一種快速提高藻類孢囊產(chǎn)量的方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于海洋生物技術領域，具體涉及一種快速提高藻類孢囊產(chǎn)量的方法。將處于對數(shù)生長期中早期的藻種培養(yǎng)至細沙與培養(yǎng)基混合的體系中，光照培養(yǎng)至平臺期后期，即可獲得大量孢囊。本發(fā)明主要通過添加天然的物理介質與藻類共培養(yǎng)，達到加快孢囊形成、有效增加孢囊產(chǎn)量和穩(wěn)定性的目的。本發(fā)明解決了因孢囊量少且形成時間緩慢甚至難以在實驗室產(chǎn)生從而無法開展其亞細胞水平、分子水平上的研究等問題,同時為應用微藻孢囊評價壓艙水處理效果增加了實驗材料的易得性。
【專利說明】
-種快速提高藻類抱囊產(chǎn)量的方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于海洋生物技術領域，具體設及一種快速提高藻類抱囊產(chǎn)量的方法。
【背景技術】
[0002] 休眠抱囊(Resting cyst)是很多微藻類群特別是甲藻通過有性生殖方式產(chǎn)生的 休眠合子（少數(shù)為無性方式），是藻類生活史中的一個重要階段(Dale，1983;Anderson， 2012)。很多海洋微藻尤其是甲藻、針胞藻的繁盛可導致海洋有害藻華化armful algal blooms,HABs)或"赤潮"（Red tide),其中有些種類可W產(chǎn)生各種毒素危及海洋動物甚至人 類健康。由于抱囊在藻類種群的基因重組、抵抗不良環(huán)境、藻華的年際爆發(fā)與復發(fā)、藻種的 地理擴散和生物入侵化allegraeff&Bolch，1991)中起著重要的作用，對抱囊產(chǎn)生的條件和 抱囊本身的研究是海洋生物學和生態(tài)學的重要方向。
[0003] 目前國內(nèi)外對抱囊的研究主要是基于野外沉積物中分離得到的抱囊。研究抱囊的 分離鑒定和形態(tài)描述(Anderson, 1988;齊雨藻，1997; Mat suoka, 1998; Weller, 2006;王朝 辟，2003&2011&2014;化叫，2012&2013; Satta，2014 ;Hyeon Ho Shin，2014)、空間分布及擴 散遷移（化llegraeff, 1992 ;Marret, 199化2003; Irwin, 2003; Smayda, 2007;Lacasse, 2013; Satta, 2014;Ma;rtin Jennifer, 2014)、萌發(fā)條件和影響因素化okinos&Anderson, 1995 ; Bravo ,2010；Kennaway,2004；Figueroa,2005；Anderson,1979&1980&1985&1987；Tang, 2008)及與赤潮生消的關系（Andersonl978&1989; DALE ,1983 ;Kremp&胎iskanen, 1999; Matsuoka&Fukuyo 2002; Bravo&Figueroa, 2014;Anderson, 2014)等。另外，抱囊由于處于休 眠狀態(tài)，且通常具有一層較厚的抱囊壁保護，在各種環(huán)境壓力如厭氧、低(高)溫、黑暗、極端 鹽度等條件下能長期存活，因此成為檢測船舶壓艙水(Ships'ballast water)處理效果的 理想實驗材料。鑒于藻類抱囊的實驗室產(chǎn)生過程受眾多環(huán)境條件影響，常常很難穩(wěn)定、快速 地獲得所需要的抱囊數(shù)量，而通過收集海洋沉積物的抱囊又設及用船、特殊取泥設備、海 況、海洋底質條件、繁復和困難的抱囊分離和鑒定流程等眾多限制條件，使能獲得的抱囊數(shù) 量常常無法滿足實驗室和應用的急切需要，比如對抱囊在亞細胞、分子水平上的研究和壓 艙水處理中大量的材料需求。
