用于鑒定桃果實肉色性狀的單核苷酸多態(tài)性標記位點、引物、試劑盒及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于鑒定桃果實肉色性狀的單核苷酸多態(tài)性標記位點、引物、試劑盒及應(yīng)用。所述的單核苷酸多態(tài)性標記位點是桃基因組第1染色體的第24827153位核苷酸，該核苷酸為A或G。本發(fā)明篩選得到桃基因組第1染色體的第24827153作為核苷酸多態(tài)性標記位點，能夠用于鑒定或輔助鑒定桃果實肉色性狀，在鑒定桃果實肉色性狀時具有較高的準備率。本發(fā)明對15個雜交群體共221份待測桃單株進行SNPs準確率的驗證，結(jié)果表明，果實肉色SNPs較最近報道的其他研究平均準確率從73.76％提升至86.43％。這說明，利用本發(fā)明的單核苷酸標記位點進行檢測具有簡單、快速、成本低的優(yōu)點，能夠?qū)崿F(xiàn)生產(chǎn)中大規(guī)模的應(yīng)用。
【專利說明】
用于鑒定桃果實肉色性狀的單核昔酸多態(tài)性標巧位點、引物、 試劑盒及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及用于鑒定桃果實肉色（白/黃)性狀的單核巧酸多態(tài)性標記位點、引物、 試劑盒及應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 選擇是育種中最重要的環(huán)節(jié)之一，它是指在一個群體中選擇符合要求的基因型， 來進行后續(xù)的培育。但在傳統(tǒng)育種中，由于很難獲知后代的基因型，因此選擇的依據(jù)通常是 表現(xiàn)型而非基因型，運種選擇方法對質(zhì)量性狀而言一般是有效的，但對數(shù)量性狀來說，因為 其表現(xiàn)型與基因型之間缺乏明確的對應(yīng)關(guān)系，因而效率不高。此外，對于W果實性狀為目標 的果樹來說，運些性狀都有其特定的表現(xiàn)時期，通常需要度過3-5年甚至更長時間的童期， 因而選擇的時間較晚。運對于那些植株高大、占地多、生長季長的作物，特別是果樹之類的 園藝作物，顯然是非常不利的。
[000引近20年來迅速發(fā)展起來的基于DNA的分子標記技術(shù)，即"分子標記輔助選擇" (marker-assisted selection,縮寫為MAS)給育種提供了嶄新的途徑。它通過分析與目的 基因緊密連鎖的分子標記的基因型來進行育種，從而達到提高育種效率的目的。Bliss (2002)利用包括161個包括同工酶標記、抗病基因類似物標記和SSR(Simple Sequence R邱eats,簡單重復(fù)序列）標記等構(gòu)建的圖譜，將桃果實肉色標記定位在第1連鎖群的31cM 處。由于進行分子標記輔助選擇有兩個重要的前提，首先是必須得到與目標性狀緊密連鎖 的標記，即建立目標基因與分子標記的連鎖關(guān)系。其次是檢測的自動化，由于分子標記輔助 選擇要求對育種群體進行大規(guī)模檢測，因而要求檢測的方法要簡單、快速、成本低、比較準 確，W實現(xiàn)檢測過程(包括DNA的提取、分子標記的檢測、數(shù)據(jù)分析等）的自動化。但是，可W 發(fā)現(xiàn)在過去很長一段時間內(nèi)采用的分子標記，如RFLP(Rest;riction Fragment Length Polymorphism,限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性）、RAPD(random amplified polymo;rphic DM,隨機擴增多態(tài)性DNA)、AFLP和SSR等通常需要酶切或PCR后用電泳檢測分型結(jié)果，很難 實現(xiàn)運一點。
