基于目標(biāo)物誘導(dǎo)的鄰近結(jié)合構(gòu)建熒光信號擴(kuò)增生物傳感平臺檢測腺苷的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種雙功能探針，包含：用于特異性識別腺苷的兩段腺苷適體；用于為切刻酶提供酶切位點；用于為切刻/聚合反應(yīng)提供模板的聚合/切刻模板和用于連接所述的兩段腺苷適體的輔助堿基；本發(fā)明還公開了一種檢測腺苷的試劑以及檢測方法。可以實現(xiàn)免標(biāo)記高靈敏檢測腺苷，方法的檢測限為8.4×10?8mol·L?1，達(dá)到人尿樣中腺苷含量檢測要求，具有檢測人尿樣中腺苷含量的潛力和潛在的實際應(yīng)用價值。
【專利說明】
基于目標(biāo)物誘導(dǎo)的鄰近結(jié)合構(gòu)建黃光信號擴(kuò)増生物傳感平臺 檢測腺昔的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種W目標(biāo)物誘導(dǎo)的鄰近結(jié)合為基礎(chǔ)的巧光信號擴(kuò)增生物傳感平臺 用于免標(biāo)記靈敏檢測腺巧的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 腺巧(AD)是一種內(nèi)源性核巧，能夠調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)、周圍神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng) 的正常運行，是美國食品藥品管理局(抑A)批準(zhǔn)的治療陣發(fā)性室上性屯、動過速(PSVT)藥物。 此外，腺巧的表達(dá)水平與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展階段具有密切關(guān)系，是腫瘤的潛在生物標(biāo)志物。 因此，定量檢測腺巧在疾病的早期診斷和臨床治療方面具有重要意義。
[0003] 傳統(tǒng)的腺巧檢測方法，如放射性免疫法、毛細(xì)管電泳法和高效液相色譜法，已經(jīng)用 于腺巧的檢測。然而，運些檢測方法存在不同程度的局限性，例如，放射性免疫法須進(jìn)行放 射性標(biāo)記，危害健康、污染環(huán)境;毛細(xì)管電泳法需要復(fù)雜的樣品預(yù)處理，且檢測結(jié)果重現(xiàn)性 差、靈敏度低；高效液相色譜法需要大量樣品。因此，需要構(gòu)建新的簡便、安全、高靈敏度和 重現(xiàn)性好的腺巧定量檢測策略。其中，基于適體的巧光法成為一種有效的腺巧檢測方法。
[0004] 目前基于適體與腺巧的選擇性結(jié)合來檢測腺巧的相關(guān)研究主要有:Liu課題組和 Wang課題組分別設(shè)計了阻滯型探針，通過腺巧取代下與適體結(jié)合的阻滯鏈，引發(fā)擴(kuò)增反應(yīng) 得到可檢測的巧光信號，進(jìn)行腺巧的檢測。然而，在此種結(jié)合作用中，阻滯鏈和目標(biāo)物與適 體鏈之間存在競爭，不利于目標(biāo)物的有效結(jié)合。Yu課題組設(shè)計了分裂型探針用于腺巧的檢 測，該方法將腺巧適體分為兩部分，分別設(shè)計在兩個探針中，腺巧能夠使分裂的適體相互靠 近，使探針形成復(fù)合雙鏈結(jié)構(gòu)，引發(fā)聚合酶輔助的信號擴(kuò)增，在插入染料后得到巧光信號。 然而，在此種結(jié)合方式中，分裂的適體各自游離在溶液中，局部濃度低，不利于有效結(jié)合腺 巧，進(jìn)而影響檢測效果。
[0005] 因此，亟需設(shè)計適體局部濃度高的新型探針構(gòu)建巧光生物傳感平臺用于腺巧的檢 測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種基于目標(biāo)物誘導(dǎo)的鄰 近結(jié)合構(gòu)建巧光信號擴(kuò)增生物傳感平臺檢測腺巧的方法，該方法可W實現(xiàn)免標(biāo)記高靈敏檢 測腺巧，方法的檢測限為8.4Xl(T8mol . [1，達(dá)到人尿樣中腺巧含量檢測要求，具有檢測人 尿樣中腺巧含量的潛力和潛在的實際應(yīng)用價值。
