腦膜炎奈瑟菌血清組x的新的合成寡聚體及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及合成新的高級寡聚體及其制備方法。特別地，本發(fā)明涉及腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)血清組X(下文中為Men?X)寡聚體(更特別地四聚體)的化學合成。本發(fā)明提供從使用具有特定鏈長的經純化糖的合成途徑中獲得的Men?X莢膜寡聚體，并且提供所述新的寡聚體，作為用于開發(fā)針對由于Men?X感染引起的細菌性腦膜炎的綴合物疫苗的候選物。
【專利說明】
腦膜炎奈瑟菌血清組X的新的合成真聚體及其制備方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明設及合成新的寡聚體及其制備方法。特別地，本發(fā)明設及腦膜炎奈瑟菌 (Neisseria meningitidis)血清組《（serogroup X)(下文中為Men-X)寡聚體（更特別地四 聚體)的化學合成，及其作為用于開發(fā)針對由于Men-X感染引起的細菌性腦膜炎的綴合物疫 苗的候選物的用途。
【背景技術】
[0002] 細菌性腦膜炎引起約1，70,000的年死亡數，在工業(yè)化國家中有至少5%-10%病死 率，且在發(fā)展中國家有20 %病死率。肺炎鏈球菌（Sheptococcus pneumoniae)、流感嗜血桿 菌巧aemophilus influenzae)b型化ib)和腦膜炎奈瑟菌引起全世界大多數的細菌性腦膜 炎病例。
[0003] 目前已確定了腦膜炎奈瑟菌的總共13個不同血清組（即A、B、C、D、2犯、H、I、K、L、 W135、X、Y和Z)，但感染中約90%是由血清組A、B、C、Y和W135。然而，腦膜炎奈瑟菌的血清組X (Men-X)最近逐漸成為對公共健康的實質性威脅。血清組X被報道出現在北美、歐洲、澳大利 亞及西非。
[0004] 疫苗接種被認為是控制感染性疾病擴散的最有效方式。有覆蓋腦膜炎球菌血清組 A、C、Y及W的數種腦膜炎球菌疫苗，然而目前市場中沒有可W防護由血清組X引起的腦膜炎 的許可疫苗。所W，存在開發(fā)能夠提供覆蓋血清組X的更廣泛保護的更全面疫苗的需求。
[0005] 目前開發(fā)了綴合物疫苗W提供針對多糖抗原的更強保護，其通過將弱（多糖)抗原 與載體蛋白質(優(yōu)選來自于相同的微生物)共價連接產生，從而通過T-細胞依賴性免疫應答 將所述載體的免疫屬性賦予所連接的抗原。
[0006] 寡糖或多糖合成的進步W及生物學研究中開發(fā)的新技術已經打開了糖類疫苗設 計的新途徑。近年來已制備多種有希望的基于糖類的疫苗候選物，其包括天然糖類和合成 產生的糖類兩者。
[0007] 天然糖類證明為疫苗形成中的重要組分，但其具有許多缺點。與天然糖類相關的 主要缺點是本身非常具有挑戰(zhàn)性的分離與純化。另外，任何生物污染物或殘留的工藝雜質 帶來多種質量保證問題。另外，多糖質量不一致性和多糖大小分布問題導致批次不合格。細 菌多糖在可用于綴合前需要進行修飾，導致對表位不同程度的損傷。
[000引然而，基于合成糖類的疫苗相對于天然糖類具有許多優(yōu)勢，包括其限定良好的化 學結構。任何生物污染的機會也更少，并且因此提供更好的安全譜。另外，合成分子在合成 期間可按需要進行修飾W提高在綴合期間的產率，并通過與寡糖分子連接的內置接頭(in? built linker) 使在綴合過程期間對免疫原性表位的損傷最小化。
[0009]鑒于Men-X疾病不斷提高的發(fā)病率，已經有數種方法用于制備合成可模擬天然多 糖的合成Men-X寡糖。例如，國際專利申請no. PCT/US2011/037364(題目為"Synthetic oligosaccharide for Neisseria meningitidis vaccine")公開了用于寡糖及其綴合物 的化學合成的方法。該發(fā)明還提供了用于診斷、治療和預防由腦膜炎奈瑟菌引起的感染的 免疫原性和免疫保護性組合物及其抗體。另外，題目為"Synthesis of Neisseria meningitidis X capsular polysaccharide fragments"的發(fā)表文南犬（Laura Morelli和 Luigi Lay; 2013卷，第2期，ARKIVOC)公開了S種可綴合Men-X芙膜多糖片段（capsular polysaccharide fragment)的合成。
[0010] 目前用于寡糖合成的現存系統(tǒng)設及用于合成細菌Men-x多糖的繁瑣的生產和純化 工序。運些方法或者消耗時間或者會產生不同大小寡聚體的混合物。雖然有關于連續(xù)性寡 糖制備的概括性陳述，但并沒有關于Men-X四聚體和進一步更高級Men-X寡聚體的制備的可 實現的公開。W上公開的現有技術教導了 Men-X二聚體和S聚體芙膜多糖的化學合成。它們 未公開四聚體的形成并且不能產生高產率的二聚體和=聚體。
[0011] 報道于BeiIstein J.Org.Chem.2014，10，2367-2376的S聚體綴合物不能提供良 好的免疫原性。另外，現有技術在合成起始步驟中使用-40°C用于0-叔己基二甲基氯硅烷 (0-the巧Idimethylsilyl chlo;ride，0TDS)脫保護，并且a-憐酸化需要8-9天，然而本發(fā)明 在〇°C至室溫進行并且在遠遠更短的時間內完成。另外，現有技術公開了氨化反應為24-48 小時，然而本發(fā)明需要更短的用于氨化反應的時間。
