一種基于兩核苷酸合成測序的pcr產(chǎn)物snp分型/突變檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種基于兩核苷酸合成測序的PCR產(chǎn)物SNP分型/突變檢測方法。通過循環(huán)將兩核苷酸同時加入到測序反應(yīng)中，每個測序反應(yīng)得到的不是具體的堿基序列，而是加入的兩核苷酸種類的編碼及其核苷酸合成的編碼數(shù)目組成的信息，根據(jù)每個分析位點的野生型、突變型、雜合型均對應(yīng)唯一、獨特的兩類編碼及其編碼數(shù)目的測序信息判斷出待測PCR產(chǎn)物的SNP分型/突變類型。利用該測序方法閱讀長度的特點，可以實現(xiàn)只需一條測序引物即可獲得多個位點的分析，避免了利用多重測序引物進行多個分析。該方法有效減少了SNP分型/突變檢測的成本、降低測序所需模板量、提高檢測靈敏度、縮短操作時間。
【專利說明】
-種基于兩核昔酸合成測序的PCR產(chǎn)物SNP分型/突變檢測 方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，是一種PCR產(chǎn)物的SNP分型/突變檢測方法，具體設(shè)及一 種兩核巧酸實時合成檢測PCR產(chǎn)物的SNP分型/突變，尤其是同一 PCR產(chǎn)物中多個SNP分型/突 變的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 近年來，人類基因組中突變的檢測引起了廣泛的關(guān)注。單核巧酸多態(tài)性（SNPs， single nucleotide polymorphisms)和點突變在進化研究和在普通疾病的診斷中得到廣 泛的應(yīng)用，使得它逐漸成為分子生物學(xué)檢測中倍受歡迎的分子標(biāo)記(markers)。不斷出現(xiàn)的 新方法和技術(shù)為SNP/突變的檢測提供了可靠的前景。運些技術(shù)大部分基于等位基因特異性 雜交技術(shù)來鑒定SNP/突變位點，比如，高密度基因忍片、padlock探針、或者PCR擴增。盡管各 種操作簡單的技術(shù)相繼出現(xiàn)，為SNPs的檢測提供了可行、簡便的技術(shù)，但是DNA測序技術(shù)仍 然是檢測SNP/突變最可靠的技術(shù)。作為SNP/突變檢測金標(biāo)準(zhǔn)的Sanger DNA測序技術(shù)不僅能 鑒定突變而且還能提供堿基的具體信息，但是運一技術(shù)需要電泳，且需要對DNA樣品進行標(biāo) 記，導(dǎo)致測序耗時耗力。另外一種測序技術(shù)一一焦憐酸測序，它是一種基于酶聯(lián)級反應(yīng)的測 序技術(shù)。該技術(shù)通過每次向反應(yīng)體系中加入一種脫氧核巧S憐酸(dNTP)，在四種酶的作用 下，釋放出與核巧酸數(shù)量成正比的峰。由于不同類型的SNP/突變特定的峰型，所W通過特定 峰的類型可W區(qū)分不同的SNP/突變。盡管焦憐酸測序技術(shù)被廣泛用在臨床診斷，科學(xué)研究 中。但是它仍然擁有幾下幾個缺點。（1)不同步延伸造成的測序長度較短；（2)有限的測序檢 測靈敏度。運些問題導(dǎo)致它只能用來檢測長度不超過60bp內(nèi)的幾個SNPs。傳統(tǒng)的SNPs測序 中（每個焦測序反應(yīng)只檢測一個SNP的方法），每個SNP需要一條測序引物和一對PCR擴增引 物，同一條DNA模板上待測的突變數(shù)量增加勢必導(dǎo)致測序成本大幅。為了降低檢測成本，提 出了能同時檢測同一條DNA模板上幾個不同SNPs的多重測序。但是，運種多重焦測序的方法 只能同時檢測同一條DNA模板上相隔不超過25bp的兩個SNPs,并且每個測序反應(yīng)只能檢測 不超過3個SNPs。