[0004] SNPs標記（single nucleotide polymo;rphisms，單核巧酸多態(tài)性）主要是指在基 因組水平上由單個核巧酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。它在基因組上分布廣泛，數(shù)量眾 多，因此很容易檢測到相對于R化？、34?0、4。1^\55財示記更連鎖的標記，且在檢測時具有高 通量、簡單、快速、高靈敏度的優(yōu)點，是進行分子標記輔助育種中最具潛力的標記。近年來， Falchi(2013)利用一個黃肉的突變體，發(fā)現(xiàn)位于Chrl的25639445-25641500bp處的 ppa006109m上存在的轉(zhuǎn)座子序列插入導(dǎo)致了果實肉色的變異。隨后，Micheletti等人 (2015)利用數(shù)量不超過9000個SNPs的忍片對1580份桃種質(zhì)進行關(guān)聯(lián)分析，得到了與果實肉 色（白/黃)性狀關(guān)聯(lián)的SNPs位于化rl (第1染色體)的26479525bp處。
[0005] 然而，現(xiàn)有的與桃果實肉色（白/黃)性狀連鎖的SS財示記距離目標基因定位距離較 遠，在雜交后代的早期鑒定中準確率較低;而現(xiàn)有的與目標性狀連鎖的SNPs標記多來自忍 片鑒定的結(jié)果，由于忍片位點較少（少于9000個），因此不能保證鑒定出的SNPs是與目標性 狀最關(guān)聯(lián)或連鎖的位點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供用于鑒定桃果實肉色性狀的單核巧酸多 態(tài)性標記位點、引物、試劑盒及應(yīng)用，該標記位點在鑒定桃果實肉色性狀時具有較高的準確 率。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：
[0008] 用于鑒定桃果實肉色性狀的單核巧酸多態(tài)性標記位點，所述的單核巧酸多態(tài)性標 記位點是桃基因組第1染色體的第24827153位核巧酸，該核巧酸為A或G。
[0009] 用于鑒定桃果實肉色性狀的PCR擴增引物對，所述引物對中的上游引物是根據(jù)桃 基因組第1染色體的第24827153位核巧酸及其上游序列進行設(shè)計，所述引物對中的下游引 物是根據(jù)第1染色體的第24827153位核巧酸的下游序列進行設(shè)計。
[0010] 所述引物對由如沈Q ID NO.2和沈Q ID NO.3所示的兩條單鏈DNA分子組成。
[0011] 用于鑒定桃果實肉色性狀的單堿基延伸引物，所述單堿基延伸引物為如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和沈Q ID NO.6所示的核巧酸序列。
[0012] 用于鑒定桃果實肉色性狀的試劑盒，所述的試劑盒包括所述的PCR擴增引物對和 所述的單堿基延伸引物。
[0013] 桃基因組第1染色體的第24827153位核巧酸的單核巧酸多態(tài)性在鑒定或輔助鑒定 桃果實肉色性狀中的應(yīng)用。
[0014] -種單核巧酸多態(tài)性標記位點在桃果實肉色性狀分子標記輔助選擇育種方面的 應(yīng)用。
[0015] 所述的單核巧酸多態(tài)性標記位點在鑒定或輔助鑒定桃果實肉色是白色性狀或是 黃色性狀中的應(yīng)用。
[0016] -種試劑盒在桃果實肉色性狀分子標記輔助選擇育種方面的應(yīng)用。
[0017] -種利用單核巧酸多態(tài)性標記位點鑒定桃果實肉色性狀的方法，包括W下步驟： [001引（l)PCR擴增：W待測桃的基因組DNA為模板，用PCR擴增引物對進行PCR擴增，獲得 PCR擴增產(chǎn)物；
[0019] (2)SAP反應(yīng):配制SAP反應(yīng)體系，加入步驟（1 )PCR擴增反應(yīng)后的反應(yīng)體系中，除去 PCR擴增反應(yīng)中未反應(yīng)的dNTP;
[0020] (3)單堿基延伸反應(yīng):配制單堿基延伸反應(yīng)體系，加入步驟(2)SAP反應(yīng)后的反應(yīng)體 系中；
[0021 ] (4)基因分型：將完成單堿基延伸反應(yīng)的產(chǎn)物進行樹脂脫鹽處理，點在忍片上，由 忍片掃描儀掃描，檢測分析，根據(jù)不同產(chǎn)物的分子量大小進行基因分型。
