一種利用重組表達iRFP的結核分枝桿菌測定抗結核藥物最低抑菌濃度的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種藥物療效的檢測方法，特別涉及一種利用重組表達iRFP的結核分枝桿菌測定抗結核藥物最低抑菌濃度的方法。本發(fā)明提供一種抗結核藥物的MIC測定方法，其特征是，根據(jù)生長曲線及時間?熒光強度曲線以及不同濃度抗結核藥物作用下本發(fā)明所述結核分枝桿菌菌株不同時間點熒光強度檢測，確定加入藥物后4天可以判斷MIC結果，根據(jù)不同濃度的待測藥物導致熒光的變化計算試驗藥物的MIC值。
【專利說明】
-種利用重組表達i RFP的結核分枝桿菌測定抗結核藥物最低 抑菌濃度的方法
技術領域：
[0001] 本發(fā)明設及一種藥物療效的檢測方法，特別設及一種利用重組表達iRFP的結核分 枝桿菌測定抗結核藥物最低抑菌濃度的方法。
【背景技術】：
[0002] 結核病是嚴重的全球性健康問題。嚴峻的結核病形勢要求加速新型抗結核藥物的 研究開發(fā)?？焖?、低廉、高通量的篩選方法能縮短篩選周期，加快新藥開發(fā)的進程。
[0003] 最低抑菌濃度(minimum inhibitoiT concentration,MIC)是指抑制細菌生長所 需藥物的最低濃度。MIC測定是新藥篩選的第一步和關鍵一步，傳統(tǒng)的結核分枝桿菌MIC測 定方法有固體瓊脂培養(yǎng)基法、液體培養(yǎng)基法等，由于受結核分枝桿菌生長緩慢的制約，至少 需要4周的時間得到結果?？焖俚腂ACTEC 460系統(tǒng)的高成本、藥物樣品需要量多W及放射性 等問題限制了其在藥物篩選評價中的應用。快速顯色法是基于氧化還原指示劑能被活細胞 線粒體中脫氨酶還原而產(chǎn)生可見的顏色變化的原理。甲基嚷挫基四挫(me thy 1 thiazolyl tetrazolium，MTT)比色分析法首先被Mosmann于1983年用于哺乳動物細胞生長存活的測 定，MTT被活細胞還原成甲瑣顆粒，甲瑣顆粒的形成量與活細胞數(shù)量及細胞活性狀態(tài)呈正比 關系，提示MTT可用來反映細菌的生長和存活狀況，可用于抗菌藥物敏感性測定。與MTT相 比，Alamar blue的水溶性好，對細胞無損傷，在培養(yǎng)基中性質(zhì)穩(wěn)定，不易自發(fā)地產(chǎn)生氧化還 原反應。現(xiàn)已應用于革蘭氏陰性桿菌、陽性球菌、絲狀真菌等的敏感性試驗。Alamar blue法 是目前抗結核藥物MIC測定中最常用的方法。無論是MTT法，還是Alamar blue法，在測定抗 結核藥物的MI別寸，都需要7-8天的時間，并需要額外加入試劑如M1T或Alamar blue。
[0004] 巧光/生物發(fā)光標記物標記結核分枝桿菌進行MIC測定是一種新的技術。紅外巧光 蛋白是指最大激發(fā)與吸收波長在684/708nm之間的巧光蛋白，其可在哺乳動物體內(nèi)穩(wěn)定表 達且不受膽綠素、血液的自發(fā)巧光的影響，廣泛的應用于活體動物的成像的研究。IFP1.4是 最早應用于體內(nèi)成像的近紅外巧光蛋白。而iRFP是IFP1.4基礎上通過對細菌光敏色素結構 改造獲得的新型光敏色素型巧光蛋白，是最新發(fā)展的穩(wěn)定的近紅外巧光蛋白。iRFP作為標 記物已應用于腫瘤細胞，干細胞等體外高通量的篩選實驗。迄今為止，尚未見有國內(nèi)外將 iRFP標記結核分枝桿菌并應用于抗結核藥物MIC檢測的相關報道。
[0005] 本發(fā)明提供一種新穎、快速、簡便的抗結核藥物MIC測定方法，縮短現(xiàn)有MIC測定方 法的檢測時間，簡化測定方法，并節(jié)約檢測成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供一種重組質(zhì)粒pMV361-iRFP。
