大豆myb轉(zhuǎn)錄因子基因提高大豆異黃酮生物合成的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種大豆MYB轉(zhuǎn)錄因子基因提高大豆異黃酮生物合成的應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。GmMYB9基因大小為1188bp，編碼395個氨基酸；酵母單雜交實驗結(jié)果表明GmMYB9具有轉(zhuǎn)錄激活活性，亞細(xì)胞定位結(jié)果證明GmMYB9定位在細(xì)胞核中；實時熒光定量PCR結(jié)果表明GmMYB9在大豆未成熟胚向成熟種子發(fā)育過程中的表達(dá)趨勢與異黃酮的積累趨勢一致，在高異黃酮品種中的表達(dá)量高于異黃酮含量低的品種；轉(zhuǎn)化GmMYB9基因的T2代轉(zhuǎn)基因大豆種子和葉片中的異黃酮含量均有提高，證明GmMYB9基因參與調(diào)控大豆異黃酮的生物合成，對培育高異黃酮大豆品種具有重要意義。
【專利說明】
大豆MYB轉(zhuǎn)錄因子基因提高大豆異黃酬生物合成的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及大豆MYB轉(zhuǎn)錄因子GmMYB9基因提高大豆異黃 酬生物合成的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆含有豐富的蛋白質(zhì)和油脂，是重要的糧食和經(jīng)濟(jì)作物。大豆中的異黃酬能夠 提高植物防御非生物脅迫的能力，同時在人類的營養(yǎng)和健康方面具有諸多功效。異黃酬合 成途徑是植物苯丙烷類代謝途徑的分支途徑，苯丙烷類代謝在植物中普遍存在，但異黃酬 主要在豆科植物中合成，它的積累受遺傳因素和環(huán)境因素共同決定。
[0003] 異黃酬代謝途徑由多個關(guān)鍵酶共同催化完成，單獨(dú)調(diào)節(jié)某一個關(guān)鍵酶無法獲得預(yù) 期的結(jié)果。但是MB轉(zhuǎn)錄因子基因通過與異黃酬合成途徑關(guān)鍵酶基因的啟動子結(jié)合，能夠調(diào) 控多個關(guān)鍵酶基因的表達(dá)和mRNA轉(zhuǎn)錄的起始，進(jìn)而參與調(diào)控異黃酬的生物合成。因此，研究 大豆的MYB轉(zhuǎn)錄因子，分析其在轉(zhuǎn)錄水平上對異黃酬生物合成的調(diào)控，闡明其相關(guān)功能，有 助于進(jìn)一步了解大豆異黃酬的調(diào)控機(jī)理。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種大豆MYB轉(zhuǎn)錄因子GmMYB9基因提高大豆異黃酬生物合成 的應(yīng)用。
[0005] 大豆異黃酬含量屬于數(shù)量性狀，是定量遺傳類型。近年來，已有研究報道顯示位于 數(shù)量性狀位點(diǎn)（Quanti tative Trait Locus, QTL)附近的基因能夠調(diào)控相應(yīng)的數(shù)量性狀，如 玉米巧粒行數(shù)0化附近的FASCIATED EAR2通過調(diào)控每穗玉米的巧粒行數(shù)來提高玉米產(chǎn)量， 所W我們將目標(biāo)聚焦在位于大豆異黃酬OTL附近的MYB類轉(zhuǎn)錄因子。為了降低遺傳因素及環(huán) 境因素對大豆異黃酬含量的影響，我們比較分析前人的研究結(jié)果，選取不同品種的自交系 在不同年份、不同地點(diǎn)定位到的位于大豆第6號染色體上游、與大豆異黃酬合成相關(guān)的2個 QTL，化Y1和qGm06，在qGm06的closet marker下游0.3cM處找到候選MYB轉(zhuǎn)錄因子基因 GmMYB9,到目前為止，關(guān)于GmMYB9的作用還未見報道。
[0006] 本發(fā)明利用gateway技術(shù)構(gòu)建GmMYB9的植物表達(dá)載體，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆胚 尖遺傳轉(zhuǎn)化方法將GmMYB9轉(zhuǎn)入大豆中，獲得T2代轉(zhuǎn)基因大豆，用高效液相法化PLC)測量T2代 轉(zhuǎn)基因大豆的葉片及種子中的異黃酬含量，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因植株種子異黃酬含量提 高了 1.11倍，葉片異黃酬含量提高了 1.56倍，葉片中的異黃酬含量提升幅度更高，說明 GmMYB9基因主要在葉片中調(diào)控異黃酬的生物合成。