煙草查爾酮合成酶NtCHS1基因及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了煙草查爾酮合成酶NtCHS1基因，編碼區(qū)核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發(fā)明通過實驗證明，改變煙草中查爾酮合成酶基因的表達水平，可以調(diào)節(jié)煙草花色、株高以及綠原酸和蕓香苷等類黃酮化合物的含量，因此，本發(fā)明構(gòu)建了含有NtCHS1基因的重組表達載體、NtCHS1基因沉默載體，并轉(zhuǎn)化煙草植株。本發(fā)明通過過表達或沉默技術(shù)調(diào)節(jié)NtCHS1基因的表達，可以獲得花色深淺各異或株高較低的轉(zhuǎn)基因煙草植株，提高了煙草的觀賞價值；并且可以提高煙草中綠原酸和蕓香苷合成，實現(xiàn)了利用煙草大量生產(chǎn)蕓香苷和綠原酸的目的，使得煙草葉片獲得了更廣泛的應(yīng)用，具有重大的經(jīng)濟價值和應(yīng)用前景。
【專利說明】
煙草查爾酬合成酶NtCHSI基因及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及煙草查爾酬合成酶化CHS1基因，W及該基因在調(diào)控?zé)煵葜旮?、花色，?綠原酸、蕓香巧等類黃酬化合物的含量中的應(yīng)用。本發(fā)明還設(shè)及含有該基因的重組表達載 體，W及其在制備煙草綠原酸和蕓香巧等酪類化合物中的應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 煙草是我國主要的經(jīng)濟作物之一，種植面積和產(chǎn)量均居世界首位。煙草生物產(chǎn)量 大，含有大量的化學(xué)成分，在卷煙工業(yè)、醫(yī)藥、食品、飼料W及農(nóng)藥等方面都有重要的用途。 但我國對煙草的利用方式比較單一，目前主要用于制備卷煙等煙制品，沒有充分發(fā)揮其多 種功效的生物學(xué)特性綜合利用。
[0003] 綠原酸(化lorogenic acid，CGA)，又稱咖啡單寧酸、咖啡較酸，是一種重要的活性 物質(zhì)，具有屯、血管保護、抗氧化、抗紫外及抗福射、抗誘變及抗癌、保肝利膽、抗菌、抗病毒、 降脂降糖、免疫調(diào)節(jié)等作用。綠原酸在植物中分布廣泛，主要存在于忍冬科忍冬屬、菊科葛 屬及杜仲科杜仲屬等植物中。在杜仲、金銀花、咖啡、菊花等植物中的含量非常高。蕓香巧 (Rutin),別名蘆下、維生素 P、紫搬皮巧等。蕓香巧存在于槐米、香椿、養(yǎng)麥等多種植物中，特 別是在槐花中含量較高。蕓香巧具有豐富的藥理學(xué)活性，如抗炎、抗病毒、涼血止血、降低毛 細血管壁脆性等作用。目前蕓香巧在臨床上常用于防治腦溢血、高血壓、視網(wǎng)膜出血、紫癒 和急性出血性腎炎等疾病。綠原酸和蕓香巧在醫(yī)藥、化工和食品等領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用。
[0004] 我國在蕓香巧和綠原酸的生物合成、藥理活性、提取純化W及開發(fā)利用等方面的 研究較為滯后。現(xiàn)有技術(shù)中，綠原酸和蕓香巧的主要來源是從天然植物中提取。但是，對于 任何一種天然化合物，單純依靠天然植物資源，均不利于可持續(xù)發(fā)展。因此，擴大其來源途 徑勢在必行。目前，利用基因工程方法對次生代謝途徑的遺傳特性進行改造，合成編碼代謝 途徑中限速酶基因，導(dǎo)入細胞內(nèi)增加其表達量和提高目標(biāo)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量是最常用的策 略，已發(fā)展為具有廣闊應(yīng)用前景的熱點研究領(lǐng)域。
[0005] 蕓香巧和綠原酸均屬于酪類物質(zhì)，在植物中酪類化合物通過苯丙烷代謝途徑合 成。在苯丙烷代謝途徑中，肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、芥子酸等酪類酸是中間產(chǎn)物，運些酸可 進一步轉(zhuǎn)化為香豆素、綠原酸，也可W形成CoA醋、咖啡酸，再進一步轉(zhuǎn)化為類黃酬、木質(zhì)素 等多酪類物質(zhì)。查爾酬合成酶(化alconesynthase，C服，EC 2.3.1.74)是類黃酬代謝途徑中 的第一個關(guān)鍵酶，也是重要的限速酶。它催化3分子的丙二酷-CoA和1分子的對香豆酷-CoA 結(jié)合形成查爾酬，查爾酬進一步衍生轉(zhuǎn)化構(gòu)成各類黃酬化合物。目前CHS的研究多集中在植 物花青素合成途徑方面，C服基因的過量表達引起轉(zhuǎn)基因植株花和果皮中色素的積累。
