一種適用于高密度細胞培養(yǎng)體系的免疫細胞的無血清培養(yǎng)基的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種適用于高密度細胞培養(yǎng)體系的免疫細胞的無血清培養(yǎng)基，其包括基礎培養(yǎng)基和添加組分，其中，所述基礎培養(yǎng)基為RPMI 1640；所述添加組分及其濃度如下：人白蛋白，12?16g/L；轉鐵蛋白，20?25mg/L；人重組胰島素，24?30mg/L；L?谷氨酰胺，8?10g/L；HEPES，5?7g/L；以及白介素?2，3×105?8×105IU/L。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的免疫細胞無血清培養(yǎng)基采用RPMI 1640作為基礎培養(yǎng)基以及特定的添加組分的組合，能夠使得免疫細胞快速、大量的增殖，且細胞存活率更高，特別適合免疫細胞的高密度細胞培養(yǎng)體系。
【專利說明】
-種適用于高密度細胞培養(yǎng)體系的免疫細胞的無血清培養(yǎng)基
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及一種適用于高密度細胞培養(yǎng)體系的免疫細胞的無血清培養(yǎng)基，屬于細 胞培養(yǎng)技術領域。
【背景技術】
[0002] 細胞免疫治療是采集人體自身免疫細胞，經過體外培養(yǎng)，使其數(shù)量成千倍增多，祀 向性殺傷功能增強，然后再回輸?shù)饺梭w來殺滅血液及組織中的病原體、癌細胞、突變的細 胞，打破免疫耐受，激活和增強機體的免疫能力，兼顧治療和保健的雙重功效，例如常見的 細胞免疫治療有細胞因子誘導的殺傷細胞(CIK)療法、樹突狀細胞(DC)療法、DC+CIK細胞療 法、自然殺傷細胞(NK)療法、DC-T細胞療法等。
[0003] 上述細胞免疫治療中比較重要的一個環(huán)節(jié)是"免疫細胞的體外培養(yǎng)"，而運個環(huán)節(jié) 中最重要的是用于免疫細胞培養(yǎng)的無血清培養(yǎng)基。雖然血清是動物細胞培養(yǎng)中最基本的添 加物，尤其是在原代培養(yǎng)或者細胞生長狀況不良時，常常會先使用有血清的培養(yǎng)液進行培 養(yǎng)，待細胞生長旺盛W后，再換成無血清培養(yǎng)液;但由于動物血清中含有動物成分，且成分 復雜，應用與臨床細胞治療體系中，可能會導致一些潛在的風險，因此，無血清培養(yǎng)基被廣 泛的應用于培養(yǎng)哺乳動物W制備單克隆抗體，病毒抗原和重組蛋白等。
[0004] 無血清培養(yǎng)基是指不需要添加血清就可W維持細胞在體外較長時間生長繁殖的 合成培養(yǎng)基，可W應用于培養(yǎng)免疫細胞，例如淋己細胞（例如，T淋己細胞、B細胞、NK細胞 等）、樹突狀細胞(也稱DC細胞）、單核/巨隧細胞等。
[0005] 關于細胞培養(yǎng)體系，現(xiàn)有技術中除了常規(guī)的培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶等二維的細胞 培養(yǎng)體系，現(xiàn)在已研發(fā)出=維培養(yǎng)體系，例如目前市售的高密度細胞培養(yǎng)桶，是一種既可W 適用于貼壁細胞，又可W適用于懸浮細胞的=維培養(yǎng)體系，可W快速地培養(yǎng)大量細胞，且可 W進行為期半年W上的長期細胞培養(yǎng)，不需要經常更換耗材，與傳統(tǒng)的培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿和培 養(yǎng)瓶相比，更方便、成本更低，因此受到本領域研發(fā)人員的廣泛關注。
[0006] 然而，現(xiàn)有技術中的無血清培養(yǎng)基大多適用于中等規(guī)模的細胞培養(yǎng)體系，一般來 說無法適用于大規(guī)模的、高密度的細胞培養(yǎng);另一方面，現(xiàn)有的無血清培養(yǎng)基僅適用于培養(yǎng) 板、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶等二維的細胞培養(yǎng)體系，無法適用于高密度細胞培養(yǎng)桶運樣的=維培養(yǎng) 體系。