在前人的研究中，R1-MYB轉(zhuǎn)錄因子 GmMYB176能夠在發(fā)根中調(diào)控大豆異黃酬的生物合成;玉米的CRC基因（玉米R2R3-M1^類轉(zhuǎn)錄 因子與地LH類轉(zhuǎn)錄因子的基因融合序列)在大豆種子中超表達(dá)，總異黃酬的含量提高了 3倍 多，若表達(dá)CRC的同時抑制與IFS競爭底物的酶基因 F3H(flavanone 3-hy化oxylase)的表 達(dá)，異黃酬的含量能提高4倍多。雖然GmMYB9基因在大豆種子中調(diào)控異黃酬的生物合成效果 沒有玉米的CRC基因明顯，但GmMYB9基因能夠提高大豆葉片中的異黃酬含量，運(yùn)在現(xiàn)有的研 究中尚未見到相關(guān)報道。由于異黃酬能夠提高植物防御非生物脅迫的能力，所w推測在大 豆的復(fù)葉期至完熟期的過程中如果遇到非生物脅迫，GmMYB9在大豆葉片中調(diào)控異黃酬的生 物合成就會發(fā)揮抵御非生物脅迫的功效。
[0007] 本發(fā)明所提供的大豆MYB轉(zhuǎn)錄因子GmMYB9,編碼基因如SEQ ID No.l所示，它是由 395個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，序列如SEQ ID No.2所示，屬于典型的R2R3型大豆MYB轉(zhuǎn)錄 因子。
[0008] 本發(fā)明所提供的大豆MYB轉(zhuǎn)錄因子GmMYB9基因在提高大豆異黃酬生物合成中的應(yīng) 用。
[0009] 本發(fā)明所提供的大豆MYB轉(zhuǎn)錄因子GmMYB9基因在提高大豆葉片中異黃酬生物合成 中的應(yīng)用。
[0010] 利用任何一種能夠引導(dǎo)外源基因在植物中表達(dá)的載體，將本發(fā)明所提供的GmMYB9 編碼基因?qū)胫参锛?xì)胞，可獲得異黃酬含量提高的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及轉(zhuǎn)基因植株。使用本發(fā) 明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核巧酸前可加上任何一種增強(qiáng)啟動子或誘導(dǎo) 型啟動子。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所使用的載體進(jìn)行加 工，如加入植物可選擇性標(biāo)記(GUS基因、蛋光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶 大霉素、卡那霉素等）。攜帶有本發(fā)明GmMYB9的表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病 毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織， 并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。被轉(zhuǎn)化的宿主既可W是單子葉植物，也可W是雙子葉植 物。本發(fā)明的基因?qū)Ω牧级箍浦参锂慄S酬代謝，特別是培育高異黃酬大豆品種具有重要意 義。
【附圖說明】
[0011] 圖 1 是GmMYB9的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖，M.DNA Marker(DL2000)，l.PCR結(jié)果；
[0012] 圖2是GmMYB9在酵母系統(tǒng)中的激活能力分析圖；
[0013] 圖3是亞細(xì)胞定位載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌液PCR圖，M.DNA Marker(DL2000)，1-2PCR結(jié) 果；
[0014] 圖4是GmMYB9的亞細(xì)胞定位結(jié)果圖；
[001引圖5是GmMYB9在大豆不同組織中的表達(dá)圖；
[0016] 圖6是連接C服8啟動子序列的PCAMBIA1301載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌電泳圖，M.DNA Marker (DL2000)，1-2PCR 結(jié)果；
[0017]圖 7 是煙草葉片 GUS 活性分析圖，A:CK;B:CaMV 35S;C:CHS8promoter;D: CHS8promoter+GmMYB9；
[0018] 圖8是植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌菌液PCR電泳圖，M.DNA Marker(DL2000)，1-4PCR 結(jié)果；
