一種脂肪干細(xì)胞的提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種脂肪干細(xì)胞的提取方法，包括以下步驟：抽取人體脂肪到離心管中，加生理鹽水混勻后離心，將沉積層棄掉；再次加入生理鹽水混勻后離心，將沉積層棄掉；然后向離心管中加EDTA?胰蛋白酶和I型膠原酶，混勻后放入恒溫?fù)u床中消化；取出離心管，加入無(wú)血清培養(yǎng)基終止消化，混勻，離心，將脂肪層和中間層棄掉；再加生理鹽水，混勻后離心，棄掉上清液；加入培養(yǎng)基混勻，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)皿中；待繁殖、傳代后，回收，檢驗(yàn)，合格即得。本發(fā)明提出的一種脂肪干細(xì)胞的提取方法，提取過(guò)程中無(wú)需機(jī)械破碎，操作簡(jiǎn)單，成本低，所得脂肪干細(xì)胞純度高，數(shù)量高，繁殖傳代快且存活率高，可廣泛應(yīng)用于整形美容行業(yè)。
【專利說(shuō)明】
一種脂肪干細(xì)胞的提取方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及生物細(xì)胞技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種脂肪干細(xì)胞的提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]干細(xì)胞是具有自我復(fù)制和多向分化的原始細(xì)胞，是機(jī)體的起源細(xì)胞，是形成人體各種組織器官的原始細(xì)胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細(xì)胞或組織器官，醫(yī)學(xué)界稱其為“萬(wàn)用細(xì)胞”。干細(xì)胞是指尚未分化的細(xì)胞，存在于早期胚胎、胎盤(pán)及其附屬物、骨髓、外周血和成年組織中，它能夠被培養(yǎng)成肌肉、骨骼和神經(jīng)等200多種人體細(xì)胞、組織和器官。干細(xì)胞技術(shù)最顯著的作用就是:能再造一種全新的、正常的甚至更年輕的細(xì)胞、組織和器官。
[0003]脂肪干細(xì)胞是近年來(lái)從脂肪組織中分離得到的一種具有多向分化潛能的干細(xì)胞，脂肪干細(xì)胞能夠在體外穩(wěn)定增殖且衰亡率低，同時(shí)它具有取材容易、少量組織即可獲取大量干細(xì)胞，適宜大規(guī)模培養(yǎng)，對(duì)機(jī)體損傷小等優(yōu)點(diǎn)，而且其來(lái)源廣泛，體內(nèi)儲(chǔ)備量大，適宜自體移植，逐漸成為近年來(lái)新的研究熱點(diǎn)之一，如何實(shí)現(xiàn)從干細(xì)胞到脂肪細(xì)胞的分化，是構(gòu)建工程脂肪組織不可回避的問(wèn)題。基于上述問(wèn)題，本發(fā)明提出了一種脂肪干細(xì)胞的提取方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺點(diǎn)，而提出的一種脂肪干細(xì)胞的提取方法。
[0005]—種脂肪干細(xì)胞的提取方法，包括以下步驟:
51、抽取人體脂肪，分裝到50ml離心管中，每支離心管分裝18?20ml脂肪，然后向每支離心管中加生理鹽水至40?45ml ；
52、用吸管將步驟SI中離心管里的脂肪和生理鹽水吹吸混勻，以500?1500r/min的轉(zhuǎn)速離心4?8min，然后靜置3?5min ；
53、將吸管伸入經(jīng)步驟S2靜置后的離心管底部，將沉積層吸取棄掉，然后再加入生理鹽水至40?45ml ；
54、將步驟S3中離心管里的脂肪和生理鹽水吹吸混勻，以500?1500r/min的轉(zhuǎn)速離心4?8min，靜置3?5min，再用吸管伸入離心管底部，將沉積層吸取棄掉；
55、將步驟S4中剩余的脂肪調(diào)整到每支離心管12?16ml，然后向離心管中加EDTA-胰蛋白酶8?16ml，再加I型膠原酶2?4ml，吹吸均勾后放入恒溫?fù)u床中消化0.8?Ih ；
