Ⅰ型鴨甲型肝炎病毒樣顆粒的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種Ⅰ型鴨甲型肝炎病毒樣顆粒的制備方法。本發(fā)明將Ⅰ型鴨甲型肝炎病毒結構蛋白前體基因P1和蛋白水解酶基因3CD在桿狀病毒表達系統(tǒng)中共表達，制備并鑒定了鴨肝炎病毒樣顆粒，為鴨肝炎病毒新型疫苗的研制奠定了基礎。IFA結果顯示重組蛋白在昆蟲細胞中成功表達；以P3代病毒(MOI＝5)感染懸浮生長的昆蟲細胞，收集細胞裂解液上清，可見直徑約20～25nm的球形病毒樣顆粒，與DHV天然病毒高度相似；Western blotting分析病毒樣顆粒的結構組成，以Ⅰ型鴨甲型肝炎病毒鴨多抗血清作為一抗，可見特異性結構蛋白條帶，與理論值相符。本發(fā)明操作程序簡便，易進行大規(guī)模生產，具有廣闊的應用前景。
【專利說明】
I型鴨甲型肝炎病毒樣顆粒的制備方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及I型鴨甲型肝炎病毒樣顆粒的制備，屬于生物制品領域，本發(fā)明設及I 型鴨甲型肝炎病毒，W及該病毒樣顆粒的制備方法。
【背景技術】
[0002] 鴨甲型肝炎病毒(duck hepatitis A virus，DHAV)屬于小RNA病毒科禽肝炎病毒 屬鴨甲型肝炎病毒種，臨床上主要引起21日齡W下的維鴨發(fā)生急性肝炎，該病W傳播迅速、 高致死性、引起維鴨出現肝炎及出血為主要特征，病死率高達100%，是一種急性高度致死 性傳染病，是嚴重危害養(yǎng)鴨業(yè)的疫病之一。DHAV包括經典型（即我國原I型鴨肝炎病毒）、臺 灣新型、韓國新型S種亞型，名稱分別為DHAV-1、DHAV-2和DHAV-3，3個型之間存在明顯的差 異，無交叉抗原性，其中DHAV-1呈世界性分布，也是中國DHAV流行的主要血清型。
[0003] 鴨肝炎病毒粒子呈二十面體對稱，直徑為20~40nm，無囊膜，核屯、為單股正鏈的 RNA。由于在國外鴨病毒性肝炎的發(fā)病率較低，未引起足夠的重視，因此關于運種病毒的研 究，特別是在分子生物學方面的研究起步較晚，直到2006年，該病毒的全基因組序列才被首 次報道。整個基因組為約7690個核巧酸組成的單股正鏈RNA(+ssRNA)，編碼2249個氨基酸， 不含5'帽子結構，3'端有poly(A)尾己，只有一個較大的開放讀碼框(0RF)，即RNA5'末端只 含有一個翻譯起始位點，病毒的RNA指導合成一條完整蛋白，稱為多聚蛋白。多聚蛋白在翻 譯過程中不斷被自身編碼的蛋白酶水解，分解成P1、P2和P3產物，P1、P2和P3又進一步分別 分解為小片段蛋白。P1區(qū)是結構蛋白前體，編碼S個結構蛋白VP0、VP1和VP3，VP1為主要宿 主保護蛋白。P2和P3區(qū)編碼非結構蛋白，P3區(qū)的蛋白水解酶3C和它的前體3CD在多聚蛋白的 水解中發(fā)揮主要作用。
[0004] 目前對鴨病毒性肝炎的預防主要W雞胚化弱毒疫苗為主，但普遍存在安全性低、 免疫效果不夠理想等缺點，加之異毒株的出現，其預防效果有逐漸下降趨勢，因此迫切需要 開展DHV預防新策略研究。
[0005] 病毒樣顆粒(Virus like particles，VLPs)是由某種病毒的一個或多個結構蛋白 自行裝配而成的高度結構化的空屯、蛋白顆粒，相比單獨的多膚或蛋白，VLPs具有與天然病 毒更為相近的構象表位，能更有效地刺激機體的細胞免疫和體液免疫，且化Ps無復制和感 染能力，是很有發(fā)展前景的新型疫苗。
[0006] VLPs是由一個或多個病毒的衣殼蛋白自行組裝而成，但是并不是所有病毒都適合 進行VLPs的研制，因為不是所有病毒的衣殼蛋白都可W自行包裝成病毒粒子。有些病毒結 構簡單，只需要一個主要保護性結構蛋白就可自行組裝成病毒樣粒子，有些病毒結構復雜， 則需要多個結構蛋白甚至其他蛋白的參與和輔助。如流感病毒樣顆粒的制備，有報道用血 凝素化A)、神經氨酸酶(NA)、基質蛋白（Ml)、基質蛋白（M2)中任何一種制備的化Ps，也有報 道HA-MlVLPs、HA-NA-M2VLPs，其免疫效果當然也不盡相同。
