一種永生化山羊小腸上皮細(xì)胞系及其建立方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供了一種永生化山羊小腸上皮細(xì)胞系及其建立方法。該方法步驟以下：通過(guò)組織塊培養(yǎng)原代山羊小腸細(xì)胞，隨后永生化原代培養(yǎng)的細(xì)胞，并通過(guò)標(biāo)記刮除法純化山羊小腸上皮細(xì)胞，最后建立永生化的山羊小腸上皮細(xì)胞系。該永生化山羊小腸上皮細(xì)胞在培養(yǎng)的過(guò)程中無(wú)需添加任何細(xì)胞生長(zhǎng)因子，操作方便簡(jiǎn)單，且比原代細(xì)胞培養(yǎng)節(jié)省大量的成本；現(xiàn)有技術(shù)中通常采用先純化再永生化細(xì)胞的方法，本發(fā)明方法采用標(biāo)記法來(lái)逐步刮除純化永生化的山羊小腸上皮細(xì)胞，避免了現(xiàn)有技術(shù)中因培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)使山羊小腸上皮細(xì)胞衰老，最終造成細(xì)胞永生化失敗的缺陷。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
-種永生化山羊小腸上皮細(xì)胞系及其建立方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，設(shè)及一種永生化山羊小腸上皮細(xì)胞系及其建立方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 山羊小腸上皮細(xì)胞對(duì)腸道營(yíng)養(yǎng)吸收代謝、微生物菌群關(guān)系W及作為山羊腸道免疫 屏障具有重要意義。國(guó)外學(xué)者對(duì)小腸上皮細(xì)胞與腸道免疫機(jī)制研究較多，主要是利用人、小 鼠和大鼠小腸上皮細(xì)胞作為模型[1-2]。目前，對(duì)于反當(dāng)動(dòng)物的小腸上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)研究 甚少。在通過(guò)培養(yǎng)獲得原代小腸上皮細(xì)胞的方法上，主要是采用酶消化法。酶消化法在消化 組織塊的過(guò)程中，會(huì)使細(xì)胞膜表面受體遭到不可逆的破壞，影響細(xì)胞的正常生理轉(zhuǎn)運(yùn)功能， 同時(shí)，分離的原代細(xì)胞增值能力弱。然而，采用組織塊培養(yǎng)小腸上皮細(xì)胞能夠在體外獲得類(lèi) 似于體內(nèi)天然的小腸上皮細(xì)胞，且細(xì)胞膜表面受體并未受到酶的強(qiáng)烈消化，因此，在體外通 過(guò)組織塊培養(yǎng)的細(xì)胞能夠保持正常的生理的功能，同時(shí)，組織塊分離的細(xì)胞增值能力較強(qiáng)。
[0003] 國(guó)外研究者已經(jīng)建立多種小腸上皮細(xì)胞系，如：IEC-6、IEC-18和化c〇-2[3-5]。然 而，運(yùn)些小腸上皮細(xì)胞系基本上都是轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，存在染色體失調(diào)的特征。Rusu等[6]利用 膠原酶消化法能夠獲得一定純度的奶牛小腸上皮細(xì)胞，然而，運(yùn)些細(xì)胞并沒(méi)有被永生化，體 外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)運(yùn)些原代小腸上皮細(xì)胞只能僅僅傳5代并伴隨著大量的細(xì)胞衰老和調(diào)亡，根本 無(wú)法滿(mǎn)足試驗(yàn)的需求。Miyazawa等[7]利用電穿孔進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作來(lái)獲得永生化的奶牛小 腸上皮細(xì)胞，但是，電穿孔對(duì)細(xì)胞損傷太大，它能夠?qū)е录?xì)胞膜W及細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，不可逆 的影響細(xì)胞的生物學(xué)功能。W上國(guó)外兩篇報(bào)道僅僅是對(duì)奶牛小腸上皮細(xì)胞的研究，然而，目 前國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道建立了永生化的山羊小腸上皮細(xì)胞系。
[0004] 國(guó)內(nèi)也進(jìn)行了少量的山羊小腸上皮細(xì)胞研究報(bào)道，但是也僅局限于對(duì)山羊小腸上 皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)。在大多數(shù)物種情況下，從組織塊周?chē)軌蚍蛛x出山羊小腸上皮細(xì)胞和 成纖維細(xì)胞，且運(yùn)兩種細(xì)胞夾雜生長(zhǎng)。由于成纖維細(xì)胞增殖速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于上皮細(xì)胞，當(dāng)成纖 維細(xì)胞增殖到一定程度會(huì)包圍著山羊小腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，最終抑制山羊小腸上皮細(xì)胞的生 長(zhǎng)。因此，在體外培養(yǎng)的原代山羊小腸上皮細(xì)胞僅僅能夠傳代3-5代，之后，細(xì)胞開(kāi)始無(wú)法增 值并出現(xiàn)調(diào)亡，例如，本實(shí)驗(yàn)室研究者匡偉于2007年獲得了山羊小腸上皮細(xì)胞，傳至3代時(shí)， 大量的細(xì)胞衰老和調(diào)亡，無(wú)法增值，最終導(dǎo)致后續(xù)試驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行[引。