[0004] 在室內(nèi)條件下實現(xiàn)基于純培養(yǎng)的抱囊大量生產(chǎn)，一方面有助于研究抱囊形成和萌 發(fā)的過程、與有害藻華赤潮生消的關系和在亞細胞、分子水平上探索抱囊形成的誘因及其 分子調控機制，W及設計出可用于野外檢測或鑒定特定甲藻抱囊的探針，另一方面，穩(wěn)定、 大量、快速的抱囊生產(chǎn)將為發(fā)展和應用壓艙水處理技術提供重要的檢測材料。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種快速提高藻類抱囊產(chǎn)量的方法。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用技術方案為：
[0007] -種快速提高藻類抱囊產(chǎn)量的方法，將處于對數(shù)生長期中早期的藻種培養(yǎng)至細沙 與培養(yǎng)基混合的體系中，光照培養(yǎng)到平臺期后期（約一個半月至兩月左右，成熟抱囊形態(tài)、 顏色等隨種類而異），即可獲得大量抱囊。
[0008] 所述培養(yǎng)基為W天然海水或人工海水（鹽度32左右）為基礎介質配制的培養(yǎng)基； 如，W天然海水(鹽度32左右)為基礎介質的f/2培養(yǎng)基或GSe培養(yǎng)基、L1培養(yǎng)基等。
[0009] 所述藻種為皆為已被證實在其生活史中能夠產(chǎn)生休眠抱囊的甲藻；如錐狀斯氏 藻、短溝別什萊藻、哈曼褐多溝藻、亞利山大藻、鏈狀裸甲藻等。
[0010] 所述細沙為經(jīng)100M1網(wǎng)篩篩選天然海水細沙。
[001。 具體；
[0012] 將處于對數(shù)生長期中早期的藻種培養(yǎng)至細沙與培養(yǎng)基混合的體系中，每毫升體系 中培養(yǎng)400-2000個藻種細胞，體系中細沙與培養(yǎng)基的體積比為1:160-620,進而在2TC ± 0.5°C的恒溫光照，光暗比為12L: 12D,光照強度~100皿〇1 photons ? nf2 ? s-i的條件下培 養(yǎng)，培養(yǎng)大致1-2個月，使平板內(nèi)的抱囊在平臺期后期W接近指數(shù)的增長速率增長，即可W 獲得大量抱囊。但培養(yǎng)條件可W根據(jù)種類的特殊需求做出相應調整。
[0013] 在上述一定范圍內(nèi)，抱囊的數(shù)量隨細沙量的增加而增加，增長呈正相關關系。因此 通過添加物理介質的方式可W有效加快并增加抱囊的產(chǎn)生。
[0014] 獲得大量抱囊，其計數(shù)是在倒置顯微鏡(0LMPUS，1I73型）的十倍物鏡下進行，計數(shù) 視野采取從上到下、W "S"形對每個孔內(nèi)形態(tài)完整的抱囊進行計數(shù)統(tǒng)計并拍照。
[0015] 所述藻類產(chǎn)抱囊的方法可應用于海洋性微型藻類的實驗室培養(yǎng)或壓艙水處理效 果檢測中。
[0016] 本發(fā)明所具有的優(yōu)點：
[0017] 本發(fā)明方法采用添加天然的物理介質與藻類細胞共培養(yǎng)的方式，快藻類抱囊的形 成，在不添加任何化學成分和改變藻生長所需各種理化因子的情況下，簡單有效地提高了 抱囊產(chǎn)量和產(chǎn)速。其中，在錐狀斯氏藻（Scrippsiella trochoidea)中，抱囊產(chǎn)量比同期未 添加細沙組最高提高了 107% ;在短溝別什萊藻(Biecheleria brevisulcata)中，抱囊產(chǎn)量 比同期未添加細沙組最高提高了500%。
[0018] 同時，本發(fā)明方法可快速、大量、穩(wěn)定的生產(chǎn)微藻抱囊，其解決因抱囊量少、不穩(wěn)定 且形成時間緩慢而影響其研究和應用的問題。并且可應用于海洋性微型藻類的實驗室培養(yǎng) 和壓艙水處理效果檢測和其它應用。
【附圖說明】
[0019] 圖1為本發(fā)明實施例中所設置的培養(yǎng)方案。圖中共設置四個組:A、對照組（Og細 沙）；B、0.0Ig細沙組;C、0.02g細沙組;D、0.04g細沙組，每一豎排的=個培養(yǎng)孔為一組，即每 組有=個平行。
[0020] 圖2為本發(fā)明在錐狀斯式藻（Scrippsiella trochoidea)中實施后根據(jù)統(tǒng)計的抱 囊數(shù)繪制的變化曲線圖。
[0021 ]圖3為本發(fā)明在短溝別什萊藻(Biecheleria brevisulcata)中實施后根據(jù)統(tǒng)計的 抱囊數(shù)繪制的變化曲線圖。
【具體實施方式】