[0007] 現(xiàn)在亟待開發(fā)專用于高密度細胞培養(yǎng)體系的免疫細胞的無血清培養(yǎng)基。

【發(fā)明內容】

[000引鑒于相關技術的上述問題和/或其他問題，本發(fā)明一方面提供了一種適用于高密 度細胞培養(yǎng)體系的免疫細胞的無血清培養(yǎng)基，其包括基礎培養(yǎng)基和添加組分，其中，所述基 礎培養(yǎng)基為RPMI 1640 ;所述添加組分及其濃度如下：人白蛋白，12-16g/l;轉鐵蛋白，20- 25mg/l;人重組膜島素，24-30mg/L;k谷氨酷胺，8-10g/l;肥?65，5-7g/L; W及白介素-2，3 X 105-8X 105IU/1;各添加組分的濃度W所述無血清培養(yǎng)基的總體積為基準。
[0009] 優(yōu)選的，W所述無血清培養(yǎng)基的總體積為基準，所述RMPI 1640培養(yǎng)基的干粉量為 14.8-19.8g/Lo
[0010] 優(yōu)選的，W所述無血清培養(yǎng)基的總體積為基準，所述RMPI 1640培養(yǎng)基的干粉量為 18g/L，所述人白蛋白的濃度為13g/L，所述轉鐵蛋白的濃度為22mg/L，所述人重組膜島素的 濃度為27mg/L，W及所述k谷氨酷胺的濃度為9g/L。
[0011] 優(yōu)選的，所述肥PES的濃度為6g/L。
[001^ 優(yōu)選的，所述白介素-2的濃度為5X 105iU/L。
[0013] 優(yōu)選的，所述添加組分還包括慶大霉素和鏈霉素，所述慶大霉素的濃度為IX 105- 4X105IU/L，所述鏈霉素的濃度為1 X 105-4X 105IU/L。
[0014] 優(yōu)選的，所述添加組分還包括酪紅鋼，所述酪紅鋼的濃度為5-7mg/l;所述無血清 培養(yǎng)基的抑值為7.2~7.6。
[0015] 本發(fā)明另一方面提供了上述的無血清培養(yǎng)基在高密度細胞培養(yǎng)體系中的應用。
[0016] 優(yōu)選的，所述高密度細胞培養(yǎng)體系為高密度細胞培養(yǎng)桶。
[0017] 優(yōu)選的，所述免疫細胞為CIK細胞。
[001引本發(fā)明的適用于高密度細胞培養(yǎng)體系的免疫細胞的無血清培養(yǎng)基，采用RPMI 1640作為基礎培養(yǎng)基W及特定的添加組分的組合，尤其是人白蛋白、轉鐵蛋白、人重組膜島 素和心谷氨酷胺，四者同時滿足特定的濃度范圍時，能夠使得免疫細胞快速、大量的增殖， 且細胞存活率更高，特別適合免疫細胞的高密度細胞培養(yǎng)體系。
【具體實施方式】
[0019] W下通過實施例對本發(fā)明作進一步的說明，但本發(fā)明并不限于運些具體實施方 式。
[0020] 在本發(fā)明的一個具體實施方案中，一種適用于高密度細胞培養(yǎng)體系的免疫細胞的 無血清培養(yǎng)基，其包括基礎培養(yǎng)基和添加組分，其中，所述基礎培養(yǎng)基為RPMI 1640;所述添 加組分及其濃度如下：人白蛋白，12-16g/l;轉鐵蛋白，20-25mg/l;人重組膜島素，24-30mg/ 谷氨酷胺，8-10g/l;肥陽S，5-7g/L; W及白介素-2,3X 105-8X 105IU/L。
[0021] 本發(fā)明的發(fā)明人經過大量的研究試驗發(fā)現(xiàn)，當免疫細胞的無血清培養(yǎng)基采用RPMI 1640作為基礎培養(yǎng)基W及上述特定的添加組分的組合，尤其是人白蛋白、轉鐵蛋白、人重組 膜島素和心谷氨酷胺，四者同時滿足上述的濃度范圍時，能夠使得免疫細胞快速、大量的增 殖，且細胞存活率更高，特別適合免疫細胞的高密度細胞培養(yǎng)體系。
[0022] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，W所述無血清培養(yǎng)基的總體積為基準，所述 RMPI 1640培養(yǎng)基的干粉量為14.8-19.8g/L。
