一種過表達tmem88基因質(zhì)粒、構(gòu)建方法及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開一種過表達TMEM88基因質(zhì)粒，包括TMEM88基因CDS序列與pEGFP?C2真核表達載體的重組構(gòu)建而成；其核苷酸如序列表SEQ ID NO:3，位于TMEM88基因的第10?489位；氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示。本發(fā)明還公開一種過表達TMEM88基因的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。本發(fā)明具有能夠顯著抑制人肝癌細(xì)胞的增殖，并顯著促進人肝癌細(xì)胞的凋亡的優(yōu)點。
【專利說明】
-種過表達TMEM88基因質(zhì)粒、構(gòu)建方法及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種過表達TMEM88基因質(zhì)粒、構(gòu)建方法 及其應(yīng)用。 技術(shù)背景
[0002] 肝癌是一種常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，主要包括原發(fā)性和繼發(fā)性兩大類，其中最 常見的是原發(fā)性肝癌(PHC)，其發(fā)病于肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞或肝實質(zhì)細(xì)胞，具有惡性程度高、 發(fā)病率和死亡率高等特點，流行病調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，PHC位居腫瘤發(fā)病率的第5位，死亡率更是 高達第3位，僅次于胃癌和肺癌，給人類的健康和發(fā)展帶來了巨大的威脅。而且PHC的發(fā)病存 在一定的地域性，好發(fā)于亞洲和非洲，在我國東南沿海地區(qū)，每年被確診為PHC的患者就高 達30余萬人次，在世界新發(fā)病例中約占55 %，且近年來還有逐年遞增的趨勢，因此我國面臨 著非常嚴(yán)峻的PHC形勢，尋找有效的治療PHC的手段和藥物顯得尤為重要。
[0003] 基因工程，又稱為基因重組技術(shù)，是二十世紀(jì)屯十年代發(fā)展起來的在體外對DNA進 行操作的一口技術(shù)，廣泛用于疾病基礎(chǔ)研究、基因治療、基因免疫、基因疫苗等。其=要素分 別為:酶、目的基因、載體。而真核表達載體是基因工程中用于構(gòu)建真核基因表達系統(tǒng)的一 種載體，近幾十年來，各國學(xué)者圍繞真核表達載體進行了各種疾病、基因等相關(guān)研究，在基 因工程方面做了大量工作，為醫(yī)學(xué)科學(xué)研究開辟了嶄新途徑。
[0004] TMEM88是TMEM88蛋白家族亞家族的成員，其基因定位于染色體17pl3.1，Lee等人 證實了在抓贍屬胚胎細(xì)胞中定位在細(xì)胞膜上，是一個兩次跨膜蛋白，TMEM88由159個氨基酸 殘基組成，其分子量大約為17KD，在159氨基酸中第43-63氨基酸殘基組成了第一個跨膜結(jié) 構(gòu)域，而第88-108氨基酸殘基組成了第二個跨膜結(jié)構(gòu)域。IWL的PDZ結(jié)構(gòu)域大約有100個氨基 酸，包含6個beta-strands和2個a-helices組成，而和TMEM88的V-W-V序列結(jié)合的IWL的PDZ 結(jié)構(gòu)域的序列定位在be1:a-s1:rands和a-helices之間，TMEM88可W通過其C端的V-W-V序列 與DVL1的PDZ結(jié)構(gòu)域結(jié)合，通過切斷D化與化rizle和LRP5/6的結(jié)合而抑制經(jīng)典的Wnt/b- catenin通路，從而發(fā)揮其生物學(xué)作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種過表達TMEM88基因質(zhì)粒、構(gòu)建方法及其應(yīng)用。并證明所 述重組質(zhì)粒為TMEM88功能研究提供了良好的實驗工具，也為研究人肝癌中TMEM88基因的功 能提供有效實驗方法。
[0006] 人源TMEM88基因已在GenBank注冊，注冊號NM_203411.1，定位于17pl3.1，全長 887bp，其中CDS序列48化P，編碼159個氨基酸。人源TMEM88基因的組織表達譜分析顯示：該 基因在人的許多腫瘤中均有表達。
[0007]本發(fā)明通過下列技術(shù)方案解決上述技術(shù)問題的：一種過表達TMEM88基因質(zhì)粒，包 括TMEM88基因 CDS序列與PEGFP-C2真核表達載體的重組構(gòu)建而成；其核巧酸如序列表SEQ ID N0:3,位于TMEM88基因的第10-489位;氨基酸序列如序列表SEQ ID N0:4所示。