[0012]發(fā)明目的
[0013] 因此本發(fā)明的主要目的是新的Men-x芙膜寡聚體(優(yōu)選Men-x四聚體)的合成。
[0014] 本發(fā)明的另一目的是提供用于新的Men-x芙膜寡聚體(優(yōu)選Men-x四聚體)合成的 方法。
[0015] 然而本發(fā)明的另一目的是提供利用具有特定鏈長的經純化糖的合成途徑。
[0016] 然而本發(fā)明的另一目的是提供能夠用于具有增強效力的針對腦膜炎奈瑟菌的綴 合物疫苗的合成Men-x芙膜寡聚體。
[0017] 然而本發(fā)明的另一目的是提供達到純度物理化學質量標準的合成Men-x芙膜寡聚 體制備方法。
[0018] 然而本發(fā)明的另一目的是其成本效率、增強的效力和改善的保質期。
[0019] 發(fā)明概述
[0020] 因此，本發(fā)明設及新的Men-x芙膜寡聚體的合成，W及通過組合用W構建Men-x寡 糖主鏈的兩種構建單元(building block)來合成所述Men-x芙膜寡聚體的方法。所述兩種 構建單元命名為延伸單元(propagation unit)和末端單元(termination unit)。將所述延 伸單元添加至末端單元，所述末端單元在任一端終止該鏈。
[0021] 用于合成延伸單元的原料為糖單糖，包括葡糖胺鹽酸鹽，其為豐富且廉價的原料。
[0022] 在一個實施方案中，此合成的關鍵步驟為制備a或0端基異構體(anomer)，優(yōu)選糖 麟酸醋（sugar地OS地onate)的a端基異構體。
[0023] 全部合成順序在多克級(multigram)規(guī)模上進行優(yōu)化，W該方式其只在幾個步驟 內包括柱純化。該糖巧化導致與接頭部分連接的a-端基異構體和e-端基異構體的形成。該 端基異構體混合物利用柱色譜脫保護并分離，導致產生具a或巧妾頭立體化學的末端基團。 所述經純化形式通過iH-NMR分析確認。
[0024] 該二聚體通過利用偶聯試劑(如新戊酷氯(pivaloyl chloride))并隨后使用艦進 行氧化使延伸單元與末端單元相組合進行制備。為了從二聚體制備四聚體，將二聚體的保 護基團（例如乙酸醋基團)脫保護，并利用與產生二聚體相似的條件使其與延伸單元偶聯。
[0025] 該迭代的乙酸醋脫保護和偶聯將提供四聚體單元。最終步驟包括(如果需要的話） 疊氮基團向NHAc的一步轉化，隨后通過堿處理進行保護基（例如乙酸醋、芐基和饑Z)的移 除，W及氨化將提供期望的Men-X高級寡聚體，包括四聚體、五聚體、六聚體等(包含接頭）。
[0026] 本發(fā)明導致在非常短的時間段內合成所述新的高級寡聚體。
[0027] 本發(fā)明使將6C接頭與寡聚體連接成為可能，其導致通過在綴合期間提供靈活性使 空間位阻最小化。
[0028] 此外，本發(fā)明中的6C接頭與糖環(huán)直接連接，而不是在現有技術情況中通過憐酸醋 連接。如此安置接頭使其得W適當地優(yōu)化，導致免疫原性W及綴合物疫苗產率提高，并會為 該化合物賦予更好的穩(wěn)定性。
[0029] 所有使用新方法設計成用于Men-X芙膜多糖的合成的舉例說明性步驟導致寡聚體 更好的產率、增強的抗原性(如圖1所示）W及超過95%的純度(如圖7和圖10中所示）。
[0030] 附圖簡述
[0031] 圖1描述了在使用細菌多糖、帶有a接頭（1)的合成Men-X四聚體和帶有a(l-TT)接 頭的合成Men-X四聚體-TT綴合物的抑制性ELISA中抗Men-X抗體與細菌多糖結合的百分比 抑制的圖示。
[0032] 圖2描述了具有a-接頭（1)的Men-X四聚體的1歷時普。
[0033] 圖3描述了 1的"C NMR譜。
[0034] 圖 4 描述了 1 的DEPT-NMR 譜。
[0035] 圖5描述了 1 的2D COSY NMR譜。
[0036] 圖6描述了 1 的2D HSQC NMR譜。
[0037] 圖7描述了 1的HPLC色譜圖。
[003引圖8描述了具有fH妾頭（1A)的Men-X四聚體的iRMR譜。
[0039] 圖9描述了a-接頭（1A)的"C NMR譜。
[0040] 圖10描述了 1A的HPLC色譜圖。
[0041] 發(fā)明詳述
[0042] 因此，本發(fā)明設及腦膜炎芙膜寡糖(更具體地Men-X寡糖）的化學合成，其用于針對 腦膜炎奈瑟菌的綴合物疫苗的開發(fā)，腦膜炎奈瑟菌常被稱為腦膜炎球菌(meningococcus)， 其為細菌性腦膜炎及其他形式腦膜炎球菌疾病(例如腦膜炎球菌血癥(meningococcemia)) 的病原體之一。所述合成按W下步驟完成：
[0043] 1.如方案1所示，合成半縮醒(化合物10)。
[0044] 2.如方案2所示，合成延伸單元(化合物12)和末端單元(化合物14)。
[0045] 3.如方案3所示，合成高級寡聚體。
[0046] 在描述本發(fā)明優(yōu)選實施方案之前，應該理解，該發(fā)明不限于所描述的具體材料，因 為其可W變化。也應該理解，本文中使用的術語僅用于描述具體實施方案的目的，且不旨在 W任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0047] 必須注意的是，除非上下文中另有明確說明，沒有數量詞修飾的名詞表示一個/種 或更多個/種。