[0019] 圖9是部分T〇、Ti、T2代轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測結(jié)果圖，M:DNA Marker(DL2000) ;P:陽 性質(zhì)粒;N:野生型大豆；1-14:轉(zhuǎn)基因大豆；
[0020] 圖10是部分T2代轉(zhuǎn)基因植株的Southern blot檢測結(jié)果圖，P:陽性質(zhì)粒;WT:野生 型大豆；1-3:轉(zhuǎn)化pCB35SRlR2-GFP-GmMYB9載體的植株；
[0021] 圖11a是野生型與T2代轉(zhuǎn)基因植株的種子異黃酬含量圖，WT:野生型大豆；1-3:轉(zhuǎn) 化 pCB35SRlR2-GFP-GmMYB9 載體的植株；
[0022]圖Ub是野生型與轉(zhuǎn)化基因 GmMYB9的T2代轉(zhuǎn)基因植株的新鮮葉片異黃酬含量圖， WT:野生型大豆；1-3:轉(zhuǎn)化pCB35SRlR2-GFP-GmMYB9載體的植株；
[002引圖12是GmMYB9在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)量圖，WT:野生型大豆；1-3:轉(zhuǎn)化 pCB35SRlR2-GFP-GmMYB9 載體的植株；
[0024] 圖13是轉(zhuǎn)GmMYB9基因 T2代葉片中異黃酬合成關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量分析圖；WT:野 生型大豆；1-3:轉(zhuǎn)化pCB35SRlR2-GFP-GmMYB9載體的植株。
【具體實施方式】
[0025] 實施例1、大豆GmMYB9基因的克隆
[0026] 用RNAiso Plus(購自hKaRa)提取大豆品種Williams 82的20d胚總RNA，經(jīng)1%瓊 脂糖電泳檢測RNA的完整性。cDNA的合成按照Reverse Transc;rip1:ase M-MLA^RNase H-)的 說明書進(jìn)行。根據(jù)GmMYB9的全長序列設(shè)計引物，引物為：
[00打]GmMYB9-F:AACAACATAGAGAGCCATAATACCC
[0028] GmMYB9-R：CATAGACTCCTCTTTCAAACACCTC
[0029] 按照表1反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增：
[0030] 表1PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系
[0031]
[0032] PCR反應(yīng)程序為：95。[4111111;94。[303,57。[503,72。[903,30個循環(huán)；72。(：延伸 1 Omin。經(jīng)PCR擴(kuò)增得到GmMYB9基因，如圖1所示，由1188個堿基對組成，讀碼框自5 '端第1位 到第1188位堿基，編碼一個由395個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，其中自氮端第13-63和66- 114個氨基酸殘基保守結(jié)構(gòu)域是典型的結(jié)合域。
[0033] 實施例2、大豆GmMYB9基因在酵母中的表達(dá)
[0034] 在基因的5'端和3'端分別設(shè)計含EcoR I和Sal I酶切位點(diǎn)的引物，W測序鑒定正 確的pMD18-T-GmMYB9的質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PMD18-T購自hKaRa公司。引物如下（用 下劃線標(biāo)出酶切位點(diǎn)）：
[003引 GmMYB9-HF:5，-CCGGAATTCATGGGAAGGAGTCCTTGC-3,，EcoR I
[0036] GmMYB9-HR:5，-ACGCGTCGACCTACAGATACTGAATGTA-3，，Sal I
[0037] 將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠DM純化回收試劑盒(購自BioTeke公司）純化后，用EcoR 巧口Sal I雙酶切，回收純化后，與同樣用EcoR I和Sal I雙酶切的pG服T7(購自clontech)載 體連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化埃希氏大腸桿菌化.coli)DH5a，經(jīng)驗證后，轉(zhuǎn)入酵母AH109(購自 clontech)中表達(dá)。