[000引一種構(gòu)建上述過表達TMEM88基因的方法，包括如下步驟：
[0009] (n收集、裂解細(xì)胞，提取RNA進行逆轉(zhuǎn)錄得到TMEM88CDNA;
[0010] (2)采用PCR技術(shù)，擴增出人工TMEM88基因的CDS序列片段；
[0011] (3) TMEM88基因的CDS序列片段的純化；
[001^ (4)對所獲得的基因片段和祀GFP-C2真核表達載體進行Kpn巧蛇coRI雙酶切，并進 行連接；
[0013] (5)將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TG1中，并挑去陽性克隆進行培養(yǎng)，然后抽提質(zhì)粒。
[0014] 優(yōu)選地，提取RNA后，進行變性;具體的工藝步驟:將RNA在65°C中放置5-lOmin后， 轉(zhuǎn)移至冰水中放置。
[00巧]優(yōu)選地，逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系包括：5XRT Master Mix、RNA、Nuclease-free Water; 具體的工藝步驟包括：
[0016] (1)配制反應(yīng)體系：5XRT Master Mix 化L+RNA 化L+Nuclease-free Water 化1^;
[0017] (2)將上述反應(yīng)體系放置37°C，并作用15min;
[0018] (3)將上述反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至50°C，并作用5min;
[0019] (4)將上述反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至98°C，并作用5min;
[0020] (5)將上述反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至4°C，冷卻后凍存，即得到cDNA。
[0021] 優(yōu)選地，根據(jù)TMEM88的CDS序列，設(shè)計上、下游引物;上、下引物序列分別如下：
[0022] TMEM88-F:5 '-CCGGAATTCCGGATGGCGGATGTCCCCG-3 '
[0023] TMEM88-R:5'-GGGGTACCCCTTAGACCCAGACCTTTCCT-3'。
[0024] 優(yōu)選地，PCR的反應(yīng)體系如下：2XPrimeSTAR Max、cDNA樣品、上下游引物、高純水； [00巧]具體的工藝步驟包括：
[0026] (1)配制反應(yīng)體系：2XPrimeSTAR Max 2^iL+cDNA化L+引物各化L+高純水22化；
[0027] (2)將上述反應(yīng)體系混勻后放入PCR儀器，設(shè)置如下程序運行：
[0028；
[0029] (3)將上述PCR產(chǎn)物進行1-1.2%瓊脂糖凝膠電泳；
[0030] (4)回收目的DNA片段。
[0031] 優(yōu)選地，對TMEM88的PCR產(chǎn)物和祀GFP-C2載體進行EcoR巧日Kpnl的雙酶切；酶切體 系如下：限制性內(nèi)切酶巧coRI和KpnI)、10XBufferl'ango、TMEM88的PCR產(chǎn)物、祀GFP-C2載 體;具體的工藝步驟包括：
[0032] a)配制反應(yīng)體系：10XBufferTango2化巧coRI和KpnI各0.扣L+TMEM88的PCR產(chǎn) 物或和祀GFP-C2載體化L
[0033] (2)將上述反應(yīng)體系放置37°C水浴鍋中，并作用4~化；
[0034] (3)進行1 -1.2 %瓊脂糖凝膠電泳；
[0035] (4)觀察結(jié)果并回收目的DNA片段。
[0036] 優(yōu)選地，在連接之前，對載體進行去憐酸化處理；
[0037] 去憐酸化體系（1化L):CIAP化1、10 X CIAP緩沖液化1、載體祉1
[003引連接體系（10化）：CIAP去憐酸化后的載體0 .化1、10 X T4DNA連接酶緩沖液化1、 T4DNA連接酶化1、PCR酶切純化產(chǎn)物7.化1;
[0039] 連接方法:將上述反應(yīng)體系置于0.5ml的離屯、管中混勻，16°C水浴過夜。
[0040] 優(yōu)選地，
[0041 ] (1)取出儲存于-80°C的TG1感受態(tài)細(xì)胞，冰浴解凍后加入lOiil連接產(chǎn)物，混勻，冰 上靜置30min;
[0042] (2)42°C熱休克90s，取出置冰上3min;
[0043] (3)加入50化118培養(yǎng)液，37°(：、250巧111振蕩培養(yǎng)45111111;
[0044] (4)取出lOOiil轉(zhuǎn)化液涂于帶有相應(yīng)抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37°C倒置培養(yǎng)8~ 1化。
