基于家蠶血淋巴分離的家蠶微孢子蟲感染鱗翅目昆蟲細胞的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了基于家蠶血淋巴分離的家蠶微孢子蟲感染鱗翅目昆蟲細胞的方法，具體方法如下：先飼養(yǎng)家蠶并用家蠶微孢子蟲進行感染，飼養(yǎng)直至家蠶上蔟結(jié)繭；然后將結(jié)繭后的蠶蛹進行表面消毒，取蠶蛹血淋巴，篩選成功感染家蠶微孢子蟲的蠶蛹血淋巴加入鱗翅目昆蟲細胞sf9中培養(yǎng)，即獲得感染家蠶微孢子蟲的sf9細胞。本發(fā)明的方法步驟簡單，感染效率高，并且不容易引入雜菌，實現(xiàn)了家蠶微孢子蟲對鱗翅目昆蟲細胞高效而穩(wěn)定的侵染，為家蠶微孢子蟲功能基因組、遺傳操作、侵染機制等方面的研究材料提供了新的制備方法。
【專利說明】
基于家蠶血淋己分離的家蠶微抱子蟲感染鱗翅目昆蟲細胞的 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及基于家蠶血淋己分離的家蠶微抱子蟲感染鱗 翅目昆蟲細胞的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 微抱子蟲(microsporidia)是一類專性細胞內(nèi)寄生的單細胞真核生物，其寄主極 為廣泛，幾乎能夠感染從無脊椎動物到脊椎動物甚至包括人在內(nèi)的所有動物。微抱子蟲是 昆蟲、魚類、曬齒類動物、兔類、皮毛動物及靈長動物的重要病原，同時也是幢蟲生物防治的 殺蟲劑。經(jīng)過長期的演化，微抱子蟲已展現(xiàn)出了十分豐富的物種多樣性，目前已被鑒定發(fā)現(xiàn) 的微抱子蟲已超過1400多種，分布于超過150個屬，并且每年都還有新的物種被發(fā)現(xiàn)。
[0003] 家蠶微抱子蟲(Nosema bombycis，N.b)是第一個被人們所鑒別的微抱子蟲，由瑞 ±植物學(xué)家化rlNagcIi于1857年在家蠶中發(fā)現(xiàn)并命名，其寄生于家蠶體內(nèi)引發(fā)家蠶微粒子 病，2012年，國際原生生物進化和分類委員會認可了將微抱子蟲歸于真菌。因其可經(jīng)卵垂直 傳播而被世界各養(yǎng)蠶國家和地區(qū)列為蠶業(yè)生產(chǎn)的唯一法定檢疫對象。目前該病害仍然對蠶 業(yè)生產(chǎn)產(chǎn)生著巨大的危害。作為自然界中最成功的寄生蟲之一，微抱子蟲對人類的生產(chǎn)生 活具有巨大的威脅，有大量學(xué)者對微抱子蟲的形態(tài)結(jié)構(gòu)、遺傳進化、致病機理等生物學(xué)特性 進行著研究。
[0004] 目前，由于家蠶微抱子蟲的嚴格細胞內(nèi)寄生的特性所W無法直接進行離體培養(yǎng)， 只能通過家蠶或鱗翅目昆蟲（lepidopteran)細胞進行培養(yǎng)。2005年李艷紅等人建立了家蠶 微抱子蟲侵染草地貪夜蛾卵巢細胞體系，該方法利用從家蠶絲腺和中腸分離的家蠶微抱子 蟲經(jīng)K0H處理后侵染sf21細胞株，該方法雖然能夠成功感染sf21細胞株，但是穩(wěn)定性和重復(fù) 性差，因此運極大的制約了利用細胞對家蠶微抱子蟲進行研究。因此建立高效而穩(wěn)定的家 蠶微抱子蟲侵染鱗翅目昆蟲細胞的方法對家蠶微抱子蟲功能基因組、遺傳操作、侵染機制 等方面的研究有著重要的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供基于家蠶血淋己分離的家蠶微抱子蟲感染鱗翅 目昆蟲細胞的方法，方法操作簡單，感染效率高。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0007] 基于家蠶血淋己分離的家蠶微抱子蟲感染鱗翅目昆蟲細胞的方法，包括如下步 驟：
[0008] 1)飼養(yǎng)家蠶并用家蠶微抱子蟲進行感染，然后飼養(yǎng)至家蠶上康結(jié)雖；
[0009] 2)將結(jié)雖后的蠶蛹進行表面消毒，取蠶蛹血淋己，然后篩選成功感染家蠶微抱子 蟲的蠶蛹血淋己加入鱗翅目昆蟲細胞sf9中培養(yǎng)，即獲得感染家蠶微抱子蟲的sf9細胞。
[0010] 優(yōu)選的，步驟1)為將家蠶5齡起蠶，按照104個家蠶微抱子蟲每頭將家蠶微抱子蟲 混懸液涂抹在桑葉上進行添食，飼養(yǎng)直至上康結(jié)雖。