[004引術語"化合物(compond r及"化合物(compd r已可互換地使用。
[0049]半縮醒單元的合成：
[0050] 在本發(fā)明的一個實施方案中，方案1描述了半縮醒（10)的合成。用于合成Men-X芙 膜寡糖的原料為糖，其選自葡糖胺HC1，更具體地但不限于D(±)葡糖胺HC1化合物(化合物 2)。
[0051] 方案1.半縮醒單元(化合物10)的合成
[0052] 4-0-乙酷基-2-疊氮基-3,6-二-0-芐基-2-脫氧-a, 0-D-化喃葡萄糖
[00531
[0054] 在化晚存在下，使葡糖胺HC1經受重氮基轉移試劑(例如但不限于咪挫-1-橫酷疊 氮化物、Na2C〇3、CuS〇4.甜2〇)W獲得化合物3。用于將化合物2轉化為化合物3的有機溶劑選 自但不限于甲醇或乙醇，或其中任一種與水的組合。在〇°C至室溫，將如此獲得的化合物3與 供體基團（如對甲苯硫酪、S氣化棚乙酸（boron trifluoride diethyl etherate， BF3.0Et2)和無水二氯甲燒(DCM))反應3天至4天，W獲得化合物4。用于將化合物3轉化為化 合物4的有機溶劑選自二氯甲燒、乙臘或氯仿。在0°C至室溫，在選自甲醇或乙醇或其在水中 的混合物的組合的有機溶劑存在下，將如此獲得的化合物4經受脫乙酷化試劑（例如甲醇 鋼)3小時至7小時(優(yōu)選4小時），得到化合物5。將如此獲得的化合物5通過在有機溶劑(選自 但不限于乙臘或二氯甲燒)存在或不存在下與苯甲醒二甲縮醒[PhCH(0Me)2]、對甲苯橫酸 (p-TSA)、乙臘在室溫下反應過夜來進行亞芐基(benzyl idene)保護。該反應導致形成化合 物6,隨后使其在有機溶劑(選自但不限于二甲基甲酯胺(DMF)和二甲基亞諷)存在下經受與 芐基漠和氨氧化鋼在室溫下2小時至4小時(優(yōu)選3小時）的芐基保護。W上反應導致形成化 合物7。隨后使化合物7在有機溶劑(選自但不限于無水二氯甲燒(DCM)、氯仿、四氨巧喃)存 在下，在與S乙基硅烷化tsSiH)和S氣化棚乙酸(BF3.0Et2)在0°C下反應2小時至4小時（優(yōu) 選3小時）的同時經受區(qū)域選擇性開環(huán)，產生化合物8。使化合物8在溶劑(選自但不限于化 晚、二氯甲燒和4-二甲氨基化晚(DMAP) (cat.))存在下，在與乙酸酢(Ac2〇)在0°C下反應3.5 小時至5小時(優(yōu)選4.5小時）的同時進行乙酷化，產生化合物9。使如此獲得的化合物9在等 摩爾比例的選自但不限于丙酬:此0、二氯甲燒:出0中與N-漠代班巧酷亞胺(NBS)在0°C下反 應1小時至3小時(優(yōu)選2小時）的同時經受硫代甲苯基脫保護W形成化合物10。
[0055] 所述化合物10作為合成延伸單元(12) W及兩種末端單元（即14和14A)的共同中間 體。
[0056] 制備傳播和末端單元的示意圖在如下方案2中示出。
[0057] 方案2:延伸單元(化合物12)和末端單元(化合物14和化合物14A)的合成。
[0化引
[0059] 從方案1如此得到的化合物10經受亞憐酷化劑(phospMtylation agentK不限于 亞憐酸二苯醋化晚）W及隨后S乙胺化t3N-TEA)與出0的等摩爾混合物（1:1)在室溫下 (85% )2小時(優(yōu)選1小時），用于取代末端氨W得到化合物11，其為包含a和0二者混合物的 單體組件(monomeric block)。將如此得到的化合物11與憐酸化3P化)和乙臘在室溫下反應4 天，用于選擇性且完全地接收化合物11的a端基異構體作為化合物12。如此得到的化合物12 作為Men-X四聚體合成中的延伸單元。
[0060] 化合物9在-5°c下在四氨巧喃中在N-艦代班巧酷亞胺(NIS)和=氣甲橫酸存在下 用接頭6-(Z-氨基)-1-己醇處理1小時，得到化合物13。所述化合物13通過在室溫至50°C下 與化0Me、Me0H反應經受脫乙酷化，在連續(xù)的S個步驟中獲得末端單元。如此獲得的末端單 元通過硅膠柱色譜進行分離，導致獲得具有產生自a位的6C接頭的化合物14(Ri = -(C此） sNHCbz，R2 = H)和具有產生自0位的6C接頭的化合物14A (Ri = H，R2 = - (C出)6畑況Z)。
[0061 ]如此獲得的化合物14和14A作為寡聚體合成的末端單元。
[0062] 寡聚體合成：
[0063] -旦制備了延伸單元和末端單元，后續(xù)的寡聚體可于此后通過如下所述方法和如 方案3所示制備。
[0064] 通過使延伸單元12與末端單元14反應W生成化合物15(具有r1 = -(CH2)sN肥bz，R2= H，R3=Ac的a端基異構體)來制備二聚體。相似地，通過使延伸單元12與末端單元14A反應 W產生二聚體化合物15A(具有r1 = H，R2 = -(C此)6NHCbz，R3=Ac的0端基異構體）。上述制備 二聚體的反應如下進行:在偶聯試劑(其不限于新戊酷氯偶聯試劑)存在下，在化晚中在室 溫下進行30分鐘，隨后在-40°C下利用艦進行氧化，在化晚:此0(9.72:0.25)中，反應1.5小 時(86 % )，產生具有良好產率的二聚體化合物15和化合物15A(69 % )。
[0065] 方案3.高級寡聚體(二聚體、=聚體和四聚體)的合成
[0066]
