一種利用黃岑根轉(zhuǎn)化合成熊果苷的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用黃岑根轉(zhuǎn)化合成熊果苷的方法，屬于熊果苷合成技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過自制組織培養(yǎng)液培養(yǎng)黃岑根，加入氯化鈣和失水山梨醇脂肪酸酯增加黃岑根的細(xì)胞通透性，增加對苯二酚通過率，促進(jìn)黃岑根對熊果苷的合成，再乙醇提取結(jié)晶，干燥制得熊果苷。本發(fā)明生產(chǎn)周期短，分離純化容易，選擇性好，充分利用培養(yǎng)液中添加氯化鈣和表面活性劑提高組織細(xì)胞通透率，增加熊果酸的產(chǎn)量，針對性強(qiáng)，所得產(chǎn)物生物利用度高達(dá)99.6%以上，產(chǎn)量提高了30.2～32.5%。
【專利說明】
一種利用黃岑根轉(zhuǎn)化合成熊果苷的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種利用黃岑根轉(zhuǎn)化合成熊果苷的方法，屬于熊果苷合成技術(shù)領(lǐng)域。 【背景技術(shù)】
[0002]熊果苷又名熊果素，呈白色針狀結(jié)晶或粉末。萃取自熊果的葉子，能夠通過抑制體內(nèi)酪氨酸酶的活性，阻止黑色素的生成，從而減少皮膚色素沉積，祛除色斑和雀斑，同時(shí)還有殺菌、消炎的作用。主要用于高級化妝品的制備。熊果苷是源于綠色植物的天然活性物質(zhì)，集“綠色植物、安全可靠”和“高效脫色”三者合諧統(tǒng)一于一體的皮膚脫色組份，它能迅速滲入肌膚，在不影響細(xì)胞增殖濃度的同時(shí)，能有效地抑制皮膚中的酪氨酸酶的活性，阻斷黑色素的形成，通過自身與酪氨酶直接結(jié)合，加速黑色素的分解與排泄，從而減少皮膚色素沉積，祛除色斑和雀斑，而且對黑色素細(xì)胞不產(chǎn)生毒害性、刺激性、致敏性等副作用，同時(shí)還有殺菌、消炎的作用。它是當(dāng)今流行的最為安全有效的美白原料，也是二十一世紀(jì)的理想皮膚美白祛斑活性劑。目前熊果苷合成方法有化學(xué)合成法、酶合成法和生物轉(zhuǎn)化法，應(yīng)用最廣泛的是生物轉(zhuǎn)化法，它利用生物體中酶體系將原料高效地轉(zhuǎn)化為目標(biāo)產(chǎn)物。該法所用原料潔凈，轉(zhuǎn)化率高，生產(chǎn)無污染，但生產(chǎn)周期長，分離純化復(fù)雜，可利用酶系有限，選擇性差，且所得產(chǎn)物生物利用度低，產(chǎn)量低。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題:針對生物轉(zhuǎn)化法合成熊果酸生產(chǎn)周期長，分離純化復(fù)雜，可利用酶系有限，選擇性差，且所得產(chǎn)物生物利用度低，產(chǎn)量低的弊端，提供了一種通過自制組織培養(yǎng)液培養(yǎng)黃岑根，加入氯化鈣和失水山梨醇脂肪酸酯增加黃岑根的細(xì)胞通透性，增加對苯二酚通過率，促進(jìn)黃岑根對熊果苷的合成，再乙醇提取結(jié)晶，干燥制得熊果苷的方法。本發(fā)明通過向培養(yǎng)液中添加氯化鈣和表面活性劑提高組織細(xì)胞通透率，提高了黃岑根對對苯二酚的利用度，增加熊果酸的產(chǎn)量，解決了傳統(tǒng)生物轉(zhuǎn)化法合成熊果酸生產(chǎn)周期長，分離純化復(fù)雜，可利用酶系有限，且生物利用度低、產(chǎn)量低的問題。