56、取出步驟S5中的離心管，向每支離心管中加1?15ml的無(wú)血清培養(yǎng)基終止消化，吹吸混勾，以1500?2500r/min離心3?6min，靜置3?5min后，將脂肪層和中間層棄掉，留下底部細(xì)胞層；
57、向步驟S6中得到的底部細(xì)胞層中加生理鹽水至40?45ml，吹吸混勻，以1500?2500r/min離心3?6min，靜置3?5min后，棄掉上清液；
58、將步驟S7中所得的細(xì)胞加入10?15ml的培養(yǎng)基混勻，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，靜置70?75h后換液；
S9、步驟S8中的細(xì)胞繁殖至一定數(shù)量時(shí)進(jìn)行傳代，待細(xì)胞傳至第5代，且第5代細(xì)胞達(dá)到規(guī)定數(shù)量時(shí)回收，進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)合格后提供給客戶進(jìn)行回輸或面部注射。
[0006]優(yōu)選的，所述步驟SI中抽取的脂肪為人體腹部、臀部或大腿脂肪。
[0007]優(yōu)選的，所述步驟S5中加入的EDTA-胰蛋白酶和I型膠原酶的重量比為4:1。
[0008]優(yōu)選的，所述步驟S5中恒溫?fù)u床的轉(zhuǎn)速為150?250r/min。
[0009]優(yōu)選的，所述步驟S5中恒溫?fù)u床的溫度為37°C。
[0010]優(yōu)選的，所述步驟S9中的檢查內(nèi)容包括:無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、內(nèi)毒素檢查。
[0011]本發(fā)明提出的一種脂肪干細(xì)胞的提取方法，取材于人體脂肪細(xì)胞較多的腹部、臀部或大腿，不僅能使脂肪充分發(fā)揮其作用，還能使人體曲線更完美，提取過(guò)程中無(wú)需機(jī)械破碎，所得脂肪干細(xì)胞純度高，數(shù)量高，繁殖傳代快且存活率高，可廣泛應(yīng)用于整形美容行業(yè)，本發(fā)明提出的提取方法，操作簡(jiǎn)單，成本低，值得推廣。
【具體實(shí)施方式】
[0012]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步解說(shuō)。
[0013]實(shí)施例一
本發(fā)明提出的一種脂肪干細(xì)胞的提取方法，包括以下步驟:
51、抽取人體腹部脂肪，分裝到50ml離心管中，每支離心管分裝19ml脂肪，然后向每支離心管中加生理鹽水至43ml ；
52、用吸管將步驟SI中離心管里的脂肪和生理鹽水吹吸混勻，以1200r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，然后靜置5min ；
53、將吸管伸入經(jīng)步驟S2靜置后的離心管底部，將沉積層吸取棄掉，然后再加入生理鹽水至43ml ；
54、將步驟S3中離心管里的脂肪和生理鹽水吹吸混勻，以1200r/min的轉(zhuǎn)速離心5min，靜置5min，再用吸管伸入離心管底部，將沉積層吸取棄掉；
55、將步驟S4中剩余的脂肪調(diào)整到每支離心管14ml，然后向離心管中加EDTA-胰蛋白酶8ml，再加I型膠原酶2ml，吹吸均勻后放入37°C的恒溫?fù)u床中消化0.8h，恒溫?fù)u床的轉(zhuǎn)速為220r/min；
56、取出步驟S5中的離心管，向每支離心管中加12ml的無(wú)血清培養(yǎng)基終止消化，吹吸混勾，以2200r/min離心4min，靜置5min后，將脂肪層和中間層棄掉，留下底部細(xì)胞層；
57、向步驟S6中得到的底部細(xì)胞層中加生理鹽水至43ml，吹吸混勻，以2200r/min離心4min，靜置5min后，棄掉上清液；
58、將步驟S7中所得的細(xì)胞加入13ml的培養(yǎng)基混勻，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，靜置7 Ih后換液；