[0022]下面結合附圖和實例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不限于W下的實施例內(nèi) 容。
[0023] 本發(fā)明方法在錐狀斯式藻和短溝別什萊藻中進行了實施應用。
[0024] 實施例1
[0025] 方法；
[0026] a:采集天然細沙;沙選取天然海水浴場的細沙，經(jīng)100WI1網(wǎng)篩篩選(鏡檢下篩孔尺 寸在75-95微米之間），篩選得到的細沙為表面粗糖、具有不規(guī)則的形狀。
[0027] 篩選后的細沙經(jīng)蒸饋水反復沖洗W去除可能存在的底泥;經(jīng)沖洗后用精密天平分 別稱取不同質量（如O.Olg/cm2等），外層用錫錐紙包好，12rC高壓蒸汽滅菌30min，烘干備 用。
[0028] b:將細沙與純培養(yǎng)的某藻種混合；
[0029] 培養(yǎng)板選用多孔細胞培養(yǎng)板(Corning 3513，NY)，該培養(yǎng)板為聚苯乙締材質，培養(yǎng) 板平底、透明、表面平滑、無菌、無熱原。每個孔直徑22.1mm，高15mm，生長面積3.8cm2,最大 體積約為5.7cm3。實施例中培養(yǎng)所用體積小于5.0cm3。
[0030] 培養(yǎng)板內(nèi)各成分添加順序依次為對應重量的細沙、4ml f/2培養(yǎng)基、3%的青鏈霉 素混合液(Solarbio)(即0.12ml)、藻液。實驗共設置四個組:A、對照組(Og細沙）；B、0.0Ig細 沙組;C、0.02g細沙組;D、0.04g細沙組，每一豎排的S個培養(yǎng)孔為一組，即每組有S個平行 (參見圖1)。
[0031] 接種的藻類均為接種在100ml錐形瓶內(nèi)培養(yǎng)約一周，分布在上層的處于對數(shù)生長 期的中早期藻液。加入的藻液體積根據(jù)最終每孔中藻細胞密度而定，因而在加入原藻液前 需取出適量藻液，經(jīng)2%體積的Lugol試劑固定后，在顯微鏡下用細胞計數(shù)框計數(shù)=次，取平 均值并將其換算到12孔培養(yǎng)板中每個孔的細胞密度（即為實驗的起始細胞密度），W此來確 認需加入藻液的體積;即400-2000個細胞/ml最為適宜。
[0032 ] f/2培養(yǎng)基為W天然海水(鹽度32左右)為基礎介質的f/2培養(yǎng)基。
[0033] 實驗所用培養(yǎng)液為國際上實驗室內(nèi)通用的甲藻培養(yǎng)液，其配制方法:將天然海水 用孔徑為0.22皿的濾膜進行過濾，121°C、0.1 MPa高溫高壓滅菌30min，室溫冷卻后按照f/2 培養(yǎng)基配制方法(Guillard，1975)添加除娃酸鋼W外的四種成分，所用培養(yǎng)液具體組分信 息見表1、2、3。
[0034] 表1 f/2培養(yǎng)基培養(yǎng)基配方 rnmsi
[00
[00
[0040] c.置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)一段時間，收集抱囊。
[0041] 將上述體系于室內(nèi)光照培養(yǎng)箱(CXZ智能型光照培養(yǎng)箱，寧波江南儀器廠），培養(yǎng)溫 度均為21±0.5°C，光照強度為100皿〇1 ? nf2 ? s^，光暗比為12L:12D的條件培養(yǎng)，而后對生 長的抱囊計數(shù)
[0042] 計數(shù)方法是在倒置顯微鏡(0LMPUS，1I73型）的十倍物鏡下進行，計數(shù)視野采取從 上到下、W"S"形對每個孔內(nèi)形態(tài)完整的抱囊進行計數(shù)統(tǒng)計并拍照。每組的抱囊數(shù)為S個平 行孔內(nèi)抱囊的平均值。實施例2
[0043] 實驗藻種：錐狀斯式藻（Scrippsiella trochoidea)
[0044] 初始細胞密度:764個/ml
[0045] 培養(yǎng)初始階段每天對板內(nèi)情況進行觀察，發(fā)現(xiàn)抱囊后每隔一天進行一次統(tǒng)計計 數(shù)，計數(shù)情況見表4及圖2。
[0046] 表4錐狀斯氏藻(Scrippsiella trochoidea)各組別抱囊計數(shù)結果(單位:個）
[0047]
[004引實施例3
