一種促癌多肽n1及其載體和應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種促癌多肽N1及其載體和應(yīng)用。該促癌多肽N1，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明利用生物工程技術(shù)基因重組多肽N1對應(yīng)的DNA序列到N?Terminal p3xFLAG?CMV真核表達載體，經(jīng)酶切和序列分析證明重組成功后，將此真核表達多肽轉(zhuǎn)染到食管癌Eca109細胞，免疫印跡證明多肽的蛋白表達，對多肽功能進行驗證結(jié)果發(fā)現(xiàn)多肽N1能夠促進食管癌細胞的增殖以及遷移能力，能夠成為食管鱗癌的靶向治療提供新的藥物開發(fā)靶點。
【專利說明】
-種促癌多化N1及其載體和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種促癌多膚N1及其載體和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 食管癌（eso地ageal cancer)是世界最常見的八大惡性腫瘤之一，而我國則為全 世界食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國家之一。食管癌惡性程度高、病程進展迅速、易復(fù)發(fā)和 轉(zhuǎn)移、預(yù)后極差。食管癌主要有兩種類型:鱗癌和腺癌。西方國家主要W腺癌為主，而我國則 主要W鱗癌為主。
[0003] 目前，食管癌的首選治療方法依然是手術(shù)，近年來隨著手術(shù)方式的不斷改進，早期 術(shù)后5年生存率已接近90 %，5年總體生存率可達30%左右，但仍不令人滿意。而作為食管癌 綜合治療的有效手段，化療起著重要的作用，尤其在中晚期食管癌治療中扮演著重要角色。 食管癌中的研究發(fā)現(xiàn)PFTK1高表達，與順銷等藥物的化療效果密切相關(guān)，可能參與了食管癌 的耐藥過程。PFTK1基因位于人類1號染色體的7q21.13,轉(zhuǎn)錄本約eOOObp，編碼469個氨基 酸，其催化結(jié)構(gòu)域與Cdc相關(guān)蛋白序列有高度同源性，Cdc2相關(guān)蛋白家族可調(diào)控細胞的G1/ S、G2/M期轉(zhuǎn)化。此外，在氨基端的66-72和11 3-11 9有兩個核定位序列（nuclear localization signal,化SKPFTKI的133-230結(jié)構(gòu)域為其激酶結(jié)構(gòu)域，研究表明該段能夠 可W結(jié)合細胞周期蛋白切Clin 03,同時還發(fā)現(xiàn)其還可W與細胞周期抑制蛋白P21CIPI相互 作用：進一步研究證實，PFTKI可W通過憐酸化Rb調(diào)節(jié)細胞周期G-S的轉(zhuǎn)化。從而證明PFTK1 是一類細胞周期蛋白，參與細胞周期的調(diào)控。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明目的:針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種促癌多膚N1，滿 足制備抗癌藥物的使用需求。本發(fā)明的另一目的是提供一種表達上述促癌多膚N1的載體。 本發(fā)明還有一目的是提供上述促癌多膚N1的用途。
[0005] 技術(shù)方案:為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0006] -種促癌多膚N1，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0007] 編碼所述的促癌多膚N1的基因，其DM序列如SEQ ID NO.2所示。
[000引含有所述的編碼基因的載體。
[0009] 所述的載體，將促癌多膚N1的DNA序列克隆到P 3XFLAG-CMV載體上獲得。
[0010] 所述的促癌多膚N1在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
[0011] 有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明利用生物工程技術(shù)基因重組氨基酸多膚對應(yīng) 的DNA序列到N-Terminal p3x化AG-CMV真核表達載體，經(jīng)酶切和序列分析證明重組成功后， 將此真核表達多膚轉(zhuǎn)染到食管癌Ecal09細胞，免疫印跡證明多膚的蛋白表達，對多膚功能 進行驗證結(jié)果發(fā)現(xiàn)多膚N1能夠促進食管癌細胞的增殖W及遷移能力。因此，多膚N1能夠為 食管鱗癌的祀向治療提供新的藥物開發(fā)祀點。