[0004]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下所述的技術(shù)方案是:(1)按重量份數(shù)計(jì)，稱取90?95份硝酸鉀、8?9份磷酸二氫鉀、1?2份乙二胺四乙酸二鈉、0.1?0.3份硼酸、0.1?0.2份甘氨酸、0.3?0.5份硫酸鋅、10?20份肌醇、40?50份水解乳蛋白、10?15份葡萄糖、50?55份蔗糖及800?900份蒸餾水，攪拌混合均勻，得自制黃岑根組織培養(yǎng)液；(2)量取400?500mL上述自制黃岑組織培養(yǎng)液裝入錐形瓶中，再移入無菌箱中，向錐形瓶中接種4?5g鮮嫩的黃岑毛狀根，用黑布遮住無菌箱在黑暗環(huán)境中于27?29°C下培養(yǎng)18 ?22天；(3)培養(yǎng)結(jié)束后分別向錐形瓶中加入10?20mL質(zhì)量濃度為5%氯化鈣溶液和3?5mL失水山梨醇脂肪酸酯，放置在搖床上振蕩混合過夜，再向其中加入1?2mL質(zhì)量濃度為10%對苯二酚溶液，繼續(xù)保溫轉(zhuǎn)化30?35h;(4)取出轉(zhuǎn)化后黃岑毛狀根，并用去離子水沖洗20?30min后，放入氣流粉碎機(jī)中粉碎， 過60目標(biāo)準(zhǔn)篩，得黃岑根碎塊，將黃岑根碎塊移入超聲提取儀中，同時(shí)向其中加入黃岑根碎塊總體積3?5倍質(zhì)量濃度為60%乙醇溶液，以300?400W功率超聲振蕩提取3?5h后，過0.4 ?0.5mi微孔濾膜，得純化提取液；(5)將上述純化提取液裝入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，旋蒸濃縮至其原體積的1/5后，向其加入0.1 ?〇.3g熊果苷晶種，攪拌均勻后放入4?6°C冰水浴中靜置結(jié)晶過夜，過濾得析出的熊果苷晶體，將其放入真空干燥機(jī)中，在0.05?0.07MPa的真空度和60?70°C條件下干燥1?2h，即得熊果苷。
[0005]本發(fā)明的應(yīng)用方法:將本發(fā)明制得的熊果苷添加至祛斑霜原料中，添加量為祛斑霜原料總質(zhì)量3.5?4.0%，制得祛斑霜，該熊果苷生物利用度高達(dá)99.6%以上，可有效抑制體內(nèi)酪氨酸酶的活性，阻止黑色素的生成，與傳統(tǒng)的生物轉(zhuǎn)化法相比熊果苷產(chǎn)量提高了30.2 ?32.5%，生產(chǎn)周期縮短了7?9天。
[0006]本發(fā)明與其他方法相比，有益技術(shù)效果是:(1)本發(fā)明生產(chǎn)周期短，分離純化容易，選擇性好；(2)充分利用培養(yǎng)液中添加氯化鈣和表面活性劑提高組織細(xì)胞通透率，增加熊果酸的產(chǎn)量，針對性強(qiáng)；(3)所得產(chǎn)物生物利用度高達(dá)99.6%以上，產(chǎn)量提高了30.2?32.5%。【具體實(shí)施方式】
[0007]首先按重量份數(shù)計(jì)，稱取90?95份硝酸鉀、8?9份磷酸二氫鉀、1?2份乙二胺四乙酸二鈉、〇.1?〇.3份硼酸、0.1?0.2份甘氨酸、0.3?0.5份硫酸鋅、10?20份肌醇、40?50份水解乳蛋白、10?15份葡萄糖、50?55份蔗糖及800?900份蒸餾水，攪拌混合均勻，得自制黃岑根組織培養(yǎng)液;然后量取400?500mL上述自制黃岑組織培養(yǎng)液裝入錐形瓶中，再移入無菌箱中，向錐形瓶中接種4?5g鮮嫩的黃岑毛狀根，用黑布遮住無菌箱在黑暗環(huán)境中于27 ?29°C下培養(yǎng)18?22天;在培養(yǎng)結(jié)束后分別向錐形瓶中加入10?20mL質(zhì)量濃度為5%氯化鈣溶液和3?5mL失水山梨醇脂肪酸酯，放置在搖床上振蕩混合過夜，再向其中加入1?2mL質(zhì)量濃度為10%對苯二酚溶液，繼續(xù)保溫轉(zhuǎn)化30?35h;取出轉(zhuǎn)化后黃岑毛狀根，并用去離子水沖洗20?30min后，放入氣流粉碎機(jī)中粉碎，過60目標(biāo)準(zhǔn)篩，得黃岑根碎塊，將黃岑根碎塊移入超聲提取儀中，同時(shí)向其中加入黃岑根碎塊總體積3?5倍質(zhì)量濃度為60%乙醇溶液，以 300?400W功率超聲振蕩提取3?5h后，過0.4?0.5mi微孔濾膜，得純化提取液;最后將上述純化提取液裝入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，旋蒸濃縮至其原體積的1/5后，向其加入0.1?0.3g熊果苷晶種，攪拌均勻后放入4?6°C冰水浴中靜置結(jié)晶過夜，過濾得析出的熊果苷晶體，將其放入真空干燥機(jī)中，在0.05?0.07MPa的真空度和60?70°C條件下干燥1?2h，即得熊果苷。