所W，有必要提出一種能利用單次測序反應(yīng)檢測同一條DNA模板上多個不 同SNPs的方法。另外，傳統(tǒng)焦測序技術(shù)中，四個核巧酸(A、G、C、T)輪流加入到聚合反應(yīng)中。每 次加入一個核巧酸，產(chǎn)生一個與加入核巧酸數(shù)量成比例的峰信號。盡管運種技術(shù)基于靈敏 的酶聯(lián)級反應(yīng)，但是它仍然需要pmol級的DNA模板量。對于一些模板量較少或者較珍貴的 DNA樣本，有必要提出一種能基于微量樣本的SNPs測序方法。
[0003] 最近，我們實驗室提出一種基于兩核巧酸實時合成測序的方法，該方法通過每次 反應(yīng)同時加入未標(biāo)記的兩種dNPTs實時測序，得到兩組編碼，解碼運兩組編碼便能確定測序 片段的具體堿基信息（肖鵬峰等，中國發(fā)明專利:ZL 2012 1 0128597.6)。該方法具有大幅 提高測序長度，且測序得到的峰譜信號比傳單核巧酸合成測序的峰譜信號強等特點。誠然， 兩核巧酸合成焦測序不能測定具體的堿基信息，只能獲得由兩類編碼及其編碼數(shù)目構(gòu)成的 信息。然而，對比傳統(tǒng)的單核巧酸加入的焦測序，對于未知的多模板DNA序列，它原理上同樣 不能給出Sanger測序方法清晰的"雜合"圖譜，只能給出依據(jù)核巧酸加入方式得到的具有先 后次序的"雜合型"堿基序列，即傳統(tǒng)焦測序也不是真正意義上的測序（對堿基序列的識 另IJ)，而是對序列"峰型"的識別。基于同樣的原理，對于待測序列大致已知、且只有幾種可能 的序列，如果每種類型PCR產(chǎn)物的一次循環(huán)兩核巧酸合成焦測序得到由兩類編碼及其編碼 數(shù)目構(gòu)成的信息具有唯一性，那么基于"模式"的判斷就同樣具有唯一性，也就可W用于PCR 產(chǎn)物的SNP分型和突變檢測。本發(fā)明利用兩核巧酸實時合成測序得到的一組編碼信息的特 點，使得PCR產(chǎn)物中不同DNA模板序列得到不同的峰譜圖。也就是說，PCR產(chǎn)物中分析位點的 不同類型在一次兩核巧酸合成測序的信息中具有唯一性，從而實現(xiàn)對不同DNA模板類型的 區(qū)分。
[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種一次兩核巧酸合成測序?qū)CR產(chǎn)物中SNP分型/突變得檢 測方法。通過兩核巧酸同時加入到測序反應(yīng)中，得到一系列峰譜信息圖。在峰譜圖中，同一 個分析位點的不同類型得到的測序峰型和(或者)峰信號強度不同，根據(jù)信號峰型和(或者） 峰信號強度不同來判定所分析位點的類型。該方法能有效提高SNP/突變檢測的靈敏度、縮 短操作時間、節(jié)省測序費用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，提供一種基于兩核巧酸合成測序的PCR產(chǎn)物SNP分 型/突變檢測方法，尤其是PCR產(chǎn)物中多個SNP/突變位點的方法。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0007] -種基于兩核巧酸合成測序的PCR產(chǎn)物SNP分型/突變檢測方法，包括如下步驟： [000引（1)提取樣本的基因組DNA;
[0009] (2)PCR擴增獲得目的片段；
[0010] (3)利用兩核巧酸對目的片段進行兩核巧酸同時合成測序反應(yīng)，所述的兩核巧酸 為dATPa S、dCTP、dTTP、dGTP中選擇的兩種不同的核巧酸；
[0011] (4)由測序圖譜得到的SNP位點處的峰型確定SNP分型/突變類型。