[0045] -種使用上述過表達TMEM88基因質(zhì)粒在抑制人肝癌細(xì)胞的增殖、促進人肝癌細(xì)胞 的調(diào)亡的應(yīng)用。
[0046] 將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人肝癌細(xì)胞系中，能夠顯著抑制人肝癌細(xì)胞的增殖，并顯 著促進人肝癌細(xì)胞的調(diào)亡。因此，本發(fā)明有助于研究TMEM88基因功能，并且為研究其在人肝 癌中發(fā)病的作用提供了有用分子生物學(xué)工具。本發(fā)明運用基因重組技術(shù)，針對TMEM88基因， 構(gòu)建重組真核表達載體祀GFP-C2-TMEM88,并將其轉(zhuǎn)染至肝癌細(xì)胞株中，研究TMEM88過表達 對肝癌細(xì)胞增殖和調(diào)亡的影響，為進一步研究TMEM88的功能，W及肝癌的基因治療奠定了 基礎(chǔ)。
【附圖說明】
[0047] 圖1為本發(fā)明真核表達載體祀GFP-C2的結(jié)構(gòu)示意圖。
[004引圖2為本發(fā)明真核重組載體祀GFP-C2-TMEM88的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0049]圖3為本發(fā)明真核重組載體祀GFP-C2-TMEM88的酶切鑒定圖譜。
[(K)加 ]圖4為本發(fā)明真核重組載體祀GFP-C2-TMEM88的測序圖譜。
[0化1] 圖5為本發(fā)明真核重組載體祀GFP-C2-TMEM88在HEK 293T細(xì)胞中的表達情況圖
[0052] 圖6為本發(fā)明未轉(zhuǎn)染組的調(diào)亡細(xì)胞數(shù)值的影響情況圖
[0053] 圖7為本發(fā)明真核重組載體祀GFP-C2-TMEM88對肝癌細(xì)胞系調(diào)亡的影響情況圖
【具體實施方式】
[0054] 下面結(jié)合實施例，對本發(fā)明作進一步說明。下述實施例中，凡未注明具體實驗條件 的，均為按照本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)條件、實驗室手冊中的條件、按照制造廠商所建議 的條件。實施例1
[0化5] 構(gòu)建過表達TMEM88基因質(zhì)粒
[0化6] l、TMEM88cDNA 的提取
[0057] (1)取出細(xì)胞培養(yǎng)皿棄凈培養(yǎng)基，用1ml的PBS緩沖液清洗細(xì)胞面(2-3次）。
[005引（2)加入1ml的化izol裂解細(xì)胞lOmin，用移液器輕輕混勻細(xì)胞后將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn) 移至離屯、管中，顛倒混勻后室溫靜置5min。
[0059] (3)加入化i201的1/5量的S氯甲燒(4°C預(yù)冷），劇烈混勻后室溫靜置5min，高速低 溫離屯、15min(4°C，12000;r/min)。
[0060] (4)將0.4ml上層液體轉(zhuǎn)移至新的離屯、管中，加入等體積的異丙醇，顛倒混勻后靜 置 60min(-20°C)，高速低溫離屯、15min(4°C，12000r/min)后棄上清。
[0061 ] (5)加入lml75%的乙醇溶液后振蕩混勻，高速低溫離屯、5min(4°C，12000r/min)后 棄上清，并干燥5min。
[0062] (6)加入20iiL無酶水溶解沉淀后，用于逆轉(zhuǎn)錄，也可凍存于-80度。
[0063] (7)RNA 的變性
[0064] 將抽提好的RNA進行變性，變性步驟如下:將RNA在65°C中放置5min后，迅速轉(zhuǎn)移至 冰水中放置2min。
[00化]帶掉壽后欣化累（10山,）々n下，
[0066]
[0067] 工藝步驟包括：
[0068] (1)將上述反應(yīng)體系放置37°C，并作用15min;
[0069] (2)將上述反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至50°C，并作用5min;
[0070] (3)將上述反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至98°C，并作用5min;
[0071] (4)將上述反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至4°C，冷卻后凍存，即得到cDNA。
[0072] 2、TMEM88基因的克隆
[0073] 根據(jù)TMEM88的CDS序列，設(shè)計上下游引物，引物序列如下：
[0074] TMEM88-F: 5 ' -CCGGAATTCCGGATGGCGGATGTCCCCG-3 '（含EcoRI酶切位點）