[0007] 本發(fā)明還提供重組質(zhì)粒pMV361-iRFP的構建方法，其特征是，包括W下步驟質(zhì) 粒piRFP為模板，聚合酶鏈式反應擴增iRFP基因，將擴增得到的目的片段與PMV361載體進行 雙酶切后連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒DNA、酶切測序驗證等步驟，得到重組質(zhì)粒pMV361-iRFP。
[000引本發(fā)明提供用所述的重組質(zhì)粒pMV361-iRFP構建的表達iRFP的結核分枝桿菌菌 株。
[0009] 本發(fā)明還提供所述重組表達iRFP的結核分枝桿菌菌株構建方法，其特征是，包括 W下步驟：
[0010] 將構建的重組質(zhì)粒pMV361-iRFP電轉(zhuǎn)化至結核分枝桿菌出7Rv標準株中，培養(yǎng)結核 分枝桿菌得穩(wěn)定表達iRFP的結核分枝桿菌菌株。
[0011] 優(yōu)選的本發(fā)明所述的構建方法，其特征是，包括W下步驟：
[0012] 將構建的重組質(zhì)粒pMV361-iRFP電轉(zhuǎn)化至結核分枝桿菌曲7Rv標準株中，37°C7H11 固體培養(yǎng)基培養(yǎng)21天后，從卡那霉素濃度為25μg/ml的7H11固體培養(yǎng)基中挑取單克隆菌落， 磨菌器研磨后，移至卡那霉素濃度為50μg/ml的7朋液體培養(yǎng)基中20化.P. m/min震蕩培養(yǎng)， 隔日5000g離屯、收集細菌更換培養(yǎng)基，同時取樣檢測OD570與巧光強度的變化。直至巧光強度 隨著OD570的增長而增長且呈線性關系，獲得穩(wěn)定表達iRFP的結核分枝桿菌菌株。
[0013] 本發(fā)明還提供所述結核分枝桿菌菌株在檢測抗結核藥物的療效中的應用。
[0014] 本發(fā)明還提供一種抗結核藥物的療效測定方法，其特征是，使用本發(fā)明所述結核 分枝桿菌菌株和抗結核藥物進行接觸，對不同時間點菌株發(fā)出的巧光強度進行檢測，根據(jù) 巧光強度計算抗結核藥物的療效。
[0015] 本發(fā)明提供一種抗結核藥物的MIC測定方法，其特征是，根據(jù)生長曲線及時間-巧 光強度曲線W及不同濃度抗結核藥物作用下本發(fā)明所述結核分枝桿菌菌株不同時間點巧 光強度檢測，確定加入藥物后4天可W判斷MIC結果，根據(jù)不同濃度的待測藥物導致巧光的 變化計算試驗藥物的MIC值。
[0016] W下是本發(fā)明名詞術語的解釋
[0017] pMV361(大腸桿菌分枝桿菌穿梭表達載體）
[001 引 iRFP(the in打ared fluorescent protein iRFP是IFP1.4基礎上通過對細菌光 敏色素結構改造獲得的新型光敏色素型巧光蛋白）
[0019] 結核分枝桿菌曲7Rv標準株(Mycobacteri皿化ber州losis結核分枝桿菌國際標準 株，廣泛應用于抗結核藥物敏感性測試中）
[0020] 在高濃度卡那霉素篩選壓力下，篩選獲得穩(wěn)定表達iRFP的結核分枝桿菌菌株。（從 卡那霉素濃度為25μg/ml的7H11固體培養(yǎng)基中挑取單克隆菌落，磨菌器研磨后，移至卡那霉 素濃度為50iig/ml的7朋液體培養(yǎng)基中2(K)r.p.m/min震蕩培養(yǎng)，隔日5000g離屯、收集細菌更 換培養(yǎng)基，同時取樣檢測0D日7日與巧光強度的變化。巧光強度隨著0D日7日的增長而增長且呈線 性關系，則認定為穩(wěn)定表達iRFP的結核分枝桿菌菌株。應用高濃度的卡那霉素目的是篩選 出含iRFP重組表達質(zhì)粒的菌株。）
[0021 ]抗結核藥物的MIC(MIC=Minimal inhibitoiT concentration,最低抑菌濃度。即 抑制結核分枝桿菌生長所需的最低藥物濃度）