[0067] 如此獲得的化合物15和化合物15A通過與堿(例如甲醇鋼）于甲醇中在0°C至55 °C 下反應1.5小時來脫乙酷化W分別獲得化合物16 (定量的）（具有Ri = -(C也)sNHCbz，R2 = H，R3=H的a端基異構體)和化合物16A(78%)(具有r1 = H，R2 = -(C也)6NHCbz，R3 = H的e端基異構 體)。
[0068] 此后，如此獲得的二聚體化合物(化合物16和化合物16A)利用相似的偶聯試劑和 條件再次與延伸單元12偶聯W分別產生具有高產率的S聚體化合物17(具有Ri = -(C出） sNHCbz，R2 = H，R3=Ac 的 a 端基異構體)和化合物 17A(具有 r1 = H，R2 = -(C出)sNHCbz，R3 = Ac 的 0端基異構體）。
[0069] 使所得的化合物17和化合物17A獨立地經受脫酷化試劑，分別產生化合物18(具有 Rl = -(畑2)6NHCbz，R2 = H，R3 = H的a端基異構體）和化合物18A(具有Rl = H，R2 = -(畑2) 6畑Cbz，R3 = H的0端基異構體）。
[0070] 使如此獲得的所得化合物18和18A經受迭代反應條件W獲得高級合成寡聚體(X和 XA)，其包括四聚體（1和1A)、五聚體、六聚體等，更優(yōu)選化合物19(具有Ri = -(C出)6NHCbz，R2 =H的a端基異構體)和化合物19A (具有Ri = H，R2 = - (C出)6畑Cbz的0端基異構體)的四聚體。
[0071] 使如此獲得的化合物19和19A經受：用（a)硫代乙酸和化晚在室溫下處理，導致疊 氮基團轉換為NHAc，隨后(b)乙酸醋基團脫保護，W及(C)通過氨化進行芐基和化Z脫保護， 運產生包括四聚體（1和1A)、五聚體、六聚體等的高級合成寡聚體(X和XAKMen-X寡聚體的 運兩種端基差向異構體均可通過按照上述方案推斷出。
[0072] 如此獲得的四聚體（1)和（1A)在短時間段內迅速合成。合成所述四聚體(1)和（1A) 所用時間為225小時至276小時，優(yōu)選257小時。
[0073] 如此獲得的端基異構體寡聚物（即Men-X四聚體巧日Men-X四聚體1A)中的任一種或 二者均用作用于開發(fā)針對由于Men-X感染引起的細菌性腦膜炎的綴合物疫苗的潛在候選 物。
[0074] Men-X 四聚體 1
[0078] 上述的方法詳述通過非限制性實施例舉例說明：
[007
[007
[007 實施例：
[0079] 實施例1:化合物3的合成：
[0080] 1，3,4,6-四-0-乙酷基-2-疊氮基-2-脫氧-0-化喃葡萄糖(3):
[0081]
[0082]向攬拌中的在甲醇中的葡糖胺溶液(20gm，93mmo 1)添加 IH-咪挫-1-橫酷疊氮化物 (19.3gm，llOmmol)，隨后添加無水碳酸鋼（19.7gm，186mmol)。使反應混合物在氮氣氛下在 室溫(rt)下攬拌15min。向反應混合物添加化S化.5出0(97111旨，9.3111111〇1)并在室溫下攬拌化。 在反應完成后（通過化C監(jiān)測），反應混合物通過布氏漏斗過濾。W 10%甲醇：乙酸乙醋 (200mL)洗涂固體殘留物。該粗制反應物料2-疊氮基-2-脫氧-D-葡萄糖(20g)原樣用于下一 步驟。
[008：3]向攬拌中的在[I比晚（120mL)中的2-疊氮基-2-脫氧-D-葡萄糖（20邑111，971]11]1〇1)逐滴 添加乙酸酢（80mL，776mmol)。使反應混合物在0°C攬拌化，并在室溫下攬拌化。反應完成后 (通過TLC監(jiān)測），將該反應混合物在減壓下濃縮m去除過量的化晚）。將固體殘留物W此0 (200mL)稀釋并W30%乙酸乙醋:石油酸(pet ether)(200血)抽提兩次。通過無水硫酸鋼將 有機層干燥，過濾并濃縮。經過兩步W92%產率獲得16g的純產物3。
[0084]實施例2:化合物4的合成：
[00化]4-甲基苯基3，4，6-S-0-乙酷基-2-疊氮基-2-脫氧-1-硫代-a，0-D-化喃葡糖巧 (4)：
[0086]
[0087] 巧氮氣氛h巧0"C h問攜拌中的在DCMQ.2升）中的1，3,4,6-四-0-乙酷基-2-疊氮 基-2-脫氧-D-II比喃葡萄糖(3)(120gm，321mmol)添加對甲苯硫酪(79.8gm，643mmol)。攬拌反 應混合物5min，隨后在氮氣氛下經過30min逐滴添加 BF3.0Et2( 119mL，965mmol)。使反應在室 溫下攬拌72h。在耗盡最大量原料后（通過化C監(jiān)測），將反應混合物冷卻至0°C并W化H(X)3 (1L)稀釋至抑中性。通過無水硫酸鋼將抽提的有機層干燥，過濾并在減壓下濃縮。將粗制殘 余物通過快速凝膠柱色譜純化，使用2%乙酸乙醋:石油酸用作洗脫劑W得到黃色糖漿狀化 合物（syrup compound)4,80gm，60%產率。
[008引實施例3:化合物5的合成：
[0089] 4-甲基苯基2-疊氮基-2-脫氧-1-硫代-a,0-D-化喃葡糖巧(5):
[0090]
[0091] 在氮氣氛下在0°C下，向攬拌中的MeOH( 1升）中的過乙酷化硫代糖巧4(82gm， 187111111〇1)溶液經301]1；[]1逐份添加化016(40.4肖1]1，437111111〇1)。使反應混合物在室溫下再攬拌 池。反應完成后(通過化C監(jiān)測），向反應混合物中添加乙酸，直至反應混合物的pH變?yōu)橹行浴?用乙酸乙醋(800mL)將該反應混合物抽提兩次。通過無水硫酸鋼將分離的有機層干燥，過濾 并在減壓下濃縮。llOg粗制產物直接用于下一步驟。