[0075] TMEM88-R: 5 ' -GGGGTACCCCTTAGACCCAGACCTTTCCT-3 '（含Kpnl酶切位點）
[0076] PCR過程中所用的酶優(yōu)選為化kara公司的PrimeSTAR Max高保真酶，其反應(yīng)體系和 反應(yīng)程序如下：
[0077] 反巧體系（50山.）：
[007引
[0079] 將上述反應(yīng)體系混勻后放入PCR儀器，設(shè)置如下程序運行：
[0080] 反應(yīng)溫度 反應(yīng)時間
[0081；
[0082] (3)將上述PCR產(chǎn)物進行1-1.2%瓊脂糖凝膠電泳；
[0083] (4)觀察結(jié)果并回收目的DNA片段。
[0084] 將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，通過與DNA Marker的對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在500bp出 得到一條帶，大小與TMEM88目的片段(包括酶切位點）的大小基本一致，表明成功擴增出人 TMEM88基因的CDS序列。
[0085] 3、TMEM88目的片段的純化
[0086] 純化所用的試劑盒優(yōu)選為愛思進公司的膠回收試劑盒，純化步驟如下：
[0087] (1)在紫外燈下切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用濾紙吸盡凝膠表面液體并切 碎。計算凝膠重量，每lOOmg等于10化1體積。
[008引（2)加入3個凝膠體積的Buffer DE-A，混合均勻后于75°C加熱(低烙點瓊脂糖凝膠 于40°C加熱），間斷混合(每2~3min)，直至凝膠塊完全烙化。
[0089] (3)加0.5個Buffer DE-A體積的Buffer DE-B，混合均勻。當(dāng)分離的DNA片段小于 400bp時，需再加入1個凝膠體積的異丙醇。
[0090] (4)吸取步驟3中的混合液，轉(zhuǎn)移到DNA制備管(置于2ml離屯、管）中，12，00化pm離屯、 Imin。棄濾液。
[0091] (5)將制備管置回2ml離屯、管，加500iil Buffer Wl，12,000巧m離屯、30s，棄濾液。
[0092] (6)將制備管置回2ml離屯、管，加700iil Buffer W2，12,000rpm離屯、30s，棄濾液。W 同樣的方法再用7〇化1 Buffer W2洗涂一次12,000巧m離屯、Imin。
[0093] (7)將制備管置回2ml離屯、管中，12,000巧m離屯、Imin。
[0094] (8)將制備管置于潔凈的1.5ml離屯、管中，在制備膜中央加25~30iil Eluent或去 離子水，室溫靜置Imin。12000巧m離屯、Imin洗脫DM。
[00M] 4、PCR產(chǎn)物和真核表達載體的雙酶切
[0096] 對TMEM88的PCR產(chǎn)物和祀GFP-C2載體進行EcoR I和Kpnl的雙酶切，酶切體系和方 法如下：
[0097] 酶切體系（10化）：
[0098；
[0099] 酶切方法:將W上反應(yīng)體系置于0.5ml的離屯、管中混勻，37°C水浴4~化(溫度和時 間的選擇依據(jù)內(nèi)切酶的說明書而定）。1.2%瓊脂糖凝膠電泳后迅速觀察結(jié)果并回收目的 DNA片段(回收方法同2.2.3.3)，避免紫外長期照射。
[0100] 5、酶切產(chǎn)物的連接
[0101] 對TMEM88和祀GFP-C2的雙酶切產(chǎn)物進行連接，連接所用的酶優(yōu)選為T4連接酶。在 連接之前，為避免載體的自身環(huán)化，故對載體進行去憐酸化處理。
[0102] 去憐酸化體系（1化L):CIAP化1、10XCIAP緩沖液化1、載體祉1
[0103] 連接體系（10化）：CIAP去憐酸化后的載體0 .化1、10 X T4DNA連接酶緩沖液化1、 T4DNA連接酶化1、PCR酶切純化產(chǎn)物7.化1;
[0104] 連接方法:將上述反應(yīng)體系置于0.5ml的離屯、管中混勻，16°C水浴過夜。
[01化]6、連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化
[0106] 轉(zhuǎn)化所用的大腸桿菌感受態(tài)為:TG1，轉(zhuǎn)化步驟如下：
[0107] (1)取出儲存于-80°C的TG1感受態(tài)細(xì)胞，冰浴解凍后加入lOiil連接產(chǎn)物，輕輕混 勻，冰上靜置30min。
[0108] (2)42°C熱休克90s(不要搖晃），迅速取出置冰上3min。
[0109] (3)加入50化118培養(yǎng)液，37°(：、250巧111振蕩培養(yǎng)45111111。
[0110] (4)取出約10化1轉(zhuǎn)化液涂于帶有相應(yīng)抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37°C倒置培養(yǎng)8~ 1化。