[0022] 抗結核藥物異煙阱（soniazid，INH)、利福平（Rifampicin，RFP)、乙胺下醇 (Ethambutol，EMB)、莫西沙星（Moxif loxcin，Mfx)、貝達哇嘟（TMC207)、鏈霉素 (5化日91:〇1117(3；[]1，51)、阿米卡星(411114日(3；[]1，4111)、左氧氣沙星化日￥〇;1^1〇皿(3；[]1，口^)、利奈挫胺 (Linezolid，LZD)
[0023] 本發(fā)明的主要技術方案包括W下方面：
[0024] 1似PMV361為載體的iRFP重組表達質(zhì)粒的構建
[0025] W質(zhì)粒piRFP為模板，聚合酶鏈式反應擴增iRFP基因，將擴增得到的目的片段與 PMV361載體進行雙酶切后連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒DNA等步驟，得到重組質(zhì)粒pMV361-iRFP 后，酶切鑒定并進行測序；
[00%] 2) iRFP重組表達結核分枝桿菌菌株的構建
[0027] 將構建的重組質(zhì)粒pMV361-iRFP電轉(zhuǎn)化至結核分枝桿菌出7Rv標準株中，液體培養(yǎng) 結核分枝桿菌，誘導iRFP近紅外巧光蛋白表達，應用小動物活體成像IVIS Spec化um系統(tǒng)檢 測重組結核分枝桿菌菌株iRFP的表達量；
[0028] 3)穩(wěn)定表達iRFP的結核分枝桿菌菌株的篩選
[0029] 從卡那霉素濃度為25μg/ml的7H11固體培養(yǎng)基中挑取單克隆菌落，磨菌器研磨后， 移至卡那霉素濃度為50iig/ml的7朋液體培養(yǎng)基中2(K)r.p.m/min震蕩培養(yǎng)，隔日5000g離屯、 收集細菌更換7H9培養(yǎng)基，同時取樣檢測0D57G與巧光強度的變化。巧光強度隨著0D57G的增長 而增長且呈線性關系，則認定為穩(wěn)定表達iRFP的結核分枝桿菌菌株。
[0030] 4)建立MIC測定方法
[0031] 不同濃度抗結核藥物1畑、3。？^1〔207、1^、618作用下11?。?重組表達結核分枝桿 菌菌株不同時間點巧光強度(Radiant Efficiency)改變檢測。確定加入藥物后4天可W判 斷MIC結果，根據(jù)不同濃度的待測藥物導致巧光的變化計算試驗藥物的MIC值，MIC定義為結 核分枝桿菌生長被抑制90%的藥物濃度，即巧光強度(Radiant Efficiency)下降10倍(其 對應菌量下降一個log值)對應的藥物濃度；
[0032] 5)應用重組表達iRFP結核分枝桿菌菌株測定藥物MIC
[0033] 應用重組表達iRFP結核分枝桿菌菌株在96孔板中測定INH、RFP、EMB、Mfx、TMC207、 SM、Am、LFX、LZD九種藥物的MIC;與應用MABA法測定MIC結果對比，符合率100%。
[0034] 本發(fā)明利用iRFP(最新發(fā)展的穩(wěn)定的近紅外巧光蛋白）重組結核分枝桿菌，應用的 PMV361載體是一種常用的高效的表達載體。應用小動物活體成像IVIS Spec化um系統(tǒng)檢測 重組結核分枝桿菌菌株iRFP的巧光表達。本發(fā)明在96孔板中檢測試驗藥物的MIC值酶標儀 檢測轉(zhuǎn)化菌的巧光。用于本發(fā)明的待測樣品用量少，適用于新化合物的早期大量篩選工作。 待測樣品用本發(fā)明測得的MIC值與傳統(tǒng)的Alamar blue法獲得的MIC值一致，或在可接受的 范圍內(nèi)。本發(fā)明的方法通過預試驗證實在接種菌量為l*l〇6CFU/ml時，僅需培養(yǎng)4天，即可通 過巧光強度計算出待測藥物的MIC值。
[0035] 本發(fā)明方法的優(yōu)點為：
