豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的雙重實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)試劑盒及引物和探針的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明一種用于檢測(cè)豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株gB基因和gE基因的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及其專用引物、TaqMan探針。本發(fā)明建立了針對(duì)gB基因和gE基因的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，能夠快速鑒別偽狂犬病野毒株(同時(shí)含有g(shù)B基因和gE基因)與基因缺失株(僅含有g(shù)B基因)，并可對(duì)病毒拷貝數(shù)進(jìn)行精確定量。本發(fā)明的試劑盒和檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)、靈敏度高，將在豬偽狂犬病毒的檢測(cè)、毒株鑒定及疫苗生產(chǎn)中發(fā)揮作用。
【專利說(shuō)明】
豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的雙重實(shí)時(shí)黃光定量PCR檢 測(cè)試劑盒及引物和探針
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于動(dòng)物病原檢測(cè)領(lǐng)域，設(shè)及鑒別豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的方 法，特別設(shè)及一種用于鑒別豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的gB基因和巧基因的雙重實(shí)時(shí) 巧光定量PCR檢測(cè)方法及其專用引物、TaqMan探針、檢測(cè)試劑盒W及所述引物、探針在檢測(cè) 豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株中濁基因和巧基因中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由偽狂犬病毒(PseudorabiesVirusJRV)引起的B 類傳染病(0IE認(rèn)定），分布廣泛，危害嚴(yán)重，可W感染不同年齡段的豬，但W妊娠母豬和哺乳 仔豬感染最為嚴(yán)重，導(dǎo)致妊娠母豬流產(chǎn)、死胎和木乃伊胎，哺乳仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀、麻搏、衰 竭死亡，死亡率高達(dá)100%。目前，偽狂犬病已成為對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)危害最大的傳染病之一，每 年給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 偽狂犬病毒屬于瘤疹病毒科中的a瘤疹病毒亞科，基因組為雙鏈DNA分子，大小約 150kb，成熟病毒粒子攜帶50余種蛋白，其旨8、旨6、旨6、旨1、11(等毒力基因是其復(fù)制非必需基 因，其編碼的蛋白為非必需糖蛋白，缺失運(yùn)些基因后，其復(fù)制擴(kuò)增及抗原性并不受任何影 響，但毒力卻大大降低。巧基因是偽狂犬的主要毒力相關(guān)基因，也是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織所規(guī) 定基因缺失疫苗的首選缺失基因。目前，歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家應(yīng)用巧基因缺失疫苗及其配套的 鑒別診斷方法已實(shí)現(xiàn)了偽狂犬的凈化，中國(guó)也已廣泛使用巧基因缺失弱毒疫苗用于偽狂犬 的預(yù)防和控制。濁基因是偽狂犬病毒復(fù)制所必需的基因，在野毒株與基因缺失株中均存在。
[0004] 目前，國(guó)內(nèi)外常用的實(shí)驗(yàn)室診斷偽狂犬病毒的方法主要包括病毒分離、兔體接種 實(shí)驗(yàn)、抗體診斷、病原學(xué)診斷、分子生物學(xué)診斷等幾大類，其中分子生物學(xué)診斷中的實(shí)時(shí)巧 光定量PCR檢測(cè)技術(shù)W其快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)成為快速發(fā)展的檢測(cè)手段。
[0005] 實(shí)時(shí)巧光定量PCR技術(shù)（Quantitative Real-time PCR，qPCR)是 1996年由美國(guó) Appl ied Biosystems公司推出的，該技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入巧光基團(tuán)，利用巧光信 號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析[Heid CA， Stevens J,Livak KJ,Williams PM.Real time quantitative PCR.Genome Res.19960ct； 6( 10): 986-94.]。實(shí)時(shí)巧光定量PCR作為一個(gè)極有效的實(shí)驗(yàn)方法，已被廣泛地應(yīng)用于分子生 物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。與常規(guī)PCR相比該技術(shù)可快速、靈敏的檢測(cè)病毒RNA和DNAW及細(xì)菌 DNA，目前該方法已廣泛用于人類傳染病的診斷和病原定量、W及動(dòng)物病原體的檢測(cè)、畜禽 產(chǎn)品的檢驗(yàn)檢疫、生物制品的鑒定等領(lǐng)域[Jozefczuk J,Adjaye J.Quantitative real? time PCR-based analysis of gene expression.Methods Enzymol.2011;500:99-109.]