[0022] 本發(fā)明篩選得到桃基因組第1染色體的第24827153位核巧酸多態(tài)性標記位點，能 夠用于鑒定或輔助鑒定桃果實肉色（白/黃)性狀，在鑒定桃果實肉色（白/黃)性狀時具有較 高的準確率。
[0023] 本發(fā)明針對桃基因組第1染色體的第24827153位核巧酸多態(tài)性的特性，設(shè)計了特 定的PCR引物擴增對和單堿基延伸引物，將完成單堿基延伸反應(yīng)的的產(chǎn)物進行樹脂脫鹽處 理，點在忍片上，由忍片掃描儀掃描，進行MALDI-TOF質(zhì)譜檢測，Typer4.0軟件分析實驗數(shù) 據(jù)，根據(jù)不同產(chǎn)物的分子量大小獲得其基因分型結(jié)果。
[0024] 本發(fā)明對15個雜交群體共221份待測桃單株進行SNPs準確率的驗證，結(jié)果表明，本 發(fā)明對肉色性狀的平均準確率從73.76%提升至86.43%。運說明，利用本發(fā)明的單核巧酸 標記位點進行檢測具有簡單、快速、成本低的優(yōu)點，能夠?qū)崿F(xiàn)生產(chǎn)中大規(guī)模的應(yīng)用。
【具體實施方式】
[0025] W下結(jié)合實施例對本發(fā)明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0026] 實施例1 SNPs標記位點的獲得
[0027] 本發(fā)明W從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所桃種質(zhì)資源圃隨機獲得的129份桃種 質(zhì)為樣品，采用常規(guī)CTAB法提取樣品DNA，并通過Illumina HiSeq 2000測序儀對129份桃種 質(zhì)進行重測序，得到121加數(shù)據(jù)，平均覆蓋桃基因組89.28%，平均測序深度為4.21 X左右。 根據(jù)測序得到的50-150bp的reads，與桃參考基因組V. 1.0(http : //www. rosaceae . org/ node/355)進行比對，鑒定出4063377個SNPs,利用運些SNPs對129份種質(zhì)的表型性狀進行全 基因組關(guān)聯(lián)分析，鑒定出與桃果實肉色的有顯著關(guān)聯(lián)的SNPs位于第1染色體的第 24827153bp 處。
[0028] 實施例2利用SNP標記鑒定桃果實肉色（白/黃)性狀的方法 [00巧]1、DNA提取
[0030] 采用常規(guī)CTAB法提取待測桃樣品組織的DNA，去除RNA，DNA樣品總體積不低于15ii 1。用紫外光光度計測定DNA樣品在26化m、280皿處的0D值，計算DNA含量和OD260/28日的比值。 DNA樣品純度0〇26日/28日值應(yīng)在1.8-2.0之間，濃度稀釋至1 Ong/山。
[0031] 2、設(shè)計引物
[0032] 根據(jù)桃基因組第1染色體的第24827153位處左右各2(K)bp序列（具體的核巧酸序列 見表1)，設(shè)計引物。
[0033] 親1 SNPs妾側(cè)序列信息
[0034]
[0035] 其中，R表示A或G。
[0036] 引物由生物技術(shù)公司合成后，稀釋PCR擴增上下游引物至終濃度均為0.5咖。稀釋 單堿基延伸引物至延伸引物1、2、3終濃度分別為祉M、10咖、15咖，備用。引物序列見表2。
[0037] 表2引物序列
[00；3 引
[0039] 3、PCR反應(yīng)體系及Mass ARRAY分析
[0040] 按照SEQUEN0M-巧LEX標準操作流程進行PCR、SAP、單堿基延伸反應(yīng)，主要步驟如 下：
[0041 ] (l)PCR擴增反應(yīng)
[0042] 首先，配制PCR擴增體系，具體見表3。
[0043] 表3 Sequenom MassArray系統(tǒng)基因分型擴增PCR反應(yīng)組分
[0044]
[0045]
[0046] 其中，Primer Mix為PCR擴增上游引物和下游引物各加入0.化1。
[0047] 將上述試劑轉(zhuǎn)移到PCR管或板中，