[0036] ①新穎：國內(nèi)外尚未見相關報道；
[0037] ②快速:將現(xiàn)有的MIC測定方法7-8天的檢測時間縮短為4天，有利于新藥篩選和臨 床檢測；
[0038] ③操作簡單:與Alamar blue、MTT法相比，不需額外加入試劑，不僅節(jié)約了成本，還 簡化了操作步驟；
[0039] ④測定結果可量化:結果更客觀，更具有重復性。
【附圖說明】：
[0040] 圖1 iRFP基因擴增電泳圖
[0041 ]注：M: DNAmarker; Lane 1 -3: PCR 產(chǎn)物
[0042] 圖2 pMV361+iRFP重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI酶切鑒定電泳圖
[0043] 注:M: DNAmarker; Lane 1 -3:酶切結果
[0044] 圖3 pMV361+iRFP重組質(zhì)粒的構建過程
[0045] 圖4 MTBpMV361+iRFP中的iRFP巧光蛋白表達鑒定
[0046] 圖5巧光強度與菌量的線性關系
[0047] 注:0D570 = 0.1 相當于 1 X 108CFU/ml 菌量
【具體實施方式】
[0048] 下面結合附圖和實施例對本發(fā)明進行詳細描述，但所述內(nèi)容是對本發(fā)明的解釋而 不是限定。
[0049] 實施例1
[(K)加 ]iRFP重組表達質(zhì)粒pMV361-iRFP的構建
[0化1] iRFP基因在GenBank中對應的編號為JN247409.1，通過NCBI的BLAST程序獲取iRFP 基因啟動子區(qū)的部分序列，并分析PMV361質(zhì)粒圖譜及序列，將iRFP基因插入PMV361的編碼 框(CDS4274-4337)中。根據(jù)載體PMV361序列及iRFP基因序列選擇EcoRI和化ndin作為酶切 位點，設計擴增正向引物5'端加入EcoRI酶切位點及PMV361的EcoRI酶切位點附近部分序 列，反向引物5'加入化ndin酶切位點及PMV361的化ndin酶切位點附近的部分序列(表1)。 [0化2] 表1擴增iRFP基因引物序列 [0化3]
[0054] 注:斜體下劃線部分為酶切位點
[005引利用設計的引物，W質(zhì)粒piRFP為模版，擴增iRFP基因。并用瓊脂糖凝膠電泳鑒定 擴增產(chǎn)物大小（圖1)?；厥沾笮≌_的目的產(chǎn)物。應用融合重組試劑盒將iRFP基因與EcoRI 及化ndin酶切后的線性表達載體PMV361連接。本發(fā)明應用的piRFP質(zhì)粒(購于Addgene編號 31857)，本發(fā)明所用載體PMV361，但不限于該質(zhì)粒載體。本發(fā)明將iRFP與PMV361的連接產(chǎn)物 轉(zhuǎn)化入化ansl-Tl感受態(tài)細胞，分別通過菌落PCR與陽性克隆質(zhì)粒EcoRI酶切方法進行鑒定 (圖2)。經(jīng)測序分析證明，所插入的片段準確性為100%，最終獲得重組質(zhì)粒pMV361-iRFP(圖 3)。
[0056] 實施例2
[0057]重組表達iRFP結核分枝桿菌菌株的構建及鑒定 [005引1.結核分枝桿菌H37RV標準株感受態(tài)細菌的制備
[0059]結核分枝桿菌H37RV培養(yǎng)至對數(shù)生長期，在收獲細胞的24小時前加入0.1體積的2M 甘油(終濃度為1.5W/V)。冰上放置30分鐘使結核分枝桿菌停止生長。100ml菌液分裝至預冷 的離屯、管中，4°C5000g離屯、10分鐘，棄去上清液。30mll0%預冷甘油重懸細胞。4°C5000g離 屯、10分鐘，棄去上清液。重復上一步。3ml預冷10%甘油重懸細胞。200iil/管分裝于滅菌 1.5ml EP管中保存。凍于-80°C冰箱中備用。