[0006] 煙草是典型的基因工程模式植物，目前煙草已經(jīng)作為生物反應(yīng)器成功應(yīng)用于多種 藥用蛋白、抗體W及疫苗的生產(chǎn)。因此，本發(fā)明利用基因工程方法，通過調(diào)控?zé)煵莼ㄖ蠧HS基 因的表達量，形成各類顏色的煙草花制品，提高了煙草的觀賞價值;通過超表達CHS基因，獲 得能夠高產(chǎn)蕓香巧、綠原酸等強藥理活性物質(zhì)的煙草植株或煙草懸浮細胞系，對提高煙草 在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域的利用價值有非常重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明從普通煙草中克隆獲得了化CHS1基因（包括編碼區(qū)和 調(diào)控區(qū)）。本發(fā)明的實驗證明，通過基因過表達和基因沉默改變煙草中化CHS1基因的表達水 平，可W調(diào)節(jié)煙草株高、花色及綠原酸、蕓香巧等類黃酬化合物的含量。本發(fā)明為改良煙草 品質(zhì)，提高煙草在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域的利用價值有非常重要的意義。
[000引本發(fā)明還構(gòu)建了含有化CHS1基因的重組表達載體，W及化CHS1基因沉默載體，并 將其導(dǎo)入煙草中，增強或減弱了其原有基因的表達，從而可調(diào)控?zé)煵莸幕ㄉ?變深或變淺）、 株高(變矮），W及綠原酸和蕓香巧的合成能力(含量升高或降低）。
[0009] 本發(fā)明是通過W下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0010] 煙草查爾酬合成酶化CHS1基因，包括啟動子和編碼區(qū)（編碼區(qū)即為狹義上的煙草 查爾酬合成酶化CHS1基因），啟動子的核巧酸序列如SEQ ID NO. 1所示，編碼區(qū)的核巧酸序 列如SEQ ID NO. 2所示(該序列中，第16~195位為外顯子序列；第196~1184位為內(nèi)含子序 列，第1185~2176位外顯子序列）；其所編碼的氨基酸（查爾酬合成酶）的序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0011] 所述煙草查爾酬合成酶化CHS1基因，通過控制其表達量，可W調(diào)控?zé)煵莼ㄉ?、煙?株高，W及綠原酸和蕓香巧等類黃酬化合物的含量高低，具體為:過表達化CHS1基因，可W 加深煙草花色，提高煙草植株中綠原酸和蕓香巧等類黃酬的含量，獲得高產(chǎn)綠原酸和蕓香 巧的轉(zhuǎn)基因材料;抑制化CHS1基因的表達，可W使煙草花色變淺，降低株高，降低草植株中 綠原酸和蕓香巧等類黃酬的含量。
[0012] 一種含有化CHS1基因的重組表達載體，其上裝載有化CHS1基因，所用載體為任意 一種可用于根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植株的雙元載體，如pBI系列載體(如pBI 121)，pCHF系列載體 (如pCHFl)、Gateway?系列載體(如PH2GW7)或其他衍生植物表達載體，優(yōu)選的，為PC3301- ZDS載體。
[0013] 所述含有化CHS1基因的重組表達載體的構(gòu)建方法為：從煙草中提取總RNA，進行 cDNA反轉(zhuǎn)錄，然后利用特異性引物進行PCR擴增，得擴增產(chǎn)物(為煙草查爾酬合成酶化CHS1 基因的外顯子）；將擴增產(chǎn)物與載體(如PC3301-ZDS載體)連接，即得到含有化CHS1基因的重 組表達載體。
[0014] 所述特異性引物為：
[0015] 化C服1-F:ATCTAGAAACCCTAGTAATCGTCCATC；
[0016] NtCHSl-R:TGAGCTCCCACTAAGTAGCAACACTGTG;如沈Q ID NO.7、8所示；其中，限制性 內(nèi)酶切位點為引物中下劃線標(biāo)注序列，分別為XbaI酶切位點：TCTAGA; Sac I酶切位點： GAGCTCo
[0017] 所述含有化CHS1基因的重組表達載體，將其導(dǎo)入煙草植株中，獲得轉(zhuǎn)基因植物A， 該轉(zhuǎn)基因植物A具有如下（1)或(2)中至少一種特征：
[0018] (1)轉(zhuǎn)基因植物A的花色深于野生型植物；
[0019] (2)轉(zhuǎn)基因植物A的綠原酸、蕓香巧等黃酬類化合物的含量高于野生型植物。
[0020] 因此，所述含有化CHS1基因的重組表達載體具有W下用途：
[0021] (1)在調(diào)節(jié)煙草花色(使花色加深）中的應(yīng)用。
[0022] (2)在調(diào)節(jié)煙草植株中綠原酸、蕓香巧等黃酬類化合物的含量(提高含量）中的應(yīng) 用。
[0023] (3)在制備綠原酸和蕓香巧中的應(yīng)用。
[0024] 將含有化CHS1基因的重組表達載體，導(dǎo)入煙草植株中，獲得轉(zhuǎn)基因植物A的具體方 式可W為:將含有化CHS1基因的重組表達載體轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌(如LBA4404菌株）（該菌株可 通過常規(guī)市場途徑購買得到），獲得含化CHS1基因的根瘤農(nóng)桿菌菌株，然后轉(zhuǎn)化煙草受體， 再通過組織培養(yǎng)技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株。進一步，培養(yǎng)該植株，并提取、分離、純化，得到 煙草綠原酸和蕓香巧。
[0025] 一種化CHS1基因沉默載體(RNAi干擾載體），其上裝載有化CHS1基因的干擾片段 (序列如SEQ ID NO.4所示），所用載體為任意一種可用于根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植株的干擾載體， 如pTCK系列載體(如PTCK303等），GatewayTW系列載體(如抑aLSCATE等)或其他衍生植物表 達載體。