[003引酵母感受態(tài)制備及轉(zhuǎn)化方法參照MatchmakerTMQne-HybridLibrary Construct ion&Screenin 邑 Kit (clontech)說明書進(jìn)行。
[0039] 重組質(zhì)粒pG服T7-GmMYB9轉(zhuǎn)入酵母AH109后，能夠在含有5mM 3-AT的營養(yǎng)缺陷型培 養(yǎng)基SD/-化p/-Hi s/-Ade (圖2)上生長，說明GmMYB9具有轉(zhuǎn)錄激活活性，是轉(zhuǎn)錄激活子。
[0040] 實施例3、大豆GmMYB9基因的亞細(xì)胞定位研究
[0041 ] 去掉GmMYB9的終止密碼子，采用重疊延伸PCR(SOE-PCR)的方法構(gòu)建GmMYB9與綠色 巧光蛋白基因 eGFP的融合基因，在5 '端和3 '端分別設(shè)計含Xba I和SacI酶切位點(diǎn)的引物，W 鑒定正確的pMD18-T-GmMYB9及peGFP-Xl為模板，分別W0-F3和0-R3、0-F4和0-R4為成對引 物進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物回收后做好標(biāo)記。引物如下（用下劃線標(biāo)出酶切位點(diǎn)）：
[0042] GmMYB9-S0E-F(0-F3):5'-GCTCTAGAATGGGAAGGAGTCCTTGC-3',Xba I
[0043] GmMYB9-S0E-R(0-R3):
[0044] 5 ' -CACCAT狂助扛C遲島;乂X右m島QiCAGATACTGAATGTACTT-3 '（波浪線代表連
[0045] 接目的基因與報告基因之間的Li址er)
[0046] eGFP-S0E-F(0-F4):
[0047] 5，-gtatctgCCA-OX迫 ICQ￡￡A￡'￡atggtgagcaagggcgag-3 '
[0048] eGFP-S0E-R(0-R4):5 '-CGAGCTCTTACTTGTACAGCTCGTC-3'，SacI
[0049] W回收的GmMYB9和eGFP作為模板，0-F3和0-R4為引物，選用高保真酶Primer Star (購自TaKaRa)進(jìn)行SOE-PCR，W獲得GmMYB9: eGFP融合基因。反應(yīng)體系如表2所示：
[00加]表2S0E-PCR擴(kuò)增體系
[0化1 ]
[0052] 反應(yīng)程序為:94°C5min
[0053] 95°C 10s,68°C-1 °C/cycle 20s,68°C3min,lOcycles
[0054] 95°C10s
[0055] 46°C20s,68°C3min,22cycles
[0056] 68°C10min
[0化7] 10°C forever
[005引將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠DM純化回收試劑盒(購自BioTeke公司）純化后，用Xba I和SacI雙酶切，回收純化后，與同樣用Xba I和SacI雙酶切的pBI121(本實驗室保存)載體 連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化埃希氏大腸桿菌化.coli)D冊a,經(jīng)驗證后，轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌邸A105(本 實驗室保存）中表達(dá)。
[0059] 根癌農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)的制備采用常規(guī)的化Cl2法。
[0060] 重組質(zhì)粒981121-6111]\^9:66。?轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌6齡105后（圖3)，轉(zhuǎn)化洋蔥表皮細(xì) 胞，制作臨時裝片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察GmMYB9的定位情況，結(jié)果表明GmMYB9定位在 細(xì)胞核中（圖4)。
[0061 ] 實施例4、大豆GmMYB9基因的組織特異性表達(dá)