。 目前針對(duì)濁基因和巧基因建立的雙重qPCR檢測(cè)方法較少，Ma等根據(jù)PRV濁和姐基因分別設(shè) 計(jì)引物和探針，建立了診斷PRV野毒株的巧光定量PCR方法，該方法對(duì)PRV野毒株具有良好的 擴(kuò)增效果，而對(duì)疫苗缺失株及其他常見豬病原的檢測(cè)均為陰性[文獻(xiàn)l:Development of real-time polymerase chain reaction assays for rapid detection and differentiation of wild-typep seudorabies and gene-deleted vaccine viruses， MaW，LagerKM，Richt JA，et al.J Vet Dia即Invest,2008,20(4):440-447.]。馬興杰等針 對(duì)gB、姐和gG建立了的鑒別診斷PRV強(qiáng)弱毒的納米PCR檢測(cè)方法并組裝了試劑盒，試驗(yàn)結(jié)果 表明，該試劑盒具有較高的靈敏性、特異性及可重復(fù)性，檢驗(yàn)結(jié)果可靠[文獻(xiàn)2:鑒別豬偽狂 犬病毒巧/gB/gG的納米PCR及巧光定量PCR方法的建立及評(píng)價(jià)，馬興杰，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院學(xué) 位論文]。雖如此，由于病毒變異的風(fēng)險(xiǎn)客觀存在，更豐富的檢測(cè)技術(shù)有助于防范病毒變異 所導(dǎo)致的檢測(cè)失利，本發(fā)明利用自主設(shè)計(jì)的引物和探針建立了豬偽狂犬病野毒株與基因缺 失株的鑒定、檢測(cè)方法，與其它學(xué)者的引物和探針具有差異性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供用于對(duì)豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的gB基因和 姐基因進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)的引物與TaqMan探針，W實(shí)現(xiàn)豬偽狂犬病野毒株與 基因缺失株的鑒別。
[0007] 本發(fā)明所提供的用于對(duì)豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的gB基因和姐基因進(jìn)行 雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)的引物為：
[000引用于檢測(cè)gB基因的上游引物(gB-F)的核巧酸序列如序列表中SED ID N0:1所示， 用于檢測(cè)濁基因的下游引物(濁-R)的核巧酸序列如序列表中SEQ ID N0:2所示；
[0009] 用于檢測(cè)巧基因的上游引物(姐-F)的核巧酸序列如序列表中SED ID N0:3所示， 用于檢測(cè)巧基因的下游引物(巧-R)的核巧酸序列如序列表中SEQ ID N0:4所示。
[0010]由上述引物衍生的引物序列也屬于本
【發(fā)明內(nèi)容】
。所述衍生序列是指在沈Q ID NO: 1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3和/或沈Q ID N0:4的基礎(chǔ)上經(jīng)過(guò)一至十個(gè)堿基的取代、缺失 或添加得到的引物序列。
[0011] 本發(fā)明所提供的用于對(duì)豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的gB基因和姐基因進(jìn)行 雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)的化qMan探針，用于檢測(cè)gB基因的化qMan探針(PRV-gB)的核巧 酸序列如序列表中SED ID NO: 5所示；用于檢測(cè)gB基因的化qMan探針(PRV-gE)的核巧酸序 列如序列表中SEQ ID N0:6所示;所述探針為經(jīng)過(guò)巧光標(biāo)記的，其5'端標(biāo)記有報(bào)告巧光基 團(tuán)，3 '端標(biāo)記有澤滅巧光基團(tuán)。
[0012] 由上述化qMan探針序列的衍生序列也屬于本
【發(fā)明內(nèi)容】
。所述衍生序列是指在SEQ ID N0:5和SEQ ID N0:6的基礎(chǔ)上，在序列的5'端和/或3'端再添加、減少一個(gè)或多個(gè)堿基得 到的序列。
[001引所述PRV-gB的報(bào)告巧光基團(tuán)為FAM，巧光澤滅基團(tuán)為TAMRA;所述PRV-巧的報(bào)告巧 光基團(tuán)為R0X，巧光澤滅基團(tuán)為B冊(cè)2。
[0014] 為防止PCR擴(kuò)增時(shí)被延伸，所述探針的3'端已經(jīng)憐酸化處理。
[0015] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供用于對(duì)豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的gB基因和 巧基因進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)的試劑盒。
[0016] 本發(fā)明所提供的實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)試劑盒，包括上述用于對(duì)豬偽狂犬病野毒 株與基因缺失株的濁基因和巧基因進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)的引物和化qMan探針。
[0017] 具體來(lái)講，所述試劑盒包括W下用于25化雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR反應(yīng)體系的試劑： 實(shí)時(shí)巧光定量PCR反應(yīng)液Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.扣L(購(gòu)于hkaRa公司），濁-F(2化 M) 0.5化，gB-R(20yM) 0.5化，gE-F(20yM) 0.5化，gE-R(20yM) 0.5化，PRV-gB (1 OiiM) 1化，PRV- 邑6(10咖）1化，尺臟-化66出0 6.5化。