[0026] 優(yōu)選的，所述化C服1基因沉默載體(RNAi干擾載體），是采用Gateway重組克隆技術(shù) 構(gòu)建的，其構(gòu)建方法包括W下兩步：
[0027] (1)8?反應(yīng)構(gòu)建入口克隆:將干擾片段(序列如569 10^.4所示)在8?〇1〇11日3611 n enzyme mix催化作用下重組到入口克隆PD0NRTM201上，經(jīng)BP反應(yīng)構(gòu)建入口克??；
[00%]所述干擾片段的制備方法為：從煙草中提取總RNA，進行cDNA反轉(zhuǎn)錄，經(jīng)兩步PCR (用特異性引物組合Fi-chs/Ri-chs和attBl/attB2)擴增，即獲得兩端含有特異性結(jié)合位點 的干擾片段at巧-PCR產(chǎn)物。所述特異性引物組合Fi-chs/Ri-chs和attBl/attB2的序列如下 所示：
[00 巧]Fi-chs:AAAAAGCAGGCTTCGTATCACTAATAGCGAGCAT;
[0030] Ri-chs：AGAAAGCTGGGTCGGGCATGTCTACACCAC；
[0031] attBl:GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT;
[0032] at巧2:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT;如沈Q ID N0.9、10、ll、12所示；
[0033] 所述BP反應(yīng)的反應(yīng)體系為:TE buffer 6ul，入口克隆PD0NRTM201 lul，干擾片段 lul，BP cion曰seTMn Enzyme Mix 2ul;
[0034] 所述BP反應(yīng)的具體步驟如下:干擾片段和PD0NRTM201混合反應(yīng)物在25°C條件下反 應(yīng)2~化，然后加入化L的蛋白酶K，37°C溫育lOmin終止BP反應(yīng)，即得入口載體質(zhì)粒；
[0035] (2)LR反應(yīng)構(gòu)建RNAi干擾載體:將上述入口載體質(zhì)粒與抑7GWIWG2(I)重組整合，經(jīng) LR反應(yīng)構(gòu)建RNAi干擾載體。
[0036] 所述LR反應(yīng)的反應(yīng)體系為:TE buffer 6ul，表達載體抑7GWIWG2(I)lul，入口載體 質(zhì)粒lul，LR clonaseTMEElnzyme Mix 化 1(反應(yīng)條件同BP反應(yīng)）。
[0037] 所述化CHS1基因沉默載體(RNAi干擾載體），將其導(dǎo)入煙草植株中，可獲得轉(zhuǎn)基因 植物B(該轉(zhuǎn)基因植物B中的化CHS1基因的表達受到抑制或失活），該轉(zhuǎn)基因植物B具有如下 (1)或(2)或(3)中至少一種特征：
[0038] (1)轉(zhuǎn)基因植物B的花色淺于野生型植物；
[0039] (2)轉(zhuǎn)基因植物B的株高低于野生型植物；
[0040] (3)轉(zhuǎn)基因植物B的綠原酸、蕓香巧等黃酬類化合物的含量低于野生型植物。
[0041] 因此，所述化CHS1基因沉默載體(RNAi干擾載體)具有W下用途：
[0042] (1)在調(diào)節(jié)煙草花色(使花色變淺）中的應(yīng)用。
[0043] (2)在調(diào)節(jié)煙草株高(變矮）中的應(yīng)用。
[0044] (3)在調(diào)節(jié)煙草植株中綠原酸、蕓香巧等黃酬類化合物的含量(降低含量）中的應(yīng) 用。
[0045] 將化CHS1基因沉默載體，導(dǎo)入煙草植株中，獲得轉(zhuǎn)基因植物B的具體方式可W為： 將化CHS1基因沉默載體轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌（如LBA4404菌株），獲得含化CHS1基因沉默載體的 根瘤農(nóng)桿菌菌株，然后轉(zhuǎn)化煙草受體，再通過組織培養(yǎng)技術(shù)獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株。
[0046] 一種含化CHS1基因的根瘤農(nóng)桿菌，是由上述含有化CHS1基因的重組表達載體或 化CHS 1基因沉默載體轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌所得。
[0047] -種制備煙草綠原酸和蕓香巧的方法(提高煙草中綠原酸和蕓香巧含量的方法）： 將上述含有化CHS1基因的重組表達載體轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌（如LBA4404菌株），獲得含化CHS1 基因的根瘤農(nóng)桿菌菌株，然后轉(zhuǎn)化煙草受體，通過組織培養(yǎng)技術(shù)獲得轉(zhuǎn)化成功的煙草植株， 培養(yǎng)該植株，提取得到煙草綠原酸和蕓香巧。