[0005] 綜上所述，在對(duì)基于組織塊培養(yǎng)的山羊小腸上皮細(xì)胞進(jìn)行永生化時(shí)，存在著如下 的技術(shù)難點(diǎn)：1)如果首先對(duì)山羊小腸上皮細(xì)胞進(jìn)行單克隆純化，那么會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞調(diào)亡從而 無(wú)法進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞永生化操作；2)如果對(duì)沒(méi)有純化的山羊小腸上皮細(xì)胞直接先進(jìn)行細(xì)胞 永生化操作，那么成纖維細(xì)胞也會(huì)被永生化，由于永生化的成纖維細(xì)胞增殖速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于 上皮細(xì)胞，那么與上皮細(xì)胞一起夾雜生長(zhǎng)的成纖維細(xì)胞會(huì)包圍山羊小腸上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，從 而導(dǎo)致上皮細(xì)胞被成纖維細(xì)胞擠壓生長(zhǎng)，最終使得永生化的山羊小腸上皮細(xì)胞從培養(yǎng)瓶底 脫落。
[0006] 參考文獻(xiàn)：
[0007] [1]Iwamoto T，Yamada K，Shimizu M，Totsuka M.2011?Establishment of intestinal epithelial cell lines from adult mouse small and large intestinal crypts.Biosci Biotechno1 Biochem,75(5):925-929.
[0008] [2]Walsham AD,MacKenzie DA,Cook V.2016.Lactobacillus reuteri Inhibition of Enteropathogenic Escherichia coli Adherence to Human Intestinal Epithelium.Front Microbiol,7:244.
[0009] [3]Quaroni A,Isse；Lbacher KJ，Ruoslahti E. 1978.Fibronectin synthesis by epithelial crypt cells of rat small intestine.Proc Natl Acad Sci USA,75(11): 5548-5552.
[0010] [4]Quaroni A,Isselbacher KJ.1981.Cytotoxic effects and metabolism of benzo[a]pyrene and 7，12-dimethylbenz[a]nthracene in duodenal and ileal epithelial cell cultures.J Natl Cancer Inst，67:1353-1362.
[0011] [5]Fogh J，F(xiàn)ogh JM，0rf*eo T.1977.0ne hun虹ed and twenty-seven cultured human tumor cell lines producing tumors in nude mice.J Natl Cancer Inst,59 (1):221-226.
[0012] [ 6 ] R u s u D , L o r e t S , P e u 1 e n 0 , M a i n i 1 J,Dandrifosse G.2005.Immunochemical,biomolecular and biochemical characterization of bovine epithelial intestinal primocultures.BMC Cell Biol,6:42.
[0013] [7]Miyazawa K,Hondo T,Kanaya T,Tanaka S.2010. Characterization of newly established bovine intestinal epithelial cell line.Histochem Cell Biol, 133(1):125-134.
[0014] [8]Bai H,Sakurai T,Bai R.2014.Establishment and characterization of immortalized bovine endometrial epithelial cells.Anim Sci J,85(8):799-804.

【發(fā)明內(nèi)容】

[0015] 為了克服了上述困難，本發(fā)明目的是提供一種永生化山羊小腸上皮細(xì)胞系及其建 立方法，從而獲得具有無(wú)限增殖能力的山羊小腸上皮細(xì)胞。其發(fā)明思路為:通過(guò)組織塊培養(yǎng) 原代山羊小腸細(xì)胞，得到增殖能力較強(qiáng)的原代山羊小腸細(xì)胞，并永生化山羊小腸細(xì)胞；隨 后，通過(guò)標(biāo)記刮除法逐步純化永生化的山羊小腸上皮細(xì)胞，最后，再單克隆山羊小腸上皮細(xì) 胞。該方法簡(jiǎn)單，不需要添加任何刺激因子并能夠連續(xù)傳代的山羊小腸上皮細(xì)胞，為山羊小 腸上皮細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)吸收代謝調(diào)控和腸道微生物菌群關(guān)系W及腸道免疫屏障提供實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 素材。