[0018] 為方便檢測(cè)，所述試劑盒中還可包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，所述陽(yáng)性對(duì)照為豬偽 狂犬病野毒株基因組DNA和豬偽狂犬病毒基因缺失株基因組DNA或分別攜帶豬偽狂犬病野 毒株濁基因和巧基因的重組質(zhì)粒pGEM-gB和pGEM-gE，所述陰性對(duì)照為不含豬偽狂犬病野毒 株與基因缺失株的反應(yīng)體系，如出〇(雙蒸水、無(wú)菌去離子水等）。
[0019] 本發(fā)明的第S個(gè)目的是提供一種用上述雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)試劑盒及雙重 實(shí)時(shí)巧光定量PCR技術(shù)對(duì)豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的gB基因和巧基因進(jìn)行定性、定 量檢測(cè)的方法。
[0020] 利用本發(fā)明所提供的試劑盒對(duì)豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的gB基因和姐基 因進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)，可包括W下步驟：
[0021] 1)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：將分別攜帶豬偽狂犬病野毒株gB基因和gE基因的重組質(zhì)粒 pGEM-gB和pGEM-姐作為標(biāo)準(zhǔn)品，分別10倍梯度稀釋成1 X 108、1 X 107、1 X 106、1 X 1〇5、1 X 104、1 X 103、1 X 102、1 X 1 〇1拷貝（copi eS) /化，W不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，在上述引物 和TaqMan探針的引導(dǎo)下進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)束后，W各標(biāo)準(zhǔn)品的濃度 Log值(X軸)對(duì)其相應(yīng)Ct值(Y軸)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0022] 2)提取待測(cè)樣品的基因組DNA，W提取的基因組DNA為模板，在上述引物和化qMan 探針的引導(dǎo)下進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)；
[0023] 3)用得到的CT值或巧光信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)濁基因和巧基因定性檢測(cè)，再根據(jù)巧光 信號(hào)的強(qiáng)度和步驟1)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出待測(cè)樣品中所含豬偽狂犬病毒gB基因和巧基因的 拷貝數(shù)，實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)。
[0024] 利用W上檢測(cè)結(jié)果，本發(fā)明提供一種鑒別豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的方 法，在上述步驟后還包括：
[00巧]4)結(jié)果判定：
[0026] 結(jié)果判定方法1:陽(yáng)性對(duì)照樣品CT值<38,陰性對(duì)照樣品CT值>3別寸檢測(cè)成立，待 測(cè)樣品CT值<38時(shí)判定結(jié)果為陽(yáng)性，CT值>38時(shí)則判定結(jié)果為陰性，若樣品中檢測(cè)到豬偽 狂犬病毒的gB基因和姐基因均為陽(yáng)性，則判定樣品為豬偽狂犬病野毒株;若樣品中檢測(cè)到 濁基因?yàn)殛?yáng)性，巧基因?yàn)殛幮?，則判定樣品為豬偽狂犬病毒基因缺失株；
[0027] 結(jié)果判定方法2:根據(jù)巧光信號(hào)的變化，對(duì)待測(cè)樣品中的gB基因和巧基因進(jìn)行定性 檢測(cè)，同時(shí)出現(xiàn)gB基因和巧基因的巧光擴(kuò)增曲線判定樣品為豬偽狂犬病野毒株，只出現(xiàn)gB 基因巧光擴(kuò)增曲線判定樣品為豬偽狂犬病毒基因缺失株。
[0028] 在上述方法中，所述步驟2)中的待測(cè)樣品主要包括:血清、病毒細(xì)胞培養(yǎng)物。
[0029] 所述步驟1)和步驟2)中的25化雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR反應(yīng)體系可包括:模板化L， 實(shí)時(shí)巧光定量PCR反應(yīng)液Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.扣L(購(gòu)于hkaRa公司），濁-F(2化 M) 0.5化，gB-R(20yM) 0.5化，gE-F(20yM) 0.5化，gE-R(20yM) 0.5化，PRV-gB (1 OiiM) 1化，PRV- 姐（1〇咖）1化，RNA-free出0 6.化L。引物稀釋為20ngAiL，反應(yīng)體系中最終加量為lOng。 化qMan探針稀釋為1 Ong/jiL，反應(yīng)體系中最終加量為1 Ong。
[0030] 所述步驟1)和步驟2)中的實(shí)時(shí)巧光定量PCR反應(yīng)條件可為:先95°C預(yù)變性2min;然 后95°C變性15s，60°C退火30s，共45個(gè)循環(huán)。在每個(gè)循環(huán)的延伸結(jié)束時(shí)進(jìn)行巧光信號(hào)檢測(cè)。