[0048] 本發(fā)明通過實驗證明，通過改變煙草中查爾酬合成酶基因（NtCHSl)的表達水平， 可W調(diào)節(jié)煙草花色、株高W及綠原酸和蕓香巧等類黃酬化合物的含量。在重要的雙子葉模 式植物煙草中驗證了化CHS1基因在上述應(yīng)用中的作用。過表達化C服1基因可W加深煙草花 色，提高類黃酬含量，獲得高產(chǎn)綠原酸和蕓香巧的轉(zhuǎn)基因材料;抑制化CHS1基因的表達，可 W使煙草花色變淺，降低株高，降低類黃酬含量。因此，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了簡單有效的調(diào)節(jié)植物 花色、株高W及類黃酬含量的方法，同時也為培育高綠原酸和蕓香巧含量的煙草基因工程 品系提供一種新的方法。
[0049] 本發(fā)明通過過表達或沉默技術(shù)調(diào)節(jié)化CHS1基因的表達，調(diào)節(jié)植物花色和株高的方 法，是采用基因工程方法，將化CHS 1基因?qū)霟煵葜仓昊蛞种浦仓陜?nèi)源化C服1基因，從而獲 得了花色深淺各異或株高較低的轉(zhuǎn)基因煙草植株，提高煙草的觀賞價值。本發(fā)明對利用基 因工程煙草，提供規(guī)?；挠^賞煙草新品系具有重要意義。
[0050] 本發(fā)明從煙草中克隆化CHS1基因，構(gòu)建含所述DNA分子的植物表達載體，用根瘤農(nóng) 桿菌介導(dǎo)，將化CHS1基因?qū)霟煵莶⒃偕鲋仓?，PCR檢測外源目的基因化CHS1的整合情 況，高效液相色譜測定煙草中蕓香巧和綠原酸的含量，篩選獲得蕓香巧和綠原酸含量提高 的轉(zhuǎn)基因煙草植株。查爾酬合成酶(NtCHSl)是煙草植物合成蕓香巧的關(guān)鍵酶和限速酶，增 強查爾酬合成酶的活性，可W提高煙草蕓香巧的含量，同時可W提高上游合成途徑中綠原 酸的含量。本發(fā)明將化CHS1基因轉(zhuǎn)化煙草，提高煙草中綠原酸和蕓香巧合成，獲得高綠原酸 和蕓香巧含量的煙草新植株，為培育高綠原酸和蕓香巧含量的煙草基因工程品系提供一種 新的方法。
[0051] 本發(fā)明的通過轉(zhuǎn)化化CHS1基因提高煙草中綠原酸和蕓香巧含量的方法，是采用基 因工程方法，將化CHS1基因?qū)霟煵葜仓曛?，獲得了綠原酸和蕓香巧含量顯著提高的轉(zhuǎn)基 因煙草植株，最高分別可達到7.42mg/g和5.42mg/g，分別是非轉(zhuǎn)基因煙草(綠原酸4.73mg/ g，蕓香巧3.48mg/g)的1.55倍和1.56倍，從而實現(xiàn)了利用煙草大量生產(chǎn)蕓香巧和綠原酸的 目的，使得煙草葉片獲得了更廣泛的應(yīng)用。本發(fā)明對利用基因工程煙草，提供規(guī)?；a(chǎn)綠 原酸和蕓香巧的新原料具有重要意義，具有重大的經(jīng)濟價值和應(yīng)用前景，尤其在醫(yī)療、保健 領(lǐng)域。
【附圖說明】
[0052] 圖1:T0代過表達轉(zhuǎn)基因煙草DM水平檢測結(jié)果，其中，對照是W非轉(zhuǎn)化煙草基因組 DNA為模板時，沒有擴增出目的條帶;轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)基因陽性植株擴增出特異的一條亮帶。
[0053] 圖2:T0代過表達轉(zhuǎn)基因陽性煙草植株RNA水平檢測結(jié)果，其中，CK為非轉(zhuǎn)化煙草的 化CHS1基因的表達水平，〇1-0、(：-2-0、(：-3-0、(：-5-0為轉(zhuǎn)基因煙草的不同株系（一棵轉(zhuǎn)基因 植株代表一個株系）的化CHS1基因的表達水平。
[0054] 圖3:T0代干擾轉(zhuǎn)基因陽性煙草植株RNA水平檢測結(jié)果，其中，CK為非轉(zhuǎn)化煙草的 化CHS 1基因的表達水平，C-1-R、C-2-R、C-5-R、C-6-R為轉(zhuǎn)基因煙草的不同株系（一棵轉(zhuǎn)基因 植株代表一個株系）的化CHS1基因的表達水平。
[0055] 圖4:T1代過表達轉(zhuǎn)基因陽性煙草植株中花色圖片，其中，CK為非轉(zhuǎn)化煙草的花色， C-1-0，C-2-0，C-3-0，C-5-0為過表達化CHS1基因的轉(zhuǎn)基因植株的花色。
[0056] 圖5:T1代干擾轉(zhuǎn)基因陽性煙草植株中花色圖片，其中，CK為非轉(zhuǎn)化煙草的花色，(：- 1-尺，(：-2-1?，(：-5-1?，(：-6-1?為抑制化(：服1基因表達的轉(zhuǎn)基因植株的花色。
[0057] 圖6:T1代干擾轉(zhuǎn)基因陽性煙草植株株高圖片，其中，CK為非轉(zhuǎn)化煙草的株高，CR為 抑制化CHS 1基因表達的轉(zhuǎn)基因植株的株高。
[005引圖7:T1代過表達轉(zhuǎn)基因陽性煙草植株中綠原酸含量結(jié)果，其中，CK為非轉(zhuǎn)化煙草 的綠原酸含量，C20、C30、C50為過量表達化CHS1基因的轉(zhuǎn)基因植株的綠原酸含量。
[0059] 圖8:T1代干擾轉(zhuǎn)基因陽性煙草植株中綠原酸含量結(jié)果，其中，CK為非轉(zhuǎn)化煙草的 綠原酸含量，C1R，C2R，C5R，C6R為抑制化C服1基因表達的轉(zhuǎn)基因植株的綠原酸含量。
[0060] 圖9:T1代過表達轉(zhuǎn)基因陽性煙草植株中蕓香巧含量結(jié)果，其中，CK為非轉(zhuǎn)化煙草 的蕓香巧含量，C20、C30、C50為過量表達化CHS 1基因的轉(zhuǎn)基因植株的蕓香巧含量。