[0023] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，W所述無血清培養(yǎng)基的總體積為基準，所述 RMPI 1640培養(yǎng)基的干粉量為18g/L，人白蛋白的濃度為13g/L，轉鐵蛋白的濃度為22mg/L， 人重組膜島素的濃度為27111旨/1，^及心谷氨酷胺的濃度為9g/L。當本發(fā)明的免疫細胞的無 血清培養(yǎng)基中，人白蛋白、轉鐵蛋白、人重組膜島素和k谷氨酷胺同時采用上述特定的濃度 時，特別適合免疫細胞的高密度細胞培養(yǎng)體系，尤其是諸如高密度細胞培養(yǎng)桶之類的=維 培養(yǎng)體系，具有較好的增殖效果和細胞存活率。
[0024] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，無血清培養(yǎng)基中還可W添加抗生素，添加組分 還包括慶大霉素和鏈霉素，慶大霉素的濃度為1 X 105-4X 105IU/L，鏈霉素的濃度為1 X lO5- 4X105IU/L。運兩種抗生素組合及其特定的濃度，特別適合免疫細胞的高密度細胞培養(yǎng)體 系，抗菌效果優(yōu)異，細胞存活率高。
[0025] 在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案中，所述添加組分還包括酪紅鋼，所述酪紅鋼的 濃度為5-7mg/L。酪紅鋼可W作為培養(yǎng)基中的酸堿指示劑，當采用5-7mg/L的濃度時，更優(yōu)選 6mg/L的濃度時，對于免疫細胞的高密度細胞培養(yǎng)體系來說，酸堿指示非常靈敏。
[0026] 在本發(fā)明的再一個優(yōu)選實施方案中，將該無血清培養(yǎng)基的pH值控制在7.2~7.6。
[0027] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基是專用于高密度細胞培 養(yǎng)桶的免疫細胞無血清培養(yǎng)基。
[0028] 在本分嗎的一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的無血清培養(yǎng)基是專用于CIK細胞的高 密度細胞培養(yǎng)體系的無血清培養(yǎng)基。
[0029] 實施例1
[0030] 實施例1的適用于高密度細胞培養(yǎng)體系的免疫細胞的無血清培養(yǎng)基的配制過程如 下：
[0031] 步驟1):在無菌條件下將合成的RPMI1640干粉在電子天平上稱取180g后置于消毒 容器內，力的L純化水稀釋后攬拌均勻獲得基礎培養(yǎng)基；
[00創(chuàng)步驟2):將添加組分：130g人白蛋白、220mg轉鐵蛋白、270mg人重組膜島素、90g k 谷氨酷胺、60g皿PES、2g慶大霉素(相當于2X105IU/L)和2g鏈霉素(相當于2X105IU/L)、5 X 106IU白介素-2 W及60mg酪紅鋼鹽依次加入步驟1)獲得的基礎培養(yǎng)基中，充分混勻；
[0033] 步驟3):過濾滅菌，再調節(jié)pH值至7.4±0.2，最后加入純化水將提及調節(jié)至lOL
[0034] 步驟4):培養(yǎng)基配制完成后，過濾滅菌，分裝、封口，最后冷藏(-20°C環(huán)境)備用。 [003引實施例2
[0036] 實施例2的適用于高密度細胞培養(yǎng)體系的免疫細胞的無血清培養(yǎng)基的配制過程如 下：
[0037] 步驟1):在無菌條件下將合成的RPMI1640干粉在電子天平上稱取180g后置于消毒 容器內，力的L純化水稀釋后攬拌均勻獲得基礎培養(yǎng)基；
[0038] 步驟2):將添加組分：126g人白蛋白、200mg轉鐵蛋白、260mg人重組膜島素、88g k 谷氨酷胺、65g皿PES、2.2g慶大霉素（相當于2.2X105IU/L)和2.2g鏈霉素（相當于2.2X 105IU/1)、4X106IU白介素-2W及65mg酪紅鋼鹽依次加入步驟1)獲得的基礎培養(yǎng)基中，充分 混勻；
[0039] 步驟3):過濾滅菌，再調節(jié)pH值至7.4±0.2，最后加入純化水將提及調節(jié)至lOL