[017、質(zhì)粒的小量抽提
[0112] 挑去8個陽性克隆加入含有2mlLB培養(yǎng)基(氨節(jié)抗性）的離屯、管中，37°C、250rpm振 蕩培養(yǎng)8~12h，然后對菌液進行質(zhì)粒抽提，所用的試劑盒為愛思進公司的質(zhì)粒小量抽提試 劑盒，抽提步驟如下：
[0113] (1)用滅菌牙簽挑取細(xì)菌的單克隆，放入盛2~3ml含有相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)液的 15ml離屯、管中，37°C、250巧m振蕩培養(yǎng)8~12h。
[0114] (2)將約1ml菌液轉(zhuǎn)入1.5ml離屯、管中，4°C、12,000巧m離屯、Imin，上清。
[0115] (3)加250iil Buffer S1懸浮細(xì)菌沉淀，懸浮需均勻，不應(yīng)留有小的菌塊。
[0116] (4)加250iil Buffer S2,溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)4~6次使菌體充分裂解，直至形 成透亮的溶液。
[0117] (5)加350iU Buffer S3,溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合6~8次，12,000rpm離屯、 10min〇
[0118] (6)吸取步驟5中的離屯、上清并轉(zhuǎn)移到制備管（置于2ml離屯、管中），120(K)rpm離屯、 Imin，棄濾液。
[0119] (7)將制備管置回離屯、管，加500iU Buffer Wl，12,000巧m離屯、Imin，棄濾液。
[0120] (8)將制備管置回離屯、管，加700iil Buffer W2，12,000巧m離屯、Imin，棄濾液；W同 樣的方法再用70化1 Buffer W2洗涂一次。棄濾液。
[0121] (9)將制備管置回2ml離屯、管中，12,000巧m離屯、Imin。
[0122] (10)將制備管移入新的1.5ml離屯、管中，在制備管膜中央加60~80iil無菌水，室溫 靜置Imin，12,000巧111離屯、1111；[]1，棄制備管。
[0123] (11)樣品置-20°C備用。圖2為真核重組載體祀GFP-C2-TMEM88的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0124] 8、對質(zhì)粒進行酶切鑒定和送測序?qū)Τ樘岷玫馁|(zhì)粒進行EcoR I和Kpnl的雙酶切鑒 定，酶切體系和方法如下：
[0125] 酶切體系（10化）：
[012d
[0127] 酶切方法:將上述反應(yīng)體系置于0.5ml的離屯、管中混勻，37 °C酶切4-化后，瓊脂糖 凝膠電泳、紫外分光儀觀察、凝膠成像儀拍照保存。并將酶切鑒定正確的質(zhì)粒送生工生物公 司測序，見圖3。其中1: PEGFP-C2雙酶切;2: PEGFP-C2-TMEM88雙酶切、3: TMEM88的PCR產(chǎn)物。
[0128] 測序結(jié)果見圖4,測序結(jié)果表明，測序圖譜由紅、黑、綠和藍色測序峰組成，代表不 同的堿基序列，本實驗的測序結(jié)果顯示四色巧光的信號較強，且較為單一，將測序結(jié)果通過 BLAST比對，發(fā)現(xiàn)與GencBank中公布的序列一致，目的基因片段長度實為480bp。
[0129] 實施例2:過表達TMEM88基因質(zhì)粒的表達
[0130] 1、細(xì)胞培養(yǎng)
[0131] 本發(fā)明所需培養(yǎng)的細(xì)胞為:皿K 293T、HepG2，SMMC-7402，SMMC-7721，SGC-7901 細(xì) 胞，首先復(fù)蘇細(xì)胞，并用含有體積比為10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基于37°C、5%C02的細(xì) 胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，并及時換液和傳代。
[0132] (1)細(xì)胞復(fù)蘇:將液氮內(nèi)凍存的細(xì)胞取出，迅速浸入37°C的溫水中并輕輕搖晃至完 全融化(復(fù)溫時間應(yīng)控制在兩分鐘W內(nèi)），迅速轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至離屯、管中并加入5ml培養(yǎng)基， 低速離屯、（100化/min，2min)后棄盡上清，加入5ml培養(yǎng)基輕輕懸浮細(xì)胞后接種至培養(yǎng)皿中 開始培養(yǎng)。
[0133] (2)細(xì)胞換液:輕輕棄去舊的細(xì)胞培養(yǎng)基，PBS溫和清洗后加入新鮮的完全培養(yǎng)基 (含有10%胎牛血清的高糖DMEM)繼續(xù)培養(yǎng)(注:PBS和新鮮的培養(yǎng)基需要37°C預(yù)熱）。
