一種皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于細胞培養(yǎng)領域，具體涉及一種皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法。本發(fā)明提供的皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)基包括DMEM基礎培養(yǎng)基，還包括表皮生長因子、轉化生長因子、維生素H、重組人胰島素、轉鐵蛋白、橙皮苷和白藜蘆醇。本發(fā)明提供的皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)基可以縮短角質形成細胞的貼壁時間，防止角質形成細胞分化和減少角質形成細胞受成纖維細胞的污染；同時該皮膚角質形成細胞培養(yǎng)基還能提高角質形成細胞的增殖率，維持角質形成細胞在傳代過程中的活力和細胞特性，是一種較為理想的角質形成細胞體外培養(yǎng)基。
【專利說明】
-種皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于細胞培養(yǎng)領域，具體設及一種皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方 法。
【背景技術】
[0002] 人體的皮膚是由表皮、真皮及皮下組織=部分組成。角質形成細胞是表皮的一種 角質蛋白細胞，是構成表皮的重要組成部分。正常情況下，人體表皮細胞有規(guī)律地進行增 殖、分化和脫落，維持著皮膚糖、蛋白質、脂肪、水和電解質的平衡，具有保護自身、調(diào)節(jié)體 溫、排泄廢物和免疫調(diào)節(jié)等功能。
[0003] 角質形成細胞是表皮細胞的主要組成部分，是一種能合成角質蛋白的上皮細胞。 在角質形成細胞向角質細胞演變的過程中，一般可W分為四層，即基底層、棘層、顆粒層W 及角質層。有人把前=層或前二層稱為生發(fā)層或馬爾匹基層。此外，在某些部位，特別在掌 巧部位，角質層下方還可見到透明層。
[0004] 角質形成細胞的體外培養(yǎng)可W為皮膚毒理學、燒傷治療學、美容學和皮膚病發(fā)病 機制的研究提供了新的途徑。但是，皮膚角質形成細胞在分離培養(yǎng)中過程中存在易分化、易 受成纖維細胞污染、不易貼壁等問題，而且角質形成細胞的繁殖力較低、細胞活力較弱，細 胞的成活率不高。因此，建立一種體系穩(wěn)定、適合于皮膚角質形成細胞細胞生長增殖的培養(yǎng) 方法成為當務之急。
[0005] 張興等發(fā)表了一篇題目為"人皮膚角質形成細胞的制備及體外培養(yǎng)"的論文，該論 文主要探討了人皮膚角質形成細胞的制備及體外培養(yǎng)，結果顯示:膜酶+分離酶消化可獲得 較純的角質形成細胞，細胞在限制性KC-FSM培養(yǎng)基中生長良好，培養(yǎng)4她、72h后測得的D值 顯著高于DMEM培養(yǎng)基和RPMI1640培養(yǎng)基。因此，膜酶+分離酶消化、限制性KC-FSM培養(yǎng)基體 外培養(yǎng)是制備和培養(yǎng)人皮膚角質形成細胞的好方法。但是，該限制性KC-FSM培養(yǎng)基在人皮 膚角質形成細胞體外培養(yǎng)過程中仍存在細胞易分化，細胞貼壁時間較長和細胞體外增殖率 較低的缺陷，不利于該方法的推廣和應用。
[0006] 中國專利申請201510741542.9公開了一種培養(yǎng)基及其應用與角質形成細胞的培 養(yǎng)方法，所述角質形成細胞的培養(yǎng)基包括KC-FSM無血清基礎培養(yǎng)基、KGF、EGF、谷氨酷胺和 非必需氨基酸。采用上述提供的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)后，可獲得數(shù)量大、活力高的角質形成細 胞，細胞特性在傳代過程中保持良好，另外該培養(yǎng)基是采用無血清培養(yǎng)基作為基礎培養(yǎng)基， 在保證了細胞活力的前提下，避免了異源血清帶來的風險。但是，該角質形成細胞的培養(yǎng)方 法在細胞培養(yǎng)過程中存在易氧化、易分化的缺陷，大大的限制了該角質形成細胞的培養(yǎng)方 法的使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了克服現(xiàn)有技術中角質形成細胞在體外培養(yǎng)過程中存在細胞易分化、易受成纖 維細胞污染、易氧化、貼壁時間長和細胞增殖率低的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種皮膚 角質形成細胞的培養(yǎng)基及其培養(yǎng)方法，w解決上述問題。
[0008] 本發(fā)明提供了一種皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)基，包括DMM基礎培養(yǎng)基，還包括如 下組分及其濃度:表皮生長因子2-4ng/ml、轉化生長因子3-5ng/ml、維生素 H l-3ug/ml、重 組人膜島素6-9mg/ml、轉鐵蛋白5-8ug/ml、澄皮巧10-20umol/L和白襲蘆醇6-12umol/L。