[0007] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
[000引本發(fā)明的第一方面，提供一種雙功能探針(di-probe )，包含：
[0009]兩段腺巧適體，所述腺巧適體用于特異性識別腺巧，當(dāng)體系中不存在腺巧時，兩段 腺巧適體不能結(jié)合，不會引發(fā)后續(xù)的擴(kuò)增反應(yīng);而當(dāng)體系中存在腺巧時，腺巧能夠與其適體 特異性結(jié)合，引起適體的鄰近結(jié)合，進(jìn)而引發(fā)聚合/切刻反應(yīng)；
[0010] 切刻識別位點，所述切刻識別位點用于為切刻酶提供酶切位點；
[0011] 聚合/切刻模板，所述聚合/切刻模板用于為聚合/切刻反應(yīng)提供模板；
[0012] 輔助堿基，所述輔助堿基用于連接所述的兩段腺巧適體。
[0013] 所述雙功能探針的核巧酸序列為W下之一：
[0014] (l)SEQ ID N0.1所示的核巧酸序列；或
[0015] (2)與SEQ ID No. 1所示的核巧酸序列具有90% W上同源性且功能相同的核巧酸 序列。
[0016] 優(yōu)選的，所述雙功能探針的核巧酸序列如SEQ ID NO.1所示，具體如下：
[0017] GGG AGT TGA GTG CTG AGG ATG CGG AGG AAG GT TTT TT AC CTG GGG GAG TAT (沈Q ID NO.l);
[0018] 其中，正常字體為聚合/切刻模板，斜體為切刻識別位點，加粗為兩段腺巧適體，斜 體加粗為輔助堿基。
[0019] 上述雙功能探針在檢測腺巧中的應(yīng)用也是本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0020] 本發(fā)明的第二方面，提供一種檢測腺巧的試劑，包括：
[0021] 上述雙功能探針、聚合酶、連接酶、切刻酶、鎖式探針(pad-probe)和化T染料；
[0022] 所述鎖式探針的核巧酸序列如SEQ ID NO.2所示，具體如下：
[0023] pad-probe：AGT GCT GAG GAA ACC CAA CCC GCC CTA CCC GCT GAG GAA ACC CAA CCC GCC CTA CCC GCT GAG GGA GTT G(沈Q ID N0.2)。
[0024] 所述切刻酶為化.BbvCI切刻酶。
[0025] 所述聚合酶為KF聚合酶和化i29聚合酶。
[00%] 所述連接酶為T4DNA連接酶。
[0027] 本發(fā)明的第=方面，提供一種檢測腺巧的方法，步驟如下：
[0028] (1)制備不同濃度的腺巧，加入雙功能探針，恒溫解育；使腺巧與雙功能探針中的 適體充分結(jié)合，引起探針的雜交。
[0029] (2)向步驟（1)反應(yīng)后的溶液中加入KF聚合酶和化.BbvCI切刻酶，構(gòu)建聚合/切刻 反應(yīng)體系，進(jìn)行聚合/切刻反應(yīng)，產(chǎn)生引物序列；
[0030] (3)向步驟(2)反應(yīng)后的溶液中加入pad-probe、T4DNA連接酶，進(jìn)行連接反應(yīng)，再加 入化i29聚合酶和化.BbvCI切刻酶，進(jìn)行指數(shù)型滾環(huán)擴(kuò)增；
[0031] (4)向步驟(3)反應(yīng)后的溶液中加入化T染料，解育，檢測巧光強(qiáng)度，構(gòu)建巧光強(qiáng)度 與腺巧濃度之間的線性方程，對待測樣品，可通過測定樣品的巧光強(qiáng)度，代入線性方程，計 算樣品的腺巧濃度。
[0032] 步驟(1)中，所述恒溫解育的條件為:37°C恒溫解育120min。
[0033] 步驟(2)中，進(jìn)行聚合/切刻反應(yīng)體系的組成包括：10 XCutSmaパ緩沖液、dNTPs溶 液、KF聚合酶、Nt.抓vCI切刻酶和純水。
[0034] 在本發(fā)明的一個【具體實施方式】中，所述聚合/切刻反應(yīng)體系為：向lOiiL的雙功能探 針與適體結(jié)合后的溶液中加入2.化L 10XCutSmaパ緩沖液、3.0化dNTPs溶液、0.2化L KF 聚合酶、0.2化L化.BbvCI切刻酶和4.化L純水，組成20化體系。