[0134] (3)細(xì)胞傳代:在細(xì)胞中加入1ml的膜酶后置于培養(yǎng)箱中進行消化，在顯微鏡下觀 察細(xì)胞形態(tài)變化，及時加入完全培養(yǎng)基終止消化，轉(zhuǎn)移細(xì)胞懸液至離屯、管中低速離屯、 (100化/min，2min)后棄上清，用PBS洗涂一次后加入0.2ml培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞并重新接種至培 養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。
[0135] (4)細(xì)胞凍存:將傳代過程中的細(xì)胞懸液低速離屯、（100化/min，2min)后棄上清，加 入1ml細(xì)胞凍存液(配方見)輕輕懸浮細(xì)胞后分裝至細(xì)胞凍存管中進行分級凍存，即4°C0.5- 化、-20 °C 1 -化、-80 °C約2地、液氮凍存。
[0136] 2、質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染(脂質(zhì)體法）
[0137] (1)用25化L的化ti-MEM稀釋扣1的脂質(zhì)體和總量約為化g的DNA，溫和混勻，室溫靜 置5min。
[0138] (2)將（1)中的兩種溶液溫和混勻，室溫靜置20min，W形成DM-脂質(zhì)體復(fù)合物。
[0139] (3)棄去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，加入1ml Opti-MEM轉(zhuǎn)染液，將(2)中的DNA-脂質(zhì)體復(fù) 合物緩慢滴加到培養(yǎng)皿中，輕輕搖晃培養(yǎng)皿混勻。
[0140] (4)37°C、5%C02培養(yǎng)化后，用預(yù)溫的PBS清洗一次，換新鮮的完全培養(yǎng)液后繼續(xù)培 養(yǎng)約2地。
[0141] 3、免疫印記
[0142] (1)總蛋白提取:離屯、收集細(xì)胞，用PBS清洗2-3次后，加入0.5ml細(xì)胞裂解液，冰上 裂解lOmin，然后高速冷凍離屯、lOmin，收集0.4ml上清液，加入上樣緩沖液，沸水浴5min，放 置冰上待電泳。
[0143] (2)安裝制膠板并檢漏，首先配制分離膠(配方見，分離膠濃度的選擇根據(jù)所觀察 蛋白量的大?。?ml異丙醇壓線，待充分凝固后(約化），配制濃縮膠，插入所需梳子，待充 分凝固后使用。
[0144] (3)安裝電泳系統(tǒng)，在電泳槽中加入500ml電泳緩沖液，將10化樣品加入上樣孔后 開始電泳(80V電泳0.化+100V電泳1.化）。
[0145] (4)電泳結(jié)束后，切下SDS-PAGE膠，應(yīng)用S明治方式（從下往上依次是濾紙+膠+ PVD刊莫+濾紙)進行濕轉(zhuǎn)
[0146] (5)安裝電轉(zhuǎn)系統(tǒng)，在電轉(zhuǎn)槽中加入500ml預(yù)冷的電轉(zhuǎn)緩沖液(配方見），并將整個 電轉(zhuǎn)槽放入冰水中，開始電轉(zhuǎn)(100V電轉(zhuǎn)化或200mA電轉(zhuǎn)化）
[0147] (6)電轉(zhuǎn)結(jié)束后，輕輕取下PVD刊莫，用麗春紅染色鑒定轉(zhuǎn)膜是否成功，轉(zhuǎn)膜成功后， 用TBST洗去麗春紅，室溫封閉至少化。
[014引（7)封閉完之后，用TBST洗膜(3次，5min)后，加入一抗溶液(一抗:GFP抗體，兔抗， Western-抗稀釋液1:500稀釋)4°C解育過夜。
[0149] (8)次日，用TBST洗膜(3次，lOmin)后，加入二抗溶液(二抗:辣根酶標(biāo)記的山羊抗 兔二抗TBST溶液1:5000稀釋)室溫解育1 -化。然后用TBST洗膜(3次，20min)。
[0150] (9)用E化發(fā)光劑檢巧UPVDF上的條帶，并用X射線膠片暗室顯影。
[0151] 實驗結(jié)果顯示，真核重組表達載體祀GFP-C2-TMEM88在真核細(xì)胞內(nèi)能夠正常表達， 為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)，見圖5。其中1:未轉(zhuǎn)染的293T細(xì)胞裂解液;2:表示轉(zhuǎn)染祀GFP-C2- TMEM88的293T細(xì)胞裂解液。
[0152] 實施例3:過表達TMEM88基因后對人肝癌細(xì)胞化pG2，SMMC-7402，
[0153] SMMC-7721，SGC-7901 增殖情況的影響