[0040] 步驟4):培養(yǎng)基配制完成后，過濾滅菌，分裝、封口，最后冷藏(-20°C環(huán)境)備用。 [0041 ] 應用例1和應用例2
[0042] 人外周血單個核細胞分離
[0043] 人工采集外周血50-100ml，入兩個50ml離屯、管中。首先在2000巧m轉速下離屯、8分 鐘，留下血細胞沉淀。用人淋己細胞分離液分離單個核細胞，按體積比1:1用生理鹽水懸浮 血細胞。20(K)rpm轉速下離屯、20分鐘。離屯、好的樣品從上至下依次為：生理鹽水和少量血漿 層;單個核細胞層(核細胞層為少量白色層）、淋己分離液層W及粒細胞紅細胞層。將單個核 細胞層吸出轉移到1個50ml離屯、管中。
[0044] 向收集單個核細胞的離屯、管中添加生理鹽水至45ml，旋緊蓋子顛倒混勻，進行3次 梯度離屯、洗涂(依次為：180化pm轉速離屯、8分鐘、150化pm轉速離屯、8分鐘、120化pm轉速離屯、 8分鐘），離屯、溫度為20°C，最后收集細胞沉淀，獲得CIK(切tokine-Induced Ki 1 ler，細胞因 子誘導的殺傷細胞)細胞，加入本發(fā)明實施例1的無血清培養(yǎng)基使得細胞濃度調整至1.2X 106 個/ml。
[0045] 應用例1:采用市售的FiberCell品牌C2025型號的高密度細胞培養(yǎng)桶（參見 門berCell細胞培養(yǎng)系統(tǒng)產品銷售網頁），W及本發(fā)明實施例1獲得的無血清培養(yǎng)基進行CIK 細胞的培養(yǎng)。
[0046] 將5mlCIK細胞濃度為1.2 X 106個/ml的培養(yǎng)基用注射器載入上述的高密度細胞培 養(yǎng)桶中，再將25ml實施例1獲得的無血清培養(yǎng)基加入到50ml儲液瓶中（CIK細胞的接種密度 為2 X 105個/ml);具體地，儲液瓶中的培養(yǎng)基通過硅膠管與細胞培養(yǎng)桶連接，在蠕動累的作 用下，持續(xù)循環(huán)流動，培養(yǎng)基通過細胞培養(yǎng)桶的中空纖維進行交換，給細胞培養(yǎng)桶內的細胞 不斷的提供營養(yǎng)物質;將整個高密度細胞培養(yǎng)桶放入5%C02,37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0047] 應用例2:具體過程與應用例1相同，不同在于采用實施例2獲得的無血清培養(yǎng)基進 行CIK細胞的培養(yǎng)。
[004引效果數(shù)據(jù)
[00例對比例1:采用市售的FiberCell品牌C2025型號的高密度細胞培養(yǎng)桶（參見 門berCell細胞培養(yǎng)系統(tǒng)產品銷售網頁），W及市售的友康品牌(NC0101)常規(guī)RPMI1640免疫 細胞無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)過程與應用例1相同，具體不再寶述。
[0050] 對比例A:采用市售的Corning品牌T75型號的細胞培養(yǎng)瓶，W及市售的友康品牌 (NC0101)常規(guī)RPMI1640免疫細胞無血清培養(yǎng)基;具體的，在T75培養(yǎng)瓶中加入10ml常規(guī)免疫 細胞無血清培養(yǎng)基，用移液器加入2mlCIK細胞濃度為1.2 X 106個/ml的常規(guī)無血清培養(yǎng)基 (CIK細胞的接種密度為2 X 105個/ml)進行懸浮培養(yǎng)，將培養(yǎng)瓶放入5 % C〇2，37 °C的培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)14天，觀察儲液瓶中培養(yǎng)基顏色，當培養(yǎng)基顏色變黃時，需要更換培養(yǎng)基（一般在第5 天、第10天更換培養(yǎng)基）。
[0051] 分別檢測應用例1、應用例2、對比例1和對比例A的細胞增殖速率W及細胞存活率。
[0052] 檢測細胞增殖速率
[0化3] 應用例1和應用例2, W及對比例1和對比例A，均在培養(yǎng)1、3、6、10、12和14天后，分 別取樣培養(yǎng)液，進行細胞濃度的檢測，檢測結果參見下表1。
[0054]表 1
[0化5]
[0056]檢測細胞存活率