[0016] 為了實(shí)現(xiàn)W上目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0017] 本發(fā)明提供了一種永生化山羊小腸上皮細(xì)胞系的建立方法，包括W下步驟:通過(guò) 組織塊培養(yǎng)原代山羊小腸細(xì)胞，隨后永生化原代培養(yǎng)的細(xì)胞，并通過(guò)標(biāo)記刮除法純化山羊 小腸上皮細(xì)胞，最后建立永生化的山羊小腸上皮細(xì)胞系；
[0018] 可選地，所述的標(biāo)記刮除法為：用記號(hào)筆畫(huà)出上皮細(xì)胞樣集落，然后，用槍頭刮掉 圈外的雜細(xì)胞?？蒞如上述反復(fù)操作。
[0019] 可選地，該永生化山羊小腸上皮細(xì)胞系的建立方法具體包括如下步驟：
[0020] 1)對(duì)消毒預(yù)處理過(guò)的小腸組織塊進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng):用含有10%胎牛血清、lOOU/血青 霉素、lOOyg/mL鏈霉素、4mm/L谷氨酷胺、膜島素-砸元-轉(zhuǎn)鐵蛋白、5ng/mL表皮生長(zhǎng)因子、化 g/mL氨化可的松和1%非必須氨基酸的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)消毒預(yù)處理過(guò)的小腸組織塊， 在含有5 %的C〇2、37 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞密度達(dá)到50-60 %，開(kāi)始將組織塊移除并用PBS 清洗，隨后，膜蛋白酶消化細(xì)胞;可選地，消毒預(yù)處理的方法為:將采集的山羊小腸組織放入 含有500U/mL青霉素、500yg/mL鏈霉素和12.5iig/mL兩性霉素 B的DMEM培養(yǎng)基中。
[0021] 2)逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝及感染原代山羊小腸細(xì)胞，通過(guò)在原代山羊小腸細(xì)胞中介導(dǎo)入 SV40T基因 W實(shí)現(xiàn)山羊小腸細(xì)胞的永生化；
[0022] 3)標(biāo)記刮除法逐步純化山羊小腸上皮細(xì)胞:待永生化的山羊小腸細(xì)胞生長(zhǎng)密度為 60-80%時(shí)，用記號(hào)筆畫(huà)出上皮細(xì)胞樣集落，然后，用槍頭刮掉圈外的雜細(xì)胞;如上述反復(fù)操 作至獲得90 %的山羊小腸上皮細(xì)胞；
[0023] 4)建立山羊小腸上皮細(xì)胞系：96孔板單克隆山羊小腸上皮細(xì)胞，并對(duì)其進(jìn)行逐步 培養(yǎng)，得到永生化山羊小腸上皮細(xì)胞系；其中，先將步驟(3)中純化的山羊小腸上皮細(xì)胞進(jìn) 行96孔板單克隆，建立山羊小腸上皮細(xì)胞系；待96孔板細(xì)胞密度達(dá)到視野下40%-80%時(shí)， 分離消化細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至24孔板進(jìn)一步培養(yǎng)；更進(jìn)一步地，如果，24孔板細(xì)胞密度達(dá)到50- 80%，細(xì)胞轉(zhuǎn)移至25cm2培養(yǎng)瓶進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)。
[0024] 本發(fā)明提供了一種永生化山羊小腸上皮細(xì)胞系，其特征在于，由上述的建立永生 化山羊小腸上皮細(xì)胞系的方法建立而成。
[0025] 通過(guò)本發(fā)明的技術(shù)方法，達(dá)到了如下的有益效果：
[0026] (1)本發(fā)明建立的永生化山羊小腸上皮細(xì)胞在培養(yǎng)的過(guò)程中無(wú)需添加任何細(xì)胞生 長(zhǎng)因子，操作方便簡(jiǎn)單，且比原代細(xì)胞培養(yǎng)節(jié)省大量的成本。
[0027] (2)本發(fā)明研究顯示，當(dāng)上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)時(shí)，成纖維細(xì)胞增殖 迅速，培養(yǎng)至8~10天，上皮細(xì)胞開(kāi)始衰老和調(diào)亡。本發(fā)明并沒(méi)有純化上皮細(xì)胞直接進(jìn)行轉(zhuǎn) 基因操作，而是上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞共同被感染，從而避免了因培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)使山羊小 腸上皮細(xì)胞衰老，最終造成細(xì)胞永生化失敗。由于，成纖維細(xì)胞增殖速度明顯高于上皮細(xì) 胞，大量的成纖維細(xì)胞包圍上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致上皮細(xì)胞被成纖維細(xì)胞擠壓生長(zhǎng)。本發(fā) 明靈活的采用標(biāo)記法來(lái)逐步刮除純化山羊小腸上皮細(xì)胞。
[0028] (3)本發(fā)明建立的山羊小腸上皮細(xì)胞系已傳至30代，未出現(xiàn)任何衰老跡象。
【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖1是山羊小腸上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)顯微鏡放大圖。其中，山羊小腸組織塊周?chē)?4 小時(shí)內(nèi)分裂出碟卵石形態(tài)的山羊小腸上皮細(xì)胞(A)和一天后生長(zhǎng)出的少量山羊成纖維細(xì)胞 (B，箭頭）。放大倍數(shù)為40 X。
