時 的狀態(tài)，W二分裂方式繁殖，菌體為桿狀。
[0035] 生理生化鑒定按W下步驟進(jìn)行：生理生化實驗方法參照《乳酸細(xì)菌分類鑒定及實 驗方法》(凌代文1999)進(jìn)行鑒定。
[0036] 對本發(fā)明的戊糖片球菌R09進(jìn)行精氨酸水解試驗，CK為培養(yǎng)基中不接戊糖片球菌 R09的對照組，與對照組相比，本發(fā)明的戊糖片球菌R09在MRS液體培養(yǎng)基上于37°C、150r/ min，培養(yǎng)24h后，其培養(yǎng)基沒有發(fā)生顏色變化，表明精氨酸經(jīng)細(xì)菌酶水解，釋放有堿性物質(zhì)， 發(fā)生的是陽性反應(yīng)。
[0037] 因此，本發(fā)明戊糖片球菌R09的生理生化特征為:葡萄糖、薦糖和乳糖發(fā)酵為陽性， 淀粉水解為陰性，明膠液化呈陽性，V-P試驗和M-時式驗呈陽性，硝酸鹽還原為陰性，能水解 精氨酸。
[0038] 對本發(fā)明的戊糖片球菌R09進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，按W下步驟進(jìn)行:通過16S rDNA 序列分析，由上海生物工程股份有限公司進(jìn)行測序，測得的序列為：
[0039] CATGCAAGTCGAACGAACTTCCGTTAATTGATTATGACGTACTTGTACTGATTGAGATTTTAACACGAAGTGAGTGG CGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCAGAAGTAGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCGTATA ACAGAGAAAACCGCATGGTTTTCTTTTAAAAGATGGCTCTGCTATCACTTCTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTA GTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCAGTGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACTGAGA CACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCG TGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACGTGGGTAAGAGTAACTGTTTACCCAGTG ACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGo
[0040] 對測序結(jié)果進(jìn)行比對，最后再用MEGA5.05作圖軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的繪制，所得 本發(fā)明戊糖片球菌R09的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。通過各序列間的進(jìn)化距離，得知各菌株間 的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近。
[0041 ] 實施例3
[0042] 本發(fā)明的戊糖片球菌R09的性質(zhì)。
[0043] 對本發(fā)明的戊糖片球菌R09進(jìn)行葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸產(chǎn)氣試驗，CK為培養(yǎng)基中不接戊 糖片球菌R09的對照組，與對照組相比，本發(fā)明的戊糖片球菌R09在MRS液體培養(yǎng)基上，37 °C、 15化/min培養(yǎng)3天后，戊糖片球菌R09的培養(yǎng)基變黃，表明本發(fā)明的戊糖片球菌R09產(chǎn)酸，試 驗試管的頂部出現(xiàn)大量氣泡，表明戊糖片球菌R09產(chǎn)氣。本發(fā)明的戊糖片球菌R09在MRS液體 培養(yǎng)基上37°C培養(yǎng)24小時后，有效活菌數(shù)為1.1 X l〇iDc化/mL，產(chǎn)酸量為151.8°T。
[0044] 對本發(fā)明的戊糖片球菌R09進(jìn)行藥敏試驗研究，挑取菌株R09少許制成菌懸液，均 勻涂布于MRS平板培養(yǎng)基上，將四環(huán)素、氯霉素、紅霉素、復(fù)方新諾明、先鋒嚷目虧、氣贓酸、氣 嗦酸、頻特靈、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素、萬古霉素、氨節(jié)青霉素、青霉素 G、先鋒V和利福 平共16種藥敏片置于平板上，37°C培養(yǎng)2地后，所有平板上均未出現(xiàn)抑菌圈，表明R09菌株具 有很強(qiáng)的耐藥性，在用于動物防病治病時可與多數(shù)抗生素同時使用。
[0045] 實施例4
[0046] 本發(fā)明的戊糖片球菌R09在微生物飼料添加劑方面的應(yīng)用。
[0047] 本實施例將本發(fā)明的戊糖片球菌R09應(yīng)用于微生物豬飼料添加劑中，在斷奶仔豬 的日糧中添加6%的含有戊糖片球菌R09菌株數(shù)量2X106的發(fā)酵飼料，然后在喂養(yǎng)該生物飼 料的第〇、14、28、35天時，對仔豬糞便中的大腸桿菌和菌落總數(shù)進(jìn)行測定，并對仔豬腸道中 該乳酸菌的數(shù)量和日增重進(jìn)行測定，喂養(yǎng)35天時測定結(jié)果如下：斷奶仔豬腸道中的乳酸菌 數(shù)量由7.5 X 103c化/g增加到3.6 X 104c化/g，仔豬糞便中大腸桿菌的數(shù)量由lg4.81c化/g減 少到lg4.08cfu/g，機(jī)體采食量由445.02g/d增加到455.91g/d。
[004引本發(fā)明的戊糖片球菌R09分離自健康豬腸道，安全性高，可產(chǎn)生有機(jī)酸，運(yùn)些酸類 物質(zhì)本身既是營養(yǎng)物質(zhì)又可降低腸道pH值，對病原菌和腐敗菌有抑制作用，因此將其應(yīng)用 于微生物添加劑或發(fā)酵飼料中，最終再輸送至豬腸道中，提高了機(jī)體免疫力，預(yù)防機(jī)體感染 追疾，促進(jìn)豬的生長發(fā)育。
[0049]雖然，本說明書中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述， 但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可W對之作一些修改或改進(jìn)，運(yùn)對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。 因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的運(yùn)些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范 圍。
【主權(quán)項】
1. 一株戊糖片球菌(？6(1;[〇(3〇(^118口6111:〇8&〇6118)1?09，于2016年5月23日保藏在中國微 生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為:CGMCC No. 12487。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)R09，其特征在于，其 16S rDNA序列為SEQ ID N0:1所示，具體為： CATGCAAGTCGAACGAACTTCCGTTAATTGATTATGACGTACTTGTACTGATTGAGATTTTAACACGAAGTGA GTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCAGAAGTAGGGGATAACACCTGGAAACAGATGCTAATACCG TATAACAGAGAAAACCGCATGGTTTTCTTTTAAAAGATGGCTCTGCTATCACTTCTGGATGGACCCGCGGCGTATTA GCTAGTTGGTGAGGTAAAGGCTCACCAAGGCAGTGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGGACT GAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGC CGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACGTGGGTAAGAGTAACTGTTTACCC AGTGACGGTATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAG〇3. 權(quán)利要求1所述的戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)R09在微生物飼料添加劑 方面的應(yīng)用。
【文檔編號】A23K10/18GK106047759SQ201610547138
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月12日
【發(fā)明人】李肖, 來航線, 韋小敏, 李海洋, 薛泉宏
【申請人】西北農(nóng)林科技大學(xué)