[0031] 本發(fā)明提供了一種鑒別豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR 檢測(cè)試劑盒與檢測(cè)方法。本發(fā)明的試劑盒中含有兩對(duì)引物和兩條探針，引物和探針?lè)謩e針 對(duì)豬偽狂犬病病毒的濁基因和巧基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)。本發(fā)明通過(guò)建立針對(duì)濁基因和巧基因 的雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR方法，能夠鑒別偽狂犬病野毒株（同時(shí)含有g(shù)B基因和巧基因）與基 因缺失株(僅含有g(shù)B基因），并可對(duì)病毒拷貝數(shù)進(jìn)行精確定量。本發(fā)明可為疫苗生產(chǎn)過(guò)程中 的質(zhì)量監(jiān)控和合理化配苗提供有力依據(jù)，確保疫苗接種的安全性和合理性，對(duì)豬偽狂犬疫 苗的生產(chǎn)具有指導(dǎo)作用。本發(fā)明的試劑盒和檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)，將在豬偽狂犬病 毒的檢測(cè)及疫苗生產(chǎn)中發(fā)揮重要作用，應(yīng)用前景廣闊。
[0032] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
【附圖說(shuō)明】
[0033] 圖1為濁、巧基因雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)濁基因的標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線；
[0034] 圖2為濁、巧基因雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)濁基因的標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0035] 圖3為濁、巧基因雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)巧基因的標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線；
[0036] 圖4為濁、巧基因雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)巧基因的標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0037] 圖5為濁、巧基因雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)特異性實(shí)驗(yàn)的擴(kuò)增曲線；
[0038] 圖6為濁、巧基因?qū)崟r(shí)巧光定量PCR引物與探針篩選的擴(kuò)增曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見： 《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》（Sambrook，J.，Russel1，David W.， Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 3rd edit ion，2001，NY，Cold Spring Harbor)。
[0040] 所述百分比濃度如無(wú)特別說(shuō)明均為質(zhì)量/質(zhì)量(W/W，單位g/lOOg)百分比濃度、質(zhì) 量/體積(W/V，單位g/lOOmU百分比濃度或體積/體積(V/V，單位mL/lOOmU百分比濃度。
[0041] 實(shí)施例中描述到的各種生物材料的取得途徑僅是提供一種實(shí)驗(yàn)獲取的途徑W達(dá) 到具體公開的目的，不應(yīng)成為對(duì)本發(fā)明生物材料來(lái)源的限制。事實(shí)上，所用到的生物材料的 來(lái)源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可W按照實(shí)施例中的提 示替換使用。
[0042] 所用引物由華大基因公司合成，TaqMan探針由化kara公司合成。
[0043] 實(shí)施例在W本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的 操作過(guò)程，實(shí)施例將有助于理解本發(fā)明，但是本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
[0044] 實(shí)施例1、設(shè)計(jì)對(duì)豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的gB基因和姐基因進(jìn)行雙重實(shí) 時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)的引物及化qMan探針
[0045] 從NCBI的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)GenBank化t1:p://www.ncbi .nlm.nih.gov)檢索獲得豬偽狂 犬病野毒株的gB基因（GenBank號(hào):NC_006151)和巧基因（GenBank號(hào):AF207700)的序列，用 DNA Man軟件進(jìn)行比對(duì)后，根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則，分別對(duì)gB基因和巧基因各設(shè)計(jì)3對(duì)引物對(duì)用 于PCR擴(kuò)增，通過(guò)電泳結(jié)果各自篩選到引物特異性高、擴(kuò)增效果好的引物對(duì)，確定gB基因特 異性的引物對(duì)序列為自5'端第17211-17574位堿基，姐基因特異性的引物對(duì)序列為自5'端 第443-1357位堿基;在此基礎(chǔ)上再用Primer Express 6.0軟件對(duì)豬偽狂犬病野毒株與基因 缺失株在該片段范圍進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)的引物及TaqMan探針，各設(shè)計(jì)2對(duì)引物 探針，并通過(guò)單重巧光定量PCR進(jìn)行優(yōu)選，最終確定最優(yōu)的濁基因特異性的引物探針序列為 自5'端第17411-17543位堿基，姐基因特異性的引物探針序列為自5'端第1060-1143位堿 基。