[0030] 圖2是山羊小腸上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞被永生化之后顯微鏡放大圖。其中，山羊小 腸上皮細(xì)胞呈現(xiàn)界限明顯的島蝸狀，被大量的成纖維細(xì)胞包圍生長(zhǎng)(A)，繼續(xù)生長(zhǎng)一段時(shí) 間，呈現(xiàn)島蝸狀小腸上皮細(xì)胞被成纖維細(xì)胞從培養(yǎng)瓶底部擠掉(B)。
[0031 ]圖3是利用標(biāo)記刮除法純化后的山羊小腸上皮細(xì)胞的顯微鏡放大圖。
[0032] 圖4是經(jīng)過(guò)96孔單克隆后的山羊小腸上皮細(xì)胞的倒置顯微鏡觀察圖。
[0033] 圖5是經(jīng)過(guò)單克隆后的山羊小腸上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的形態(tài)對(duì)比圖。其中，永生 化山羊小腸上皮細(xì)胞呈現(xiàn)典型的鋪路石和上皮樣形態(tài)(A)，山羊小腸成纖維細(xì)胞呈現(xiàn)典型 的梭形和長(zhǎng)條形的形態(tài)(B)。
[0034] 圖6是永生化的山羊小腸上皮細(xì)胞細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(A)和群體倍增次數(shù)(B)測(cè)定。
[0035] 圖7是單克隆的永生化的山羊小腸上皮細(xì)胞角蛋白18鑒定結(jié)果。
[0036] 圖8是通過(guò)免疫印跡(Western blot)對(duì)單克隆永生化的山羊小腸上皮細(xì)胞角蛋白 18的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果。
[0037] 圖9是通過(guò)RT-PCR檢測(cè)SV40T能夠在293T細(xì)胞和感染的永生化的山羊小腸上皮細(xì) 胞中表達(dá)的電泳圖。
[0038] 圖10是對(duì)單克隆永生化的山羊小腸上皮細(xì)胞特異性基因乂111111(4,2236口）、口邱*1 (B，217bp)、vimentin(C，223bp)和desmin(D，213bp)表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)電泳圖。其中，泳道 1 代表山羊小腸成纖維細(xì)胞，泳道2代表單克隆永生化的細(xì)胞，M代表標(biāo)準(zhǔn)的DNA Marker。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 為了闡明本發(fā)明的技術(shù)方案及技術(shù)目的，下面結(jié)合附圖及【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明 做進(jìn)一步的介紹。
[0040] 實(shí)施例1
[0041] 本實(shí)施例中，建立了一種永生化山羊小腸上皮細(xì)胞系。其具體步驟包括：
[0042] 1)將采集的山羊小腸組織，放入含有500U/mL青霉素、500yg/mL鏈霉素和12.5iig/ mL兩性霉素 B的DMEM培養(yǎng)基中；
[0043] 2)刮除小腸組織內(nèi)容物，剔除腸系膜;將小腸組織剪碎，反復(fù)清洗，直至上清液清 亮，用含有10 %胎牛血清、lOOU/mL青霉素、lOOyg/mL鏈霉素、4mm/L谷氨酷胺、膜島素-砸元- 轉(zhuǎn)鐵蛋白、5ng/mL表皮生長(zhǎng)因子、化g/mL氨化可的松和1 %非必須氨基酸的DMEM/F12培養(yǎng)基 懸浮組織塊，均勻接種在培養(yǎng)瓶中，放入含有5%的C02、37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天。待培養(yǎng)瓶 內(nèi)山羊小腸上皮細(xì)胞密度達(dá)到50-60%，開(kāi)始將組織塊移除并用PBS清洗3次。接下來(lái)，膜蛋 白酶消化細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至6孔板內(nèi)，第二天早上進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作；
[0044] 此階段的原代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果如圖1所示：山羊小腸組織塊在接種24小時(shí)之后，能夠 很好地貼壁并分裂出一部分碟卵石形態(tài)的上皮細(xì)胞（圖1A)。在第二天，能夠在顯微鏡下看 到有少量的成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)（圖1B)。第6天成纖維細(xì)胞迅速增值，同時(shí)，小腸上皮細(xì)胞也伴 隨著增值，但是，增值速度明顯低于成纖維細(xì)胞。