[0057]培養(yǎng)14天后，收集各組的培養(yǎng)液，進行流式檢測。檢測結果如下：
[005引應用例1的細胞存活率:96.5% ;應用例2的細胞存活率:94.4% ;對比例1的細胞存 活率:89.9% ;對比例A的細胞存活率:92.3%。
[0059] 將上述的結果進行對比可W看出，一方面，對比例1的細胞增殖速率W及細胞存活 率(細胞培養(yǎng)效果)的結果稍劣于對比例A的結果，運說明：常規(guī)的RMPI1640免疫細胞無血清 培養(yǎng)基更適合于諸如細胞瓶之類的傳統(tǒng)小規(guī)模培養(yǎng)體系，不適合高密度細胞培養(yǎng)體系；另 一方面，本發(fā)明應用例1的細胞增殖速率和細胞存活率遠高于對比例1的，運說明：本發(fā)明實 施例的免疫細胞無血清細胞培養(yǎng)基相比常規(guī)的RMPI1640免疫細胞培養(yǎng)基更適合于高密度 細胞培養(yǎng)體系。
[0060] 應當理解，雖然本說明書按照實施方式加 W描述，但并非每個實施方式僅包含一 個獨立的技術方案，說明書的運種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說 明書作為一個整體，各實施方式中的技術方案也可W經適當組合，形成本領域技術人員可 W理解的其他實施方式。
[0061] 上文所列出的一系列的詳細說明僅僅是針對本發(fā)明的可行性實施方式的具體說 明，它們并非用W限制本發(fā)明的保護范圍，凡未脫離本發(fā)明技藝精神所作的等效實施方式 或變更均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種適用于高密度細胞培養(yǎng)體系的免疫細胞的無血清培養(yǎng)基，其包括基礎培養(yǎng)基和 添加組分，其中， 所述基礎培養(yǎng)基為RPMI 1640; 所述添加組分及其濃度如下： 人白蛋白，12-16g/L; 轉鐵蛋白，20-25mg/L; 人重組膜島素，24_30mg/L; L-谷氨酰胺，8-10g/L; HEPES，5-7g/L;以及 白介素-2，3 X 105-8 X 105IU/L; 各添加組分的濃度以所述無血清培養(yǎng)基的總體積為基準。2. 如權利要求1所述的無血清培養(yǎng)基，其特征在于： 以所述無血清培養(yǎng)基的總體積為基準，所述RMPI 1640培養(yǎng)基的干粉量為14.8-19.8g/ L〇3. 如權利要求2所述的無血清培養(yǎng)基，其特征在于： 以所述無血清培養(yǎng)基的總體積為基準，所述RMPI 1640培養(yǎng)基的干粉量為18g/L，所述 人白蛋白的濃度為13g/L，所述轉鐵蛋白的濃度為22mg/L，所述人重組胰島素的濃度為 27mg/L，以及所述L-谷氨酰胺的濃度為9g/L。4. 如權利要求2所述的無血清培養(yǎng)基，其特征在于： 所述HEPES的濃度為6g/L。5. 如權利要求2所述的無血清培養(yǎng)基，其特征在于： 所述白介素-2的濃度為5X105IU/L。6. 如權利要求1至5中任意一項所述的無血清培養(yǎng)基，其特征在于： 所述添加組分還包括慶大霉素和鏈霉素，所述慶大霉素的濃度為1 X 1〇5_4 X 105IU/L， 所述鏈霉素的濃度為1 X 1〇5-4 X 105IU/L。7. 如權利要求6所述的無血清培養(yǎng)基，其特征在于： 所述添加組分還包括酚紅鈉，所述酚紅鈉的濃度為5_7mg/L; 所述無血清培養(yǎng)基的pH值為7.2~7.6。8. 如權利要求1至7中任意一項所述的無血清培養(yǎng)基在免疫細胞的高密度細胞培養(yǎng)體 系中的應用。9. 如權利要求8所述應用，其特征在于：所述高密度細胞培養(yǎng)體系為高密度細胞培養(yǎng) 桶。10. 如權利要求8所述應用，其特征在于:所述免疫細胞為CIK細胞。
【文檔編號】C12N5/078GK106047807SQ201610693939
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月19日
【發(fā)明人】顏學恒, 周艷
【申請人】上海逍鵬生物科技有限公司