[0007] 鴨甲型肝炎病毒的基因組結構較為復雜，對其編碼蛋白的功能還未完全清楚。目 前，國內外還沒有關于鴨肝炎病毒樣顆粒研制的相關報道。如何同時表達=個結構蛋白？= 個結構蛋白能否自行組裝成VLPs?都不可預測，有待進一步研究。

【發(fā)明內容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種I型鴨甲型肝炎病毒樣顆粒的制備方法，將I型鴨甲型肝 炎病毒的結構蛋白前體基因 P1和蛋白水解酶基因3CD在桿狀病毒表達系統(tǒng)中共表達，在昆 蟲細胞Sf9中制備并鑒定了 I型鴨肝炎病毒樣顆粒，為I型鴨甲型肝炎病毒新型疫苗的研制 奠定了基礎。本發(fā)明I型鴨甲型肝炎病毒樣顆粒的制備包括W下步驟：
[0009] (1))含I型鴨甲型肝炎病毒結構蛋白前體基因 P1和蛋白水解酶基因3CD克隆到桿 狀病毒轉移載體P化stBacDual中，得到桿狀病毒轉移載體pF抓-P13CD;
[0010] (2)pF抓-P13CD重組質粒的轉座；
[0011] (3)重組Bacmid DNA的獲得與鑒定；
[0012] (4)重組桿狀病毒巧ac-P13CD的制備及擴增；
[0013] (5)重組桿狀病毒巧ac-P13CD共感染宿主細胞制備病毒樣顆粒；
[0014] (6)病毒樣顆粒的純化。
[0015] 其中，步驟（1)中所述重組質粒載體的構建用到的載體為Invihogen公司Bac-to- Bac系統(tǒng)中的桿狀病毒轉移載體pI^stBacDual。
[0016] 步驟(1)中I型鴨甲型肝炎病毒結構蛋白前體基因 P1的擴增引物為：
[0017] P1-F/R : 5^ -GTAGCGGCCGCACCATGGATACTCTTACTAAAAC- / 3/5 / - GTACTGCAGTTATTCAATTTCCAGATTGAGTTC-^。
[0018] I型鴨甲型肝炎病毒蛋白水解酶基因3CD的擴增引物為：
[0019] 3CD-F/R : / -GTACTCGAGACCATGAGCGGGCGGGTGAATTTCAG- / 3/V - GTAGCTAGCTCAGATCATCATGCAAGCTGTG-' 3。
[0020] 步驟(2)(3)(4)中所述質粒的重組、重組Bacmid DNA的獲得與鑒定、重組桿狀病毒 的制備及擴增均參照Invitrogen公司Bac-to-Bac說明書進行。
[0021] 步驟（5)具體可W是：重組桿狀病毒rBac-P13CD的M0I為5,感染生長密度為2X 106cells/ml的懸浮培養(yǎng)的昆蟲細胞Sf9,72h后收集細胞沉淀，反復凍融3-5次，離屯、收集上 清即為病毒樣顆粒溶液。所述昆蟲細胞Sf9為Invitrogen公司產品。
[0022] 步驟(6)中所述病毒樣顆粒的純化采用氯仿抽提和超速離屯、法。
[0023] 本發(fā)明首先擴增出I型鴨甲型肝炎病毒P1基因，克隆入桿狀病毒轉移載體 pFas巧acDual獲得重組轉移載體pF抓-P1;將擴增的3CD基因亞克隆入pF抓-P1，獲得的重組 質粒命名為pF抓-P13CD;將pF抓-P13CD重組質粒轉化DHlOBac感受態(tài)細胞，涂板培養(yǎng)，直至 藍白斑出現;挑取藍白斑中的白色單菌落，W堿裂法提取重組Bacmid DNA，進行PCR鑒定;將 重組Bacmid DNA轉染生長昆蟲細胞Sf9,待細胞出現明顯病變時收集上清，即為重組桿狀病 毒；IFA結果顯示重組蛋白在昆蟲細胞中成功表達；WP3代病毒(M0I = 5)感染懸浮生長的昆 蟲細胞，收集細胞裂解液上清，經濾膜過濾、氯仿抽提、超速離屯、純化后，憐鶴酸負染電鏡觀 察，可見直徑約20~25nm的球形病毒樣顆粒，與DHV天然病毒高度相似;Western blotting 分析病毒樣顆粒的結構組成，WI型鴨甲型肝炎病毒鴨多抗血清作為一抗，可見特異性結構 蛋白條帶，與理論值相符。本發(fā)明操作程序簡便，易進行大規(guī)模生產，昆蟲細胞Sf9是一種懸 浮培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)要求較低，非常適合生產實踐中大規(guī)模生產，具有廣闊的應用前景。
【附圖說明】
[0024] 圖 1 重組Bacmid PCR鑒定