[0045] (3)逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝及感染原代山羊小腸細(xì)胞，W實(shí)現(xiàn)永生化:感染祀細(xì)胞之前， 在10cm培養(yǎng)皿中接種4X105個(gè)293T細(xì)胞(Clonetech)，待細(xì)胞密度達(dá)到90%的時(shí)候開(kāi)始轉(zhuǎn) 染；徹底振蕩Xfect Polymer轉(zhuǎn)染試劑（Clonetech)，然后，加入Xfect Reaction Buffer至 含有SV40T基因的pLXSN逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(Clonetech)及pVSVG包裝質(zhì)粒(Clonetech)總體積 600化指形管中，縱滿(mǎn)振蕩5s;加入化L Xfect Polymer到1.5ml指形管，縱滿(mǎn)振蕩10s，室溫 解育lOmin;將DNA-Xfect溶液逐滴加入到10cm培養(yǎng)皿中，左右搖勻，培養(yǎng)化；之后用新鮮的 lOmL完全培養(yǎng)基替換轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基另外解育4她;接下來(lái)，0.45皿過(guò)濾除去細(xì)胞碎片，收集 病毒液;接下來(lái)，使用含有祉g/mL聚凝胺的2mL病毒液感染山羊小腸細(xì)胞，32°C，1200g離屯、 90min;放入C〇2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h。將上清液吸棄，加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3d換液。
[0046] (4)永生化山羊上皮細(xì)胞的純化及培養(yǎng):待感染的山羊小腸上皮細(xì)胞和成纖維細(xì) 胞生長(zhǎng)密度為80 %時(shí)，使用標(biāo)記刮除法來(lái)純化山羊小腸上皮細(xì)胞，其具體方法如下：首先， 用記號(hào)筆畫(huà)出上皮細(xì)胞樣集落，然后，用槍頭刮掉圈外的雜細(xì)胞。由于，成纖維細(xì)胞增殖速 度太快，因此，每隔兩天刮一次。經(jīng)過(guò)上述反復(fù)操作，能夠獲得90 %的小腸上皮細(xì)胞。
[0047] 細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征觀察：經(jīng)過(guò)感染的山羊小腸上皮細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)界限明顯的島蝸 狀，被大量的成纖維細(xì)胞包圍生長(zhǎng)(圖2A)。繼續(xù)生長(zhǎng)一段時(shí)間，部分的小腸上皮細(xì)胞被成纖 維細(xì)胞從培養(yǎng)瓶底部擠掉（圖2B)。經(jīng)過(guò)標(biāo)記刮除法操作，只有一個(gè)明顯的島蝸狀的小腸上 皮細(xì)胞在生長(zhǎng)(圖3)。
[0048] (5)建立山羊小腸上皮細(xì)胞系:將步驟(4)中獲得的小腸上皮細(xì)胞經(jīng)過(guò)96孔板單克 隆，建立山羊小腸上皮細(xì)胞系（圖4);待96孔板細(xì)胞密度達(dá)到80% (視野下70%-80%)時(shí)，分 離消化細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至24孔板進(jìn)一步培養(yǎng)。如果，24孔板細(xì)胞密度達(dá)到80%，細(xì)胞轉(zhuǎn)移至 25cm2培養(yǎng)瓶進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)。單克隆的永生化山羊小腸上皮細(xì)胞呈現(xiàn)典型的鋪路石和上 皮樣形態(tài)（圖5A)，然而，山羊小腸成纖維細(xì)胞呈現(xiàn)典型的梭形和長(zhǎng)條形的形態(tài)（圖5B)。
[0049] 測(cè)試?yán)?
[0050] 本測(cè)試?yán)?，?duì)實(shí)施例1中培養(yǎng)出來(lái)的永生化山羊小腸上皮細(xì)胞的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線 和細(xì)胞群體倍增時(shí)間進(jìn)行了測(cè)定。
[0051] 當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，通過(guò)消化制成細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，每孔按5X103的細(xì)胞接種 于48孔板。從接種時(shí)算起，每隔2地計(jì)數(shù)3孔的細(xì)胞數(shù)，算其平均值。加500山的PBS清洗一次， 加 500iil的抓TA，37 °C解育4min，棄上清。200山的膜酶消化4min，之后加2(K)山培養(yǎng)基終止消 化，吹打細(xì)胞，使細(xì)胞成單細(xì)胞懸液，操作至第7天結(jié)束。培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)量為縱 坐標(biāo)。同時(shí)，按下面公式計(jì)算細(xì)胞群體倍增時(shí)間：
[0052] TD = tlog2/(log 化-logNO)
[0053] TD:細(xì)胞群體倍增時(shí)間化）
[0化4] T:培養(yǎng)時(shí)間
[0化日]No:接種細(xì)胞數(shù)
[0056] Nt:培養(yǎng)t小時(shí)的細(xì)胞數(shù)
[0057] 測(cè)定結(jié)果如圖6所示。由圖6A可知，0~Id山羊小腸上皮細(xì)胞并沒(méi)有增值并出現(xiàn)了 增值抑制;培養(yǎng)至1~4d山羊小腸上皮細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞的增殖能力較強(qiáng);4~7d細(xì) 胞出現(xiàn)增值抑制。由圖6B可知，在山羊小腸上皮細(xì)胞培養(yǎng)至96h，細(xì)胞的增值能力最強(qiáng)。通過(guò) 運(yùn)個(gè)測(cè)定證明永生化后的山羊小腸上皮細(xì)胞能夠繼續(xù)增值。同時(shí)，說(shuō)明永生化過(guò)的山羊小 腸上皮細(xì)胞符合細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律。
[005引測(cè)試?yán)?