[0008]實(shí)例 1首先按重量份數(shù)計(jì)，稱取90份硝酸鉀、8份磷酸二氫鉀、1份乙二胺四乙酸二鈉、0.1份硼酸、〇.1份甘氨酸、〇.3份硫酸鋅、10份肌醇、40份水解乳蛋白、10份葡萄糖、50份蔗糖及800份蒸餾水，攪拌混合均勻，得自制黃岑根組織培養(yǎng)液;然后量取400mL上述自制黃岑組織培養(yǎng)液裝入錐形瓶中，再移入無菌箱中，向錐形瓶中接種4g鮮嫩的黃岑毛狀根，用黑布遮住無菌箱在黑暗環(huán)境中于27°C下培養(yǎng)18天;在培養(yǎng)結(jié)束后分別向錐形瓶中加入10mL質(zhì)量濃度為5%氯化鈣溶液和3mL失水山梨醇脂肪酸酯，放置在搖床上振蕩混合過夜，再向其中加入lmL質(zhì)量濃度為10%對苯二酚溶液，繼續(xù)保溫轉(zhuǎn)化30h;取出轉(zhuǎn)化后黃岑毛狀根，并用去離子水沖洗 20min后，放入氣流粉碎機(jī)中粉碎，過60目標(biāo)準(zhǔn)篩，得黃岑根碎塊，將黃岑根碎塊移入超聲提取儀中，同時(shí)向其中加入黃岑根碎塊總體積3倍質(zhì)量濃度為60%乙醇溶液，以300W功率超聲振蕩提取3h后，過0.4wii微孔濾膜，得純化提取液;最后將上述純化提取液裝入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，旋蒸濃縮至其原體積的1/5后，向其加入0.lg熊果苷晶種，攪拌均勻后放入4°C冰水浴中靜置結(jié)晶過夜，過濾得析出的熊果苷晶體，將其放入真空干燥機(jī)中，在〇.〇5MPa的真空度和 60°C條件下干燥lh，即得熊果苷。
[0009]將本發(fā)明制得的熊果苷添加至祛斑霜原料中，添加量為祛斑霜原料總質(zhì)量3.5%， 制得祛斑霜，該熊果苷生物利用度高達(dá)99.69%，可有效抑制體內(nèi)酪氨酸酶的活性，阻止黑色素的生成，與傳統(tǒng)的生物轉(zhuǎn)化法相比熊果苷產(chǎn)量提高了 30.2%，生產(chǎn)周期縮短了 7天。
[0010]實(shí)例2首先按重量份數(shù)計(jì)，稱取93份硝酸鉀、9份磷酸二氫鉀、2份乙二胺四乙酸二鈉、0.2份硼酸、〇.2份甘氨酸、0.4份硫酸鋅、15份肌醇、45份水解乳蛋白、13份葡萄糖、53份蔗糖及850份蒸餾水，攪拌混合均勻，得自制黃岑根組織培養(yǎng)液;然后量取450mL上述自制黃岑組織培養(yǎng)液裝入錐形瓶中，再移入無菌箱中，向錐形瓶中接種5g鮮嫩的黃岑毛狀根，用黑布遮住無菌箱在黑暗環(huán)境中于28°C下培養(yǎng)20天;在培養(yǎng)結(jié)束后分別向錐形瓶中加入15mL質(zhì)量濃度為5% 氯化鈣溶液和4mL失水山梨醇脂肪酸酯，放置在搖床上振蕩混合過夜，再向其中加入2mL質(zhì)量濃度為10%對苯二酚溶液，繼續(xù)保溫轉(zhuǎn)化33h;取出轉(zhuǎn)化后黃岑毛狀根，并用去離子水沖洗 25min后，放入氣流粉碎機(jī)中粉碎，過60目標(biāo)準(zhǔn)篩，得黃岑根碎塊，將黃岑根碎塊移入超聲提取儀中，同時(shí)向其中加入黃岑根碎塊總體積4倍質(zhì)量濃度為60%乙醇溶液，以350W功率超聲振蕩提取4h后，過0.5wii微孔濾膜，得純化提取液;最后將上述純化提取液裝入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，旋蒸濃縮至其原體積的1/5后，向其加入0.2g熊果苷晶種，攪拌均勻后放入5°C冰水浴中靜置結(jié)晶過夜，過濾得析出的熊果苷晶體，將其放入真空干燥機(jī)中，在〇.〇6MPa的真空度和 65°C條件下干燥2h，即得熊果苷。
[0011]將本發(fā)明制得的熊果苷添加至祛斑霜原料中，添加量為祛斑霜原料總質(zhì)量3.8%， 制得祛斑霜，該熊果苷生物利用度高達(dá)99.81%，可有效抑制體內(nèi)酪氨酸酶的活性，阻止黑色素的生成，與傳統(tǒng)的生物轉(zhuǎn)化法相比熊果苷產(chǎn)量提高了 31.4%，生產(chǎn)周期縮短了 8天。