[0025] M:化b DNA Ladder;
[0026] 1:重組Bacmid DNAWM13-F/P1-R為引物對的PCR產物；
[0027] 2:重組Bacmid DNAWM13-F/R為引物對的PCR產物；
[002引 3:重組Bacmid DNAWM13-R/P1-F為引物對的PCR產物。
[00巧]圖2重組蛋白的IFA檢測
[0030] A: WVP0多抗為一抗;B: WVP1多抗為一抗;C: WVP3多抗為一抗；
[0031] D: W3C多抗為一抗;E: W3D多抗為一抗;F:空白對照。
[0032] 圖31型鴨甲型肝炎病毒樣顆粒投射電鏡圖（97000X)。
[0033] 圖41型鴨甲型肝炎病毒樣顆粒Western blot分析圖
[0034] 1:正常Sf 9細胞裂解液;2:1型鴨甲型肝炎病毒樣顆粒純化產物。
【具體實施方式】
[0(X3日]實施例1轉移載體pF抓-P13CD的構建與鑒定
[0036] 根據已發(fā)表的I型鴨甲型肝炎病毒-SH株全基因的序列（GeneBank登錄號： 冊232302)，設計兩對引物P1-F/R和3CD-F/R，
[0037] P1-F:5'-GTAGCGGCCGCACCATGGATACTCTTACTAAAAC-'3(SEQ ID No.l)
[0038] P1-R:5'-GTACTGCAGTTATTCAATTTCCAGATTGAGTTC-'3(SEQ ID No.2)
[0039] 3CD-F:5^GTACTCGAGACCATGAGCGGGCGGGTGAATTTCAG-^(沈Q ID No.3)
[0040] 3CD-R:5'-GTAGCTAGCTCAGATCATCATGCAAGCTGTG-'3(SEQ ID No.4)，W提取的I型 鴨甲型肝炎病毒-SH株RNA為模板，分別擴增出結構蛋白前體基因 PI和蛋白水解酶基因3CD。 擴增出的P1產物經Not I和Pst I雙酶切后插入經同樣酶切的桿狀病毒轉移載體 P化stBacDual，獲得重組質粒pF抓-P1，將3CD擴增產物經趾0巧日Nhe I酶切后插入pF抓- P1，獲得的重組質粒命名為pF抓-P13CD。
[0041 ] 實施例化F抓-P13CD重組質粒的轉座
[0042] 將pF抓-P13CD重組質粒轉化DHlOBac感受態(tài)細胞，涂板培養(yǎng)，直至藍白斑出現。
[0043] 實施例3重組Bacmid DNA的獲得與鑒定
[0044] 挑取白色單菌落，W堿裂法提取重組Bacmid DNA，并對其進行PCR鑒定。如圖1所 示，分別 WM13-F/P1-R、M13-F/R、M13-R/P1-F(M13-F/R 是公知序列，在 Invitrogen 公司 Bac- to-Bac說明書)為S對引物進行PCR，結果分別出現特異性條帶，與理論值相符，說明目的基 因同源重組成功，獲得的重組桿粒正確。
[0045] 實施例4重組桿狀病毒巧ac-P13CD的制備及擴增
[0046] 將重組Bacmid DNA轉染生長良好的昆蟲細胞Sf9,待細胞出現明顯病變時收集上 清，即為P1代重組桿狀病毒。WP1代病毒進行擴增得到P2代，P2代擴增得到P3代病毒?？瞻?實驗測得P3代重組桿狀病毒的滴度為1.0 X 108p化/ml。
[0047] 實施例5重組蛋白在昆蟲細胞Sf9中的表達及鑒定
[004引將P3代重組病毒感染6孔板上的Sf9細胞，感染后4她，用細胞免疫巧光試驗鑒定其 表達情況，W制備的VPO多抗、VPl多抗、VP3多抗、3C多抗、3D多抗為一抗，結果如圖2所示，均 出現了特異性巧光，而未感染重組病毒的Sf9細胞對照組沒有出現巧光，說明結構蛋白前體 P1和蛋白水解酶前體3CD獲得了成功表達，且P1在3CD的作用下成功水解為VP0、VP1、VP3。
[0049] 實施例6病毒樣顆粒的大量制備
[0050] 將昆蟲細胞Sf9W不低于5X105cells/ml的密度接種于搖瓶中，27°C11化pm振蕩 培養(yǎng)至密度約2X106cells/ml。將重組桿狀病毒巧ac-P13CDW感染復數5感染搖瓶中培養(yǎng) 好的昆蟲細胞Sf 9，27 °C 11化pm繼續(xù)振蕩培養(yǎng)72h，離屯、收集細胞沉淀，用適量PBS溶解細胞 沉淀，于-80°C和37 °C反復凍融3-5次，100(K)rpm離屯、5min收集上清，即為初始病毒樣顆粒溶 液。