[0046] 引物和探針優(yōu)選過(guò)程:分別對(duì)所設(shè)計(jì)的2對(duì)gB基因和巧基因 （gB 1、gB2; gE 1、巧2)巧 光定量引物與探針進(jìn)行單重實(shí)時(shí)巧光定量PCR，所用反應(yīng)體系與反應(yīng)條件如下：
[0047] 1)25化單重實(shí)時(shí)巧光定量PCR反應(yīng)體系可包括:模板化L，實(shí)時(shí)巧光定量PCR反應(yīng)液 Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.扣L(購(gòu)于hkaRa公司），上游引物F(20yM)0.扣L，下游引物 R(20山00.5化，探針（10咖）1化，RNA-free出08.5化。引物稀釋為20ng/iiL，反應(yīng)體系中最終 加量為lOngeTaqMan探針稀釋為lOng/jiL，反應(yīng)體系中最終加量為lOng。
[004引 2)單重實(shí)時(shí)巧光定量PCR反應(yīng)條件可為:先95°C預(yù)變性2min;然后95°C變性15s，60 °C退火30s，共45個(gè)循環(huán)。在每個(gè)循環(huán)的延伸結(jié)束時(shí)進(jìn)行巧光信號(hào)檢測(cè)。
[0049] 反應(yīng)結(jié)束后比較CT值和平臺(tái)期所能達(dá)到的擴(kuò)增值，篩選出較好的濁基因和巧基因 巧光定量引物與探針。實(shí)時(shí)巧光定量PCR擴(kuò)增曲線見圖6。
[0050] 經(jīng)過(guò)優(yōu)選，本發(fā)明確定的對(duì)豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)巧光定 量PCR檢測(cè)的引物及化qMan探針序列如下：
[0化1]濁基因上游引物（濁斗）：5'-6641'(：1'〔6口'61461〇：46646-3'（沈0 10備：1)
[0化2]濁基因下游引物（濁-1〇:5'-646616〔01；464〔641'〔46-3'（沈0 10備：2);
[0化3]巧基因上游引物（邑6斗）：5'-(：1'〔6164164〔〇：4〔44466-3'（沈0 10備：3)
[0化4]巧基因下游引物（邑6-10:5'-(：1764164〇1^'64〔614(：1'(：-3'（5邸10備:4);
[0055] gB基因 TaqMan巧光探針（PRV-gB) :5'-(FAM)TGACCCTGAACCTGACGCTGCTGGA (TAMRA)-3'（S邸 ID N0:5)
[0056] 姐基因 haMan巧光探針（PRV-gE): 5 ' -(ROX) CGCCACCTGGGACTACACGCT (BHQ2) -3 ' (沈D ID N0:6)。
[0057] PRV-gB的報(bào)告巧光基團(tuán)為FAM，巧光澤滅基團(tuán)為TAMRA;PRV-巧的報(bào)告巧光基團(tuán)為 R0X，巧光澤滅基團(tuán)為B冊(cè)2。為防止PCR擴(kuò)增時(shí)被延伸，所述探針的3'端已經(jīng)憐酸化處理。
[0058] 實(shí)施例2、用本發(fā)明的引物及TaqMan探針對(duì)豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的gB 基因和巧基因進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)
[0化9] 一、提取待測(cè)樣品的基因組DNA
[0060] 對(duì)滅活的豬偽狂犬野毒株與基因缺失株的細(xì)胞培養(yǎng)物W及收集的12份臨床疑似 血清病料提取基因組DNA，具體方法包括W下步驟：
[0061] (1)分別取20化L滅活的偽狂犬野毒株與基因缺失株細(xì)胞培養(yǎng)物W及臨床血清加 入到1.5mL離屯、管中，加入ImL DNAzol裂解液振蕩混勻，靜置10分鐘裂解；
[00創(chuàng) （2)12000rpm離屯、10分鐘，取上清約800化至新的1.5mL離屯、管中，加入500化無(wú)水 乙醇，輕輕混勻靜置5分鐘，使DNA析出；
[0063] (3) 1200化pm離屯、10分鐘，棄上清，加入80化L 75%乙醇洗涂DNA沉淀，輕輕混勻后 12000巧m離屯、5分鐘；
[0064] (4)重復(fù)上一步驟；
[0065] (5)棄上清，待離屯、管中殘留液體驚干后，加入20化無(wú)酶水溶解DM沉淀，-20°C凍 存?zhèn)溆谩?br>[0066] 二、豬偽狂犬病毒濁基因和巧基因的雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
[0067] 1、PCR擴(kuò)增豬偽狂犬病毒濁基因和巧基因
[0068] 對(duì)步驟一提取的豬偽狂犬病毒野毒株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到豬偽狂犬 病毒濁基因（引物為gB-F和濁-R)和巧基因（引物為巧-F和巧-R)的目的片段，2扣L反應(yīng)體系 如下：
[00例表1濁基因和巧基因的PCR擴(kuò)增體系 「00701
[0071] 2、標(biāo)準(zhǔn)品制備
[0072] 將純化回收的豬偽狂犬病毒濁基因和巧基因目的片段分別克隆至pGEM-T載體(購(gòu) 自Promega公司）中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒，并篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒送華大基因公司測(cè)序，驗(yàn)證質(zhì)粒 構(gòu)建知否成功。測(cè)序結(jié)果表明獲得了序列正確的分別攜帶gB基因和巧基因的重組質(zhì)粒，分 別命名為pGEM-濁和pGEM-巧。
[0073] 3、雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
[0074] 對(duì)測(cè)序正確的分別攜帶gB基因和姐基因重組質(zhì)粒pGEM-gB和pGEM-姐用化no化op 測(cè)定濃度，并計(jì)算各標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)，按照10倍梯度將gB基因和巧基因標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至1 X 1〇8、1 X 1〇7、1 X 1〇6、1 X 1〇5、1 X 1〇4、1 X 1〇3、1 X 1〇2、1 X l〇icopiesAiL，每個(gè)樣品做2個(gè)重 復(fù)，W不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，在引物和TaqMan探針的引導(dǎo)下進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)巧光定量 PCR檢測(cè)。