[0154] 將對數(shù)生長期的細(xì)胞進行傳代，得到細(xì)胞懸液，并W適當(dāng)密度(約IX 108 ? 1/1)將 細(xì)胞W每孔10化L的量重新接種到96孔板中，培養(yǎng)約2地，待到細(xì)胞密度為80%左右，進行 祀GFP-C2-TMEM88的瞬時轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染一段時間后在每孔中加入20化適當(dāng)濃度巧mg ? mL-i)的 MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄去每孔中的培養(yǎng)基，并加入15化L的DMS0,室溫振蕩溶解lOmin后，在 492nm波長處測吸光度(A值），用各組吸光值的均值表示細(xì)胞的增殖情況。
[01巧]MTT實驗顯示：與未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染了PEGFP-C2-TMEM88的肝癌細(xì)胞系化epG2, SMMC-7402，SMMC-7721，SGC-7901)出現(xiàn)了明顯的增殖現(xiàn)象(P<0.05)，說明過表達TMEM88基 因能夠明顯抑制人肝癌細(xì)胞的增殖，見表1。
[0156]表1過表達TMEM88基因后對人肝癌細(xì)胞增殖情況的影響
[0157]
[015引實施例4:過表達TMEM88基因?qū)θ烁伟┘?xì)胞株SMMC-7721調(diào)亡的影響
[0159] 將對數(shù)生長期的細(xì)胞進行傳代，得到細(xì)胞懸液，并W適當(dāng)密度(約IX 108 ? 1/1)將 細(xì)胞接種至化孔板中，培養(yǎng)約2地，待到細(xì)胞密度為80%左右，進行pEGFP-C2-TMEM88的瞬時 轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染一段時間后收集細(xì)胞懸液。低速離屯、5min，收集細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基，并用PBS緩沖 液清洗細(xì)胞2-3次。用400ul Binding Buffer重新懸浮細(xì)胞，加入加1 Annexin V染液，輕輕 混勻后放置4°C避光條件下解育15min。加入1 Oul PI，輕輕混勻后放置4 °C避光條件下解育 5min，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞調(diào)亡，實驗重復(fù)3次。
[0160] 流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：與未轉(zhuǎn)染組的調(diào)亡細(xì)胞數(shù)值相比，轉(zhuǎn)染了祀GFP-C2-TMEM88 組的調(diào)亡細(xì)胞數(shù)值均有明顯升高，且差異存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<〇. 05)。說明過表達TMEM88基 因能夠明顯從促進人肝癌細(xì)胞的調(diào)亡，見圖6-7。
[0161] W上所述，僅為本發(fā)明較佳實施例而已，故不能W此限定本發(fā)明實施的范圍，即依 本發(fā)明申請專利范圍及說明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明專利涵蓋的范 圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種過表達TMEM88基因質(zhì)粒，其特征在于:包括TMEM88基因⑶S序列與pEGFP-C2真核 表達載體的重組構(gòu)建而成；其核苷酸如序列表SEQ ID N0:3,位于TMEM88基因的第10-489 位;氨基酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示。2. -種構(gòu)建如權(quán)利要求1所述的過表達TMEM88基因的方法，其特征在于，包括如下步 驟： (1) 收集、裂解細(xì)胞，提取RNA進行逆轉(zhuǎn)錄得到TMEM88cDNA; (2) 采用PCR技術(shù)，擴增出人工TMEM88基因的⑶S序列片段； (3) TMEM88基因的⑶S序列片段的純化； (4) 對所獲得的基因片段和pEGFP-C2真核表達載體進行Kpnl和EcoRI雙酶切，并進行連 接； (5) 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TG1中，并挑去陽性克隆進行培養(yǎng)，然后抽提質(zhì)粒。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種過表達TMEM88基因的構(gòu)建方法，其特征在于，提取RNA后， 進行變性;具體的工藝步驟:將RNA在65 °C中放置5-1 Omin后，轉(zhuǎn)移至冰水中放置。