[0092] 實施例4:化合物6的合成：
[0093] 4-甲基苯基2-疊氮基-4,6-0-亞芐基-2-脫氧-1-硫代-a,0-D-化喃葡糖巧(6):
[0094]
[0095] 向攬拌中的乙臘（1L)中的S醇硫代糖巧5(ll〇gm，353mmol)溶液添加苯甲醒二甲 縮醒（106血，707mmol)，隨后一次性添加 PTSA(6.6gm，35.3mmol)。使反應混合物在室溫下攬 拌過夜。反應完成后(通過化C監(jiān)測），W水（1L)將反應混合物稀釋并W乙酸乙醋（1L)抽提兩 次。通過無水硫酸鋼將合并的有機層干燥，過濾并在減壓下濃縮。WDCM(500mL)將粗制物料 稀釋，隨后添加石油酸(2L)導致產物沉淀(類白色固體）。通過布氏漏斗過濾沉淀，收集淺黃 白色(buff white)殘留物并干燥。分離到lOOgm 71 %的純產物6。
[0096] 實施例5:化合物7的合成：
[0097] 4-甲基苯基2-疊氮基-4,6-0-亞芐基-3-0-芐基-2-脫氧-1-硫代-a, 0-D-化喃葡糖 巧(7):
[009引
[0099] 在氮氣氛下在室溫下，向攬拌中的DMF(300mL)中的亞芐基醇6(90gm，225mmol)溶 液添加化〇H(22gm，563mmol)，隨后添加催化量的TBAI (4. Igm，11.25mmol)。使反應混合物在 室溫下攬拌15min。隨后經30min逐滴添加芐基漠（52.2mL，450mmol)。使反應混合物在室溫 下再攬拌化。反應完成后(通過化C監(jiān)測），W冰冷的水(900mL)將反應混合物稀釋，其導致形 成固體沉淀。通過Whatman濾紙將該固體物料濾出。W水巧OOmL)洗涂該固體物料，隨后W石 油酸(450mL)洗涂兩次，在真空下干燥殘留物。W91%的產率作為純產物7獲得的lOOg淺黃 白色固體。
[0100] 實施例6:化合物8的合成：
[0101] 4-甲基苯基2-疊氮基-3,6-二-0-芐基-2-脫氧-1-硫代-a,0-D-化喃葡糖巧(8):
[0102]
[0103] 在氮氣氛下在0°C下，向攬拌中的DCM( 600mL)中的化合物7 (30gm，61.27mmo 1)溶液 添加 S乙基硅烷（1171111^，735111111〇1)。使反應混合物在0°(：下攬拌15111111，隨后逐滴添加 B的.0Et2 (11.6血，91.9mmo 1)，并使其在相同溫度下攬拌池。反應完成后，在0 °C下，該反應混 合物W飽和碳酸氨鋼溶液(300mL)稀釋，并且通過抽提分離有機層。WDCM(300mL)將水層再 抽提一次并分離。通過無水硫酸鋼將所收集的有機層干燥，過濾并在減壓下濃縮。將粗制殘 余物通過快速娃凝膠柱色譜純化，使用石油酸：乙酸乙醋（7:3)作為洗脫劑W得到2?白色 固體化合物8,產率95 %。
[0104] 實施例7:化合物9的合成：
[0105] 4-甲基苯基4-0-乙酷基-2-疊氮基-3,6-二-0-芐基-2-脫氧-1-硫代-a, 0-D-化喃 葡糖巧(9):
[0106]
[0107] 在氮氣氛下在0°C下，向攬拌中的化晚（IL)中的二節(jié)醇8(90gm，183mmol)溶液添加 乙酸酢(34.5mL，366mmo 1)，隨后添加 DMAP(cat.)。使反應混合物在室溫下再攬拌化。反應完 成后(通過化C監(jiān)測），將該反應混合物在減壓下濃縮去除過量的化晚）。將殘留物W水 (900mL)稀釋并W乙酸乙醋(900mL)抽提兩次。通過無水硫酸鋼將合并的有機層干燥，過濾 并濃縮。未經純化，獲得85g( 98 %產率)的純產物9。
[0108] 實施例8:化合物10的合成：
[0109] 4-0-乙酷基-2-疊氮基-3,6-二-0-芐基-2-脫氧-a,0-D-化喃葡萄糖（10):
[0110]
[0111] 在〇°C下，向攬拌中的丙酬:水(7:l)(240mL)中的化合物9(10gm，18.7mmol)溶液逐 份添加 NBS(13.3mL，74.9mmol)。使反應混合物在相同溫度下攬拌30min至化。反應完成后 (通過化C監(jiān)測），將該反應混合物W飽和硫代硫酸鋼（20mL)澤滅反應，并在減壓下濃縮。W DCM( 300mL)抽提反應物料3次。通過無水硫酸鋼將合并的有機層干燥、過濾并濃縮。粗制物 料利用石油酸中的10%乙酸乙醋通過二氧化娃純化W獲得作為淡黃白色固體的徑基化合 物7g，85%產率。
[0112] 實施例9:化合物12的合成：
[0113] 4-0-乙酷基-2-疊氮基-3,6-二-0-芐基-2-脫氧-a-D-化喃葡糖基氨麟酸醋（12):
[0114]
[011引將半縮醒化合物10(4.5g，10.5mmol)溶解于化晚（45mL)中，并W亞憐酸二苯醋 (14. ImL，73.7mmo 1)緩慢處理。使所得反應混合物在室溫下攬拌化。將該反應混合物在0°C 下W化3N:出0(1:1，40血)稀釋，并使其再攬拌30111111。將該反應混合物在減壓下濃縮，且然后 將其利用甲苯共蒸發(fā)（coevaporate)兩次。將殘留物W飽和化20)3(50mL)稀釋，并利用DCM (60* 2)抽提。將有機層過濾、通過無水硫酸鋼干燥并在減壓下濃縮。將殘余物通過快速凝 膠柱色譜純化，使用Me0H:DCM+l%TEA(05:95)作為洗脫劑W得到暗淡黃色糖漿狀麟酸醋 (4邑，81%)。上述獲得的麟酸醋端基異構體混合物產物(4肖，6.611111101)和催化量的麟酸在室 溫下、在無水乙臘中攬拌4天。通過在(TC下添加=乙胺(2.5mL)澤滅反應，在真空下濃縮并 W飽和化20)3(100血)稀釋，且在DCM中抽提（100mL*2)。將有機層干燥(化2S04)并在減壓下 濃縮W產生粗制產物，其利用MeOH-DCM+1 %化3N(3 :97)作為洗脫劑在快速二氧化娃上純化 W獲得作為棟色濃稠糖漿狀物的純化合物12(2g，50% )。