[0062] 分別提取大豆Williams 82根、莖、葉、花、芙及20(1、30(1、40(1、50(1未成熟胚，大豆 Williams 82成熟種子、大豆星鑒35成熟種子的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，方法同實施例1。利 用實時巧光定量PCR對GmMYB9基因在大豆Williams 82不同組織及大豆星鑒35成熟種子中 的表達(dá)情況進(jìn)行檢測。按照SYBR Premix Ex化q(購自TaKaRa)說明書，在實時巧光定量PCR 儀ABI 7500中進(jìn)行。W大豆0-tubulin為內(nèi)參基因，引物如下：0-Tublin-F:5'- GGAAGGCTTTCTTGCATTGGTA-3'
[0063] P-I'ubl in-R: 5' -AGTGGCATCCTGGTACTGC-3'
[0064] GmMYB9-Q-F:5'-TAAGCCAAGAAGAAGAGCAGAC-3'
[00化]GmMYB9-Q-R:5'-CGTTATCAGTTCGCTTTGGTA-3 '
[0066] PCR反應(yīng)體系如表3:
[0067] 表3實時巧光定量PCR反應(yīng)體系
[006引
[0069] 反應(yīng)程序為:95 °C 30s; 95 °C 5s，60 °C ：Ms，72 °C 30s，40 個循環(huán)。
[0070] 采用法分析數(shù)據(jù)，確定基因的相對表達(dá)量。試驗共設(shè)3次技術(shù)重復(fù)，3次生物 學(xué)重復(fù)。
[0071] 結(jié)果（圖5)表明GmMYB9基因在大豆Williams 82各組織部位均有表達(dá)，在葉片中的 表達(dá)量最高，是成熟種子中的10倍。隨著大豆未成熟胚生長時間的延長，GmMYB9基因的表達(dá) 量也隨之升高，運(yùn)與前人研究的異黃酬在大豆未成熟胚中的積累趨勢一致。同時在不同品 種大豆種子中的表達(dá)量也不同，在異黃酬含量較高的Williams82中的表達(dá)量要高于異黃酬 含量較低的星鑒35,表明GmMYB9基因在大豆異黃酬合成途徑中可能具有調(diào)控作用。
[0072] 實施例5、大豆GmMYB9基因?qū)HS8基因的調(diào)控作用
[0073] 植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法與實施例2方法相同。將GmMYB9亞克隆于植物表達(dá)載體 PCAMBIA1301中，用C服8的啟動子(C服8P)替換PCAMBIA1301的CaMV35S啟動子構(gòu)建表達(dá)載體 PCAMBIA1301-C服8P，鑒定正確后，轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105(圖6)。
[0074] 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化煙草葉片。用去掉針頭的1ml注射器，將分別含有 PCAMBIA1301 空載體，PCAMBIA1301-CHS8P 載體，及 PCAMBIA1301-CHS8P 與 PCB35SR1R2-GFP- GmMYB9兩種載體質(zhì)粒的農(nóng)桿菌EHA105的重懸液及不含載體的重懸液(菌體重懸后0D600約 為0.2)，從煙草葉片背部緩慢注入，用記號筆做好標(biāo)記，侵染后，在16h光照、她黑暗光周期， 22°C條件下，保濕培養(yǎng)2d。
[0075] GUS巧光測定
[0076] 5.1GUS 酶提取
[0077] 1)取0.1 g煙草葉片，去掉主葉脈，放入研鉢中，加入液氮研磨成粉末；
[0078] 2)將研磨好的粉末放入預(yù)先稱重且過液氮預(yù)冷的離屯、管中，再次稱重，記錄加樣 前和加樣后離屯、管的重量(兩次差值即為樣品重量），向離屯、管中加入60化1的酶提取緩沖 液，滿旋混勻；
[00 巧]3)4。[，12000巧111離屯、10111111，取上清，-80。(：保存?zhèn)溆谩?br>[0080] 5.1化a壯ord法測定GUS提取液的蛋白含量
[0081 ] 1)按照表4配置BSA濃度梯度液，按照1:5的比例與考馬斯亮藍(lán)G250溶液混勻，室溫 放置5min，在波長595nm處測定吸收值，W蛋白濃度為橫坐標(biāo)、吸收值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲 線：
[0082] 表4BSA梯度溶液
[0083]
[0084] 2)吸取GUS提取液，補(bǔ)水至4ml，混勻后吸出1ml，加入考馬斯亮藍(lán)G250溶液 5ml，混勻后室溫放置5min，在波長595nm測定吸收值，根據(jù)回歸方程計算樣品中蛋白含量。
[0085] 5.3巧光測定