[0035] 步驟(2)中，聚合/切刻反應(yīng)的條件為:將聚合/切刻反應(yīng)體系置于37°C恒溫箱中解 育30min;解育完成后置于干式恒溫器中，保持85°C加熱25min，使聚合/切刻反應(yīng)停止。
[0036] 步驟(3)中，進(jìn)行指數(shù)型滾環(huán)擴(kuò)增的條件為：向聚合/切刻反應(yīng)后的溶液中加入T4 連接酶緩沖液、pad-probe、T4DNA連接酶和純水，37°C恒溫解育60min;再加入lOXCutSmad 緩沖液、dNTPs溶液、Phi29聚合酶、Nt.抓vCI切刻酶和純水，37°C恒溫解育ISOmin;反應(yīng)完成 后置于干式恒溫器中，保持75°C加熱25min，終止指數(shù)型滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)。
[0037] 在本發(fā)明的一個【具體實施方式】中，進(jìn)行指數(shù)型滾環(huán)擴(kuò)增的具體條件為：向聚合/切 刻反應(yīng)后的溶液中加入3.0化10XT4連接酶緩沖液、2.0化2.0Xl〇-5mol -L-i的pad- probe、0.3化L T4 DNA連接酶和4.化L純水，組成30化體系，將樣品置于37°C恒溫箱中解育 60min。后繼續(xù)向樣品中加入2.0化10XCutSmaパ緩沖液、5.0化dNTPs溶液、0.30化Phi29 聚合酶、0.4化L化.BbvCI切刻酶和2.化L純水，組成40化體系，將樣品置于37°C恒溫箱中解 育ISOmin。后將反應(yīng)完成的各樣品置于干式恒溫器中，保持75°C加熱25min，終止指數(shù)型滾 環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)。
[0038] 步驟(4)中，巧光強(qiáng)度檢測的光譜條件為:激發(fā)波長為425nm，電壓為700V，狹縫寬 度均為5. Onm，發(fā)射光譜記錄范圍為450~600nm，選擇495nm處巧光發(fā)射強(qiáng)度為衡量標(biāo)準(zhǔn)。
[0039] 步驟（4)中，構(gòu)建的巧光強(qiáng)度與腺巧濃度之間的線性方程為：F-F0 = 77.84C+ 12.98，相關(guān)系數(shù)R = 0.998。其中，F(xiàn)為含有腺巧待測樣品的巧光強(qiáng)度，F(xiàn)o為相同實驗條件下 不含腺巧樣品的巧光強(qiáng)度，C為樣品中的腺巧濃度，mol ? [1。
[0040] 上述線性方程的線性范圍為5.0Xl〇-7mol ? [1到2.0Xl0-5mol ? [1。
[0041] 本發(fā)明的基于目標(biāo)物誘導(dǎo)的鄰近結(jié)合構(gòu)建巧光信號擴(kuò)增生物傳感平臺檢測腺巧 的原理為：
[0042] 本發(fā)明利用腺巧適體能夠與腺巧選擇性結(jié)合的性質(zhì)，設(shè)計了一種雙功能探針(di? probe) ，該雙功能探針包含兩段腺巧適體、切刻識別位點 、聚合 / 切刻模板和輔助堿基； 其 中，腺巧適體用于特異性識別腺巧，當(dāng)腺巧與其適體結(jié)合后，能夠引起適體的鄰近結(jié)合，進(jìn) 而引發(fā)聚合/切刻反應(yīng)，產(chǎn)生大量的引物序列；產(chǎn)生的引物序列能夠與加入的pad-probe部 分雜交，在連接酶和聚合酶的作用下，進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物又能夠與pad- probe 部分雜交，在切刻酶的作用下 ，產(chǎn)生更多的引物序列 （引物序列與聚合模板互補(bǔ) ），與 pad-probe部分雜交，如此循環(huán)，完成指數(shù)型滾環(huán)擴(kuò)增。擴(kuò)增后產(chǎn)物含有G-四倍體序列，在加 入化T染料后，能得到增強(qiáng)的巧光信號，因此，實現(xiàn)了目標(biāo)物誘導(dǎo)的鄰近結(jié)合引發(fā)巧光信號 擴(kuò)增用于免標(biāo)記靈敏檢測腺巧。當(dāng)體系中不含有腺巧時，di-probe不能結(jié)合，也就不會引發(fā) 后續(xù)的擴(kuò)增反應(yīng)。其檢測的原理圖具體如圖1所示。