[0075] 雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR的反應(yīng)體系（2化L)如下：
[0076] 表2濁基因和巧基因的雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR反應(yīng)體系 r00771
[007引雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR的反應(yīng)條件為:先95°C預(yù)變性2min;然后95°C變性15s，60°C 退火30s，45個(gè)循環(huán)。
[0079] 標(biāo)準(zhǔn)品的雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR擴(kuò)增曲線如圖l(gB基因）和圖3(姐基因）所示，標(biāo) 準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線為平滑的"S"形曲線，圖中八組線條從左向右對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為IX 108、lX107、lX106、lX105、lX104、lX103、lX102、lX10lcopiesA^L。檢測(cè)結(jié)束后，W各標(biāo) 準(zhǔn)品的濃度Log值(X軸)對(duì)其相應(yīng)Ct值(Y軸)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2(gB基因） 和圖4(姐基因）所示，相關(guān)系數(shù)分別為R2 = 0.998與R2 = 0.993,誤差較小，標(biāo)準(zhǔn)曲線可用，由 標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的線性方程為：
[0080] y = -0.998X+37.806 (gB基因）和y = -0.993X+42.716 (gE基因）。
[0081 ] 4、豬偽狂犬病臨床血清病料的雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)
[0082] 用本發(fā)明建立的豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)試 劑與方法，對(duì)所收集的12份臨床疑似血清病料進(jìn)行檢測(cè)，分別W滅活的豬偽狂犬病野毒株 細(xì)胞培養(yǎng)物和基因缺失株細(xì)胞培養(yǎng)物為陽(yáng)性對(duì)照，W無(wú)酶水為陰性對(duì)照，根據(jù)gB基因和姐 基因雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)結(jié)果，對(duì)臨床樣本所感染的豬偽狂犬病毒的類型進(jìn)行判定， 并對(duì)所感染病毒的拷貝數(shù)進(jìn)行定量。
[0083] 結(jié)果如表3所示，所檢測(cè)的12份疑似血清中有2份血清判定為陰性(不含gB基因和 巧基因，即未感染豬偽狂犬病毒），10份血清判定為陽(yáng)性(感染豬偽狂犬病毒），其中4份血清 為豬偽狂犬病野毒株感染(含濁基因和巧基因），6份血清為豬偽狂犬病基因缺失株感染(僅 含濁基因，缺失巧基因）。
[0084] 表3疑似血清病料的雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)結(jié)果
[0085]
[0086]
[0087]實(shí)施例3、本發(fā)明檢測(cè)方法的特異性實(shí)驗(yàn)
[008引按照實(shí)施例2所述方法對(duì)豬攝病毒(CSFV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)提取RNA并進(jìn) 行反轉(zhuǎn)錄，對(duì)豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、鼻氣管炎病毒（IBR)直接提取DNA，同時(shí)W滅活的豬偽 狂犬病野毒株細(xì)胞培養(yǎng)物為陽(yáng)性對(duì)照，W無(wú)酶水為陰性對(duì)照，在本發(fā)明引物和化qMan探針 的引導(dǎo)下進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)，PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參照實(shí)施例2，W驗(yàn)證該 方法的特異性。
[0089] 檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，陽(yáng)性對(duì)照gB基因和姐基因的CT值分別為20/21 (< 38 )，結(jié)果 陽(yáng)性；陰性對(duì)照CT值為41/40( >38)，試驗(yàn)成立；而豬攝病毒（CSFV)、牛病毒性腹瀉病毒 (BVDV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、鼻氣管炎病毒（IBR)的CT值均>38,且未出現(xiàn)特定的擴(kuò)增曲 線，結(jié)果陰性。檢測(cè)結(jié)果表明用本發(fā)明的方法可特異性地檢測(cè)出豬偽狂犬病野毒株。
[0090] 實(shí)施例4、本發(fā)明檢測(cè)方法的靈敏度實(shí)驗(yàn)
[0091] 按照實(shí)施例2所述，將gB基因和姐基因標(biāo)準(zhǔn)品按照10倍梯度分別稀釋至IX 108、1 X 1〇7、1 X 1〇6、1 X 1〇5、1 X 1〇4、1 X 1〇3、1 X 1〇2、1 X l〇icopiesAiL，W不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作為 模板，在本發(fā)明引物和TaqMan探針的引導(dǎo)下進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)，PCR反應(yīng)體系 及反應(yīng)條件參照實(shí)施例2，W驗(yàn)證該方法的靈敏度。