[0116] 實施例10:化合物14和14A的合成：
[0117] 6-(節(jié)氧幾基)氨基己基2-疊氮基-3,6-二-0-芐基-2-脫氧-a-D-化喃葡糖巧（14) 和6-(節(jié)氧幾基)氨基己基2-疊氮基-3,6-二-0-芐基-2-脫氧-0-D-化喃葡糖巧（14A):
[011 引
[0119] 4-甲基苯基-4-0-乙酷基-2-疊氮基-3，6-二-0-芐基-2-脫氧-1-硫代-a，e-D-化喃 葡糖巧（9)(6.8g，12.7mmol)、NIS(5.72gm，25.4mmol)和N-(6-?基己基）氨基甲酸節(jié)醋 (3.8gm，15.2mmo 1)溶解于THF(80mU中，攬拌并在-5 °C下在惰性氣氛中冷卻。向上述混合物 經5min逐滴添加 S氣甲橫酸(0.05mL)，并將該反應混合物在相同溫度下攬拌比。完成后，將 反應混合物W化2S2O3和化HC03的飽和溶液（各200mL)稀釋。將反應混合物W乙酸乙醋 (lOOmL)抽提S次。通過無水硫酸鋼將合并的有機層干燥，過濾并在減壓下濃縮。將粗制反 應物料進一步用于脫乙酷化。將粗制反應物料溶解于甲醇（70mL)中并在室溫下經lOmin逐 份添加化OMe(2.2gm)。在50°C下將反應混合物加熱比。完成后，將反應混合物冷卻至室溫并 WAmberlite IR120酸性樹脂中和至中性抑。將反應混合物通過Whatman濾紙過濾，并將濾 液在減壓下濃縮。將粗制產物通過快速凝膠柱色譜純化，使用15%-20%乙酸乙醋:石油酸 作為洗脫劑W得到作為黃色濃稠糖漿狀物的化合物14(2.1g，27%)和144(1.8肖，18%產 率)。
[0120] 實施例11:化合物15和15A的合成：
[0121 ] 6-(節(jié)氧幾基)氨基己基(4-〇-乙酷基-2-疊氮基-3，6-二-〇-芐基-2-脫氧-a-D-Il比 喃葡糖基憐酸醋)-(1^4)-2-疊氮基-3,6-二-0-芐基-2-脫氧-a-D-化喃葡萄糖巧，S乙錠 鹽(15)
[0122] 和
[0123] 6-(節(jié)氧幾基)氨基己基(4-〇-乙酷基-2-疊氮基-3，6-二-〇-芐基-2-脫氧-a-D-Il比 喃葡糖基憐酸醋)-(1^4)-2-疊氮基-3,6-二-0-芐基-2-脫氧-0-D-化喃葡萄糖巧，S乙錠 鹽(15A)
[0124]
[0125] a-H-麟酸醋 12 (2.87gm，4.84mmol)和醇 14 (1.5gm，2.42mmol)的混合物與無水化晚 在真空中共蒸發(fā)S次。將該混合物溶解于無水化晚(50mL)中并在氮氣氛下在室溫下逐滴添 加新戊酷氯(0.9血，lOmmol)并繼續(xù)攬拌1/2小時。將反應混合物冷卻至-40°C，經過15min添 加化晚：此〇(8mM 9.75:0.25)中的12(1.2gm，4.85mmol)溶液并攬拌化。利用化2S2O3.甜2〇水 溶液（200mL，1M)澤滅反應混合物。將反應混合物W此0(200mL)稀釋并利用DCM(300mL * 2) 抽提。通過無水硫酸鋼將分離的有機層干燥，過濾并在減壓下濃縮。粗制產物利用MeOH-DCM + l%Et3N(4: 96)作為洗脫劑在快速二氧化娃上純化W獲得作為濃稠液體的純化合物15 (2.5邑，86%)。相似地，〇-護麟酸醋12與144在相同條件下反應^69%的產率獲得15八。
[0126] 實施例12:化合物16和16A的合成：
[0127] 6-(節(jié)氧幾基)氨基己基(2-疊氮基-3,6-二-0-芐基-2-脫氧-a-D-化喃葡糖基憐酸 醋)-(1 一 4)-2-疊氮基-3,6-二-〇-芐基-2-脫氧-a-D-Ii比喃葡萄糖巧，立乙錠鹽（16)
[012引和
[0129] 6-(節(jié)氧幾基)氨基己基(2-疊氮基-3,6-二-0-芐基-2-脫氧-a-D-化喃葡糖基憐酸 醋)-(1 一 4)-2-疊氮基-3,6-二-〇-芐基-2-脫氧-0-D-II比喃葡萄糖巧，S乙錠鹽（16A)
[0130]
[0131] 將含有0.25M C曲ONa的甲醇(25mL)中的二聚體化合物15 (2.5g，2.04mmo 1)溶液在 55°C下攬拌1.化。將反應混合物冷卻至室溫并WAmberlite IR-12(KH+)樹脂中和，通過 Whatman濾紙過濾并濃縮。粗制產物利用MeOH-DCM+1%化3N(4:96)作為洗脫劑在快速二氧 化娃上純化W獲得棟色糖漿狀物的純化合物16(2.4g，定量）。相似地，使化合物15A與甲醇 鋼在相同條件下反應W78%的產率獲得16A。
[0132] 實施例13:化合物17和17A的合成：
[0133] 6-(節(jié)氧幾基)氨基己基(4-〇-乙酷基-2-疊氮基-3，6-二-〇-芐基-2-脫氧-a-D-[l比 喃葡糖基憐酸醋）-(1^4)-(2-疊氮基-3,6-二-0-芐基-2-脫氧-a-D-化喃葡糖基憐酸醋)- (1 一4)-2-疊氮基-3,6-二-0-芐基-2-脫氧-a-D-化喃葡糖巧，雙乙基錠鹽（17)
[0134]和