[0043] 本發(fā)明的關(guān)鍵在于設(shè)計的di-probe對體系中是否含有腺巧的區(qū)分能力，即當(dāng)且僅 當(dāng)腺巧存在時，di-probe才能發(fā)生結(jié)合反應(yīng)。發(fā)明人發(fā)明人就di-probe中3'端與模板序列 互補(bǔ)的堿基個數(shù)對體系的檢測效果的影響進(jìn)行了考察，得到了對腺巧檢測效果最優(yōu)的雙功 能探針，如SEQ ID N0.1所示。
[0044] 本發(fā)明的有益效果：
[0045] (1)本發(fā)明的雙功能探針能夠?qū)ο偾蛇M(jìn)行特異性結(jié)合，無需進(jìn)行標(biāo)記，可用于體系 中腺巧的檢測。
[0046] (2)本發(fā)明的檢測方法可W實現(xiàn)免標(biāo)記高靈敏檢測腺巧，方法的檢測限為8.4X icrVoi ? [1，達(dá)到人尿樣中腺巧含量檢測要求，具有檢測人尿樣中腺巧含量的潛力和潛在 的實際應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0047] 圖1:目標(biāo)物誘導(dǎo)的鄰近結(jié)合構(gòu)建巧光信號擴(kuò)增生物傳感平臺用于靈敏檢測腺巧 原理圖；
[0048] 圖2:di-probe的3'端與模板序列互補(bǔ)堿基個數(shù)對體系相對巧光強(qiáng)度的影響；
[0049] 圖3:不同情況下巧光生物傳感平臺用于檢測腺巧的巧光光譜；
[0050] 圖4:A不同腺巧濃度下雙功能探針體系的巧光發(fā)射光譜;B體系相對巧光強(qiáng)度與相 應(yīng)腺巧濃度之間的線性關(guān)系；
[0051] 圖5:目標(biāo)物誘導(dǎo)的鄰近結(jié)合巧光信號擴(kuò)增傳感平臺對腺巧檢測的選擇性考察結(jié) 果。
【具體實施方式】
[0052] 結(jié)合實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，應(yīng)該說明的是，下述說明僅是為了解釋本 發(fā)明，并不對其內(nèi)容進(jìn)行限定。
[0053] 實驗試劑和儀器：
[0054] 本發(fā)明實施例中所用到的實驗試劑和儀器如下：
[0化5]腺巧（Adenosine，>99% )購自 Sigma-Aldrich(上海，中國），胞巧（C}ftidine，〉 98%)、尿巧(化1山116，〉98%)、鳥巧(611311〇31116，〉98%)、尿素和(1腫?3均購自生工生物科技 有限公司（上海，中國）dKF聚合酶化lenow片段，3'-5'ex〇-)、切刻酶(Nt.mDvCI)和T4連接酶 均購自化 W Elngland Biolabs(北京，中國），F(xiàn)*hi29 聚合酶購自I'hermo Fisher Scientific (上海，中國）?；疶購自Abeam(上海，中國）?；旌侠w維樹醋微孔濾膜(孔徑0.22皿)購于興亞 凈化材料廠(上海，中國）。實驗所用其他藥品和試劑(均為分析純)購自標(biāo)準(zhǔn)供應(yīng)商。所有溶 液均由超純水(>18.25MQ ? cm)配制。實驗中所用核酸鏈由生工生物工程股份有限公司（上 海，中國）合成和純化。
[0056]實驗中所需緩沖液組成如下：
[0化7] KC1 溶液：2M KC1。
[0化引 TE緩沖液：10mM Tris-HCl，lmM 邸TA，pH 8.0。
[0059] Cut smad緩沖液：20mM Tris-Ac，50mM KAc，10mM(Ac)2Mg，pH 7.9。
[0060] T4連接酶緩沖液：50mM Tris-肥l，10mM MgCl2，10mM DTT，lmM ATP，pH 7.5。
[0061 ]巧光測量使用日立F-7000巧光光譜儀進(jìn)行測定（日本，日立公司）。
[0062] 實施例1:雙功能探針(di-probe)的優(yōu)化設(shè)計
[0063] 表1:
[0064]
[0065] 本發(fā)明的關(guān)鍵點在于di-probe對體系中是否含有腺巧的區(qū)分能力，即當(dāng)且僅當(dāng)腺 巧存在時di-probe發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，因此，di-probe中3 '端與模板序列互補(bǔ)的堿基個數(shù)對體 系的檢測效果有重要影響。鑒于W上理論分析，設(shè)計四種3'端與模板序列互補(bǔ)的堿基個數(shù) 不同的探針(具體如表1所示），比較不同探針對體系相對巧光強(qiáng)度的影響，用于考察得到具 有最佳效果的探針序列，結(jié)果如圖2所示。