[0012] 步驟(3)中，對SNPs位點進行測序時，加入的兩核巧酸中只能含有一個可能的突變 堿基的互補堿基;對非SNPs位點的堿基進行測序時，從(dATPaS+dGTP) / (dCTP+dTTP)(簡寫 成AG/CT)、（dATPaS+dCTP)/(dGTP+dTTP)(簡寫成AC/GT)、（dATPaS+dTTP)/(dCTP+dGTP)(簡 寫成AT/CG)中任意選擇一種循環(huán)加入或幾種交替加入。
[0013]為了保證在分析位點后的DM模板序列能同步延伸，分析位點處用兩個測序反應(yīng) 分析，首先加入的兩核巧酸中包含一個(且只能是一個)可能的突變堿基的互補堿基類型， 其次再加入含有另一個可能突變堿基的互補堿基類型的兩核巧酸。例如，G/T的突變位點 中，首先加入含有其中一個互補堿基(如T的互補堿基A)的AT或者AG中的一種，然后再加入 含有另一個互補堿基(如G的互補堿基C)的CT、CG中的一種兩核巧酸組合。非分析位點的DNA 模板序列可W循環(huán)加入AG/CT，AC/GT，或者AT/CG中的一種，也可種方式交替使用。
[0014] 步驟(2)中，PCR擴增獲得目的片段的長度小于5(K)bp。
[0015] 步驟(2)中，PCR所用正向引物的5'端用生物素標(biāo)記。
[0016] 步驟(3)的具體操作方法如下：
[0017] (3-1)制備單鏈DNA模板:將PCR擴增產(chǎn)物與鏈霉親和素包裹的磁珠反應(yīng)，生物素修 飾的DM鏈固定到所述磁珠上，得到單鏈DM模板；
[0018] (3-2)測序引物雜交:將測序引物與單鏈DNA模板結(jié)合；
[0019] (3-3)利用兩核巧酸對目的片段進行兩核巧酸同時合成測序反應(yīng)。
[0020] 步驟(4)中，判斷SNP分型/突變類型的方法是根據(jù)峰的類型(兩核巧酸的種類）、峰 的高度W及峰的排列形式構(gòu)成測序圖譜確定。
[0021] 進一步，dNTPs合成實時釋放與插入到DNA模板中核巧酸量相同的檢測分子，其檢 測分子是化學(xué)發(fā)光檢測的焦憐酸鹽，電化學(xué)檢測的氨離子或者光學(xué)檢測的巧光信號。
[0022] 加入兩核巧酸實施測序反應(yīng)后，測序反應(yīng)得到的峰的類型(兩核巧酸的種類）、峰 的高度，W及峰的排列形式構(gòu)成測序圖譜。兩核巧酸測序反應(yīng)鑒定依據(jù)為同一個分析位點 不同類型(如SNP中"純合子"、"雜合子"，點突變中的"野生型"、"突變型"等)具有不同的測 序圖譜類型，根據(jù)測序所得的測序圖譜即可得到待測位點的突變類型。
[0023] 不管測序引物的位置，對于同一個分析位點在不同的兩核巧酸合成反應(yīng)中（AG/ CT，AT/CG和AC/GT中的任意一種)總可W找到不同類型對應(yīng)的不同測序圖譜，核巧酸加入的 順序則可W依據(jù)該原理選擇合適的兩核巧酸合成反應(yīng)進行檢測。
[0024] 通過循環(huán)將兩核巧酸同時加入到測序反應(yīng)中，每個測序反應(yīng)得到的不是具體的堿 基序列，而是加入的兩核巧酸種類的編碼及其核巧酸合成的編碼數(shù)目組成的信息，根據(jù)每 個分析位點的野生型、突變型、雜合型均對應(yīng)唯一、獨特的兩類編碼及其編碼數(shù)目的測序信 息判斷出待巧UPCR產(chǎn)物的SNP分型/突變類型。兩個核巧酸同時加入到測序反應(yīng)中時，每次反 應(yīng)有一個或者多個核巧酸參與合成反應(yīng)，使得反應(yīng)信號得到明顯增加，提高SNP分型/突變 檢測的靈敏度和減少測序所需要的DNA模板量。同時，利用該測序方法閱讀長度的特點，可 W實現(xiàn)只需一條測序引物即可獲得多個位點的分析，避免了利用多重測序引物進行多個分 析。
[00巧]有益效果：