[0012]實(shí)例3首先按重量份數(shù)計(jì)，稱取95份硝酸鉀、9份磷酸二氫鉀、2份乙二胺四乙酸二鈉、0.3份硼酸、0.2份甘氨酸、0.5份硫酸鋅、20份肌醇、50份水解乳蛋白、15份葡萄糖、55份蔗糖及900份蒸餾水，攪拌混合均勻，得自制黃岑根組織培養(yǎng)液;然后量取500mL上述自制黃岑組織培養(yǎng)液裝入錐形瓶中，再移入無菌箱中，向錐形瓶中接種5g鮮嫩的黃岑毛狀根，用黑布遮住無菌箱在黑暗環(huán)境中于29 °C下培養(yǎng)22天;在培養(yǎng)結(jié)束后分別向錐形瓶中加入20mL質(zhì)量濃度為5% 氯化鈣溶液和5mL失水山梨醇脂肪酸酯，放置在搖床上振蕩混合過夜，再向其中加入2mL質(zhì)量濃度為10%對苯二酚溶液，繼續(xù)保溫轉(zhuǎn)化35h;取出轉(zhuǎn)化后黃岑毛狀根，并用去離子水沖洗 30min后，放入氣流粉碎機(jī)中粉碎，過60目標(biāo)準(zhǔn)篩，得黃岑根碎塊，將黃岑根碎塊移入超聲提取儀中，同時(shí)向其中加入黃岑根碎塊總體積3?5倍質(zhì)量濃度為60%乙醇溶液，以400W功率超聲振蕩提取5h后，過0.5wii微孔濾膜，得純化提取液;最后將上述純化提取液裝入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，旋蒸濃縮至其原體積的1/5后，向其加入0.3g熊果苷晶種，攪拌均勻后放入6°C冰水浴中靜置結(jié)晶過夜，過濾得析出的熊果苷晶體，將其放入真空干燥機(jī)中，在〇.〇7MPa的真空度和70°C條件下干燥2h，即得熊果苷。
[0013]將本發(fā)明制得的熊果苷添加至祛斑霜原料中，添加量為祛斑霜原料總質(zhì)量4.0%， 制得祛斑霜，該熊果苷生物利用度高達(dá)99.93%，可有效抑制體內(nèi)酪氨酸酶的活性，阻止黑色素的生成，與傳統(tǒng)的生物轉(zhuǎn)化法相比熊果苷產(chǎn)量提高了 32.5%，生產(chǎn)周期縮短了 9天。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種利用黃岑根轉(zhuǎn)化合成熊果苷的方法，其特征在于具體制備步驟為:(1)按重量份數(shù)計(jì)，稱取90?95份硝酸鉀、8?9份磷酸二氫鉀、1?2份乙二胺四乙酸二 鈉、0.1?0.3份硼酸、0.1?0.2份甘氨酸、0.3?0.5份硫酸鋅、10?20份肌醇、40?50份水解 乳蛋白、10?15份葡萄糖、50?55份蔗糖及800?900份蒸餾水，攪拌混合均勻，得自制黃岑 根組織培養(yǎng)液；(2)量取400?500mL上述自制黃岑組織培養(yǎng)液裝入錐形瓶中，再移入無菌箱中，向錐形 瓶中接種4?5g鮮嫩的黃岑毛狀根，用黑布遮住無菌箱在黑暗環(huán)境中于27?29°C下培養(yǎng)18 ?22天；(3)培養(yǎng)結(jié)束后分別向錐形瓶中加入10?20mL質(zhì)量濃度為5%氯化鈣溶液和3?5mL失水 山梨醇脂肪酸酯，放置在搖床上振蕩混合過夜，再向其中加入1?2mL質(zhì)量濃度為10%對苯二 酚溶液，繼續(xù)保溫轉(zhuǎn)化30?35h;(4)取出轉(zhuǎn)化后黃岑毛狀根，并用去離子水沖洗20?30min后，放入氣流粉碎機(jī)中粉碎， 過60目標(biāo)準(zhǔn)篩，得黃岑根碎塊，將黃岑根碎塊移入超聲提取儀中，同時(shí)向其中加入黃岑根碎 塊總體積3?5倍質(zhì)量濃度為60%乙醇溶液，以300?400W功率超聲振蕩提取3?5h后，過0.4 ?0.5mi微孔濾膜，得純化提取液；(5)將上述純化提取液裝入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中，旋蒸濃縮至其原體積的1/5后，向其加入0.1 ?〇.3g熊果苷晶種，攪拌均勻后放入4?6°C冰水浴中靜置結(jié)晶過夜，過濾得析出的熊果苷 晶體，將其放入真空干燥機(jī)中，在0.05?0.07MPa的真空度和60?70°C條件下干燥1?2h，即得熊果苷。
【文檔編號】C07H15/203GK106047789SQ201610469312
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月25日
【發(fā)明人】仇穎超, 盛海豐, 林茂平
【申請人】仇穎超