59、步驟S8中的細(xì)胞繁殖至一定數(shù)量時(shí)進(jìn)行傳代，待細(xì)胞傳至第5代，且第5代細(xì)胞達(dá)到規(guī)定數(shù)量時(shí)回收，進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、內(nèi)毒素檢驗(yàn)，檢驗(yàn)合格后提供給客戶進(jìn)行回輸或面部注射。
[0014]實(shí)施例二
本發(fā)明提出的一種脂肪干細(xì)胞的提取方法，包括以下步驟: 51、抽取人體臀部脂肪，分裝到50ml離心管中，每支離心管分裝18ml脂肪，然后向每支離心管中加生理鹽水至40ml ；
52、用吸管將步驟SI中離心管里的脂肪和生理鹽水吹吸混勻，以800r/min的轉(zhuǎn)速離心7min，然后靜置4min ；
53、將吸管伸入經(jīng)步驟S2靜置后的離心管底部，將沉積層吸取棄掉，然后再加入生理鹽水至40ml ；
54、將步驟S3中離心管里的脂肪和生理鹽水吹吸混勻，以800r/min的轉(zhuǎn)速離心7min，靜置4min，再用吸管伸入離心管底部，將沉積層吸取棄掉；
55、將步驟S4中剩余的脂肪調(diào)整到每支離心管12ml，然后向離心管中加EDTA-胰蛋白酶16ml，再加〗型膠原酶4ml，吹吸均勻后放入37°C的恒溫?fù)u床中消化lh，恒溫?fù)u床的轉(zhuǎn)速為180r/min；
56、取出步驟S5中的離心管，向每支離心管中加1ml的無(wú)血清培養(yǎng)基終止消化，吹吸混勾，以2500r/min離心3min，靜置5min后，將脂肪層和中間層棄掉，留下底部細(xì)胞層；
57、向步驟S6中得到的底部細(xì)胞層中加生理鹽水至40ml，吹吸混勻，以2500r/min離心3min，靜置5min后，棄掉上清液；
58、將步驟S7中所得的細(xì)胞加入12ml的培養(yǎng)基混勻，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，靜置75h后換液；
59、步驟S8中的細(xì)胞繁殖至一定數(shù)量時(shí)進(jìn)行傳代，待細(xì)胞傳至第5代，且第5代細(xì)胞達(dá)到規(guī)定數(shù)量時(shí)回收，進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、內(nèi)毒素檢驗(yàn)，檢驗(yàn)合格后提供給客戶進(jìn)行回輸或面部注射。
[0015]實(shí)施例三
本發(fā)明提出的一種脂肪干細(xì)胞的提取方法，包括以下步驟:
51、抽取人體大腿脂肪，分裝到50ml離心管中，每支離心管分裝20ml脂肪，然后向每支離心管中加生理鹽水至45ml ；
52、用吸管將步驟SI中離心管里的脂肪和生理鹽水吹吸混勻，以lOOOr/min的轉(zhuǎn)速離心6min，然后靜置4min ；
53、將吸管伸入經(jīng)步驟S2靜置后的離心管底部，將沉積層吸取棄掉，然后再加入生理鹽水至45ml ；
54、將步驟S3中離心管里的脂肪和生理鹽水吹吸混勻，以1000r/min的轉(zhuǎn)速離心6min，靜置4min，再用吸管伸入離心管底部，將沉積層吸取棄掉；
55、將步驟S4中剩余的脂肪調(diào)整到每支離心管15ml，然后向離心管中加EDTA-胰蛋白酶12ml，再加I型膠原酶3ml，吹吸均勻后放入37°C的恒溫?fù)u床中消化0.9h，恒溫?fù)u床的轉(zhuǎn)速為200r/min；
56、取出步驟S5中的離心管，向每支離心管中加13ml的無(wú)血清培養(yǎng)基終止消化，吹吸混勾，以1800r/min離心5min，靜置3min后，將脂肪層和中間層棄掉，留下底部細(xì)胞層；
57、向步驟S6中得到的底部細(xì)胞層中加生理鹽水至45ml，吹吸混勻，以1800r/min離心5min，靜置3min后，棄掉上清液；
58、將步驟S7中所得的細(xì)胞加入15ml的培養(yǎng)基混勻，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，靜置73h后換液； S9、步驟S8中的細(xì)胞繁殖至一定數(shù)量時(shí)進(jìn)行傳代，待細(xì)胞傳至第5代，且第5代細(xì)胞達(dá)到規(guī)定數(shù)量時(shí)回收，進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、內(nèi)毒素檢驗(yàn)，檢驗(yàn)合格后提供給客戶進(jìn)行回輸或面部注射。