[0026] 本發(fā)明應(yīng)用兩核巧酸同時加入到反應(yīng)中的一次循環(huán)測序信息，根據(jù)同一個分析位 點中不同類型具有不同的峰譜信號類型的原理，檢測PCR產(chǎn)物中的SNP/突變位點，同時利用 測序長度的特征能有效測定同一PCR產(chǎn)物中的多個SNP/突變位點，避免了一個分析位點需 要一條測序引物甚至一對PCR擴增引物的不足。此外，通過核巧酸加入方式的選擇可W使某 些合成信號放大，運一特征可W減少對分析樣品量的要求，或者減少對PCR產(chǎn)物量的要求， 或者用于提高某些低豐度DNA模板量檢測的靈敏度。
[0027] 1.本發(fā)明一次循環(huán)測序所得的峰譜圖信息來檢測分析位點的類型。
[0028] 2.本發(fā)明直接采用商品化、非標(biāo)記的天然核巧酸進行合成測序，在提高測序長度 的同時還降低了測序成本。
[0029] 3.本發(fā)明的最大優(yōu)點是能同時測定同一 PCR產(chǎn)物的多個分析位點。
[0030] 4.本發(fā)明與傳統(tǒng)測序SNP檢測方法相比，不僅減少所需測序引物數(shù)量，而且減少了 PCR擴增的引物對數(shù)，可W有效降低檢測成本及時間。
[0031 ] 5.本發(fā)明與傳統(tǒng)測序SNP檢測方法相比，不僅減少反應(yīng)次數(shù)，而且對微量樣本具有 較高的靈敏性，可W用于微量樣本的SNPs檢測。
[0032] 6.本發(fā)明操作簡單。它可W在任何基于實時合成測序的測序平臺進行，操作簡單、 易行。
【附圖說明】
[0033] 圖1是一種基于兩核巧酸合成同時檢測多個SNPs方法的原理圖，圖中1為PCR產(chǎn)物， 2為微球，3為測序引物，4為循環(huán)測序反應(yīng)(a)測序引物的延伸鏈。
[0034] 圖2根據(jù)可能的PCR產(chǎn)物序列模擬出部分DNA片段焦測序所得的峰譜圖。
[0035] 本發(fā)明中采用長度為268bp的PCR片段來作為目標(biāo)分析片段，該片段測序引物后的 待測序列為 5'-G 巨gGATTACTGGTTATTTTTCTTTTCTCATGCATTTATGCA 醫(yī)giGCACACGCAATGAAGGC ^TGTGTGTGTGAA-3 '。其中，框內(nèi)的序列表示待測的SNP突變位點。由于待測片段中總共含 有3個SNPs，可W構(gòu)成27種不同的測序圖譜。圖2顯示了其中9種。因為第二個SNP(G/A)的突 變頻率較低，我們實驗中的樣本為純合子G，所W只有純合子G的分型得到充分考慮，其他兩 種分型我們并未給出。圖譜中，橫坐標(biāo)表示每次測序反應(yīng)所加入的兩種核巧酸的種類為 (dATPaS+dCTP)、（ dTTP+dGTP)、（ dGTP+dCTP)和（dGTP+dTTP)?？v坐標(biāo)表示每次測序反應(yīng)得到 的峰譜信號強度(即峰的高度或者合成的堿基數(shù)目）。
[0036] 圖3為所選DNA片段的兩核巧酸實時焦測序所獲得的峰譜信息圖。該圖橫坐標(biāo)上，A 代表加入dATPaS和dCTP的混合物進行測序；T代表加入dGTP和dTTP的混合物進行測序。同 理，G代表加入dGTP和dCTP的混合物進行測序;C代表加入dCTP和dTTP的混合物進行測序?？v 坐標(biāo)表示測序反應(yīng)的信號強度。峰譜上方的箭頭指出SNPs位點處峰的信號強度和峰的類 型。例如，圖3a中，第一二個箭頭表示第一個SNP位點，其峰高為1.5、1.5。
【具體實施方式】
[0037] 根據(jù)下述實施例，可W更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實 施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本 發(fā)明。