[0086] 1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:配制10皿4-MU母液，用反應(yīng)終止液對其進(jìn)行線性稀釋，濃度 依次為 1000皿〇1/1、500醒〇1/1、250皿〇1/1、125加1〇1/1、62.5皿〇1/1，在激發(fā)光365醒、發(fā)射 光455nm，狹縫3nm條件下用巧光分光光度計測定各巧光強(qiáng)度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0087] 2)取6支1.5mL離屯、管，各加入90化1反應(yīng)終止液，編號；
[008引 3)取1支1.5mL離屯、管，加入ImL在37°C預(yù)熱的檢測液2mmol/LMUG，加入適量GUS提 取液測定的蛋白濃度為依據(jù)），迅速充分混合，取出10化1加入1號管中，記錄此時反應(yīng)時 間為0,嚴(yán)格計時；
[0089] 4)反應(yīng)管放入37 °C水浴保溫進(jìn)行酶反應(yīng)，分別于5、10、15、30、60min時各取出10化 1加入裝有90化1反應(yīng)終止液的2-6號管中混勻，分別為酶反應(yīng)5、10、15、30、60min時的樣品， 在激發(fā)光365nm，發(fā)射光455nm，狹縫3nm條件下測定各巧光強(qiáng)度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線讀取2-6號管 中4-MU含量。
[0090] 5.4GUS酶活性計算
[0091 ] 1)酶活力單位定義:每分鐘水解4-MUG生成Inmol或Img、化g、lng 4-MU的酶量為一 個活力單位，根據(jù)定義求出各樣品的酶活力；
[0092] 2)GUS基因表達(dá)活性每毫克蛋白的酶活力表示，W每毫克蛋白每分鐘催化MUG 生成Ipmol 4-MU作為GUS的一個活性單位。
[0093] 巧光測定結(jié)果（圖7)顯示，侵染重懸液的煙草葉片巧光值較低;侵染含有CaMV35S 啟動子與CHS8啟動子的PCAMBIA1301質(zhì)粒載體的煙草葉片的GUS巧光值提高；共侵染 PCAMBIA1301-CHS8P與pCB35SRlR2-GFP-GmMYB9質(zhì)粒載體的煙草葉片的GUS巧光值比單獨(dú)侵 染pCAMBI A1301-CHS8P質(zhì)粒載體的要高。運(yùn)就表明，轉(zhuǎn)入了 GmMYB9基因確實對CHS8基因有調(diào) 控作用，使共轉(zhuǎn)化的煙草葉片GUS巧光活性升高。而CHS8基因是植物異黃酬合成途徑中的關(guān) 鍵酶。
[0094] 實施例6、GmMYB9在大豆中的表達(dá)及對異黃酬生物合成途徑調(diào)控的分析
[0095] 利用gateway技術(shù)構(gòu)建植物表達(dá)載體pCB35SRlR2-GFP-GmMYB9,參照invi化ogen公 司提供的方法。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大豆胚尖遺傳轉(zhuǎn)化將植物表達(dá)載體PCB35SR1R2-GFP- GmMYB9(圖8)轉(zhuǎn)化大豆吉林35,并對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR、Southern blot鑒定，同時檢測陽 性植株中目的基因表達(dá)量、大豆異黃酬含量及異黃酬合成路徑上關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量，具 體方法及結(jié)果如下：
[0096] 6.1大豆胚尖的遺傳轉(zhuǎn)化及篩選
[0097] 1)種子消毒:挑取巧粒飽滿、表面光滑的大豆吉林35種子平鋪于干凈的培養(yǎng)皿中， 在通風(fēng)楓內(nèi)，將培養(yǎng)皿敞開放在干燥器中，將裝有52ml水和44ml次氯酸鋼的250ml燒杯也放 入干燥器中，沿?zé)瓋?nèi)壁緩慢加入4ml濃鹽酸，迅速合上干燥器的蓋子密封，滅菌12h。滅菌 結(jié)束后，用保鮮膜密封培養(yǎng)皿的接縫處，置于超凈工作臺中打開培養(yǎng)皿，吹20-30min去除多 余的氯氣；
[0098] 2)挑取含有pCB35SRlR2-GFP-GmMYB9載體的農(nóng)桿菌單克隆于2ml附加50mg/L rif 和50mg/L Km的液體YEP培養(yǎng)基中，28°C160巧m振蕩培養(yǎng)24h;
[0099] 3)取1ml上述菌液倒入200ml含同樣抗生素的液體YEP中，28 °C 25化pm振蕩培養(yǎng)至 0〇6〇日=0.6左右；