[0092] 結(jié)果濁基因和巧基因的擴(kuò)增曲線如圖1和圖3所示，顯示gB基因和巧基因的雙重實(shí) 時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)均可W檢測(cè)至lXl〇icopiesAiL，靈敏度較高，與文獻(xiàn)2檢測(cè)靈敏度相 當(dāng)。
[0093] 實(shí)施例5:鑒別豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)試劑 盒
[0094] 基于實(shí)施例1和2,本發(fā)明所提供的實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)試劑盒，包括所述用于對(duì) 豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的gB基因和巧基因進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR檢測(cè)的引物 和l^gMan探針。
[00M]具體來(lái)講，該試劑盒包括W下用于25化雙重實(shí)時(shí)巧光定量PCR反應(yīng)體系的試劑:實(shí) 時(shí)巧光定量PCR反應(yīng)液Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.扣L(購(gòu)于hkaRa公司），gB-F(20yM) 0.5化，gB-R(20yM) 0.5化，gE-F(20yM) 0.5化，gE-R(20yM) 0.5化，PRV-gB (1 OiiM) 1化，PRV-gE (10咖）1化，3臟-化66出0 6.5化。
[0096] 為方便檢測(cè)，試劑盒中還可包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照為豬偽狂犬病野 毒株基因組DNA和豬偽狂犬病毒基因缺失株基因組DNA或分別攜帶豬偽狂犬病野毒株gB基 因和姐基因的重組質(zhì)粒pGEM-gB和pGEM-gE;陰性對(duì)照為不含豬偽狂犬病野毒株與基因缺失 株的反應(yīng)體系，如出〇(雙蒸水、無(wú)菌去離子水等）。
[0097] 試劑盒中各試劑的使用可參考實(shí)施例2的內(nèi)容。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于對(duì)豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的gB基因和gE基因進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)的引物，是基于豬偽狂犬病野毒株的gB基因的特異性保守序列自5'端第17411-17543位堿基和gE基因的特異性保守序列自5 '端第1060-1143位堿基作為檢測(cè)序列，通過(guò)軟 件設(shè)計(jì)得到。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的引物，其特征在于：用于檢測(cè)gB基因的上游引物(gB-F)的核苷 酸序列如序列表中SED ID ΝΟ:1所示，用于檢測(cè)gB基因的下游引物(gB-R)的核苷酸序列如 序列表中SEQ ID NO:2所示；用于檢測(cè)gE基因的上游引物(gE-F)的核苷酸序列如序列表中 SED ID NO:3所示，用于檢測(cè)gE基因的下游引物（gE-R)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 4所示。3. 用于對(duì)豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的gB基因和gE基因進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)的TaqMan探針(0F-P)，是基于豬偽狂犬病野毒株的gB基因的特異性保守序列自5 ' 端第17411-17543位堿基和gE基因的特異性保守序列自5'端第1060-1143位堿基作為檢測(cè) 序列，通過(guò)軟件設(shè)計(jì)得到。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的TaqMan探針(0F-P)，其特征在于：用于檢測(cè)gB基因的TaqMan探 針（PRV-gB)的核苷酸序列如序列表中SED ID N0:5所示，用于檢測(cè)gB基因的TaqMan探針 (PRV-gE)的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 6所示;所述探針為經(jīng)過(guò)熒光標(biāo)記的，其5 '端 標(biāo)記有報(bào)告熒光基團(tuán)，3 '端標(biāo)記有淬滅熒光基團(tuán)。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的TaqMan探針(0F-P)，其特征在于:所述PRV-gB的報(bào)告熒光基團(tuán) 為FAM，焚光淬滅基團(tuán)為TAMRA;所述PRV-gE的報(bào)告熒光基團(tuán)為R0X，焚光淬滅基團(tuán)為BHQ2;為 防止PCR擴(kuò)增時(shí)被延伸，所述探針的3'端已經(jīng)磷酸化處理。6. 用于對(duì)豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的gB基因和gE基因進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測(cè)試劑盒，包括權(quán)利要求1或2和權(quán)利要求3或4或5所述的用于對(duì)豬偽狂犬病野毒株與 基因缺失株的gB基因和gE基因進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)的引物和TaqMan探針。