[0066] 由圖2可W看出，隨著3'端與模板序列互補(bǔ)的堿基個數(shù)的增加，陰性體系（未含有 腺巧體系）的巧光強(qiáng)度增加，說明互補(bǔ)堿基數(shù)增加使得di-probe探針自身結(jié)合作用增加，進(jìn) 而引發(fā)后續(xù)擴(kuò)增反應(yīng)。比較陽性體系（含有腺巧體系）結(jié)果，當(dāng)3'端與模板序列互補(bǔ)的堿基 個數(shù)為加寸，陽性體系的巧光強(qiáng)度幾乎與陰性體系的巧光強(qiáng)度相當(dāng)，運是由于3'端堿基不能 與模板序列形成嚴(yán)格的雙鏈結(jié)構(gòu)，無法引發(fā)聚合反應(yīng)，進(jìn)行信號擴(kuò)增；當(dāng)3'端與模板序列互 補(bǔ)的堿基個數(shù)為1時，陽性體系的巧光強(qiáng)度顯著增加，當(dāng)互補(bǔ)堿基個數(shù)繼續(xù)增加時，陽性體 系的巧光強(qiáng)度幾乎不變?？紤]到上述情況，W體系相對強(qiáng)光強(qiáng)度來衡量實驗結(jié)果，3'端與模 板序列互補(bǔ)的堿基個數(shù)為1時，測得體系相對巧光強(qiáng)度最大。因此，選擇di-probel作為最優(yōu) 的雙功能探針，并用于后續(xù)的實驗研究。
[0067] 實施例2:基于目標(biāo)物誘導(dǎo)的鄰近結(jié)合構(gòu)建巧光信號擴(kuò)增生物傳感平臺檢測腺巧 [006引具體方法如下；
[0069] (l)DNA探針的制備
[0070] 將實施例1優(yōu)化得到的雙功能探針委托生工生物工程股份有限公司（上海，中國） 合成和純化，將合成純化后的干粉離屯、（12,00化9111/111111，1111111)，并按說明書用16緩沖液稀 釋，按所需濃度和體積分裝，置于-20°C冰箱中保存。取適量的di-probe稀釋，滿旋混勻。將 制備好的溶液置于干式恒溫器中，95°C保持5min，后自然冷卻至室溫，放入4 °C冰箱中保存 至少化，備用。
[0071] (2)腺巧的結(jié)合反應(yīng)
[0072] 向體系中加入制備好的探針di-probe和不同濃度的腺巧，震蕩lOmin，37 °C恒溫解 育120min，使腺巧與di-probe中的適體充分結(jié)合且引發(fā)di-probe的鄰近結(jié)合。
[0073] (3)聚合/切刻反應(yīng)
[0074] 向上述樣品溶液中加入2.0化10XCutSmaパ緩沖液、3.0化dNTPs溶液、0.20化 KF聚合酶、0.2化L化.BbvCI切刻酶和4.化L純水，組成20化體系，將樣品置于37°C恒溫箱中 解育30min。后將反應(yīng)完成的各樣品置于干式恒溫器中，保持85°C加熱25min，使聚合/切刻 反應(yīng)停止。
[0075] (4)指數(shù)型滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)
[0076] 向上述樣品溶液中加入3.化L 10 X T4連接酶緩沖液、2.0化的pad-probe、0.30化 T4DNA連接酶和4.化L純水，組成30化體系，將樣品置于37 °C恒溫箱中解育60min。后繼續(xù)向 樣品中加入2.0化lOXCutSmart緩沖液、5.0化dNTPs溶液、0.30化Phi29聚合酶、0.40化 化.BbvCI切刻酶和2.3化純水，組成40化體系，將樣品置于37°C恒溫箱中解育ISOmin。后將 反應(yīng)完成的各樣品置于干式恒溫器中，保持75°C加熱25min，終止指數(shù)型滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)。
[0077] (5)巧光測定實驗