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種過表達TMEM88基因的構(gòu)建方法，其特征在于，逆轉(zhuǎn)錄的反 應(yīng)體系包括：5XRT Master Mix、RNA、Nuclease_free Water;具體的工藝步驟包括： (1) 配制反應(yīng)體系：5 XRT Master Mix 2uL+RNA 2uL+Nuclease-free Water 6uL; (2) 將上述反應(yīng)體系放置37°C，并作用15min; (3) 將上述反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至50°C，并作用5min; (4) 將上述反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至98°C，并作用5min; (5) 將上述反應(yīng)體系轉(zhuǎn)移至4°C，冷卻后凍存，即得到cDNA。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種過表達TMEM88基因的構(gòu)建方法，其特征在于，根據(jù)TMEM88 的CDS序列，設(shè)計上、下游引物;上、下引物序列分別如下： TMEM88-F:5 '-CCGGAATTCCGGATGGCGGATGTCCCCG-3 ' TMEM88-R:5 '-GGGGTACCCCTTAGACCCAGACCTTTCCT-3 '。6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種過表達TMEM88基因的構(gòu)建方法，其特征在于，PCR的反應(yīng) 體系如下:2XPrimeSTAR Max、cDNA樣品、上下游引物、高純水;具體的工藝步驟包括： (1) 配制反應(yīng)體系：2XPrimeSTARMax 25yL+cDNA lyL+引物各lyL+高純水22yL; (2) 將上述反應(yīng)體系輕輕混勻后放入PCR儀器，設(shè)置如下程序運行：(3) 將上述PCR產(chǎn)物進行1-1.2%瓊脂糖凝膠電泳； (4) 回收目的DNA片段。7. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種過表達TMEM88基因的構(gòu)建方法，其特征在于，對TMEM88的 PCR產(chǎn)物和pEGFP-C2載體進行EcoR I和Kpnl的雙酶切;酶切體系如下：限制性內(nèi)切酶(EcoRI 和Kpnl)、10 X Buf f er Tango、TMEM88的PCR產(chǎn)物、或pEGFP-C2載體;具體的工藝步驟包括： (1) 配制反應(yīng)體系：10 XBuffer Tango 2yL+EcoRI和Kpnl各0 ? 5yL+TMEM88的PCR產(chǎn)物或 和 PEGFP-C2 載體 7yL; (2) 將上述反應(yīng)體系放置37°C水浴鍋中，并作用4~6h; (3) 將上述酶切產(chǎn)物進行1-1.2%瓊脂糖凝膠電泳； (4) 觀察結(jié)果并回收目的DNA片段。8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種過表達TMEM88基因的構(gòu)建方法，其特征在于，在連接之 前，對載體進行去磷酸化處理； 去磷酸化體系（1〇此）：CIAPlyl、10 X CIAP緩沖液lyl、載體8yl 連接體系（1〇此）：CIAP去磷酸化后載體0.5yl、10 X T4DNA連接酶緩沖液lyl、T4DNA連接 酶lyl、PCR酶切純化產(chǎn)物7.5yl; 連接方法:將上述反應(yīng)體系置于〇. 5ml的離心管中混勻，16 °C水浴過夜。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種過表達TMEM88基因的構(gòu)建方法，其特征在于， (1) 取出儲存于-80°C的TG1感受態(tài)細(xì)胞，冰浴解凍后加入10yl連接產(chǎn)物，混勻，冰上靜 置30min; (2) 42°C熱休克90s，取出置冰上3min; (3) 加入500y 1 LB 培養(yǎng)液，37 °C、250rpm 振蕩培養(yǎng) 45min; (4) 取出100yl轉(zhuǎn)化液涂于帶有相應(yīng)抗性的LB固體培養(yǎng)基上，37°C倒置培養(yǎng)8~12h。10. -種使用如權(quán)利要求1所述的過表達TMEM88基因質(zhì)粒在抑制人肝癌細(xì)胞的增殖、促 進人肝癌細(xì)胞的凋亡的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/66GK106047927SQ201610425684
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月14日
【發(fā)明人】徐濤, 潘林鑫, 李小楓, 倪明明, 楊揚, 孟曉明, 黃成 , 張磊, 李俊
【申請人】徐濤