[0011] 優(yōu)選的，步驟2)中，所述表面消毒為依次用質(zhì)量分數(shù)為2%的次氯酸鋼、體積分數(shù) 為75 %的乙醇、無菌水分別浸泡5min。
[0012] 優(yōu)選的，步驟2)中，感染家蠶微抱子蟲的蠶蛹血淋己加入量按家蠶微抱子蟲與感 染鱗翅目昆蟲細胞數(shù)比例為1:10~10:1。
[0013] 優(yōu)選的，步驟2)中，所述培養(yǎng)是在溫度為28°C條件下培養(yǎng)。
[0014] 更優(yōu)選的，所述鱗翅目昆蟲細胞為草地貪夜蛾細胞。
[0015] 本發(fā)明的有益效果在于:本發(fā)明公開了基于家蠶血淋己分離的家蠶微抱子蟲感染 鱗翅目昆蟲細胞的方法，通過利用蠶蛹血淋己作為感染材料，利用蠶蛹血淋己具有較高感 染活性和純凈度的家蠶微抱子蟲的優(yōu)點，實現(xiàn)了家蠶微抱子蟲對鱗翅目昆蟲細胞高效而穩(wěn) 定的侵染，并且該方法不需要對蠶蛹血淋己中的微抱子進行提取，減少了操作步驟，因此降 低了引入雜菌的風(fēng)險，并且利用本發(fā)明的方法感染鱗翅目昆蟲細胞還具有感染效率高，重 復(fù)性好的優(yōu)點，為家蠶微抱子蟲功能基因組、遺傳操作、侵染機制等方面的研究材料提供了 新的制備方法。
【附圖說明】
[0016] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0017] 圖1為實施例1中感染家蠶微抱子蟲家蠶蠶蛹血淋己中的抱子。
[001引圖2為實施例1中侵染后12化的感染情況鏡檢。
[0019]圖3為實施例1中不同時間sf9細胞中家蠶微抱子蟲的絕對定量。
[0020] 圖4為實施例2中感染家蠶微抱子蟲家蠶蠶蛹血淋己中的抱子。
[0021] 圖5為實施例2中不同時間sf9細胞中家蠶微抱子蟲的感染情況觀察(A:轉(zhuǎn)染干擾 質(zhì)粒的感染家蠶微抱子蟲細胞;B:轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的感染家蠶微抱子蟲細胞）。
[0022] 圖6為實施例2中不同時間sf9細胞中家蠶微抱子蟲的絕對定量。
[0023] 圖7為實施例2中不同時間sf9細胞中家蠶微抱子蟲干擾祀基因相對表達量
【具體實施方式】
[0024] 下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實施例進行詳細的描述。實施例中未注明具體 條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南(第=版，J.薩姆布魯克等著） 中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[00巧]W下實施例中培養(yǎng)sf9細胞使用的培養(yǎng)基為：Sf-900? III SFM(Thermo Fisher Scientific)。
[0026] 本發(fā)明中干擾ABCGl基因表達的載體，由家蠶微抱子蟲ABCGl基因作為祀基因，并 W該基因739bp-938bp的正向和反向序列，正向序列與反向序列之間用含家蠶肌動蛋白基 因 Actin 3內(nèi)含子連接，形成ABCGl基因正向序列-Actin 3內(nèi)含子-ABCGl基因反向序列，然 后連入載體骨架進行表達，其構(gòu)建步驟參見公開號為CN102492711A的中國專利中1180- IElP-gp64S-A3intron-甜 64A-SV40 載體構(gòu)建步驟。
[0027] 實施例1
[00%]基于家蠶血淋己分離的家蠶微抱子蟲感染sf9細胞的方法，包括如下步驟：
[0029] 1)將家蠶5齡起蠶，按照lO4個家蠶微抱子蟲每頭將家蠶微抱子蟲混懸液涂抹在桑 葉上進行添食，飼養(yǎng)直至上康結(jié)雖；
[0030] 2)上康5天后將感染家蠶微抱子的蠶蛹用質(zhì)量分數(shù)為2%的次氯酸鋼、體積分數(shù)為 75%的乙醇、無菌水分別浸泡5min，然后取蠶蛹血淋己，使用顯微鏡觀察蠶蛹并對蠶蛹血淋 己進行家蠶微抱子蟲計數(shù)(圖1);