[007引向上述反應(yīng)液中加入10化的KC1溶液、1扣L的ThT染料溶液和若干純水，37 °C解育 50min，用于輸出巧光信號。利用F-7000巧光光譜儀記錄實驗結(jié)果，測定的光譜條件為:激發(fā) 波長為425加1，電壓為700V，狹縫寬度均為5.0加1，發(fā)射光譜記錄范圍為450~600加1，選擇 495nm處巧光發(fā)射強(qiáng)度為衡量標(biāo)準(zhǔn)，所有的實驗均重復(fù)=次。陰性控制實驗所加試劑與陽性 相同，但不加入腺巧。構(gòu)建巧光強(qiáng)度與腺巧濃度之間的線性方程，對待測樣品，可通過測定 樣品的巧光強(qiáng)度，代入線性方程，計算待測樣品的腺巧濃度。
[0079] 實施例3:本發(fā)明的檢測方法的可行性研究
[0080] 為了驗證本發(fā)明的檢測方法的可行性和擴(kuò)增能力，考察了不同情況下反應(yīng)體系的 巧光發(fā)射光譜。結(jié)果如圖3所示，當(dāng)體系中僅含有化T染料時（曲線a)，幾乎無明顯巧光信號， 說明化T具有較低的自身背景。當(dāng)體系中含有di-probe或pad-probe時（曲線b和曲線C)，體 系的巧光強(qiáng)度略有增加，可能是由于化T染料與di-probe或pad-probe中的G堿基相互作用， 產(chǎn)生巧光信號。在陰性條件下，巧光強(qiáng)度約為205(曲線d)，表明當(dāng)目標(biāo)物不存在時，分裂在 di-probe中的腺巧適體無法結(jié)合引發(fā)后續(xù)的聚合/切刻和指數(shù)型滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，無明顯巧 光信號。當(dāng)目標(biāo)物存在時，巧光強(qiáng)度顯著增加（曲線e)，運是由于di-probe中的腺巧適體與 腺巧選擇性結(jié)合，進(jìn)而引發(fā)后續(xù)的聚合/切刻和指數(shù)型滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)，得到大量的G-四倍體 序列，在加入染料化T后獲得明顯的巧光信號。實驗結(jié)果表明，本發(fā)明構(gòu)建的生物傳感平臺 對腺巧具有良好的響應(yīng)。
[0081] 實施例4:本發(fā)明的檢測方法的靈敏度考察
[0082] 在選擇的最適實驗條件下，考察了不同濃度腺巧存在時體系巧光強(qiáng)度，并進(jìn)一步 處理、計算得出本方法的靈敏度。不同濃度腺巧存在下的體系巧光光譜，如圖4A所示，曲線a 至化分別是腺巧濃度為〇、5.0Xl〇-V)l ? L-i、1.0Xl〇-6mol ? L-i、2.5Xl〇-6mol ? L-i、5.0X l〇-6mol ? L-i、1.0Xl〇-5mol ? L-i、1.5Xl〇-5mol ? [1 和2.0Xl0-5mol ? L-i的巧光光譜。從圖 中看出，隨著體系中腺巧濃度的增加，巧光強(qiáng)度逐漸增加。圖4B為體系相對巧光強(qiáng)度與相應(yīng) 腺巧濃度之間的線性關(guān)系。由圖可知，在腺巧濃度為5.0Xl(T7mol ? 1/1到2.0Xl(T5mol ? [1 的范圍內(nèi)，體系相對巧光強(qiáng)度與腺巧濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，其線性方程為F-F0 = 77.84C+12.98，相關(guān)系數(shù)R = 0.998。根據(jù)3S規(guī)則，計算得本方法對腺巧的檢測限為8.4 X 10-8mol ? [1，與現(xiàn)存方法具有可比性，能夠達(dá)到人尿樣中腺巧含量檢測的要求。
[0083] 實施例5:本發(fā)明的檢測方法的選擇性考察
[0084] 選擇性是評價檢測方法的重要指標(biāo)，本發(fā)明考察了 =種腺巧類似物(鳥巧、胞巧和 尿巧）對腺巧檢測的影響。如圖5所示，當(dāng)體系中僅存在胞巧、尿巧和鳥巧（均為5.0 X1(T Vol ? 1/1)時，體系無明顯的相對巧光強(qiáng)度，而當(dāng)體系中存在腺巧（5.0Xl(T5mol ? 1/1)時， 體系相對巧光強(qiáng)度顯著增加，說明此方法對腺巧表現(xiàn)出良好的選擇性。此外，本工作還考察 了實際樣品中存在的兩種含量較高的無機(jī)鹽r(8.5Xl〇-3mol ? L-1)和化+(8.5Xl〇-3mol ?