[0060] 2.重組表達iRFP的結核分枝桿菌菌株構建
[0061 ] 將基因倒入儀參數(shù)調(diào)整至2.5KV，25uF，1000 Q。感受態(tài)細胞置于冰上放置。加入化 1重組質(zhì)粒pMV361-iRFP(濃度為l-5ngAil)，將混合液轉(zhuǎn)到預冷的導入杯中，抹去被杯外冷 水，放入樣品槽內(nèi)，釋放電脈沖。取出導入杯立即加入1ml的7朋培養(yǎng)基。將混合液轉(zhuǎn)至滅菌 的EP管中。在37°C培養(yǎng)過夜。次日取10化1均勻涂于含卡那霉素(2扣g/山）的7H11培養(yǎng)基中。 37°C靜置培養(yǎng)21天，挑取陽性單克隆將其命名為MTBpm?wwp。
[0062] S.MTBpMvwwwp近紅外巧光蛋白表達鑒定
[0063] 應用IVIS Spectr皿系統(tǒng)進行重組菌株的iRFP的表達鑒定（圖4)。
[0064] 實施例3
[0065] 穩(wěn)定表達iRFP的結核分枝桿菌菌株的篩選及巧光強度與菌量的線性分析
[0066] 1.穩(wěn)定表達iRFP的結核分枝桿菌菌株的篩選
[0067] 確定iRFP表達后，從卡那霉素濃度為25iig/ml的7H11固體培養(yǎng)基中挑取多個 MTBpmvwwwp單克隆菌落，磨菌器研磨后，移至含20 %吐溫-80、10 % 0ADC、50iig/ml卡那霉素 7朋培養(yǎng)基中，37°C、200r.p.m/min震蕩培養(yǎng)，隔2日5000g離屯、收集細菌更換7朋培養(yǎng)基，同 時取樣檢測0D日7日與巧光強度的變化。巧光強度隨著0D日7日的增長而增長且呈線性關系，則篩 選為穩(wěn)定表達iRFP的結核分枝桿菌菌株。
[0068] 2.巧光強度與菌量的線性分析
[0069] 將培養(yǎng)至對數(shù)期的培養(yǎng)液，檢測OD570，應用7H9培養(yǎng)基，制備0D570 = 0.1的混合液。 繼續(xù)十倍稀釋，從不同濃度的混合液中分別取20化1移入96孔板中，檢測巧光強度。巧光強 度用Radiant Efficien巧表示。應用Gra地Pad Prism 5軟件進行線性分析，R2=1.000,理 論上說明，巧光強度可間接代表OD570值與菌量(圖5)。
[0070] 實施例4
[0071] 利用重組iRFP結核分枝桿菌MTBpmvwwwp測定MIC方法建立和應用
[00巧 1.利用重組iRFP結核分枝桿菌MTBpMvwwkfp測定MIC方法建立
[0073] 96孔板每孔加入9祉1 7H9培養(yǎng)基、2山不同濃度倍比稀釋的藥物(異煙阱、利福平、 莫西沙星、乙胺下醇、貝達哇嘟）、10化1 (lxl06CFU/ml )MTBpmv36wwp菌懸液。其中在96孔板中 設置20化1 7H9培養(yǎng)基，200山菌液的對照。在加入待檢測藥物的第0、2、4、6、8天檢測巧光強 度。根據(jù)巧光強度變化確定應用重組表達iRFP MTBpmvwwwp菌株測定MIC的標準。選用五種 作用機制不同的藥物初步判斷iRFP的表達是否受藥物的影響。五種藥物作用于MTBpMvssi -M+iWP檢測巧光強度改變，初步進行MIC測定。在加入藥物的第4天，當巧光強度降低大約一 個10倍時對應菌量對應降低一個log值，將此時對應的藥物濃度定義為MIC。
[0074] 2.應用本發(fā)明測定九種主要抗結核藥物的MIC
[0075] 將穩(wěn)定表達MTBpMvsswkfp菌株接種至含20%吐溫-8〇、1〇%〇40(：、50蛇/1111卡那霉素 7朋培養(yǎng)基中，14天左右，生長至對數(shù)期，使用多功能酶標儀檢測0D57Q值，用7朋培養(yǎng)基制成 終濃度為10化FU/ml的菌懸液。96孔板每孔終體積為20化1，由9如1 7朋培養(yǎng)基、藥物、 lOOiil菌懸液組成。96孔板上為每種藥物標定7個孔，依次倍比稀釋。每板設置2個不含抗生 素的生長對照孔、2個只含7朋培養(yǎng)基的培養(yǎng)基對照孔，96孔置于37°C培養(yǎng)箱解育。在第4、6、 8天檢測巧光強度變化。據(jù)巧光強度的變化定義藥物的MIC。實驗結果重復4次，計算平均數(shù) 與中位數(shù)(表2)。