[0059] 本測(cè)試?yán)校瑢?duì)實(shí)施例1中培養(yǎng)出來(lái)的永生化山羊小腸上皮細(xì)胞進(jìn)行了角蛋白18 免疫巧光鑒定：
[0060] 其具體步驟如下：
[0061] (1)按1.5Xl〇4個(gè)/cm2細(xì)胞密度接種在8孔Chamber Slide;
[0062] (2)待細(xì)胞密度為60%，PBS洗3次。用4%PFA固定30min，然后PBS洗3次；
[0063] (3) 3 %馬血清室溫封閉60min，然后移除血清；
[0064] (4)加鼠抗羊細(xì)胞角蛋白18-抗(1:250稀釋?zhuān)?°C解育過(guò)夜，PBS洗3次；
[0065] (5)加抗鼠 FITC標(biāo)記二抗（1:400)室溫避光解育30min，PBS洗3次；
[0066] (6)加入DAPI進(jìn)行核染色（1:1000)，室溫解育7min;
[0067] (7)PBS洗3次，然后蒸饋水洗一次；
[0068] (8)封固劑封片，避光2地；
[0069] (9)巧光顯微鏡觀察細(xì)胞角蛋白18在山羊小腸上皮細(xì)胞膜中的表達(dá)(見(jiàn)圖7)。
[0070] 如圖7所示的結(jié)果表明，通過(guò)顯微鏡巧光拍照視野下的所有細(xì)胞都發(fā)出綠色巧光， 進(jìn)一步表明分離培養(yǎng)的細(xì)胞都有細(xì)胞角蛋白18抗原的表達(dá)，顯示培養(yǎng)的細(xì)胞是來(lái)自于上皮 細(xì)胞。
[0071 ]測(cè)試?yán)?
[0072] 本測(cè)試?yán)?，使用Western blot檢測(cè)了實(shí)施例1培養(yǎng)出來(lái)的永生化山羊小腸上皮 細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白細(xì)胞角蛋白18:
[0073] 其具體步驟如下：
[0074] (1)細(xì)胞總蛋白樣品制備：待實(shí)施例1中培養(yǎng)出來(lái)的永生化山羊小腸上皮細(xì)胞 (GIEs-40)大量生長(zhǎng)，提取山羊小腸上皮細(xì)胞總蛋白。同時(shí)，提取山羊小腸成纖維細(xì)胞 (GIFs)細(xì)胞總蛋白（陰性對(duì)照），進(jìn)行Western blot驗(yàn)證山羊小腸上皮細(xì)胞特異性標(biāo)志細(xì)胞 角蛋白18是否在克隆的細(xì)胞中表達(dá)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%時(shí)，膜酶消化分離山羊小腸上皮細(xì) 胞，4 °C 1000巧m離屯、5min，使細(xì)胞沉淀，棄上清。根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入RIPA裂解液(RIPA:蛋白 酶抑制劑=50:1)，一般加入20化1的RIPA裂解液，放冰上裂解30min，每隔lOmin在縱滿(mǎn)振蕩 器上縱滿(mǎn)30s，4°C12000g離屯、lOmin。小屯、吸取上清，即細(xì)胞總蛋白。測(cè)定各個(gè)樣品的蛋白濃 度，加入RIPA裂解液和蛋白上樣緩沖液使各組間的蛋白濃度一致。沸水浴變性lOmin，使蛋 白充分變性。
[00對(duì) （2)SDS-PAGE電泳:安裝好Bio-rad制膠架。根據(jù)目的蛋白的分子量大小，配置所需 分離膠濃度。按各組分的比例配置10%的分離膠，上下顛倒混勻10次，使之充分反應(yīng)。將液 體膠加入玻璃板之間，并用酒精封閉，室溫下分離膠聚合40min。再配置5%濃縮膠，將分離 膠上方的殘留酒精用濾紙吸盡，加5%濃縮膠插梳子，禁止泳道間氣泡產(chǎn)生，室溫下聚合 40min。將膠放入電泳槽中，小屯、拔出梳子。將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品分別加到樣品孔內(nèi)。100V恒壓跑 電泳，直到漠酪藍(lán)跑到前沿為止。
[0076] (3)轉(zhuǎn)膜:將NC膜和濾紙裁成和膠大小一樣略大的小塊。NC膜和濾紙放入預(yù)冷轉(zhuǎn)膜 緩沖液中浸泡20min。轉(zhuǎn)膜順序?yàn)殛帢O碳板，海綿，濾紙，膠，膜，濾紙，海綿，陽(yáng)極碳板。120V， 90min在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。
[0077] (4)封閉和雜交:根據(jù)目的蛋白和GAPDH分子量大小，用剪刀剪下所需NC膜條帶，放 入5%脫脂奶粉的封閉液封閉90min。加入GAPDH( 1:1000稀釋)和細(xì)胞角蛋白18(1:250稀釋?zhuān)?一抗，4°C慢搖解育過(guò)夜。TBST清洗液清洗3次，每次5min。加入二抗（1:5000稀釋)室溫慢搖 解育eOmiruTBST清洗液清洗3次，每次5min。
[007引（5)特異性條帶的檢測(cè)：一般使用辣根過(guò)氧化物酶HRP-ECL發(fā)光法來(lái)檢測(cè)目的蛋 白。將A液和B液按1:1混合，用濾紙吸干膜上的液體，加發(fā)光液，置于凝膠成像系統(tǒng)曝光（圖 8)。
[OOW] 如圖8所示的凝膠成像圖表明，通過(guò)Western blot檢測(cè)(^ytokeratin 18在培養(yǎng)的 細(xì)胞中能夠表達(dá)，在GIFs(山羊小腸成纖維細(xì)胞)不能夠表達(dá)。結(jié)果表明，培養(yǎng)的單克隆細(xì)胞 來(lái)自于上皮細(xì)胞。
[0080] 測(cè)試?yán)?