[0061] 圖10:T1代干擾轉(zhuǎn)基因陽性煙草植株中蕓香巧含量結(jié)果，其中，CK為非轉(zhuǎn)化煙草的 蕓香巧含量，(：11?，〔21?，〔31?，〔61?為抑制化(：服1基因表達的轉(zhuǎn)基因植株的蕓香巧含量。
【具體實施方式】
[0062] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0063] 下述實施例中所設(shè)及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有 的常規(guī)儀器、試劑、材料等，可通過正規(guī)商業(yè)途徑獲得。下述實施例中所設(shè)及的技術(shù)、實驗方 法，檢測方法等，若無特別說明，均為現(xiàn)有技術(shù)中已有的常規(guī)技術(shù)、實驗方法，檢測方法等。
[0064] 實施例1煙草化CHS1基因啟動子序列的擴增
[0065] 取1克煙草品種紅花大金元幼嫩葉片，液氮速凍后迅速用研鉢研碎，進行基因組 DNA提取。利用上游引物化CHSl-pro-F: TTTTAAGTCGTAGGCTCTCTTGCTC(如SEQ ID NO. 13所 示）和下游引物化C服l-pr〇-R:TTTCGCCGGAAAAAATGATGGAC(如SEQ ID NO. 14所示)擴增獲得 全長為2482bp的PCR產(chǎn)物，如SEQ ID N0.1所示。
[0066] 實施例2煙草化C服1基因的克隆
[0067] 利用實施例1中提取的基因組D N A，利用上游引物N t C H S 1 - D F : GCCCTTAGCGTCGACATGGTGA(女曰 SEQ ID NO . 1 5所示）和下游弓| 物 NtCHS 1-DR : ACTTAGCTGCAGCAAAGGGC(如沈Q ID NO. 16所示)擴增獲得全長為2190bp的PCR產(chǎn)物。序列分 析發(fā)現(xiàn)，NtC服1基因組DM包含兩個外顯子和一個內(nèi)含子，如如SEQ ID NO.2所示。
[006引實施例3煙草化C服1基因的克隆
[0069] 取1克煙草品種紅花大金元幼嫩葉片，液氮速凍后迅速用研鉢研碎，進行總RNA提 取、cDNA反轉(zhuǎn)錄。
[0070] 根據(jù)煙草化CHS1基因的編碼序列（如SEQ ID NO.2所示），設(shè)計擴增出完整編碼框 的上下游引物，上游和下游引物序列中分別包括限制性酶切位點（運可視選用的載體而 定），W便構(gòu)建表達載體。本實施例中的上下游引物分別為：
[0071] 化CHS1-F:ATCTAGAAACCCTAGTAATCGTCCATC；
[0072] NtC服 1-R:TGAGCTCCCACTAAGTAGCAACACTGTG;如沈Q ID N0.7、8所示。
[0073] 其中，限制性內(nèi)酶切位點為引物中下劃線標(biāo)注序列，分別為Xba I酶切位點： TCTAGA; SacI 酶切位點：GAGCTC。
[0074] ^上述引物進行擴增，得到約11706口的口〇?產(chǎn)物，為569 10^.2所示序列中的第 16~195位和第1185~2176位外顯子序列。
[0075] 本實施例采用基因克隆方法從煙草中獲得序列正確的煙草查爾酬合成酶基因 化C服1，為通過過表達策略提高煙草中綠原酸和蕓香巧含量提供了一個重要關(guān)鍵酶基因。
[0076] 實施例4煙草化CHS1基因干擾片段的擴增
[0077] 在化CHS1基因編碼區(qū)的非保守區(qū)進行干擾片段設(shè)計選擇，選擇編碼區(qū)123~415間 長293bp的序列作為干擾片段，根據(jù)干擾片段序列設(shè)計帶有特異性結(jié)合位點attB部分序列 的引物，如SEQ ID NO.4所示。
[0078] 利用實施例3中反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，經(jīng)兩步PCR(用特異性引物組合Fi-chs/ Ri-chs和attBl/attB2)擴增獲得兩端含有特異性結(jié)合位點的干擾片段attB-PCR產(chǎn)物。引物 序列如表1所示。
[0079] 表 1
[0080]
[0081 ] 實施例5含化CHS1基因的植物表達載體的構(gòu)建
[0082] 將實施例3擴增獲得的化CHS1基因序列產(chǎn)物用Xbal和SacI酶切，得到的酶切產(chǎn)物 與經(jīng)過同樣酶切的PC3301-ZDS載體連接，得到連接產(chǎn)物。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)， 獲得轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，送測序公司測序，結(jié)果顯示，該質(zhì)粒為將化CHS1基因插入 PC3301-ZDS載體中Xbal和SacI酶切位點間得到的植物表達載體，命名為PC3301-ZDS- 化C服1。
[0083] 本實施例將煙草化CHSl基因可操作性的連接于表達調(diào)控序列，形成含化CHSl基因 的植物表達載體，該載體可用于通過基因工程策略來提高煙草中綠原酸和蕓香巧的含量。
[0084] 實施例6NtC服1基因沉默載體的構(gòu)建
[00化]本實施例中RNAi干擾載體的構(gòu)建采用Gateway重組克隆技術(shù)構(gòu)建。Gateway重組載 體的構(gòu)建需要經(jīng)歷兩步反應(yīng)，分別是經(jīng)（1)BP反應(yīng)構(gòu)建入口克隆和經(jīng)(2化R反應(yīng)構(gòu)建RNAi干 擾載體。