[0076] 表2應用重組iRFP結核分枝桿菌菌株MTBpMvwwwpmIC結果
[0077]
[007引實施例5
[0079] 應用MTBpMvwwwp測定抗結核藥物MIC結果與應用結核分枝桿菌標準株H37RV MABA 測定的MIC結果（表3)范圍一致。MIC結果相差1-2倍濃度為可接受的誤差范圍，符合率為 88.9%。實驗結果重復4次，計算平均數(shù)與中位數(shù)，說明應用MTBpmvwwwp菌株的MIC測定結果 具有較好的穩(wěn)定性與重復性。運也表明，本發(fā)明所建立的方法，有望在藥物高通量篩選MIC 測定及臨床檢測中得到應用。
[0080] 表3MABA法測定MIC結果
【主權項】
1. 一種重組質(zhì)粒pMV361-iRFP。2. 權利要求1所述重組質(zhì)粒pMV361-iRFP的構建方法，其特征是，包括以下步驟： 以質(zhì)粒piRFP為模板，聚合酶鏈式反應擴增iRFP基因，將擴增得到的目的片段與pMV361 載體進行雙酶切后連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒DNA、酶切測序驗證等步驟，得到重組質(zhì)粒 pMV361-iRFP〇3. 用權利要求1所述的重組質(zhì)粒pMV361-iRFP構建表達iRFP的結核分枝桿菌菌株。4. 權利要求3所述重組表達iRFP的結核分枝桿菌菌株構建方法，其特征是，包括以下步 驟： 將構建的重組質(zhì)粒pMV361-iRFP電轉(zhuǎn)化至結核分枝桿菌H37Rv標準株中，培養(yǎng)結核分枝 桿菌得穩(wěn)定表達iRFP的結核分枝桿菌菌株。5. 根據(jù)權利要求3所述的構建方法，其特征是，包括以下步驟： 將構建的重組質(zhì)粒pMV361-iRFP電轉(zhuǎn)化至結核分枝桿菌H37Rv標準株中，37Γ7Η11固體 培養(yǎng)基培養(yǎng)21天后，從卡那霉素濃度為25μg/ml的7H11固體培養(yǎng)基中挑取單克隆菌落，磨菌 器研磨后，移至卡那霉素濃度為50μg/ml的7H9液體培養(yǎng)基中200r. p. m/min震蕩培養(yǎng)，隔日， 5000g離心收集細菌更換培養(yǎng)基，同時取樣檢測OD57〇與熒光強度的變化。直至熒光強度隨著 〇D 57Q的增長而增長且呈線性關系，獲得穩(wěn)定表達iRFP的結核分枝桿菌菌株。6. 權利要求3所述結核分枝桿菌菌株在檢測抗結核藥物的療效中的應用。7. -種抗結核藥物療效的體外測定方法，其特征是，使用權利要求3所述結核分枝桿菌 菌株和抗結核藥物進行接觸，對不同時間點菌株發(fā)出的熒光強度進行檢測，根據(jù)熒光強度 計算抗結核藥物的療效。8. -種抗結核藥物的MIC測定方法，其特征是，根據(jù)生長曲線及時間-熒光強度曲線以 及不同濃度抗結核藥物作用下權利要求3所述結核分枝桿菌菌株不同時間點熒光強度檢 測，確定加入藥物后4天可以判斷MIC結果，根據(jù)不同濃度的待測藥物導致熒光的變化計算 試驗藥物的MIC值。
【文檔編號】C12N15/66GK106047915SQ201610446810
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月20日
【發(fā)明人】陸宇, 何畔, 徐建, 陳效友, 王彬, 付雷, 朱慧, 郭少晨
【申請人】北京市結核病胸部腫瘤研究所