[003引實施例1:
[0039] 當(dāng)PCR產(chǎn)物如果含有尿巧二憐酸葡糖巧酸轉(zhuǎn)移酶UGT1A1基因中一個SNP (rs988748)位點，PCR產(chǎn)物中就可能含有下列兩種DNA模板之一，或者兩者均存在。DNA模板 1(SEQ ID N0:1):5'-AGAATTCTTCTTTAGCACTTAGACAADNA模板2(SEQ ID N0:2):5'- AGAATTCTTCTTTAGCACTTAGACAC
[0040] 在傳統(tǒng)的單核巧酸合成焦測序時，按照G/T的第一種加入順序方式，和T/G的第二 種加入方式，檢測樣本峰型或者峰高會不一樣(如下表）。但運兩種加入方式根據(jù)每個位點 的野生型、突變型、雜合型均對應(yīng)唯一、獨特的峰信號類型均可W判斷出樣本SNP信息:在G/ T加入方式中，"護純合型獨特測序信息為GiTi，"A"純合型為G*￥V'C/A"雜合型為護'叮1'5;而 在T/G加入方式中，"C"純合型獨特測序信息為T吃1，"A"純合型信息為T2g1，"C/A"雜合型信 息為gIti。
[0041]
[0042] 同樣的，兩核巧酸加入的方式不同，測序得信息也可能不同，但同樣可W按照"根 據(jù)每個位點的野生型、突變型、雜合型均對應(yīng)唯一、獨特的峰信號類型判斷出待測PCR產(chǎn)物 的SNP分型/突變類型"，可W判斷出樣本SNP信息。如上述rs988748位點，當(dāng)采用CT/AG加入 時，"護純合型獨特測序信息為口'*^461(運里的口\46稱為編碼，上標(biāo)0、1分別為上述編碼對應(yīng) 的數(shù)目，W下類推），"A"純合型為CT2AGV'C/A"雜合型為CTiAGi;而在AT/CG加入方式中，"C" 純合型獨特測序信息為AT^Gi，"A"純合型信息為AT2CG1，乂/A"雜合型信息為ATiCGi。
[0043] 實施例2:兩核巧酸實時合成測序同時檢測3個SNPs位點。
[0044] l、SNPs位點處測序方式的選擇：
[0045] W包含3個SNPs位點的DNA模板為例，闡述兩核巧酸實時測序同時檢測3個SNPs的 方法。該例中PCR產(chǎn)物長度為268bp，測序引物后待分析序列為5 ' -G^GATTACTGGTTATTTTT CTTTTCTCATGCATTTATGCA面自GCACACGCAATGAAGGC區(qū)國'TGTGTGTGTGAA-3'，56910側(cè)：3中只 給出了其中一種可能的序列。
[0046] 其中，框內(nèi)的序列表示待測的SNP突變位點。首先，確定SNP位點處堿基加入方式： 為保證SNPs突變位點后面的序列能同步延伸，每個SNP位點處用兩個測序反應(yīng)分析，每個測 序反應(yīng)中加入的兩核巧酸中含有一個可能的突變堿基的互補堿基進行測序反應(yīng)。使每個 SNP位點的野生型、突變型、雜合型均具有唯一的特征測序信息。
[0047] 例如，對于SNP1 (G〉A(chǔ))，如果待測序列為純合子G，則序列為:5' -GCGATT….-3 '，為 保證SNPs突變位點后面的序列能同步延伸，首先加入(dGTP+dTTP)，由于該突變類型為G/A， 所W第一次加入的兩核巧酸組合中含有一個可能的突變型A的互補堿基。第二次測序反應(yīng) 時，加入堿基(dGTP+dCTP)。運是因為另一個可能的突變類型的互補堿基是堿基C。如果該位 點為純合子G，那么運兩次測序反應(yīng)得到峰信號強度為1和2;純合子A得到峰信號強度為2和 1;雜合子的峰信號強度為1.5和1.5。