[0016]實(shí)施例四
本發(fā)明提出的一種脂肪干細(xì)胞的提取方法，包括以下步驟:
51、抽取人體腹部脂肪，分裝到50ml離心管中，每支離心管分裝18ml脂肪，然后向每支離心管中加生理鹽水至42ml ；
52、用吸管將步驟SI中離心管里的脂肪和生理鹽水吹吸混勻，以500r/min的轉(zhuǎn)速離心8min，然后靜置3min ；
53、將吸管伸入經(jīng)步驟S2靜置后的離心管底部，將沉積層吸取棄掉，然后再加入生理鹽水至42ml ；
54、將步驟S3中離心管里的脂肪和生理鹽水吹吸混勻，以500r/min的轉(zhuǎn)速離心8min，靜置3min，再用吸管伸入離心管底部，將沉積層吸取棄掉；
55、將步驟S4中剩余的脂肪調(diào)整到每支離心管16ml，然后向離心管中加EDTA-胰蛋白酶8ml，再加I型膠原酶2ml，吹吸均勻后放入37°C的恒溫?fù)u床中消化0.8h，恒溫?fù)u床的轉(zhuǎn)速為250r/min；
56、取出步驟S5中的離心管，向每支離心管中加15ml的無(wú)血清培養(yǎng)基終止消化，吹吸混勾，以2000r/min離心4min，靜置4min后，將脂肪層和中間層棄掉，留下底部細(xì)胞層；
57、向步驟S6中得到的底部細(xì)胞層中加生理鹽水至42ml，吹吸混勻，以2000r/min離心4min，靜置4min后，棄掉上清液；
58、將步驟S7中所得的細(xì)胞加入14ml的培養(yǎng)基混勻，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，靜置70h后換液；
59、步驟S8中的細(xì)胞繁殖至一定數(shù)量時(shí)進(jìn)行傳代，待細(xì)胞傳至第5代，且第5代細(xì)胞達(dá)到規(guī)定數(shù)量時(shí)回收，進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、內(nèi)毒素檢驗(yàn)，檢驗(yàn)合格后提供給客戶進(jìn)行回輸或面部注射。
[0017]實(shí)施例五
本發(fā)明提出的一種脂肪干細(xì)胞的提取方法，包括以下步驟:
51、抽取人體臀部脂肪，分裝到50ml離心管中，每支離心管分裝19ml脂肪，然后向每支離心管中加生理鹽水至44ml ；
52、用吸管將步驟SI中離心管里的脂肪和生理鹽水吹吸混勻，以1500r/min的轉(zhuǎn)速離心4min，然后靜置5min ；
53、將吸管伸入經(jīng)步驟S2靜置后的離心管底部，將沉積層吸取棄掉，然后再加入生理鹽水至44ml ；
54、將步驟S3中離心管里的脂肪和生理鹽水吹吸混勻，以1500r/min的轉(zhuǎn)速離心4min，靜置5min，再用吸管伸入離心管底部，將沉積層吸取棄掉；
55、將步驟S4中剩余的脂肪調(diào)整到每支離心管13ml，然后向離心管中加EDTA-胰蛋白酶12ml，再加I型膠原酶3ml，吹吸均勻后放入37°C的恒溫?fù)u床中消化lh，恒溫?fù)u床的轉(zhuǎn)速為150r/min；
56、取出步驟S5中的離心管，向每支離心管中加14ml的無(wú)血清培養(yǎng)基終止消化，吹吸混勾，以1500r/min離心6min，靜置3min后，將脂肪層和中間層棄掉，留下底部細(xì)胞層；
57、向步驟S6中得到的底部細(xì)胞層中加生理鹽水至44ml，吹吸混勻，以1500r/min離心6min，靜置3min后，棄掉上清液；
58、將步驟S7中所得的細(xì)胞加入1ml的培養(yǎng)基混勻，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，靜置72h后換液；
59、步驟S8中的細(xì)胞繁殖至一定數(shù)量時(shí)進(jìn)行傳代，待細(xì)胞傳至第5代，且第5代細(xì)胞達(dá)到規(guī)定數(shù)量時(shí)回收，進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、內(nèi)毒素檢驗(yàn)，檢驗(yàn)合格后提供給客戶進(jìn)行回輸或面部注射。