[004引 PCR擴增程序如下：94°C 15min; 94°C 20s，56 °C30s，72°C Imin，共45個循環(huán)；72°C 3min;4°C 保存。
[0049]配置1%瓊脂糖凝膠，對PCR反應(yīng)后的產(chǎn)物進行電泳，如果條帶明亮且單一，則進行 后續(xù)試驗。
[(X)加](2)SAP(郵堿性憐酸酶)反應(yīng)
[0051] 利用該反應(yīng)除去未用盡的dNTP，首先配制反應(yīng)體系，見表4:
[0052] 表4 SAP酶促反應(yīng)相關(guān)試劑配制組分
[0化3]
[0054] 將配好的上述溶液化1加入到完成PCR反應(yīng)的PCR管或板中。按如下程序進行SAP反 應(yīng)。
[0055] SAP 反應(yīng)程序：37 °C 40min; 85 °C 5min; 4°C 保存。
[0化6] (3)單堿基延伸反應(yīng)
[0057]首先配制單堿基延伸反應(yīng)體系，見表5:
[005引表5延伸反應(yīng)相關(guān)試劑組分
[0化9]
[0060] 其中，iPLEX Extend Primer Mix為單堿基延伸引物1、2、3的混合引物，引物1、2、3 的加入濃度分別為祉M、10咖、15咖，單堿基延伸引物1、2、3的加入量相同，共0.9化1。
[0061] 然后將配好的溶液化1加入到SAP反應(yīng)后的PCR管或板中，進行延伸反應(yīng)，程序如 下：94°C 30s; 94°C 5s，（ 52 °C 5s，80 °C 5s，5個循環(huán)），共40個循環(huán)；72 °C 3min; 4°C保存。
[0062] 將完成延伸反應(yīng)的的產(chǎn)物進行樹脂脫鹽處理，點在忍片上，由忍片掃描儀掃描，進 行MALDI-T0F質(zhì)譜檢測，Typer4.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)，根據(jù)不同產(chǎn)物的分子量大小獲得其基 因分型結(jié)果。當完成延伸反應(yīng)的產(chǎn)物分子量為6853.5左右時，化rl: 24，827，153bp處為純合 位點，分型為A/A，對應(yīng)種質(zhì)的表型為果肉呈黃色。分子量為6869.5左右時，Chrl: 24，827， 153bp處為純合位點，分型應(yīng)為G/G;分子量約為6861.5時，Chrl: 24，827，153bp處為雜合位 點，分型為A/G;G/G和A/G運兩種分型對應(yīng)的種質(zhì)表型為果肉呈白色。
[0063] 實施例3 15個雜交群體利用果實肉色關(guān)聯(lián)SNP標記進行表型性狀的盲測驗證
[0064] 1、實驗材料的選擇
[0065] W鄭州果樹研究所資源圃中種植的常規(guī)桃品種為實驗材料，從中選取調(diào)查過表型 性狀的15個雜交群體共221份單株，具體見表6。
[0066] 表6供試雜交群體的名稱及群體大小信息
[0067]
[006引
[0069] 2、利用果實肉色關(guān)聯(lián)SNP標記的鑒定方法
[0070] W本發(fā)明桃基因組第1染色體的第24827153位作為核巧酸多態(tài)性標記位點，對15 個雜交群體共221份桃單株果實肉色進行盲測鑒定，具體的鑒定方法參照實施例2的方法。 同時，W現(xiàn)有的國外報道的桃基因 SNPs位點作為對照，與本發(fā)明的SNPs位點進行比較分析。
[0071] 3、雜交群體中分型結(jié)果對表型的預(yù)測能力比較
[0072] 從鑒定結(jié)果可W看出，與目前國外報道的利用約9千個SNPs進行關(guān)聯(lián)分析得到的 最連鎖SNPs(化rl: 2647952加 P)相比，本發(fā)明SNPs位點的卡方測驗P值最低，即顯著性最高 (表 7)。
[0073] 表7不同果實肉色關(guān)聯(lián)或連鎖SNPs在15個雜交群體的分型結(jié)果及卡方測驗
[0074]
[0075] 綜合比較，其準確率如表8所示，可W看出本發(fā)明在進行雜交群體的表型性狀預(yù)測 時，準確率有明顯提升，果實肉色SNPs較最近報道的其他研究平均準確率從73.76%提升至 86.43%。