[004引對于SNP2(G/A)，首先加入(dATP+dCTP)，由于該突變類型為G/A，所W第一次加入 的兩核巧酸組合中含有一個可能的突變型C的互補堿基。第二次測序反應(yīng)時，加入堿基 (dGTP+dTTP)。運是因為另一個可能的突變類型的互補堿基是堿基A。如果該位點為純合子 G，那么運兩次測序反應(yīng)得到峰信號強度為3和1;純合子A得到峰信號強度為2和2;雜合子的 峰信號強度為2.5和1.5。
[0049] 對于SNP3(T/C)，首先加入(dATP+dCTP)，由于該突變類型為T/C，所W第一次加入 的兩核巧酸組合中含有一個可能的突變型A的互補堿基。第二次測序反應(yīng)時，加入堿基 (dGTP+dCTP)。運是因為另一個可能的突變類型的互補堿基是堿基G。如果該位點為純合子 T，那么運兩次測序反應(yīng)得到峰信號強度為2和0;純合子C得到峰信號強度為1和1;雜合子的 峰信號強度為1.5和0.5。
[0050]表1 3個SNPs位點處兩次測序反應(yīng)的峰信號強度值 [00511
[0052] 2、SNPs位點間DNA序列測序方式的選擇：
[0化3] 對于SNPs位點間的DNA序列，可W從AG/CT，AC/GT，和AT/CG堿基的加入方式中任意 選擇一種循環(huán)加入，或者幾種加入方式交替使用。本例中，我們選擇AT/CG的加入方式測定 SNP1和SNP2，SNP2和SNP3之間的序列。SNP3后面的序列我們選擇了 CT/GT的測序方式。所W， 本例中的測序方式為TGATATATATATATATATATATATATAGCT。其中，T代表的是(dGTP+dTTP);G 代表的是(dCTP+dGTP); A代表的是(dATPa S+dCTP); C代表的是(dCTP+dTTP)。
[0化4] 3、3個SNPs位點的同時確定：
[0055]根據(jù)上述方法，我們模擬出9種焦測序所得的峰譜信息（圖2)。由于待測片段中總 共含有3個SNPs位點，可W構(gòu)成27種不同的測序圖譜。但是第二個SNP(G/A)的突變頻率較 低，我們實驗中的樣本為均純合子G，所W只有純合子G的分型得到充分考慮，其他兩種分型 我們并未給出。圖2顯示了其中9種類型的測序圖。
[0化6]圖2a，d，g中，第一個SNP位點處的峰信號強度分別為1和2、2和1、1.5和1.5;由此可 知，不同的突變類型能得到不同的峰信號強度。運是運一特點奠定了該方法檢測SNPs的基 礎(chǔ)。對照表1可知，圖2a，d，g分別對應(yīng)第一個SNP的突變類型分別為純合子G、純合子A和雜合 子G/A的測序峰信號圖。圖2a~i中，SNP位點處的峰信號強度為均為3和1，由此可知九個圖 中的SNP2的突變類型相同。由于在SNP2位點前一次反應(yīng)加入了（dGTP+dTTP)，SNP2位點處原 計劃也是加入(dGTP+dTTP)。但是第一次加入(dGTP+dTTP)時，突變的DNA模板已經(jīng)參與合成 反應(yīng)，使峰信號的強度和SNP2前一個反應(yīng)和在了一起變成了 3。對照表1可知，圖2中SNP2的 突變類型為純合子G。圖2a，d，g中，第S個SNP位點SNP3的峰信號強度分別為2和0、1和1、1.5 和0.5。由于在SNP3位點前一次反應(yīng)加入了（dATPaS+dCTP)，所WSNP2位點處不必重復(fù)再加 入(dATPaS+dCTP)。對照表1可知，圖2a，b，c分別對應(yīng)第一個SNP的突變類型分別為純合子T、 純合子C和雜合子T/C的測序峰信號圖。同理，圖2d，e，f分別對應(yīng)第一個SNP的突變類型分別 為純合子T、純合子C和雜合子T/C的測序峰信號圖；圖2g，h，i分別對應(yīng)第一個SNP的突變類 型分別為純合子T、純合子C和雜合子T/C的測序峰信號圖。由此可知，根據(jù)不同堿基加入方 式下，不同的SNP突變類型具有特定的峰信號強度，可W鑒定出各個SNP分型。由于兩個核巧 酸同時加入到測序反應(yīng)中，使得每次參與合成反應(yīng)的核巧酸數(shù)量增加，測序長度能大幅提 高，所W該方法能實現(xiàn)同時測定一條DNA模板上的多個SNPs位點。