【附圖說明】
[0012] 圖1是質(zhì)粒N-Terminal p3xFLAG-CMV的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0013] 圖2是多膚N1和多膚C2的PCR產(chǎn)物圖；
[0014] 圖3是N-化rminal p3xFLAG-CMV載體和多膚N1和多膚C2質(zhì)粒酶切產(chǎn)物圖；
[0015] 圖4是檢測N-1'erminal p3xFLAG-CMV-N巧日N-Terminal p3x化AG-CMV-C2多膚的表 達電泳圖；
[0016] 圖5是在食管癌細胞系Ecal09內(nèi)驗證多膚N-Terminal pSxFLAG-CMV-NUN- Terminal p3xFLAG-CMV-C2 與 CAK(CDK7/CCNH) 是否具有相互作用結(jié)果圖；
[0017] 圖6是CCK8實驗檢測多膚促進食管癌細胞系Ecal09增殖能力結(jié)果圖；
[0018] 圖7是劃橫實驗檢測多膚促進食管癌細胞系Ecal09遷移能力結(jié)果圖。
【具體實施方式】
[0019] 下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步的說明。實施例中未注明具體條件的實驗 方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實驗指南（第=版，J.薩姆布魯克等著，黃培堂等 譯，科學(xué)出版社，2002年）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件進行。
[0020] 實施例1
[002。 本發(fā)明的多膚重組表達質(zhì)粒是將多膚N1對應(yīng)的DNA序列克隆到N-Termin al p3xFLAG-CMV真核表達載體，多膚N1的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，多膚N1對應(yīng)的編碼 基因的0魁序列如56010^).2所示。并^多膚〔2(氨基酸序列如56010^).3所示，對應(yīng)的 DNA序列如SEQ ID NO.4所示)做為參照對比。
[0022] 重組膚的克隆載體構(gòu)建提取人的PFTKlmRNA，體外逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，W此為模板，通 過PCR方法擴增得到的目的片段與N-Terminal p3xFLAG-CMV載體連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、提取等步驟 得到重組質(zhì)粒后，酶切鑒定并測序。主要過程如下：
[0023] 根據(jù)兩段氨基酸多膚的cDNA序列，利用Primer Primer 5.0軟件設(shè)計引物，并分別 在上游引物和下游引物前加上限制性內(nèi)切酶EcoR I和Kpnl識別序列及接頭，引物：
[0024] cdkl4NlR:5 '-CGGAATTCAGTTAGGCGGCACTCCAGC-3 '；
[00巧]cdkHNlF: 5 ' -GGGGTACCGATCAGTGCTTGCTGTTTGATAG-3 ' ；
[00%] cdkl4C2R:5 '-CGGAATTCATGTGACCTCATTGAGCCGCAG-3 '；
[0027] cdkl4C2F:5 '-GGGGTACCGATGAGTCAGCTTTTCCAAATTTGGG-3 '；
[00%]載體圖如圖1所示。WFlag-PFTKl全長為模板，通過PCR方法擴增出兩段氨基酸多 膚的多膚DNA序列，5化L的反應(yīng)體系為:5化10 X化q聚合酶緩沖液，化L dNTPs，2.5化上游 引物，2.5化下游引物，1化化qDNA聚合酶，化L模板，3化L無菌水。
[0029] 反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性5min;94°C變性30s，55°C退火45s，72°C延伸45s，30個循環(huán)； 72°C延伸lOminJCR反應(yīng)結(jié)束后取25化擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析并回收目的片 段，PCR產(chǎn)物圖如圖2所示。