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述試劑盒 包括以下用于25yL雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系的試劑:實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)液Premix Ex Taq(Probe qPCR) 12 · 5yL(購(gòu)于TakaRa公司），gB-F(20yM)0 · 5yL，gB-R(20yM)0 · 5yL，gE-F (20μΜ)0·5yL，gE-R(20μΜ)0·5yL，PRV-gB(1ΟμΜ)lyL，PRV-gE(1ΟμΜ)1yL，RNA-free H20 6 · 5μ L〇8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述試劑 盒中還可包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，所述陽(yáng)性對(duì)照為豬偽狂犬病野毒株基因組DNA和豬偽 狂犬病毒基因缺失株基因組DNA或分別攜帶豬偽狂犬病野毒株gB基因和gE基因的重組質(zhì)粒 pGEM-gB和pGEM-gE，所述陰性對(duì)照為不含豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的反應(yīng)體系，如 H20(雙蒸水、無(wú)菌去離子水等）。9. 權(quán)利要求6或7或8所述的雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒的應(yīng)用，該應(yīng)用為對(duì)豬偽 狂犬病野毒株與基因缺失株的gB基因和gE基因進(jìn)行定性、定量檢測(cè)，檢測(cè)包括以下步驟： 1)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：將分別攜帶豬偽狂犬病野毒株gB基因和gE基因的重組質(zhì)粒pGEM-gB 和pGEM-gE作為標(biāo)準(zhǔn)品，分別10倍梯度稀釋成1 X 108、1 X 107、1 X 106、1 X 105、1 X 104、1 X 103、1 X 102、1 X 101拷貝（C〇pieS)AiL，以不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，在權(quán)利要求1所述引 物和權(quán)利要求2或3所述TaqMan探針的引導(dǎo)下進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)束后， 以各標(biāo)準(zhǔn)品的濃度Log值(X軸)對(duì)其相應(yīng)Ct值(Y軸)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； 2) 提取待測(cè)樣品的基因組DNA，以提取的基因組DNA為模板，在所述引物和TaqMan探針 的引導(dǎo)下進(jìn)行雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)； 3) 用得到的CT值或熒光信號(hào)的變化實(shí)現(xiàn)對(duì)gB基因和gE基因定性檢測(cè)，再根據(jù)熒光信號(hào) 的強(qiáng)度和步驟1)中的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出待測(cè)樣品中所含豬偽狂犬病毒gB基因和gE基因的拷貝 數(shù)，實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)； 所述步驟1)和步驟2)中的25yL雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系包括:模板2yL，實(shí)時(shí)熒 光定量PCR反應(yīng)液Premix Ex Taq(Probe qPCR)12.5yL，gB-F(20yM)0.5yL，gB-R(20yM)0.5y L，gE-F(20μΜ)0·5yL，gE-R(20μΜ)0·5yL，PRV-gB(ΙΟμΜ)lyL，PRV-gE(ΙΟμΜ)lyL，RNA-free H 20 6.5yL;雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)條件為:先95°C預(yù)變性2min;然后95°C變性15s，60°C 退火30s，共45個(gè)循環(huán)。10.-種鑒別豬偽狂犬病野毒株與基因缺失株的方法，在權(quán)利要求9所述步驟后還包 括： 4) 結(jié)果判定： 結(jié)果判定方法1:陽(yáng)性對(duì)照樣品CT值<38,陰性對(duì)照樣品CT值多38時(shí)試驗(yàn)成立，待測(cè)樣 品CT值<38時(shí)判定結(jié)果為陽(yáng)性，CT值多38時(shí)則判定結(jié)果為陰性，若樣品中檢測(cè)到豬偽狂犬 病毒的gB基因和gE基因均為陽(yáng)性，則判定樣品為豬偽狂犬病野毒株;若樣品中檢測(cè)到gB基 因?yàn)殛?yáng)性，gE基因?yàn)殛幮?，則判定樣品為豬偽狂犬病毒基因缺失株； 結(jié)果判定方法2:根據(jù)熒光信號(hào)的變化，對(duì)待測(cè)樣品中的gB基因和gE基因進(jìn)行定性檢 測(cè)，同時(shí)出現(xiàn)gB基因和gE基因的熒光擴(kuò)增曲線判定樣品為豬偽狂犬病野毒株，只出現(xiàn)gB基 因熒光擴(kuò)增曲線判定樣品為豬偽狂犬病毒基因缺失株。
【文檔編號(hào)】C12R1/93GK106048094SQ201610634845
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年8月3日 公開號(hào)201610634845.5, CN 106048094 A, CN 106048094A, CN 201610634845, CN-A-106048094, CN106048094 A, CN106048094A, CN201610634845, CN201610634845.5
【發(fā)明人】韓志玲, 張貴剛, 商曉桂, 郝鵬, 孔彩萍, 閆聰, 陳君彥, 劉國(guó)英, 范秀麗
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