[0057]實施例3:基于焦憐酸測序平臺的兩核巧酸合成同時檢測同一條模板上的多個 SNPs位點。
[0化引 1、DNA樣本制備
[0059] 首先，從人血液中提取基因組DNA，保存在-20°C待用。在聚合酶的作用下PCR擴增 待測序片段。該片段中選取3個SNPs，且運3個SNPs覆蓋了 58bp的長度。為了有較好的焦測序 結(jié)果，該片段最好小于250bp。擴增引物為：引物F(SEQ ID N0:4):5'-biotin- ACTGGTGTCGCATTTATTTC-3 ' ；引物R(沈Q ID NO: 5): 5 '-GAGTAGAAGAAAGAGTGTTAGC-3 '。其中， 正向引物5'端標(biāo)記生物素 W獲得測序所需的PCR樣本。每個樣本用扣L的鏈霉親和素包裹的 磁珠和五倍體積的結(jié)合反應(yīng)緩沖液清洗兩遍，棄上清。再加入扣L鏈霉親和素包裹的磁珠和 五倍體積的結(jié)合反應(yīng)緩沖液在幹旋振蕩儀上振蕩使磁珠懸浮。在45化的PCR產(chǎn)物中加入50y L結(jié)合反應(yīng)緩沖液和磁珠的混合物，震常溫震蕩混合15分鐘，使生物素標(biāo)記的PCR樣本和鏈 霉親和素包裹的磁珠進行連接。利用真空樣本制備系統(tǒng)將磁珠釋放到96孔樣本板，得到單 鏈的測序模板。然后，單鏈測序模板、測序引物巧'-GTTATTTCTGGGCGAT-3'，SEQ ID N0:6)和 結(jié)合反應(yīng)緩沖液的混合物在加熱板上8(TC加熱2分鐘，使測序模板和測序引物進行結(jié)合，W 進行焦測序。
[0060] 2、兩核巧酸實時合成測序
[0061 ] 在試劑倉中加入測序所需的各種試劑（PyroMark Gold Q96 SQA Reagents(5X 96))，將包含磁珠固定PCR樣本的96孔板和試劑倉放入測序儀中，并設(shè)定測序參數(shù)。此處， dNTPs試劑中分別加入(dATPaS+dCTP)，（dGTP+dTTP)，（dATPaS+dTTP)，（dCTP+dGTP)，（dATP曰 S+dGTP)或者(dCTP+dTTP)中的任意四組進行的兩核巧酸同時合成測序反應(yīng)。設(shè)置測序方式 為TGATATATATATATATATATATATATAGCT，并點擊開始按鈕，開始測序。其中，T代表的是(dGTP+ dTTP); G代表的是(dCTP+dGTP); A代表的是(dATPa S+dCTP); C代表的是(dCTP+dTTP)。
[0062] 3、同時鑒定3個SNPs位點
[0063] 圖3為DNA樣本的兩核巧酸實時焦測序所獲得的峰譜信息。該圖橫坐標(biāo)上，A代表加 入dATPaS和dCTP的混合物進行測序;T代表加入dGTP和dTTP的混合物進行測序。同理，G代表 加入dGTP和dCTP的混合物進行測序;C代表加入dCTP和dTTP的混合物進行測序。縱坐標(biāo)表示 測序反應(yīng)的信號強度。峰譜上方的箭頭指出SNPs位點處峰的信號強度。將測序所得到的圖 譜和表1預(yù)測的SNPs位點處峰高信號作對比，即可得出3個SNPs的突變類型。圖3a中，SNP1的 峰信號強度為1.5和1.5。對比表1可知，雜合子G/A的峰信號強度為1.5和1.5。所W，SNP1為 雜合子G/A。對于SNP2,突變位點處的峰信號強度為3和1，對比表1可知，SNP2為純合子G。同 理，對于SNP3，突變位點處的峰信號強度為1.5和0.5，對比表1可知，SNP2為雜合子T/C。圖3b 中，SNP1的峰信號強度為1和2。對比表1可知，純合子G的峰信號強度為1和2。所W，SNP1為純 合子G。對于SNP2,突變位點處的峰信號強度為3和1，對比表1可知，SNP2為純合子G。同理，對 于SNP3,突變位點處的峰信號強度為1和1，對比表1可知，SNP2為純合子C。由此可見，分析 焦測序所得的圖譜，W及比較焦測序圖譜和預(yù)測分析所得的峰譜信號，我們可W正確地分 析同一條DNA模板上幾個SNPs位點。