[0100] 4)將培養(yǎng)后的菌液轉(zhuǎn)入50mL無菌離屯、管中，室溫5000rpm離屯、lOmin棄上清、收集 菌體，將菌體重懸于附加0.02% si lwet77的1/2MS液體培養(yǎng)基中（pH 5.4)，冰浴化活化菌 液；
[0101] 5)將滅菌后的大豆轉(zhuǎn)入附加 2mg/L 2,4-D的液體MS培養(yǎng)基中，25°C暗培養(yǎng)12-1化；
[0102] 6)在超凈工作臺中，用手術(shù)刀和綴子分離大豆胚尖，放置于活化好的菌液中，真空 侵染15min，將侵染后的胚尖置于附加5mg/L 6-BA的1/2MS固體培養(yǎng)基上(P冊.4)，25°C黑暗 條件共培養(yǎng)2-3d;
[0103] 7)將共培養(yǎng)后的大豆胚尖轉(zhuǎn)入附加 0.6mg/L Basta、250mg/L Cef的1/2MS固體誘 芽篩選培養(yǎng)基中（pH 5.7-5.8)，25°C/22°C16/她光照/黑暗條件下培養(yǎng)，2周后將胚尖轉(zhuǎn)移 到新的誘芽篩選培養(yǎng)基中；
[0104] 8)經(jīng)過4周篩選后，用剪刀剪取幼芽部分轉(zhuǎn)入附加0.5mg/L IBA、100mg/L Cef的3/ 8MS固體生根培養(yǎng)基中；
[0105] 9)4周后，將生根的幼苗煉苗2-3d，洗凈根部的培養(yǎng)基移入裝有大田±:草炭:賠石 (1:1:1)的營養(yǎng)鉢中，在28°C/22°C16/她光照/黑暗條件的人工氣候室中培養(yǎng)。
[0106] 6.2轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測
[0107] 1)提取轉(zhuǎn)化植株的葉片總DNA，方法參照加 iversal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0(購自TaKaRa)說明書進(jìn)行。
[0108] 2)將大豆葉片總DM稀釋30倍，取化1作模板，W未轉(zhuǎn)化的野生型大豆為陰性對照， 質(zhì)粒pCB35SRlR2-GFP-GmMYB9為陽性對照，Wbar-F、bar-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗證，引物序 列如下：
[0109] bar-F:5 '-AAACCCACGTCATGCCAGCTC-3 '
[0110] bar-R:5 '-CGACAAGCACGGTCAACTTC-3 '
[011。 3)收獲PCR檢測為陽性的植株種子，即To代種子，
[0112] 4)將To代種子種植后在人工氣侯室中培養(yǎng)，按上述方法繼續(xù)篩選后收獲Ti代種子；
[0113] 5)將Ti代種子種植在吉林大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院轉(zhuǎn)基因安全釋放基地，對T2代植株及 其種子做進(jìn)一步研究。
[0114] 圖9為GmMYB9在部分T〇、Ti、T2代轉(zhuǎn)基因大豆中的PCR鑒定結(jié)果。結(jié)果表明，GmMYB9基 因已經(jīng)整合到大豆基因組中。
[0115] 6.3T2代轉(zhuǎn)基因植株的Southern blot檢測
[0116] 首先對種植在轉(zhuǎn)基因安全釋放基地中的T2代植株葉片進(jìn)行PCR檢測，記錄好陽性 植株。然后提取陽性植株的葉片總DNA，參照Soutern雜交試劑盒DIG High Prime DNA Lableling and Detection Starter Kit I(購自羅氏公司）的方法對T2代植株進(jìn)行 Southern blot檢測。圖10為部分T2代植株的Southern blot檢測結(jié)果，進(jìn)一步證明GmMYB9 基因已經(jīng)整合到大豆基因組中，并且能夠在大豆中穩(wěn)定遺傳。
[0117] 6.4轉(zhuǎn)基因大豆植株異黃酬含量的檢測
[0118] T2代轉(zhuǎn)基因植株的種子收獲后，用高效液相法化PLC)測量PCR及Southern blot檢 測均呈陽性植株的種子及葉片異黃酬含量。結(jié)果如（圖11a、圖Ub)表5、表6所示，與野生型 相比，轉(zhuǎn)基因植株種子異黃酬含量只提高了 1.11倍，變化非常小，轉(zhuǎn)基因植株葉片異黃酬含 量提高了 1.56倍，提升的幅度要高于種子中的異黃酬，說明GmMYB9基因主要在葉片中調(diào)控 異黃酬的生物合成。
[0119] 表5野生型與T2代轉(zhuǎn)基因植株的種子異黃酬含量 「01201