[0009] 進一步地，所述皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)基包括DMM基礎培養(yǎng)基，還包括如下組 分及其濃度:表皮生長因子化g/ml、轉化生長因子4ng/ml、維生素 H 2ug/ml、重組人膜島素 8mg/ml、轉鐵蛋白6ug/ml、澄皮巧16umo 1 /L和白襲蘆醇1 Oumo 1 /L。
[0010] 進一步地，所述DMEM基礎培養(yǎng)基為高糖型DMEM培養(yǎng)基。
[0011] 進一步地，所述轉化生長因子為轉化生長因子-0。
[001^ 另外，本發(fā)明還提供了一種皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)方法，包括W下步驟：
[001引 S1取剪除皮下組織的皮膚組織，剪成0.5cmX 0.5cm的小塊放入酶液I中，放置4°C 條件下消化過夜；
[0014] S2將經(jīng)步驟S1處理后的皮膚組織分離成表皮和真皮，將表皮加入酶液II中剪碎， 放置37°C條件下解育15-20min;
[0015] S3將經(jīng)步驟S2處理后的表皮吹打6-12次，用200-240目銅網(wǎng)過濾，濾液在1200- 150化/min離屯、，棄上清，得濾渣；
[0016] S4將步驟S3得到的濾渣接入權利要求1-4任一所述的皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)基 中，于37°C、5%C〇2的條件下培養(yǎng)5-8天，即得。
[0017]進一步地，所述步驟S1中酶液功質量濃度為0.6-0.8 %的中性蛋白酶溶液。
[001引進一步地，所述步驟S1中酶液功質量濃度為0.7 %的中性蛋白酶溶液。
[0019] 進一步地，所述步驟S2中的酶液II由質量濃度為0.3-0.5%的乙二胺四乙酸和質 量濃度為0.4-0.6 %的膜酶組成。
[0020] 進一步地，所述步驟S2中的酶液II由質量濃度為0.4%的乙二胺四乙酸和質量濃 度為0.5 %的膜酶組成。
[0021] 本發(fā)明提供的皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)基的組分中，表皮生長因子是一種多功能 的生長因子，促進細胞的生長;轉化生長因子-e可W調(diào)節(jié)細胞生長和分化;維生素 H是細胞 內(nèi)多種酶的輔酶，在蛋白質合成和物質代謝中起著重要的作用，有利于角質形成細胞的生 長;重組人膜島素可W提高合成代謝能力，刺激細胞的生長;轉鐵蛋白是血漿中主要的鐵傳 遞蛋白，為細胞內(nèi)化和細胞代謝提供所需的鐵。
[0022] 澄皮巧，分子式為C2姐34〇15，CAS號為520-26-3，白襲蘆醇，分子式為Ci4出2〇3，CAS號 為501-36-0。澄皮巧和白襲蘆醇具有抗氧化作用，有利于維持細胞的生物功能。
[0023] 進一步地，經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，使用本發(fā)明提供的皮膚角質形成細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的角質 形成細胞在1化內(nèi)貼壁，角質形成細胞在1化內(nèi)呈圓形，繼而呈楠圓形，體積變大，2天左右可 見數(shù)個角質形成細胞形成小集落，5天左右細胞匯合成片。而且使用本發(fā)明提供的皮膚角質 形成細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的角質形成細胞生長旺盛，輪廓清楚，折光性好，成鋪路石樣形態(tài)，培 養(yǎng)初期可見極少量梭形纖維細胞，隨著傳代和培養(yǎng)時間的延長，成纖維樣細胞逐漸消失，可 W獲得較高純度的角質形成細胞。
[0024] 進一步地，經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)，與高糖型DMEM培養(yǎng)基相比，使用本發(fā)明提供的皮膚角質形 成細胞培養(yǎng)基在4她和72h內(nèi)可W極顯著的（P<0.01)提高角質形成細胞的增殖率，說明本 發(fā)明提供的皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)基各組分相互協(xié)調(diào)起促進角質形成細胞增長的作用， 可W有效的提高角質形成細胞的產(chǎn)率。
[0025] 本發(fā)明提供的皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)基各組分相互協(xié)調(diào)起縮短角質形成細胞 的貼壁時間，防止角質形成細胞分化和減少角質形成細胞受成纖維細胞污染的作用；同時 該皮膚角質形成細胞培養(yǎng)基還能提高角質形成細胞的增殖率，維持角質形成細胞在傳代過 程中的活力和細胞特性，是一種較為理想的角質形成細胞體外培養(yǎng)基。
[0026] 總之，本發(fā)明提供的皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)基，與現(xiàn)有技術相比具有如下優(yōu)勢：