【主權(quán)項】
1. 一種基于兩核苷酸合成測序的PCR產(chǎn)物SNP分型/突變檢測方法，其特征在于，包括如 下步驟： (1) 提取樣本的基因組DNA; (2) PCR擴增獲得目的片段； (3) 利用兩核苷酸對目的片段進行兩核苷酸同時合成測序反應(yīng)，所述的兩核苷酸為 (1八丁?(^、(101\(11'了？、(16了？中選擇的兩種不同的核苷酸，每個測序反應(yīng)得到的測序信息包括 加入的兩核苷酸的種類信息、以及核苷酸合成的數(shù)目信息； (4) 由測序圖譜得到的SNP位點處的峰型確定SNP分型/突變類型。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于兩核苷酸合成測序的PCR產(chǎn)物SNP分型/突變檢測方法，其 特征在于，步驟(3)中，兩核苷酸同時合成測序反應(yīng)從(dATPaS+dGTP) / (dCTP+dTTP)、（ dATPa S+dCTP)/(dGTP+dTTP)、（dATPaS+dTTP)/(dCTP+dGTP)中任意選擇一種循環(huán)加入或幾種交替 加入。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于兩核苷酸合成測序的PCR產(chǎn)物SNP分型/突變檢測方法，其 特征在于，步驟(2)中，PCR擴增獲得目的片段的長度小于500bp。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于兩核苷酸合成測序的PCR產(chǎn)物SNP分型/突變檢測方法，其 特征在于，步驟(2)中，PCR所用正向引物的5'端用生物素標(biāo)記。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于兩核苷酸合成測序的PCR產(chǎn)物SNP分型/突變檢測方法，其 特征在于，步驟(3)按照如下方法進行： (3-1)制備單鏈DNA模板:將PCR擴增產(chǎn)物與鏈霉親和素包裹的磁珠反應(yīng)，生物素修飾的 DNA鏈固定到所述磁珠上，得到單鏈DNA模板； (3-2)測序引物雜交:將測序引物與單鏈DNA模板結(jié)合； (3-3)利用兩核苷酸對目的片段進行兩核苷酸同時合成測序反應(yīng)。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于兩核苷酸合成測序的PCR產(chǎn)物SNP分型/突變檢測方法，其 特征在于，步驟(4)中，判斷SNP分型/突變類型的方法根據(jù)峰的類型、峰的高度、以及峰的排 列形式構(gòu)成測序圖譜確定。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于兩核苷酸合成測序的PCR產(chǎn)物SNP分型/突變檢測方法，其 特征在于，dNTPs合成實時釋放與插入到DNA模板中核苷酸量相同的檢測分子，其檢測分子 是化學(xué)發(fā)光檢測的焦磷酸鹽、電化學(xué)檢測的氫離子或者光學(xué)檢測的熒光信號。
【文檔編號】C12Q1/68GK106047990SQ201510691117
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2015年10月22日
【發(fā)明人】肖鵬峰, 王柳
【申請人】東南大學(xué)