[0030] 將PCR純化產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoR I和Kpn I雙酶切后與經(jīng)同樣酶切的載體N- Terminal p3xFLAG-CMV，利用T4連接酶16°C連接過夜，然后轉(zhuǎn)化篩選:連接產(chǎn)物加入到感受 態(tài)細胞中混勻后冰上放置30min，42 °C熱擊90s再冰上放置3min，加入80化L的LB培養(yǎng)液37 °C 震蕩45min，取一定量鋪于含Am p抗性的瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)過夜后，挑取單菌落接種于 Amp抗性的LB培養(yǎng)液中，37°C振蕩培養(yǎng)12h，SDS堿裂解法小量提取質(zhì)粒。陽性克隆N-Termin al p3x化AG-CMV-N巧日N-Terminal p3x化AG-CMV-C2送銷尚測序公司測序驗證，測序序列正 確，無突變。載體和多膚質(zhì)粒酶切結(jié)果顯示如圖3所示。
[0031 ]實施例2重組膚真核表達載體轉(zhuǎn)染食管癌細胞系并檢測其表達
[0032] 1)細胞實驗
[0033] 細胞培養(yǎng):食管癌Ecal09細胞購自中國科學(xué)院細胞庫上海保藏中屯、。用完全培養(yǎng) 基:含10%小牛血清（56°C水浴30min滅活補體）、2mmol/Lレ谷氨酷胺、lOOU/mL青霉素和 10化g/mL鏈霉素的RPMI1640，在5 % C〇2、飽和濕度、37 °C培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)傳代。收集處于 對數(shù)生長期的細胞進行下述實驗。各項試驗至少重復(fù)3次。
[0034] 2)Western Blot檢測多膚的表達。
[0035] 收集處于生長對數(shù)期的Ecal09細胞，用不含抗生素的完全培養(yǎng)基稀釋細胞為IX 106個/mL，在6cm細胞培養(yǎng)皿內(nèi)W4mL培養(yǎng)基鋪板，24h后用50化無血清的培養(yǎng)基稀釋質(zhì)粒、 對照質(zhì)粒各2g;用50化無血清的培養(yǎng)基稀釋化Su perfecting試劑，輕混勻，在室溫下保溫 5min;DNA-Superfecting復(fù)合物在室溫下解育15min，W形成DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物，加入細胞， 化后換液，36-4她后收集細胞。對轉(zhuǎn)染細胞通過蛋白印跡法檢測N-Terminal p3xFLAG-CMV- N1和N-Terminal p3xFLAG-CMV-C2多膚在食管癌Ecal09細胞系內(nèi)的表達:轉(zhuǎn)染細胞加入細 胞裂解液冰上裂解15min，離屯、取上清加入1 X SDS Loading Buffer后100°C煮5min進行 SDS-PAGE電泳，通過濕轉(zhuǎn)方法轉(zhuǎn)移至NC膜上，選用1:1000稀釋的載體標簽Flag抗體(m抗 性）、1:3000稀釋的鼠抗體進行Western Blot ting檢測。
[0036] 結(jié)果如圖4所示，通過Western Blot法，確認了多膚的成功重組構(gòu)建。在食管癌 Ecal09細胞中，NI段分子量在2化b，C2段分子量在30肺左右。
[0037] 實施例3N1段與CAK復(fù)合物CDK7/CCNH具有相互作用
[0038] 在食管癌細胞Ecal09中分別轉(zhuǎn)染PFTK1的截短構(gòu)建DNA、HA-CDK7和Myc-CCNH全長 DNAd36-4她后收集細胞，用PBS洗2次，然后用5(K)化細胞IP裂解液處理化后，12 000g、4°C， 5min離屯、將上清液轉(zhuǎn)移至新EP管。加入20化混勻的Protein A/G beads預(yù)澄清，于4°C預(yù)澄 清化。然后900g、4°C離屯、5min，將上清液轉(zhuǎn)移至新離屯、管，棄珠子。取40-6化L上清液作為 Inp ut，加入等量上樣緩沖液，沸水煮15min，離屯、后凍存。其余部分平分為兩等分，分別加 入扣L的Flag-CDK14、HA-CDK7或Myc-CCNH標簽抗體進行免疫共沉淀，同型IgG作為對照，4°C 輪轉(zhuǎn)儀過夜。再各加入30化protein A/G be ads 4°C輪轉(zhuǎn)化，用50化L細胞IP裂解液洗3 次，900g、4 °C離屯、5min，棄上清，加入上樣緩沖液后煮沸15min，離屯、后凍存;免疫印跡分析 在食管癌Ecal 09中相互作用的具體結(jié)構(gòu)域。
[0039] 結(jié)果如圖5所示，PFTK1的NI段分別與CAK復(fù)合物(CDK7/CCNH)具有相互作用，提示 在食管癌細胞中CDK7/CCNH是通過該段發(fā)揮促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展?？梢娫谑彻馨┲校琍FTK1 的NI段結(jié)構(gòu)域?qū)τ贑DK7/CCNH通過憐酸化PFTK1發(fā)揮促進食管癌進展至關(guān)重要。