[0086] (1)BP反應(yīng)構(gòu)建入口克?。簩嵤├?中擴增并純化的attB-PCR產(chǎn)物在BP ClonaseTM n enz;yme miX催化作用下重組到入口克隆pD0NRTM201上經(jīng)BP反應(yīng)構(gòu)建入口克 ??；反應(yīng)體系為：TE buffer 6ul，入口克隆PD0NRTM201 lul，attB-PCR產(chǎn)物lul，BP clonaseTME化zyme Mix化1。具體步驟如下：attB-PCR產(chǎn)物和PD0NRTM201混合反應(yīng)物在25 °C條件下反應(yīng)2-化，然后加入化L的蛋白酶K，37°C溫育lOmin終止BP反應(yīng)，取化1反應(yīng)物轉(zhuǎn)化 大腸桿菌感受態(tài)細胞D冊a，在加有Kana( 50mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上進行單菌落的篩選，挑 取單克隆提取質(zhì)粒，質(zhì)粒PCR鑒定正確后送華大公司測序。
[0087] (2 )LR反應(yīng)構(gòu)建RNAi干擾載體:將經(jīng)測序鑒定的入口載體質(zhì)粒與PH7GWIWG2 (I)重 組整合，經(jīng)LR反應(yīng)構(gòu)建RNAi干擾載體。反應(yīng)體系：TE buffer 6ul，表達載體抑7GWIWG2(I) lul，入口載體質(zhì)粒lul，LR clonaseTMEEnzyme Mix化1(反應(yīng)條件同BP反應(yīng)）。取化1重組 后的反應(yīng)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌D冊a感受態(tài)細胞，在加有壯觀霉素(50mg/L)的LB固體培養(yǎng)基上篩 選，挑取陽性克隆提取質(zhì)粒，質(zhì)粒PCR和酶切鑒定正確后送華大公司測序。
[0088] 實施例7根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)化C服1基因遺傳轉(zhuǎn)化煙草獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株
[0089] (一)含化CHS 1基因植株表達載體根瘤農(nóng)桿菌工程株的獲得
[0090] 將實施例5中的含化C服1基因的植株表達載體轉(zhuǎn)入根瘤農(nóng)桿菌化BA4404)中，獲得 的單克隆重組菌產(chǎn)物進行PCR驗證，提取質(zhì)粒并測序。結(jié)果表明，該質(zhì)粒為PC3301-ZDS- NtCHSl，含化CHS1基因的植物表達載體已成功構(gòu)建到根瘤農(nóng)桿菌菌株。將含有該質(zhì)粒的重 組菌命名為 LBA4404/pC3301 -ZDS-NtC服 1。
[0091] 將實施例6中的干擾載體轉(zhuǎn)入根瘤農(nóng)桿菌化BA4404)中，獲得的單克隆重組菌產(chǎn)物 進行PCR驗證，提取質(zhì)粒并測序。結(jié)果表明，該質(zhì)粒為抑7GWIWG2(I)-RNAi-NtCHSl，干擾載體 已成功構(gòu)建到根瘤農(nóng)桿菌菌株。將含有該質(zhì)粒的重組菌命名為LBA4404/pH7GWIWG2(I)- RNAi-化 C服 1。
[0092] (二)根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)化CHS1基因轉(zhuǎn)化煙草
[0093] (1)轉(zhuǎn)化C服1煙草的獲得、沉默化C服1煙草的獲得
[0094] 將上述LBA4404/PC3301-ZDS-化CHS1侵染煙草品種紅花大金元的葉片，農(nóng)桿菌侵 染了約100個1cm2的方形葉盤。分化出的芽經(jīng)過50mg/L的卡那霉素抗生素抗性篩選，最后移 栽成活得到45株TO代轉(zhuǎn)化C服1煙草。
[00巧]將上述LBA4404/pH7GWIWG2(I)-RNAi-NtCHSl侵染煙草品種紅花大金元的葉片，農(nóng) 桿菌侵染了約100個1cm2的方形葉盤。分化出的芽經(jīng)過50mg/L的卡那霉素抗生素抗性篩選， 最后移栽成活得到45株TO代轉(zhuǎn)化CHS1煙草。
[0096]所述轉(zhuǎn)化煙草受體后，通過PCR檢測判斷是否轉(zhuǎn)化成功，PCR檢測包括兩個方面，一 方面是指DNA水平的檢測，即檢測目的基因 NtCHSl是否成功地構(gòu)建并轉(zhuǎn)化到煙草受體中：設(shè) 計化C服1基因的DM檢測引物，進行DM擴增，紫外線下觀察到目的條帶的記為轉(zhuǎn)基因陽性； 另一方面是指RNA水平的檢測，即檢測目的基因化CHS1是否成功地在轉(zhuǎn)基因煙草植株中表 達:設(shè)計化CHS1基因的特異擴增引物，利用巧光染料法進行相對巧光定量PCR擴增，觀察轉(zhuǎn) 基因陽性植株的過量表達情況。
[0097] (2)轉(zhuǎn)化C服1煙草DNA水平的鑒定
[0098] 提取TO代轉(zhuǎn)化C服1煙草的DNA，根據(jù)CaMV35S的序列設(shè)計正向引物：