[i)，W及尿素(8.3Xl(T3mol ? 1/1)對腺巧檢測的干擾，實驗結(jié)果表明，當(dāng)體系中僅含有r、 化+W及尿素時，體系無明顯的相對巧光強(qiáng)度，復(fù)雜體系中高含量干擾物幾乎對檢測體系無 影響。因此，本方法具有用于實際樣品檢測的潛力。
【主權(quán)項】
1. 一種雙功能探針，其特征在于，包含： 兩段腺苷適體，所述腺苷適體用于特異性識別腺苷； 切刻識別位點，所述切刻識別位點用于為切刻酶提供酶切位點； 聚合/切刻模板，所述聚合/切刻模板用于為切刻/聚合反應(yīng)提供模板； 輔助堿基，所述輔助堿基用于連接所述的兩段腺苷適體。2. 如權(quán)利要求1所述的雙功能探針，其特征在于，所述雙功能探針的核苷酸序列為以下 之一： (1) SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；或 (2) 與SEQ ID No.1所示的核苷酸序列具有90%以上同源性且功能相同的核苷酸序列。3. 權(quán)利要求1或2所述的雙功能探針在檢測腺苷中的應(yīng)用。4. 一種檢測腺苷的試劑，其特征在于，包括： 權(quán)利要求1或2所述的雙功能探針、聚合酶、連接酶、切刻酶、鎖式探針(pad-probe)和 ThT染料； 所述鎖式探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。5. 如權(quán)利要求4所述的試劑，其特征在于，所述切刻酶為Nt. BbvCI切刻酶。6. 如權(quán)利要求4所述的試劑，其特征在于，所述聚合酶為KF聚合酶和Phi29聚合酶;所述 連接酶為T4DNA連接酶。7. -種檢測腺苷的方法，其特征在于，步驟如下： (1) 制備不同濃度的腺苷，加入權(quán)利要求1或2所述的雙功能探針，恒溫孵育； (2) 向步驟（1)反應(yīng)后的溶液中加入聚合酶和切刻酶，構(gòu)建聚合/切刻反應(yīng)體系，進(jìn)行聚 合/切刻反應(yīng)，產(chǎn)生引物序列； (3) 向步驟（2)反應(yīng)后的溶液中加入pad-probe、T4DNA連接酶，進(jìn)行連接反應(yīng)，再加入 Phi29聚合酶和Nt. BbvCI切刻酶，進(jìn)行指數(shù)型滾環(huán)擴(kuò)增； (4) 向步驟(3)反應(yīng)后的溶液中加入ThT染料，孵育，檢測熒光強(qiáng)度，構(gòu)建熒光強(qiáng)度與腺 苷濃度之間的線性方程，對待測樣品，通過測定樣品的熒光強(qiáng)度，代入線性方程，計算樣品 的腺苷濃度。8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(2)中，進(jìn)行聚合/切刻反應(yīng)體系的組成 包括:10 X CutSmart緩沖液、dNTPs溶液、KF聚合酶、Nt. BbvCI切刻酶和純水。9. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(3)中，進(jìn)行指數(shù)型滾環(huán)擴(kuò)增的條件為： 向聚合/切刻反應(yīng)后的溶液中加入T4連接酶緩沖液、pad-pr 〇be、T4DNA連接酶和純水，37°C 恒溫孵育60min;再加入lOXCutSmart緩沖液、dNTPs溶液、Phi29聚合酶、Nt.BbvCI切刻酶和 純水，37°C恒溫孵育180min;反應(yīng)完成后保持75°C加熱25min，終止指數(shù)型滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)。10. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(4)中，構(gòu)建的熒光強(qiáng)度與腺苷濃度之 間的線性方程為:F-F〇 = 77.84C+12.98，相關(guān)系數(shù)R = 0.998;其中，F(xiàn)為含有腺苷待測樣品的 熒光強(qiáng)度，F(xiàn)〇為相同實驗條件下不含腺苷樣品的熒光強(qiáng)度，C為樣品中的腺苷濃度，mol · L -1 〇
【文檔編號】C12N15/11GK106048024SQ201610438106
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月17日
【發(fā)明人】姜瑋, 王磊, 魏海平
【申請人】山東大學(xué)