[0081] 本測(cè)試?yán)?，使用RT-PCIU檢測(cè)了實(shí)施例諧養(yǎng)出來(lái)的永生化山羊小腸上皮細(xì)胞中 SV40T的表達(dá)及其特異性標(biāo)志：
[0082] 其具體步驟如下：
[0083] 細(xì)胞總RNA制備:提取永生化的山羊小腸上皮細(xì)胞(GIES-SV40T)總RNA。同時(shí)，提取 未感染的原代山羊小腸上皮細(xì)胞(GIEs)總RNA(陰性對(duì)照)和293T細(xì)胞的總RNA(陽(yáng)性對(duì)照）， 進(jìn)行RT-PC閲金證SV40T基因是否整合到細(xì)胞的基因組中（圖9)。同時(shí)，提取山羊小腸成纖維 細(xì)胞(GIFs)總RNA(陰性對(duì)照），進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證克隆的細(xì)胞是否表達(dá)Vi 11 in(絨毛蛋白，小 腸上皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志蛋白）和PeptU小膚轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，小腸上皮細(xì)胞的特異性標(biāo)志蛋 白）。此外，我們也檢測(cè)了Desmin(肌間線蛋白，為肌細(xì)胞特異性標(biāo)志）和vimentin(波形蛋 白，為成纖維細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白）來(lái)鑒定克隆培養(yǎng)的細(xì)胞是否含有肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞 的污染。棄上清，單層貼壁細(xì)胞每6孔板加入ImL的化izol，然后吸吹混勻并移至1.5mL的無(wú) 酶管中。使細(xì)胞能夠充分被裂解，室溫放置5min，使蛋白核酸復(fù)合物完全分離。每管加入 200ul的氯仿，蓋好管蓋，劇烈震蕩15s，室溫下放置3min，4°C 12000g離屯、15min，樣品將會(huì)分 成3層:紅色有機(jī)相，中間層和上層無(wú)色水相。RNA在水相中國(guó)，所占體積大約50 %，一般吸取 400化即可。傾斜管子45度，吸取40化L上層水相轉(zhuǎn)移到1.5mL無(wú)酶離屯、管中。每管加入50化L 異丙醇溶液室溫放置lOmin，并輕輕顛倒混勻，4°C12000g離屯、lOmin，棄上清。管底會(huì)有無(wú)色 透明的RNA沉淀，每管加入1血的75%乙醇，簡(jiǎn)單的縱滿(mǎn)，4°C7500g離屯、5min，棄上清?？諝夥?置lOmin實(shí)際可能需要30min，直到管底為無(wú)色透明RNA，禁止過(guò)干。加入20化無(wú) RNA酶水。通 過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定提取總RNA的完整性。按照羅氏反轉(zhuǎn)錄說(shuō)明書(shū)進(jìn)行cDNA的合 成。WcDNA為模板進(jìn)行目的基因的擴(kuò)增:根據(jù)Roche試劑盒說(shuō)明書(shū)配制PCR反應(yīng)液，操作在冰 上進(jìn)行。反應(yīng)液組成如下：Master Mix 1化L，上下游引物各化L，PCR級(jí)水化L，cDNA扣L。將 反應(yīng)液置入羅氏96孔PCR反應(yīng)板中，然后在羅氏Li曲teydef @96PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)。PCR反 應(yīng)條件為95°C預(yù)變性600s;PCR反應(yīng)為95°C、10s，退火60°C和72°C延伸各10s，循環(huán)45次;融 解曲線分析65°C、60s。利用2%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)目的基因的檢測(cè)。實(shí)時(shí)巧光定量PCR引 物序列和參數(shù)見(jiàn)表1。
[0084] 表1:實(shí)時(shí)定量PCR引物序列和參數(shù)： 「008引
[0086] 由圖10可知，分離培養(yǎng)的細(xì)胞能夠表達(dá)villin和peptl，山羊成纖維細(xì)胞不能表達(dá) villin和peptl。此外，分離培養(yǎng)的細(xì)胞不能夠表達(dá)vimentin，然而，山羊成纖維細(xì)胞(GIFs) 能表達(dá)vimentin。分離培養(yǎng)的細(xì)胞和山羊成纖維細(xì)胞都不表達(dá)desmin，W上結(jié)果表明，分離 培養(yǎng)的細(xì)胞來(lái)自于小腸上皮細(xì)胞(圖10)。