[OU日]6-(節(jié)氧幾基）氨基己基（4-〇-乙酷基-2-疊氮基-3，6-二-〇-芐基-2-脫氧-a-D-[l比 喃葡糖基憐酸醋）-(1^4)-(2-疊氮基-3,6-二-0-芐基-2-脫氧-a-D-化喃葡糖基憐酸醋)- (1 一4)-2-疊氮基-3,6-二-0-芐基-2-脫氧-0-D-化喃葡糖巧，雙乙基錠鹽（17A)
[0136]
[0137] a-H-麟酸醋 12 (2.55gm，4.29mmol)與醇 14 (1.7gm，1.43mmol)的混合物與無水化晚 在真空中共蒸發(fā)S次。將殘留物溶解于無水化晚(40mL)并在室溫下經lOmin逐滴添加新戊 酷氯（1.07111]^，8.581]11]1〇1)并攬拌30111；[]1。將反應混合物冷卻至-40°[，經過15111；[]1添加溶于11比 晚：水(9.75:0.25，1 OmL)中的12 (2.1 gm，8.58mmo 1，6eq.)溶液。冷卻停止并使反應混合物再 攬拌化。通過添加飽和的化2S2O3.5此0溶液（50mL)澤滅反應。將反應混合物冷卻至室溫，稀 釋于水（lOOmL)并利用DCM(400mL)抽提兩次。通過無水硫酸鋼將分離的有機層干燥，過濾并 在減壓下濃縮。殘留物使用MeOH-DCM+l%Et3N(5:96)作為洗脫劑通過快速硅膠柱色譜純 化，產出作為黃色糖漿狀物的化合物17 (1.5g，60 % )。相似地，通過a-H-麟酸醋12與16A在相 同條件下反應W88%的產率制備17A。
[013引實施例14:化合物18和18A的合成：
[0139] 6-(節(jié)氧幾基)氨基己基(2-疊氮基-3,6-二-0-芐基-2-脫氧-a-D-化喃葡糖基憐酸 醋)-(1^4)-(2-疊氮基-3,6-二-0-芐基-2-脫氧-a-D-化喃葡糖基憐酸醋)-(1^4)-2-疊氮 基-3,6-二-0-芐基-2-脫氧-a-D-化喃葡糖巧，雙乙基錠鹽（18)
[0140] 和
[0141] 6-(節(jié)氧幾基)氨基己基(2-疊氮基-3,6-二-0-芐基-2-脫氧-a-D-化喃葡糖基憐酸 醋)-(1^4)-(2-疊氮基-3,6-二-0-芐基-2-脫氧-a-D-化喃葡糖基憐酸醋)-(1^4)-2-疊氮
基-3,6-^-0-要其-9-脫窗-B-n-腫耐葡朵唐甘.抑-二7,其缺駐M ?A):
[0142]
[0143] 將甲醇（20mL)中的0.25M 邸3〇化的S聚體化合物17(1.5g，0.85mmol)在55-60°C 下攬拌化。將反應混合物在室溫下冷卻，W甲醇(20mL)稀釋，并WAmberlite IR-12(KH+)樹 脂中和，通過Whatman濾紙過濾并濃縮。粗制產物使用MeOH-DCM+1 %化3N( 5:96)作為洗脫劑 在快速二氧化娃上純化W產生作為黃色濃稠糖漿狀物的純化合物18(1.3gm，89% )。相似 地，通過與甲醇鋼在相同條件下反應W69%的產率制備化合物18A。
[0144] 實施例15:化合物19和19A的合成：
[014日]6-(節(jié)氧幾基）氨基己基（4-〇-乙酷基-2-疊氮基-3，6-二-〇-芐基-2-脫氧-a-D-[l比 喃葡糖基憐酸醋）-(1^4)-(2-疊氮基-3,6-二-0-芐基-2-脫氧-a-D-化喃葡糖基憐酸醋)- (1^4)-(2-疊氮基-3,6-二-0-芐基-2-脫氧-a-D-化喃葡萄糖基憐酸醋）-(1^4)-2-疊氮 基-3,6-二-0-芐基-2-脫氧-a-D-化喃葡糖巧，乙基錠鹽（19)
[0146]和
[0147] 6-(節(jié)氧幾基）氨基己基（4-〇-乙酷基-2-疊氮基-3，6-二-〇-芐基-2-脫氧-a-D-[l比 喃葡糖基憐酸醋）-(1^4)-(2-疊氮基-3,6-二-0-芐基-2-脫氧-a-D-化喃葡糖基憐酸醋)- (1^4)-(2-疊氮基-3,6-二-0-芐基-2-脫氧-a-D-化喃葡萄糖基憐酸醋）-(1^4)-2-疊氮 基-3，6-二-0-芐基-2-脫氧-0-D-化喃葡糖巧，乙基錠鹽（19A)
[014 引
[0149]二聚悴巧巷化甘物 i8 U . 3gm，U. Y bmmoU 與a-H-勝酸鵬 iZ U . 3gm，Z. 25mmo 1)的混 合物與無水化晚在真空中共蒸發(fā)S次。將混合物溶解于無水化晚(30mL)并在惰性氣氛中的 室溫下經lOmin逐滴添加新戊酷氯(0.65mL，5.25mmol)。將反應混合物攬拌30min。將反應混 合物冷卻至-40°0，經過15111；[]1添加11比晚：水(9.75:0.25,3111〇中的12(1.3邑111，5.251]11]1〇1)溶 液。停止冷卻并使反應混合物再攬拌化。通過添加飽和化2S2O3.5此0溶液(50mL)澤滅反應。 將反應混合物冷卻至室溫，用水稀釋（lOOmL)并通過DCM(200mL)抽提兩次。通過無水硫酸鋼 將分離的有機層干燥，過濾并在減壓下濃縮。殘留物使用MeOH-DCM+1%化3N(5:96)作為洗 脫劑通過快速硅膠柱色譜純化，W產出作為黃色半固體的化合物19(0.9g，53%)。相似地， 通過與a-H-麟酸醋12在相同條件下反應W80%的產率制備19A。
[0150] 實施例16:化合物Men-X四聚體1和1A的合成：
[0151 ] 6-(節(jié)氧幾基)氨基己基(4-0-乙酷基-2-乙酷氨基-3,6-二-〇-芐基-2-脫氧-a-D- 化喃葡糖基憐酸醋)-(1 一 4)-(2-乙酷氨基-3,6-二-0-芐基-2-脫氧-a-D-化喃葡糖基憐酸 醋）-(1 一 4)-(2-乙酷氨基-3,6-二-0-芐基-2-脫氧-a-D-化喃葡萄糖憐酸醋）-(1 一 4)-2-乙 酷氨基-3，6-二-0-芐基-2-脫氧-a-D-化喃葡糖巧，乙基錠鹽（1)