[0027] 1)本發(fā)明提供的皮膚角質形成細胞培養(yǎng)基可W有效的縮短角質形成細胞的貼壁 時間，防止角質形成細胞的分化，減少角質形成細胞受成纖維細胞的污染；
[0028] 2)本發(fā)明提供的皮膚角質形成細胞培養(yǎng)基可W有效提高角質形成細胞的增殖率， 維持角質形成細胞在傳代過程中的活力和細胞特性，是一種較為理想的角質形成細胞體外 培養(yǎng)基。
【具體實施方式】
[0029] W下通過具體實施例進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明不僅僅限于W下實施例。在本發(fā) 明的范圍內(nèi)或者在不脫離本發(fā)明的內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)，對本發(fā)明進行的變更、組合或替 換，對于本領域的技術人員來說是顯而易見的，且包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明中的各 組分均為常規(guī)市售產(chǎn)品，例如:表皮生長因子購于上海恒斐生物科技有限公司，重組人膜島 素購于上海翊圣生物科技有限公司，中性蛋白酶溶和膜酶購于Sigma公司，DMEM培養(yǎng)基購于 Gibco公司。
[0030] 實施例1、一種皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)基
[0031 ]所述皮膚角質形成細胞培養(yǎng)基包括高糖型DMEM基礎培養(yǎng)基，還包括如下組分及其 濃度:表皮生長因子化g/ml、轉化生長因子-防ng/ml、維生素 H lug/ml、重組人膜島素6mg/ ml、轉鐵蛋白加 g/ml、澄皮巧10皿ol/L和白襲蘆醇6皿ol/L。
[00創(chuàng)制備方法：
[0033] 向DMEM基礎培養(yǎng)基中，按所述濃度加入表皮生長因子、轉化生長因子、維生素 H、重 組人膜島素、轉鐵蛋白、澄皮巧和白襲蘆醇，混勻，過膜除菌即得。
[0034] 實施例2、一種皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)基
[0035] 所述皮膚角質形成細胞培養(yǎng)基包括高糖型DMEM基礎培養(yǎng)基，還包括如下組分及其 濃度:表皮生長因子：3ng/ml、轉化生長因子-Mng/ml、維生素 H 2ug/ml、重組人膜島素8mg/ ml、轉鐵蛋白6ug/ml、澄皮巧16皿01 /L和白襲蘆醇10皿01 /L。
[0036] 制備方法與實施例1類似。
[0037] 實施例3、一種皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)基
[003引所述皮膚角質形成細胞培養(yǎng)基包括高糖型DMEM基礎培養(yǎng)基，還包括如下組分及其 濃度:表皮生長因子4ng/ml、轉化生長因子-帖ng/ml、維生素 H 3ug/ml、重組人膜島素9mg/ ml、轉鐵蛋白8ug/ml、澄皮巧20皿01/L和白襲蘆醇12皿01/L。
[0039] 制備方法與實施例1類似。
[0040] 實施例4、一種皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)方法
[0041 ] S1取剪除皮下組織的皮膚組織，剪成0.5cmX 0.5cm的小塊放入酶液I中，所述酶液 I為質量濃度為0.7%的中性蛋白酶溶液，放置4°C條件下消化過夜；
[0042] S2將經(jīng)步驟S1處理后的皮膚組織分離成表皮和真皮，將表皮加入酶液II中剪碎， 所述酶液II由質量濃度為0.4 %的乙二胺四乙酸和質量濃度為0.5 %的膜酶組成，放置37 °C 條件下解育18min;
[0043] S3將經(jīng)步驟S2處理后的表皮吹打10次，用200目銅網(wǎng)過濾，濾液在1200r/min離屯、， 棄上清，得濾渣；
[0044] S4將步驟S3得到的濾渣接入本發(fā)明提供的皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)基中，于37 °C、5 % C〇2的條件下培養(yǎng)5-8天，即得。
[0045] 對比例1、一種皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)基
[0046] 所述皮膚角質形成細胞培養(yǎng)基包括低糖型DMEM基礎培養(yǎng)基，還包括如下組分及其 濃度:表皮生長因子：3ng/ml、轉化生長因子-Mng/ml、維生素 H 2ug/ml、重組人膜島素8mg/ ml、轉鐵蛋白6ug/ml、澄皮巧16皿ol/L和白襲蘆醇8皿ol/L。
[0047] 制備方法與實施例1類似。
[0048] 與實施例2的區(qū)別在于，基礎培養(yǎng)基為低糖型DMEM培養(yǎng)基。
[0049] 對比例2、一種皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)基