[0031] 3)按照家蠶微抱子蟲與sf9細胞數(shù)比例為1:1加入家蠶微抱子蟲與sf9細胞數(shù)比例 為1:10、1:1、10:1將蠶蛹血淋己加入S巧細胞中，在28°C進行培養(yǎng)，6h后更換新鮮培養(yǎng)基;之 后每3天將原有培養(yǎng)基去除，添加新鮮培養(yǎng)基28°C進行培養(yǎng)。
[0032] 培養(yǎng)過程中，每兩天進行顯微觀察，圖2為培養(yǎng)6天利用多聚甲醒固定DAPI染色觀 察結(jié)果。結(jié)果顯示，家蠶微抱子蟲與sf9細胞數(shù)比例為1:10、1:1、10:1均可W成功感染sf9細 胞，并且隨著家蠶微抱子蟲與sf9細胞數(shù)的比例增加感染效率也隨之增加，在感染第=天= 組感染率分別達:93.56 %、39.38 %、9.01 %。
[0033] 培養(yǎng)過程中，分別于化、3h、化、1化、2地、7化、120h取出部分細胞提取總DNA，用家 蠶微抱子蟲微管蛋白e-tubulin的特異性引物進行定量分析家蠶微抱子蟲的增殖情況，結(jié) 果如圖3所不。
[0034] e-tubulin的特異性引物序列如下：
[00；35] Nbl\i-F:5，-agaaccaggaacaatggacg-3,（SEQ ID NO. 1);
[0036] Nbl\i-R:5'-agcccaattat1:accagcacc-3'(沈Q ID N0.2);
[0037] 結(jié)果顯示，蠶蛹血淋己家蠶微抱子蟲感染sf9細胞后，在12h內(nèi)家蠶微抱子蟲數(shù)量 增加，而在12h至24h期間家蠶微抱子蟲數(shù)量出現(xiàn)減少，之后隨著時間增加家蠶微抱子蟲數(shù) 量逐漸增加，運表明在感染1化時家蠶微抱子蟲對宿主細胞的入侵達到最大值，隨后宿主細 胞內(nèi)基于溶酶體等系統(tǒng)對入侵物質(zhì)的清除使得在侵染12h到24h-部分家蠶微抱子蟲被清 除，而一部分逃脫宿主細胞的清除作用并進入增殖階段進行增殖。
[003引實施例2
[0039] 基于家蠶血淋己分離的家蠶微抱子蟲感染sf9細胞進行干擾實驗，具體步驟如下：
[0040] 1)將家蠶5齡起蠶，按照104個家蠶微抱子蟲每頭將家蠶微抱子蟲混懸液涂抹在桑 葉上進行添食，飼養(yǎng)直至上康結(jié)雖；
[0041] 2)上康5天后將感染家蠶微抱子的蠶蛹用質(zhì)量分數(shù)為2%的次氯酸鋼、體積分數(shù)為 75%的乙醇、無菌水分別浸泡5min，然后取蠶蛹血淋己，使用顯微鏡觀察蠶蛹并對蠶蛹血淋 己進行家蠶微抱子蟲計數(shù)(圖4);
[0042] 3)按5X 105個/孔將sf9細胞加入24孔板中，并按照化g/孔轉(zhuǎn)染干擾ABCG1基因表 達的載體，在轉(zhuǎn)染化后更換新鮮培養(yǎng)基，將步驟2)中計數(shù)后的感染家蠶微抱子蟲的蠶蛹血 淋己按照家蠶微抱子蟲與sf9細胞數(shù)比例為1:1加入，28°C進行培養(yǎng)，6h后更換新鮮培養(yǎng)基； 之后每3天將原有培養(yǎng)基去除，添加新鮮培養(yǎng)基28°C進行培養(yǎng)。
[0043] 培養(yǎng)過程中，分別于1211、2地、7211、12化對細胞的感染情況進行觀察，結(jié)果如圖5所 示。結(jié)果顯示，在瞬時轉(zhuǎn)染干擾ABCG1基因表達載體后家蠶微抱子蟲可W感染sf9細胞并進 行增殖，運表明運種獲得感染sf9細胞的方法適用于利用RNAi技術(shù)進行家蠶微抱子蟲基因 功能的研究。然后分別收集細胞提取總DNA，用家蠶微抱子蟲微管蛋白0-化bulin的特異性 引物（引物序列同上)進行絕對定量分析家蠶微抱子蟲的增殖情況，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果顯 示，轉(zhuǎn)染干擾載體的sf9細胞中家蠶微抱子蟲的數(shù)量顯著低于對照組，表明干擾ABCGl基因 表達后能夠抑制家蠶微抱子蟲在sf9細胞內(nèi)的增殖。
[0044] 然后提取感染家蠶微抱子蟲的sf9細胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得sscDNA后W特異引物 對干擾祀基因 ABCG1轉(zhuǎn)錄量進行檢測，特異引物序列如下：