[0076] 表8本發(fā)明設(shè)及的SNPs在對15個雜交群體鑒定后的表型預(yù)測能力(準確率)比較
[0077]
[0078] 綜上所述，本發(fā)明的SNPs位點能夠幫助實現(xiàn)利用桃幼苗DNA早期預(yù)測桃成齡后果 實肉色性狀的目的，該方法是利用重測序得到的400萬W上SNPs中全基因組關(guān)聯(lián)分析得到 最關(guān)聯(lián)的位點從而實現(xiàn)的，由于原始SNPs數(shù)量龐大，從而保證了得到的關(guān)聯(lián)標記關(guān)聯(lián)性高。
【主權(quán)項】
1. 用于鑒定桃果實肉色性狀的單核苷酸多態(tài)性標記位點，其特征在于，所述的單核苷 酸多態(tài)性標記位點是桃基因組第1染色體的第24827153位核苷酸，該核苷酸為A或G。2. 用于鑒定桃果實肉色性狀的PCR擴增引物對，其特征在于，所述引物對中的上游引物 是根據(jù)桃基因組第1染色體的第24827153位核苷酸及其上游序列進行設(shè)計，所述引物對中 的下游引物是根據(jù)第1染色體的第24827153位核苷酸的下游序列進行設(shè)計。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于鑒定桃果實肉色性狀的PCR擴增引物對，其特征在于，所 述引物對由如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的兩條單鏈DNA分子組成。4. 用于鑒定桃果實肉色性狀的單堿基延伸引物，其特征在于，所述單堿基延伸引物為 如SEQIDN0.4、SEQIDN0.5和SEQIDN0.6所示的核苷酸序列。5. 用于鑒定桃果實肉色性狀的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括權(quán)利要求2或3 所述的PCR擴增引物對和權(quán)利要求4所述的單堿基延伸引物。6. 桃基因組第1染色體的第24827153位核苷酸的單核苷酸多態(tài)性在鑒定或輔助鑒定桃 果實肉色性狀中的應(yīng)用。7. -種權(quán)利要求1所述的單核苷酸多態(tài)性標記位點在桃果實肉色性狀分子標記輔助選 擇育種方面的應(yīng)用。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的單核苷酸多態(tài)性標記位點在桃果實肉色性狀分子標記輔助選 擇育種方面的應(yīng)用，其特征在于，所述的單核苷酸多態(tài)性標記位點在鑒定或輔助鑒定桃果 實肉色是白色性狀或是黃色性狀中的應(yīng)用。9. 一種權(quán)利要求5所述的試劑盒在桃果實肉色性狀分子標記輔助選擇育種方面的應(yīng) 用。10. -種利用權(quán)利要求1所述的單核苷酸多態(tài)性標記位點鑒定桃果實肉色性狀的方法， 其特征在于，包括以下步驟： (1 )PCR擴增：以待測桃的基因組DNA為模板，用PCR擴增引物對進行PCR擴增，獲得PCR擴 增產(chǎn)物； (2) SAP反應(yīng):配制SAP反應(yīng)體系，加入步驟(1 )PCR擴增反應(yīng)后的反應(yīng)體系中； (3) 單堿基延伸反應(yīng)：配制單堿基延伸反應(yīng)體系，加入步驟（2)SAP反應(yīng)后的反應(yīng)體系 中； (4) 基因分型：將完成單堿基延伸反應(yīng)的產(chǎn)物進行樹脂脫鹽處理，點在芯片上，由芯片 掃描儀掃描，檢測分析，根據(jù)不同產(chǎn)物的分子量大小進行基因分型。
【文檔編號】C12Q1/68GK106048042SQ201610539560
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月9日
【發(fā)明人】王力榮, 曹珂, 朱更瑞, 方偉超, 陳昌文, 王新衛(wèi), 王琪
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所