[0050] 所述皮膚角質形成細胞培養(yǎng)基包括高糖型DMEM基礎培養(yǎng)基，還包括如下組分及其 濃度:表皮生長因子：3ng/ml、轉化生長因子-Mng/ml、維生素 H 2ug/ml、重組人膜島素8mg/ ml、轉鐵蛋白6ug/ml和澄皮巧24皿ol/L。
[0051] 制備方法與實施例1類似。
[0052] 與實施例2的區(qū)別在于，沒有添加白襲蘆醇，增加了澄皮巧的濃度。
[0053] 對比例3、一種皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)基
[0054] 所述皮膚角質形成細胞培養(yǎng)基包括高糖型DMEM基礎培養(yǎng)基，還包括如下組分及其 濃度:表皮生長因子：3ng/ml、轉化生長因子-Mng/ml、維生素 H 2ug/ml、重組人膜島素8mg/ ml、轉鐵蛋白6ug/ml和白襲蘆醇24umol/L。
[0055] 制備方法與實施例1類似。
[0056] 與實施例2的區(qū)別在于，沒有添加澄皮巧，增加了白襲蘆醇的濃度。
[0057] 對比例4、一種皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)基
[0058] 所述皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)基包括高糖型DMEM基礎培養(yǎng)基，還包括如下組分及 其濃度：表皮生長因子化g/ml、轉化生長因子-Mng/ml、維生素 H 2ug/ml、重組人膜島素 8mg/ml、轉鐵蛋白6ug/ml、澄皮巧12umo 1 /L和白襲蘆醇12umo 1 /L。
[0059] 制備方法與實施例1類似。
[0060] 實施例2的區(qū)別在于，澄皮巧和白襲蘆醇的濃度均為12皿ol/L。
[0061 ]試驗例一、皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)試驗
[0062] 1、試驗對象:皮膚組織取自健康婦女脫落的子宮內(nèi)膜。
[00創(chuàng) 2、試驗材料:實施例1、實施例2、實施例3、對比例1、對比例2、對比例3和對比例4審。 備的皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)基。
[0064] 3、試驗方法：
[0065] 將脫落的子宮內(nèi)膜按照實施例4的步驟1-3進行處理，然后把處理后的濾渣放入實 施例1、實施例2、實施例3、對比例1、對比例2、對比例3和對比例4制備的皮膚角質形成細胞 的培養(yǎng)基中，分別標志為實施例1組、實施例2組、實施例3組、對比例1組、對比例2組、對比例 3組和對比例4組，于37°C、5%C02的條件下培養(yǎng)5-8天，
[0066] 并在倒置顯微鏡下觀察細胞的貼壁時間和生長情況。
[0067] 4、試驗結果：
[0068] 試驗結果如表1所示。
[0069] 表1皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)試驗
[0072]由表1可知，使用本發(fā)明實施例1-3制備的皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)基培養(yǎng)的角質形成細胞在1化內(nèi)貼壁，在1化內(nèi)細胞呈圓形，繼而呈楠圓形，體積變大，2天左右可見數(shù)個角質形成細胞形成小集落，5天左右細胞匯合成片。而使用對比例1-4制備的皮膚角質形成細
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[( 胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的角質形成細胞的貼壁時間和細胞生長時間均比本發(fā)明的實施例1-3的時間 長，說明本發(fā)明提供的皮膚角質形成細胞培養(yǎng)基可W有效的縮短角質形成細胞的貼壁時 間，防止角質形成細胞分化和減少角質形成細胞受成纖維細胞污染，是一種較為理想的角 質形成細胞體外培養(yǎng)基。
[0073] 試驗例二、皮膚角質形成細胞生長能力測定試驗
[0074] 1、試驗對象:皮膚組織取自健康婦女脫落的子宮內(nèi)膜。
[007引 2、試驗材料:實施例1、實施例2、實施例3、對比例1、對比例2、對比例3和對比例4審。 備的皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)基。
[0076] 3、試驗方法：
[0077] 3.1、將脫落的子宮內(nèi)膜按照實施例4的步驟1-3進行處理，然后把處理后的濾渣放 入實施例1、實施例2、實施例3、對比例1、對比例2、對比例3和對比例4制備的皮膚角質形成 細胞的培養(yǎng)基，分別標志為對照組、實施例1組、實施例2組、實施例3組、對比例1組、對比例2 組、對比例3組和對比例4組，于37°C、5 % C〇2的條件下培養(yǎng)，W高糖型DMEM基礎培養(yǎng)基為對 照組，將原代細胞W相同的劑量接種到96孔板上，每孔的細胞懸液為200ul，細胞數(shù)為IX 104個，每種培養(yǎng)基設3個平行孔，分別解育4她、72h;