[0018]本發(fā)明提出的一種脂肪干細(xì)胞的提取方法，取材于人體脂肪細(xì)胞較多的腹部、臀部或大腿，不僅能使脂肪充分發(fā)揮其作用，還能使人體曲線更完美，提取過(guò)程中無(wú)需機(jī)械破碎，所得脂肪干細(xì)胞純度高，數(shù)量高，繁殖傳代快且存活率高，可廣泛應(yīng)用于整形美容行業(yè)，本發(fā)明提出的提取方法，操作簡(jiǎn)單，成本低，值得推廣。
[0019]以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種脂肪干細(xì)胞的提取方法，其特征在于，包括以下步驟: 51、抽取人體脂肪，分裝到50ml離心管中，每支離心管分裝18?20ml脂肪，然后向每支離心管中加生理鹽水至40?45ml ； 52、用吸管將步驟SI中離心管里的脂肪和生理鹽水吹吸混勻，以500?1500r/min的轉(zhuǎn)速離心4?8min，然后靜置3?5min ； 53、將吸管伸入經(jīng)步驟S2靜置后的離心管底部，將沉積層吸取棄掉，然后再加入生理鹽水至40?45ml ； 54、將步驟S3中離心管里的脂肪和生理鹽水吹吸混勻，以500?1500r/min的轉(zhuǎn)速離心4?8min，靜置3?5min，再用吸管伸入離心管底部，將沉積層吸取棄掉； 55、將步驟S4中剩余的脂肪調(diào)整到每支離心管12?16ml，然后向離心管中加EDTA-胰蛋白酶8?16ml，再加I型膠原酶2?4ml，吹吸均勾后放入恒溫?fù)u床中消化0.8?Ih ； 56、取出步驟S5中的離心管，向每支離心管中加10?15ml的無(wú)血清培養(yǎng)基終止消化，吹吸混勾，以1500?2500r/min離心3?6min，靜置3?5min后，將脂肪層和中間層棄掉，留下底部細(xì)胞層； 57、向步驟S6中得到的底部細(xì)胞層中加生理鹽水至40?45ml，吹吸混勻，以1500?2500r/min離心3?6min，靜置3?5min后，棄掉上清液； 58、將步驟S7中所得的細(xì)胞加入10?15ml的培養(yǎng)基混勻，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，靜置70?75h后換液； 59、步驟S8中的細(xì)胞繁殖至一定數(shù)量時(shí)進(jìn)行傳代，待細(xì)胞傳至第5代，且第5代細(xì)胞達(dá)到規(guī)定數(shù)量時(shí)回收，進(jìn)行檢驗(yàn)，檢驗(yàn)合格后提供給客戶進(jìn)行回輸或面部注射。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脂肪干細(xì)胞的提取方法，其特征在于，所述步驟SI中抽取的脂肪為人體腹部、臀部或大腿脂肪。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脂肪干細(xì)胞的提取方法，其特征在于，所述步驟S5中加入的Η)ΤΑ-胰蛋白酶和I型膠原酶的重量比為4:1。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脂肪干細(xì)胞的提取方法，其特征在于，所述步驟S5中恒溫?fù)u床的轉(zhuǎn)速為150?250r/min。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脂肪干細(xì)胞的提取方法，其特征在于，所述步驟S5中恒溫?fù)u床的溫度為37 °C。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脂肪干細(xì)胞的提取方法，其特征在于，所述步驟S9中的檢查內(nèi)容包括:無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、內(nèi)毒素檢查。
【文檔編號(hào)】C12N5/0775GK106047805SQ201610694409
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年8月22日
【發(fā)明人】于登偉, 于佃才, 李子合
【申請(qǐng)人】湖州賽托森生物科技發(fā)展有限公司