[0099] 355寸:1'口'〇：4口'64〔614466641';如沈9 10備.17所示。
[0100] 根據(jù)化CHS1基因的序列設(shè)計反向引物：
[0101] 油3-':4〔46〔661641'(：1'口'644〔44;如沈9 10備.18所示。
[0102] 對目的基因進行檢測。結(jié)果顯示，利用上述引物擴增出693bp的特異DNA片段（如 SEQ ID NO.5所示）。而W非轉(zhuǎn)化煙草基因組DNA為模板時，沒有擴增出任何條帶(見圖1)。
[0103] (3)轉(zhuǎn)化C服1煙草RNA水平的鑒定
[0104] 提取TO代轉(zhuǎn)化C服1煙草DNA檢測為陽性苗的總RNA，cDNA反轉(zhuǎn)錄。
[0105] 根據(jù)所述煙草化CHS1基因的編碼序列（如SEQ ID NO. 2所示），選取與其它同源基 因特異的序列區(qū)段進行特異擴增引物的設(shè)計。本實施例中的上下游特異引物為：
[0106] CHS-qF:GAGTCCTTGTTGTTTGTTCAG；
[0107] (：服-91?:46144616644161446〔〇：;如沈9 10備.19、20所示。
[0108] 擴增出序列長度為25化P的產(chǎn)物(如SEQ ID NO.6所示）。
[0109] 利用巧光染料法進行相對巧光定量PCR反應(yīng)，W煙草管家基因（NTU60495)為內(nèi)參， 上下游引物為：
[0110] actin-qF:CAAGGAAATCACCGCTTTGG；
[0111] 曰。1111-91?:44666416〔646641664，如沈9 10備.21、22所示。
[0112] 采用SYBR's'Premix Ex Taq?(Perfect Real TimeKl'akaRa公司）的試劑盒W及操 作說明書進行，每個樣品設(shè)S次重復(fù)。通過ABI 7500化3* Real-Time PCR System的 SDSShell.exe分析系統(tǒng)分析化CHS1基因的相對表達量(見圖2、圖3)。由圖2可知，非轉(zhuǎn)化煙 草的化C服1基因的表達水平低，而TO代轉(zhuǎn)化CHS1煙草中，〇1-0、(：-2-0、(：-3-0、(：-5-0均過量 表達，尤其是C-3-0;由圖3可知，與非轉(zhuǎn)化煙草的化CHS1基因的表達水平相比，TO代化CHS1 沉默煙草中，C-1-R、C-2-R、C-5-R、C-6-R表達量均降低。
[0113] 本實施例將所述的植物表達載體轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌，獲得用于轉(zhuǎn)化煙草的含化CHS1 基因植物表達載體或抑制沉默掉化C服1基因的干擾載體的根瘤農(nóng)桿菌菌株。利用所構(gòu)建的 根瘤農(nóng)桿菌菌株轉(zhuǎn)化煙草，獲得經(jīng)PCR檢測的轉(zhuǎn)基因煙草植株。
[0114] 實施例8NtC服1基因在調(diào)節(jié)花色、株高方面的應(yīng)用。
[0115] 將實施例7中得到的T1代化CHS1基因過表達株系和T1代化CHS1基因干擾株系播種 在溫室大棚中，W未轉(zhuǎn)化目的基因的野生型煙草作為對照。待花完全開放時，觀察統(tǒng)計花的 顏色。調(diào)查結(jié)果顯示，與野生型對照的花色相比（如圖4、圖5)，過表達株系C-1-0、C-2-0、C- 3-0的花色均變?yōu)樯罴t，而C-5-0花色變淺，幾乎變?yōu)榘咨?，其間有零星紅色，運可能是 化CHS1基因過表達引起的反抑制現(xiàn)象引起的。干擾株系0-1-1?、(：-2-1?、(：-5-1?、(：-6-如勺花色 變?yōu)闇\粉或是白色。與野生型對照的株高相比（如圖6)，干擾株系的株高顯著降低。
[0116] 實施例9NtC服1基因在調(diào)節(jié)煙草中綠原酸、蕓香巧等類黃酬化合物含量的應(yīng)用。
[0117] 對獲得的轉(zhuǎn)基因煙草中綠原酸和蕓香巧含量進行高效液相色譜（High Performance Liquid化romatogra地y，HPLC)測定，篩選獲得綠原酸和蕓香巧顯著提高或 降低的轉(zhuǎn)基因煙草植株。
[0118] 所述通過高效液相色譜化PLC)測定煙草中綠原酸和蕓香巧含量的方法，為常規(guī)方 法：首先參照【煙草綠原酸、蕓香巧、煙堿和茄尼醇的提取技術(shù)研究[J].中國煙草科學(xué)， 2015-02,36(1) :1-4.李曉芹，杜詠梅，張懷寶等】中的提取技術(shù)將煙草中的綠原酸和蕓香巧 提取出來，回收率達到90% ;然后利用高效液相色譜化學(xué)發(fā)光抑制檢測法測定煙草中綠原 酸和蕓香巧的含量【高效液相色譜化學(xué)發(fā)光抑制檢測法測定煙草中的綠原酸和蕓香巧[J]. 分析化學(xué)，1999，27(9): 1110-1110.賀彩霞，崔華，孫玉剛等】。
[0119] 結(jié)果如圖7~圖10所示。由圖7、圖9可知，過表達轉(zhuǎn)基因煙草植株中，綠原酸和蕓香 巧的含量均得到了不同程度的提高，其中，綠原酸的含量最高可達7.42mg/g，是非轉(zhuǎn)基因煙 草(4.73mg/g)的1.55倍;蕓香巧的含量最高可達5.42mg/g，是非轉(zhuǎn)基因煙草(3.48mg/g)的 1.56倍。由圖8、圖10可知，干擾轉(zhuǎn)基因煙草植株中，綠原酸和蕓香巧的含量均得到了不同程 度的降低，其中，綠原酸的含量最低為1.19mg/g，是非轉(zhuǎn)基因煙草(5.64mg/g)的21%;蕓香 巧的含量最低為1.76mg/g，是非轉(zhuǎn)基因煙草(4.76mg/g)的37%。