[0087] W上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù) 人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)中描述的只是說(shuō)明本 發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，本發(fā)明 要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書(shū)、說(shuō)明書(shū)及其等效物界定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種永生化山羊小腸上皮細(xì)胞系的建立方法，其特征在于，包括以下步驟:通過(guò)組織 塊培養(yǎng)原代山羊小腸細(xì)胞，隨后永生化原代培養(yǎng)的細(xì)胞，并通過(guò)標(biāo)記刮除法純化山羊小腸 上皮細(xì)胞，最后建立永生化的山羊小腸上皮細(xì)胞系。2. 如權(quán)利要求1所述的一種永生化山羊小腸上皮細(xì)胞系的建立方法，其特征在于，所述 的標(biāo)記刮除法為:用記號(hào)筆畫(huà)出上皮細(xì)胞樣集落，然后，用槍頭刮掉圈外的雜細(xì)胞。3. 如權(quán)利要求1所述的一種永生化山羊小腸上皮細(xì)胞系的建立方法，其特征在于，具體 包括如下步驟： 1) 對(duì)消毒預(yù)處理過(guò)的小腸組織塊進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)：用含有10%胎牛血清、l〇〇U/mL青霉 素、100yg/mL鏈霉素、4mm/L谷氨酰胺、胰島素-硒元-轉(zhuǎn)鐵蛋白、5ng/mL表皮生長(zhǎng)因子、lyg/ mL氫化可的松和1%非必須氨基酸的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)消毒預(yù)處理過(guò)的小腸組織塊，在 含有5 %的C02、37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至山羊小腸上皮細(xì)胞密度達(dá)到50-60%，開(kāi)始將組織塊移 除并用PBS清洗，隨后，胰蛋白酶消化細(xì)胞并進(jìn)行培養(yǎng)； 2) 逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝及感染原代山羊小腸細(xì)胞，通過(guò)在原代山羊小腸細(xì)胞中介導(dǎo)入 SV40T基因以實(shí)現(xiàn)山羊小腸細(xì)胞的永生化； 3) 標(biāo)記刮除法逐步純化山羊小腸上皮細(xì)胞:待永生化的山羊小腸細(xì)胞生長(zhǎng)密度為60-80%時(shí)，用記號(hào)筆畫(huà)出上皮細(xì)胞樣集落，然后，用槍頭刮掉圈外的雜細(xì)胞；如上述反復(fù)操作 至獲得90 %的山羊小腸上皮細(xì)胞； 4) 建立山羊小腸上皮細(xì)胞系：96孔板單克隆山羊小腸上皮細(xì)胞，建立山羊小腸上皮細(xì) 胞系；隨后對(duì)其進(jìn)行逐步培養(yǎng)，得到永生化山羊小腸上皮細(xì)胞系。4. 如權(quán)利要求3所述的一種永生化山羊小腸上皮細(xì)胞系的建立方法，其特征在于，在步 驟1)中，所述的消毒預(yù)處理的方法為:將采集的山羊小腸組織放入含有500U/mL青霉素、500 yg/mL鏈霉素和12.5yg/mL兩性霉素 B的DMEM培養(yǎng)基中。5. 如權(quán)利要求4所述的一種永生化山羊小腸上皮細(xì)胞系的建立方法，其特征在于，在步 驟4)中，所述的逐步培養(yǎng)的方法是:待96孔板細(xì)胞密度達(dá)到視野下40 %-80%時(shí)，分離消化 細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至24孔板進(jìn)一步培養(yǎng)。6. 如權(quán)利要求5所述的一種永生化山羊小腸上皮細(xì)胞系的建立方法，其特征在于，當(dāng)24 孔板細(xì)胞密度達(dá)到50-80 %，細(xì)胞轉(zhuǎn)移至25cm2培養(yǎng)瓶進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)。7. 如權(quán)利要求3所述的一種永生化山羊小腸上皮細(xì)胞系的建立方法，其特征在于，在步 驟4)中，所述的逐步培養(yǎng)的方法是:待96孔板細(xì)胞密度達(dá)到視野下40 %-80%時(shí)，分離消化 細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至24孔板進(jìn)一步培養(yǎng)。8. 如權(quán)利要求7所述的一種永生化山羊小腸上皮細(xì)胞系的建立方法，其特征在于，當(dāng)24 孔板細(xì)胞密度達(dá)到50-80 %，細(xì)胞轉(zhuǎn)移至25cm2培養(yǎng)瓶進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)。9. 一種永生化山羊小腸上皮細(xì)胞系，其特征在于，該細(xì)胞系由如權(quán)利要求1-8中任意一 項(xiàng)所述的建立永生化山羊小腸上皮細(xì)胞系的方法建立而成。
【文檔編號(hào)】C12R1/91GK106047819SQ201610700713
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年8月22日
【發(fā)明人】趙國(guó)琦, 詹康, 趙倩明, 左曉昕, 林淼, 嚴(yán)康
【申請(qǐng)人】揚(yáng)州大學(xué)