[0049]實驗藻種：短溝別什萊藻(Biecheleria brevisulcata)
[(K)加]初始細胞密度:2159個/ml
[0051]培養(yǎng)初始階段每天對板內(nèi)情況進行觀察，發(fā)現(xiàn)抱囊后每隔一天進行一次統(tǒng)計計 數(shù)，計數(shù)情況見表5及圖3。
[0052] 表5短溝別什萊藻(Biecheleria brevisulcata)各組別抱囊計數(shù)結果(單位:個）
[0化3]
[0054] 通過連續(xù)29天對平板底層的錐狀斯式藻的抱囊進行觀察、計數(shù)，從表4和圖2中發(fā) 現(xiàn)，對照組中抱囊數(shù)量呈現(xiàn)先迅速增長后基本保持穩(wěn)定的狀態(tài);加入細沙的平板中，0.0 lg 組抱囊數(shù)量先呈現(xiàn)迅速增長后緩慢增長的趨勢，0.02g和0.0?組抱囊數(shù)量則基本保持指數(shù) 增長的狀態(tài)，且隨細沙量的增多，抱囊數(shù)量增長趨勢越明顯。
[0055] 在對短溝別什萊藻連續(xù)20天的觀察、計數(shù)后，通過表5和圖3可W發(fā)現(xiàn)，未加細沙的 對照組中一直未有抱囊出現(xiàn)；而加入細沙的平板中均有抱囊出現(xiàn)，且數(shù)量均呈現(xiàn)出前期迅 速增加而后緩慢減少的趨勢(可能是因為后期平板內(nèi)細菌增多等原因抱囊破裂）。隨細沙數(shù) 量的增多，抱囊在形成速度、數(shù)量上都有明顯增長的趨勢。
[0056] 從兩個實施例中可W明顯看出本發(fā)明的實際有效性。通過本發(fā)明產(chǎn)生的藻類抱 囊，后續(xù)可W通過沉降原理或多聚鶴酸鋼（Sodium polytungstate)試劑從細沙中收集抱 。
[0057] 另外，其它生活史中能夠產(chǎn)生休眠抱囊的甲藻，如亞力山大藻、鏈狀裸甲藻、哈曼 褐多溝藻等也適用本發(fā)明的培養(yǎng)方法。
[005引本發(fā)明主要通過添加天然的物理介質與藻類共培養(yǎng)，達到加快抱囊形成、有效增 加抱囊產(chǎn)量和穩(wěn)定性的目的。本發(fā)明解決了因抱囊量少且形成時間緩慢甚至難W在實驗室 產(chǎn)生從而無法開展其亞細胞水平、分子水平上的研究等問題，同時為應用微藻抱囊評價壓 艙水處理效果增加了實驗材料的易得性。
【主權項】
1. 一種快速提高藻類孢囊產(chǎn)量的方法，其特征在于:將處于對數(shù)生長期中早期的藻種 培養(yǎng)至細沙與培養(yǎng)基混合的體系中，光照培養(yǎng)到平臺期后期，即可獲得大量孢囊。2. 按權利要求1所述的快速提高藻類孢囊產(chǎn)量的方法，其特征在于:所述培養(yǎng)基為以天 然海水(鹽度32左右)為基礎介質配制的培養(yǎng)基。3. 按權利要求1所述的快速提高藻類孢囊產(chǎn)量的方法，其特征在于:所述藻種為生活史 中能夠產(chǎn)生休眠孢囊的甲藻。4. 按權利要求1所述的快速提高藻類孢囊產(chǎn)量的方法，其特征在于:所述細沙為經(jīng)100μ m網(wǎng)篩篩選天然海水細沙。5. 按權利要求1、2、3或4所述的快速提高藻類孢囊產(chǎn)量的方法，其特征在于:將處于對 數(shù)生長期中早期的藻種培養(yǎng)至細沙與培養(yǎng)基混合的體系中，每毫升體系中培養(yǎng)400-2000個 藻種細胞，體系中細沙與培養(yǎng)基的體積比為1:160-620,進而在21°C ±0.5°C的恒溫光照，光 暗比為12L: 12D,光照強度~100μ mol photons · nf2 · s^1的條件下培養(yǎng)，使孢囊在平臺期后 期以接近指數(shù)的增長速率增長，即可以獲得大量孢囊。6. 按權利要求1所述的快速提高藻類孢囊產(chǎn)量的方法，其特征在于:所述藻類產(chǎn)孢囊的 方法可應用于海洋性微型藻類的實驗室培養(yǎng)或壓艙水處理效果檢測中。
【文檔編號】C12R1/89GK106047786SQ201610412471
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月14日
【發(fā)明人】唐贏中, 楊傲傲, 胡章喜
【申請人】中國科學院海洋研究所