[0120] 上述雖然結(jié)合實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】進行了描述，但并非對本發(fā)明保護 范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技術(shù)人員 不需要付出創(chuàng)造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護范圍W內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 煙草查爾酮合成酶NtCHSl基因，其特征在于:其啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO.l 所示，其編碼區(qū)的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2. 權(quán)利要求1所述的煙草查爾酮合成酶NtCHSl基因在調(diào)控①煙草花色或/和②煙草株 高或/和③綠原酸和蕓香苷的含量中的應(yīng)用。3. -種含有NtCHSl基因的重組表達載體，其特征在于：其上裝載有核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的NtCHSl基因/NtCHSl基因的外顯子，所用載體為用于根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植株的 雙元載體。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的含有NtCHSl基因的重組表達載體，其特征在于:所述雙元載體 選自pBI系列載體、pCHF系列載體、Gateway?系列載體或其他衍生植物表達載體。5. 權(quán)利要求3或4所述的含有NtCHSl基因的重組表達載體的構(gòu)建方法，其特征在于:從 煙草中提取總RNA，進行cDNA反轉(zhuǎn)錄，然后利用特異性引物進行PCR擴增，得擴增產(chǎn)物;將擴 增產(chǎn)物與載體連接，即得到含有NtCHSl基因的重組表達載體； 所述特異性引物為： NtCHSl-F:ATCTAGAAACCCTAGTAATCGTCCATC； NtCHSl-R:TGAGCTCCCACTAAGTAGCAACACTGTG;如SEQ ID Ν0·7、8所示。6. 權(quán)利要求3或4所述的含有NtCHSl基因的重組表達載體在①調(diào)節(jié)煙草花色中的應(yīng)用 或/和②在調(diào)節(jié)煙草植株中綠原酸、蕓香苷的含量中的應(yīng)用或/和③在制備綠原酸和蕓香苷 中的應(yīng)用。7. -種NtCHSl基因沉默載體，其特征在于:其上裝載有序列如SEQ ID NO.4所示的干擾 片段，所用載體為用于根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植株的干擾載體。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的NtCHSl基因沉默載體，其特征在于:所述干擾載體選自pTCK系 列載體，Gateway TW系列載體或其他衍生植物表達載體。9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的NtCHSl基因沉默載體，其特征在于:所述干擾片段是通過 以下方法制備得到的：從煙草中提取總RNA，進行cDNA反轉(zhuǎn)錄，經(jīng)兩步PCR擴增，即獲得干擾 片段;所述兩步PCR時所用的特異性引物為Fi-chs/Ri-chs和attBl/attB2，其核苷酸序列如 下所示： Fi-chs：AAAAAGCAGGCTTCGTATCACTAATAGCGAGCAT； Ri-chs：AGAAAGCTGGGTCGGGCATGTCTACACCAC； attBl：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT； attB2:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT;如SEQ ID Ν0·9、10、11、12所示。10. 權(quán)利要求7或8或9所述的NtCHSl基因沉默載體在①調(diào)節(jié)煙草花色中的應(yīng)用或/和② 在調(diào)節(jié)煙草株高中的應(yīng)用或/和③在調(diào)節(jié)煙草植株中綠原酸、蕓香苷的含量中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N9/10GK106047905SQ201610236929
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年4月15日
【發(fā)明人】楊愛國, 陳帥, 馮全福, 李依婷, 潘旭浩, 張銀超, 王元英
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所