[0051] 實施例7病毒樣顆粒的純化
[0052] 初始病毒樣顆粒溶液先用0.22um的濾膜過濾，再加入1/2體積的氯仿在搖床上室 溫劇烈振搖化，12000g離屯、10分鐘，取上層水相aOOOOOg離屯、2小時，PBS溶解沉淀，即為純 化的病毒樣顆粒。
[0053] 實施例8病毒樣顆粒的鑒定
[0054] 純化的病毒樣顆粒負染后進行透射電鏡觀察，結果如圖3所示，可見大小約為25nm 左右的空屯、病毒粒子，與DHV病毒粒子大小和形態(tài)相似，說明S個結構蛋白可自行組裝成病 毒樣顆粒。
[0055] 為鑒定病毒樣顆粒的結構組成，將純化的樣品進行Western blot分析，WI型鴨甲 型肝炎病毒鴨多抗血清作為一抗，結果如圖4所示，可見大小約27kDa左右的條帶，與VP1蛋 白大小相似。其原因有二，一是VP1是鴨甲型肝炎病毒的主要結構蛋白，鴨多抗中的成分主 要是抗VP1蛋白的，二是VP1和VP3大小基本相同，僅一個氨基酸的差距，電泳是無法分辨的， 所^Western blot分析中僅出現了一條印跡條帶。
[0056] W上結果可W得出，我們成功構建了制備I型鴨甲型肝炎病毒樣顆粒的桿狀病毒/ 昆蟲細胞系統(tǒng)，通過在昆蟲細胞內同時表達I型鴨甲型肝炎病毒的結構蛋白前體P1和蛋白 水解酶前體3CD，可成功組裝出病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒大小形態(tài)與野生病毒相似，且能 與病毒陽性血清發(fā)生反應，可W用于I型鴨甲型肝炎病毒病新型疫苗的進一步開發(fā)應用。
【主權項】
1. 一種I型鴨甲型肝炎病毒樣顆粒的制備方法，特征在于包括以下步驟：（1)將I型鴨甲 型肝炎病毒結構蛋白前體基因 P1和蛋白水解酶基因3CD克隆到桿狀病毒轉移載體 pFastBacDual中，得到桿狀病毒轉移載體pFK)-P13CD; (2)pFBD-P13CD重組質粒的轉座；（3) 重組Bacmid DNA的獲得與鑒定；（4)重組桿狀病毒rBac-Pl3CD的制備及擴增；（5)重組桿狀 病毒rBac-P13CD感染宿主細胞制備病毒樣顆粒;（6)病毒樣顆粒的純化。2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（1)中I型鴨甲型肝炎病毒結構蛋白前 體基因 P1 的擴增引物為：P1-F/R: 5' -GTAGCGGCCGCACCATGGATACTCTTACTAAAAC」3/V -GTACTGCAGTTATTCAATTTCCAGATTGAGTTC-7 3。3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，I型鴨甲型肝炎病毒蛋白水解酶基因3CD的 擴增引物為：3CD-F/R:5 7 -GTACTCGAGACCATGAGCGGGCGGGTGAATTTCAG-7 3/V -GTAGCTAGCTCAGATCATCATGCAAGCTGTG-7 3 〇4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(5)具體是:重組桿狀病毒rBac-P13CD 的MOI為5,感染生長密度為2X106cellS/ml的懸浮培養(yǎng)的昆蟲細胞Sf9,72h后收集細胞沉 淀，反復凍融3-5次，離心收集上清即為病毒樣顆粒溶液。5. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(6)具體是:0.22μπι濾膜過濾除去雜蛋 白；1/2體積的氯仿抽提，取上層水相；lOOOOOg離心2小時，PBS溶解沉淀，即為純化的病毒樣 顆粒。
【文檔編號】C12N15/866GK106047824SQ201610519642
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月1日
【發(fā)明人】王安平, 朱善元, 王永娟, 左偉勇, 吳雙, 郭長明, 秦楓, 洪偉鳴
【申請人】王安平, 朱善元