[0078] 3.2、將^巧容液溶解在0.1111〇1/1的？85中，使其濃度為5旨/1，將培養(yǎng)板的原培養(yǎng)液 棄去，每孔加入200ul培養(yǎng)液，每lOOul培養(yǎng)液中含MTTlOul，將培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培 養(yǎng)地，然后每孔加入20ul的DMS0中止反應，將培養(yǎng)板放在振蕩器上充分混勻，用酶標儀測定 570nm波長時每孔的光密度值(0D值），每組重復3次，取平均值。
[00巧]4、試驗結果：
[0080] 試驗結果如表2所示。
[0081 ] 表2皮膚角質形成細胞生長能力測定試驗(n = 3 +SD)
[0082]
[0083] 注:與對照組相比吁<0.05，*中<0.01。
[0084] 由表2可知，與對照組相比，使用本發(fā)明實施例1-3制備的皮膚角質形成細胞的培 養(yǎng)基可W極顯著的(P<〇.01)提高角質形成細胞的增殖率，而使用本發(fā)明實施例1-4制備的 皮膚角質形成細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)的角質形成細胞在4她和72h內(nèi)的細胞增殖率均比本發(fā)明的 實施例1-3的增殖率差，說明本發(fā)明提供的皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)基各組分相互協(xié)調(diào)起 促進角質形成細胞增長的作用，可W有效的提高角質形成細胞的產(chǎn)率。
【主權項】
1. 一種皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)基，其特征在于，包括DMEM基礎培養(yǎng)基，還包括如下組 分及其濃度:表皮生長因子2_4ng/ml、轉化生長因子3-5ng/ml、維生素 H l-3ug/ml、重組人 胰島素6_9mg/ml、轉鐵蛋白5_8ug/ml、橙皮苷10_20umol/L和白藜蘆醇6_12umol/L〇2. 如權利要求1所述的皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)基，其特征在于，包括D Μ E Μ基礎培養(yǎng) 基，還包括如下組分及其濃度:表皮生長因子3ng/ml、轉化生長因子4ng/ml、維生素 H 2ug/ ml、重組人胰島素8mg/ml、轉鐵蛋白6ug/ml、橙皮苷16umol/L和白藜蘆醇10umol/L〇3. 如權利要求1或2所述的皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)基，其特征在于，所述DMEM基礎培 養(yǎng)基為高糖型DMEM培養(yǎng)基。4. 如權利要求1或2所述的皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)基，其特征在于，所述轉化生長因 子為轉化生長因子-β。5. -種皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟： S1取剪除皮下組織的皮膚組織，剪成0.5cmX0.5cm的小塊放入酶液I中，放置4°C條件 下消化過夜； S2將經(jīng)步驟S1處理后的皮膚組織分離成表皮和真皮，將表皮加入酶液II中剪碎，放置 37°C條件下孵育15-20min; S3將經(jīng)步驟S2處理后的表皮吹打6-12次，用200-240目銅網(wǎng)過濾，濾液在1200-1500r/ min離心，棄上清，得濾渣； S4將步驟S3得到的濾渣接入權利要求1-4任一所述的皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)基中， 于37°C、5%C02的條件下培養(yǎng)5-8天，即得。6. 如權利要求5所述的皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟S1中酶液 I為質量濃度為〇. 6-0.8 %的中性蛋白酶溶液。7. 如權利要求6所述的皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟S1中酶液 I為質量濃度為〇. 7 %的中性蛋白酶溶液。8. 如權利要求5所述的皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟S2中的酶 液II由質量濃度為〇. 3-0.5 %的乙二胺四乙酸和質量濃度為0.4-0.6 %的胰酶組成。9. 如權利要求8所述的皮膚角質形成細胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟S2中的酶 液II由質量濃度為〇. 4 %的乙二胺四乙酸和質量濃度為0.5 %的胰酶組成。
【文檔編號】C12N5/071GK106047793SQ201610439563
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月16日
【發(fā)明人】陳松彬, 易萍, 倪彥艷, 張愛萍, 劉杰森
【申請人】廣東科瑋生物技術股份有限公司