[0045] ABCGl-F:5'-gagaagagacacgcttatatg-3'（SEQ ID N0.3);
[0046] ABCGl-R:5'-atcaagtccagatgtaggtt-3'（SEQ ID N0.4);
[0047] 檢測結(jié)果如圖7所示。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染干擾載體的sf9細胞感染家蠶微抱子蟲中 ABCG1基因的表達被顯著下調(diào)。
[004引穩(wěn)定性試驗：
[0049] 按照實施例1的方法將感染家蠶微抱子蟲的蠶蛹血淋己按照家蠶微抱子蟲與sf9 細胞數(shù)比例為1:1加入sf9細胞中進行培養(yǎng)，由不同的操作實驗人員進行操作，然后統(tǒng)計感 染后第3天的感染效率，同時W李艷紅等人公開的方法作為對照，結(jié)果如表1所示。
[0050] 表1、基于家蠶血淋己分離的家蠶微抱子蟲感染sf9細胞的重復(fù)性
[0化1 ]
[0052] 由表1可知，本發(fā)明所公開的基于家蠶血淋己分離的家蠶微抱子蟲感染sf9細胞重 復(fù)性更好，因此可W作為家蠶微抱子蟲感染鱗翅目昆蟲的平臺方法，為家蠶微抱子蟲功能 基因組、遺傳操作、侵染機制等方面的研究材料提供了新的制備方法。
[0053] 最后說明的是，W上優(yōu)選實施例僅用W說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通 過上述優(yōu)選實施例已經(jīng)對本發(fā)明進行了詳細的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可W在 形式上和細節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。
【主權(quán)項】
1. 基于家蠶血淋巴分離的家蠶微孢子蟲感染鱗翅目昆蟲細胞的方法，其特征在于，包 括如下步驟： 1) 飼養(yǎng)家蠶并用家蠶微孢子蟲進行感染，然后飼養(yǎng)至家蠶上蔟結(jié)繭； 2) 將結(jié)繭后的蠶蛹進行表面消毒，取蠶蛹血淋巴，然后篩選成功感染家蠶微孢子蟲的 蠶蛹血淋巴加入鱗翅目昆蟲細胞sf9中培養(yǎng)，即獲得感染家蠶微孢子蟲的sf9細胞。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述基于家蠶血淋巴分離的家蠶微孢子蟲感染鱗翅目昆蟲細胞的方 法，其特征在于:步驟1)為將家蠶5齡起蠶，按照10 4個家蠶微孢子蟲每頭將家蠶微孢子蟲混 懸液涂抹在桑葉上進行添食，飼養(yǎng)直至上蔟結(jié)繭。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述基于家蠶血淋巴分離的家蠶微孢子蟲感染鱗翅目昆蟲細胞的方 法，其特征在于:步驟2)中，所述表面消毒為依次用質(zhì)量分數(shù)為2%的次氯酸鈉、體積分數(shù)為 75 %的乙醇、無菌水分別浸泡5min。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述基于家蠶血淋巴分離的家蠶微孢子蟲感染鱗翅目昆蟲細胞的方 法，其特征在于:步驟2)中，感染家蠶微孢子蟲的蠶蛹血淋巴加入量按家蠶微孢子蟲與感染 鱗翅目昆蟲細胞數(shù)比例為1:10~10:1。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述基于家蠶血淋巴分離的家蠶微孢子蟲感染鱗翅目昆蟲細胞的方 法，其特征在于:步驟2)中，所述培養(yǎng)是在溫度為28°C條件下培養(yǎng)。6. 根據(jù)權(quán)利要求1~5任一項所述基于家蠶血淋巴分離的家蠶微孢子蟲感染鱗翅目昆 蟲細胞的方法，其特征在于:所述鱗翅目昆蟲細胞為草地貪夜蛾細胞。
【文檔編號】C12N5/07GK106047790SQ201610465548
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月23日
【發(fā)明人】李春峰, 孫濱, 潘國慶, 周澤揚, 許晨
【申請人】西南大學(xué)