[0040] 實施例4CCK騎去檢測其對食管癌細胞Ecal09增殖功能的影響
[0041 ] 細胞在培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24小時(37°C，5%C02)，細胞W5X103鋪在96孔板中，配置100 yL的細胞懸液;在培養(yǎng)箱解育一段適當(dāng)?shù)臅r間。待細胞貼壁后，在細胞活力許可情況下，轉(zhuǎn) 染兩個片段質(zhì)粒，W及空載flag(作陰性對照)和全長質(zhì)粒(作陽性對照）。轉(zhuǎn)染化后作為0點 向每孔加入10化cck-8溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)解育l-4h后用酶標儀測定在45化m處的 吸光度。之后W同樣的方法檢測在分別轉(zhuǎn)染24h, 36h, 4她后檢測相應(yīng)的吸光度。
[0042] 實驗數(shù)據(jù)W運用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行實驗數(shù)據(jù)的分析，計數(shù)資料用均數(shù)±標 準差(mean± SD)表達，兩組均數(shù)比較采用t檢驗，WP<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0043] 結(jié)果如圖6所示，食管癌細胞Ecal09在轉(zhuǎn)染2地時，N1實驗組的細胞吸光度顯著高 于C2實驗組，但兩組細胞的吸光度又顯著高于空載組和全長組(flag-PFTKl)，提示在轉(zhuǎn)染 24h左右，N1段具有較強的促進細胞增殖的功能，全長的活性還不明顯；而在36h到4她，N1實 驗組的細胞吸光度與C2實驗組相當(dāng)，全長組的細胞吸光度也有明顯的上升。因此，PFTK1的 NI段結(jié)構(gòu)域能夠增強食管癌細胞活力，C2段結(jié)構(gòu)域此功能弱。
[0044] 實施例5劃橫實驗檢測其對食管癌細胞Ecal09遷移功能的影響
[0045] 收集對數(shù)生長期的細胞，制成細胞懸液，調(diào)細胞濃度為5 X 105/mL接種于直徑30mm 培養(yǎng)皿，待細胞融合度達60%左右，轉(zhuǎn)染兩個片段質(zhì)粒，W及空載flag(作陰性對照)和全長 質(zhì)粒(作陽性對照）。轉(zhuǎn)染化后用lOOOmL槍頭緊貼培養(yǎng)皿底壁，在細胞層中劃線，稍加震蕩， 換液1次W去除漂浮的細胞，在相差顯微鏡下，可見一條無細胞的裸露區(qū)，在培養(yǎng)瓶外沿劃 痕隨機標記5個點作為固定觀測點，采集圖片后置37°C、5%C02飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)。 此后每12h取出培養(yǎng)瓶進行圖片采集、測量。
[0046] 結(jié)果如圖7所示，食管癌細胞Ecal09在轉(zhuǎn)染12h后，N1實驗組的細胞和陰性對照組 相比，間距明顯變窄，提示發(fā)生了遷移;和陽性實驗組相比，其作用相當(dāng)。而C2實驗組的變化 卻不明顯，無顯著性差異。
[0047] 可見多膚N1在食管癌細胞中具有促癌作用，為腫瘤治療開發(fā)新的祀點提供實驗依 據(jù)，對于應(yīng)用于腫瘤的臨床治療具有十分重要的開發(fā)應(yīng)用前景。
【主權(quán)項】
1. 一種促癌多肽N1，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。2. 編碼權(quán)利要求1所述的促癌多肽N1的基因，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示。3. 含有權(quán)利要求2所述的編碼基因的載體。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的載體，其特征在于：將促癌多肽N1的DNA序列克隆到p3xFLAG-CMV載體上獲得。5. 權(quán)利要求1所述的促癌多肽N1在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61K45/00GK106047832SQ201610512816
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月30日
【發(fā)明人】王燏嬋, 陳玲玲, 沈愛國, 茅國新
【申請人】南通大學(xué)