[0123] 6.5轉(zhuǎn)基因植株中61111￥89的表達(dá)量檢測
[0124] 提取GmMYB9轉(zhuǎn)基因 T2代陽性植株及野生型的葉片RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，W GmMYB9-Q-F、GmMYB9-Q-R為引物，利用實時巧光定量PCR檢測GmMYB9在轉(zhuǎn)基因植株及野生型 中的表達(dá)量。結(jié)果如圖12所示，與野生型相比，GmMYB9在轉(zhuǎn)基因株系中表達(dá)量均有顯著提 高，說明GmMYB9成功轉(zhuǎn)入大豆中，并能穩(wěn)定遺傳。
[0125] 6.6轉(zhuǎn)基因植株中異黃酬合成途徑上各關(guān)鍵酶基因的表達(dá)分析
[0126] 分別提取野生型及轉(zhuǎn)GmMYB9基因 T2代葉片的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA作模板，利用實 時巧光定量PCR檢測異黃酬合成途徑中的關(guān)鍵酶基因 PALI (Phenylalanine ammonia- lyase)、C服8、IFS2、CHI(chalcone isomerase)及F3H的表達(dá)情況，各酶基因所需引物如下： [01 打]GmPAU-F: 5' -TCAGAGTCAGCGAGAGAAGGAG-3,
[0128] GmPALl-R:5'-GGTGGTGACGCCGTAACTG-3 '
[01 巧]GmC服8-F:5'-ATCCGCCAGGCACAAAGG-3 '
[0130] GmC服8-R:5'-TGAAGTAGTAGTCAGGATAGGTGCT-3 '
[0131] GmIFS2-F:5'-AAGCCTCGTCTTCCCTTCATAG-3 '
[01 扣]GmIFS2-R:5'-CAAAGTAGAGAGAGAATAAGGGACC-3,
[0133] GmCHI-F:5'-TGTATCAGCGGCGGTCTTG-3 '
[0134] GmCHI-R:5'-TCAATACCGCAGGCAATCG-3 '
[0135] GmF3H-F:5'-TTCATTGTCTCCAGCCATCTCC-3'
[0136] GmF3H-R:5，-CGCTGTATTCCTCAGTCACCG-3 '
[0137] 結(jié)果如圖13所示，我們可W看到在轉(zhuǎn)GmMYB9基因的T2代葉片中，與野生型相比， PALI的表達(dá)量略有降低，IFS2的表達(dá)量略有升高，但都不具有統(tǒng)計學(xué)意義;F3H的表達(dá)量幾 乎沒有變化;CHS8和CHI的表達(dá)量在各轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)量都達(dá)到了極顯著水平，說明 GmMYB9通過上調(diào)異黃酬合成路徑上關(guān)鍵酶基因 CHS8和CHI的表達(dá)量來調(diào)控異黃酬的生物合 成。


【主權(quán)項】
1. 大豆MYB轉(zhuǎn)錄因子GmMYB9基因在提高大豆異黃酮生物合成中的應(yīng)用。2. 大豆MYB轉(zhuǎn)錄因子GmMYB9基因在提高大豆葉片中異黃酮生物合成中的應(yīng)用。3. 如權(quán)利要求1所述大豆MYB轉(zhuǎn)錄因子GmMYB9基因在提高大豆異黃酮生物合成中的應(yīng) 用，所述大豆MYB轉(zhuǎn)錄因子GmMYB9的序列如SEQIDNo.2所示。4. 如權(quán)利要求1所述大豆MYB轉(zhuǎn)錄因子GmMYB9基因在提高大豆異黃酮生物合成中的應(yīng) 用，所述大豆MYB轉(zhuǎn)錄因子GmMYB9的編碼基因如SEQ ID No.l所示。5. 如權(quán)利要求2所述大豆MYB轉(zhuǎn)錄因子GmMYB9基因在提高大豆葉片中異黃酮生物合成 中的應(yīng)用，所述大豆MYB轉(zhuǎn)錄因子GmMYB9的序列如SEQIDNo.2所示。6. 如權(quán)利要求2所述大豆MYB轉(zhuǎn)錄因子GmMYB9基因在提高大豆葉片中異黃酮生物合成 中的應(yīng)用，所述大豆MYB轉(zhuǎn)錄因子GmMYB9的編碼基因如SEQ ID No.l所示。
【文檔編號】A01H5/00GK106047889SQ201610389577
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月3日
【發(fā)明人】王慶鈺, 趙明珠, 閆帆, 王英, 李景文, 王天亮, 郭文云, 申梓邑, 何禹璇, 程浩
【申請人】吉林大學(xué)