[0152]和
[0153] 6-(節(jié)氧幾基)氨基己基(4-0-乙酷基-2-乙酷氨基-3,6-二-〇-芐基-2-脫氧-a-D- 化喃葡糖基憐酸醋)-(1 一 4)-(2-乙酷氨基-3,6-二-0-芐基-2-脫氧-a-D-化喃葡糖基憐酸 醋）-(1 一 4)-(2-乙酷氨基-3,6-二-0-芐基-2-脫氧-a-D-化喃葡萄糖憐酸醋）-(1 一 4)-2-乙 酷氨基-3,6-二-〇-韋基-2-脫氧-0-D-II比喃葡糖巧，乙基饋鹽（1A)
[0154]
[0155] 在惰性氣氛下在室溫下，向攬拌中的無水化晚（lOmL)中的四聚體疊氮化合物19 (0.9g，0.4mmo 1)溶液中，經lOmin逐滴添加硫代乙酸(3.2mL，過量）。使反應混合物在相同氣 溫下攬拌過夜。反應完成后（通過化C監(jiān)測），W冰水（30mL)、隨后W飽和碳酸氨鋼溶液 (20mL)稀釋反應混合物。將反應混合物通過(70mL)DCM抽提兩次。通過無水硫酸鋼將分離的 有機層干燥，過濾并在減壓下濃縮。殘留物通過最小體積的DCM(4mL)稀釋，隨后添加石油酸 (40mL)，運導致產物固體沉淀。倒出有機層，將殘留物使用5%-10%Me0H:DCM+l%TEA作為 洗脫劑通過柱色譜純化W得到作為棟色半固體的N-乙酷基四聚體化合物。分離產率： 600111旨，45%。相似地，在化晚中使化合物194與硫代乙酸在相同條件下反應^40%的產率獲 得用NHAC替代化的化合物。
[0156] 6-(節(jié)氧幾基)氨基己基(2-乙酷氨基-3,6-二-0-芐基-2-脫氧-a-D-化喃葡糖基憐 酸醋）-(1 一 4)-(2-乙酷氨基-3,6-二-0-芐基-2-脫氧-a-D-化喃葡糖基憐酸醋）-(1 一 4)- (2-乙酷氨基-3,6-二-0-芐基-2-脫氧-a-D-化喃葡糖基憐酸醋)-(1 一 4)-2-乙酷氨基-3,6- 二-0-芐基-2-脫氧-a-D-化喃葡糖巧，乙基錠鹽6-(節(jié)氧幾基)氨基己基(2-乙酷氨基- 3,6-二-0-芐基-2-脫氧-a-D-化喃葡糖基憐酸醋)-(1 一 4)-(2-乙酷氨基-3,6-二-0-芐基- 2-脫氧-a-D-化喃葡糖基憐酸醋)-(1 一 4)-(2-乙酷氨基-3,6-二-0-芐基-2-脫氧-a-D-化喃 葡糖基憐酸醋)-(1^4)-2-乙酷氨基-3,6-二-0-芐基-2-脫氧-0-D-化喃葡糖巧，乙基 錠鹽：
[0157]
[0158] 在氮氣氛下，向攢拌中的無水甲醇（20mL)中的來自上一步驟的N-乙酷基四聚體 (600mg，0.253mmol)溶液中，經5min逐份添加化016(60〇111肖，過量）。將反應混合物加熱至60 °C，保持1.化。將反應混合物冷卻至室溫并使用Amberlite IR-120樹脂中和。將反應混合物 通過肺atman濾紙過濾并將殘留物用甲醇（50mL)洗涂2-3次。將所收集的濾液在減壓下濃 縮。將粗制反應物料使用10 % MeOH: DCM+1 % TEA作為洗脫劑通過快速凝膠柱純化W產出四 聚體徑基化合物(500mg，84%)。在相似條件下具有巧妾頭的四聚體W76%的產率脫乙酷化。
[0159] 6-氨基己基（2-乙酷氨基-2-脫氧-a-D-化喃葡糖基憐酸醋）-(1 一 4)-(2-乙酷氨 基-2-脫氧-a-D-化喃葡糖基憐酸醋）-(1 一 4)-(2-乙酷氨基-2-脫氧-a-D-化喃葡糖基憐酸 醋)-(1^4)-2-乙酷氨基-2-脫氧-a-D-化喃葡糖巧，S鋼鹽(Men X四聚體1)和6-氨基己基 (2-乙酷氨基-2-脫氧-a-D-化喃葡糖基憐酸醋)-(1 一 4)-(2-乙酷氨基-2-脫氧-a-D-化喃葡 糖基憐酸醋）-(1 一 4)-(2-乙酷氨基-2-脫氧-a-D-化喃葡糖基憐酸醋）-(1 一 4)-2-乙酷氨 基-2-脫氧-0-D-化喃葡糖巧，S鋼鹽(Men X四聚體1A):
[0160]
1234 在惰性氣氛下在室溫下，向甲醇:水，l:l(30mL)中的來自上一步驟中制備的四聚 體徑基（300mg，0.128mmo 1)溶液中，添力日Pd (0H) 2/C(20mo 1 %，600mg)。將反應混合物在氨氣 氛下W104psi攬拌15h。反應完成后(通過化C監(jiān)測），將反應混合物通過娃藻±柱床(ce 1 ite bed)過濾。將該娃藻±柱床W30mL的此0洗涂=次。將分離的濾液在減壓下濃縮。將粗制物 料通過溶劑處理純化。將殘留物通過DCM洗涂，隨后通過冷甲醇洗涂(5mL* 2)次。獲得白色 固體化合物。分離產率：120mg，86 %，冊SEC純度：98%。準確質量：1235.84。觀測質量(M- Na)-1212.34〇 2 IR: :3436，2517，1632，1383，1443，1204. 3
[016；3] 1h 醒R(500MHz，D20)S5.55-5.44(m，3H)，4.10-3.96(m，4H)，3.96-3.83(m，llH)， 3.82-3.56(m，12H)，3.50(t，J=9.8Hz，lH)，3.45-3.42(m，lH)，2.93(s，2H)，2.10-1.92(m， 12H)，1.69-1.48(m，4H)，1.43-1.27(m，4H). 4 1化 NMR(126MHz，D20)6174.5,174.4,174.2,171.0,96.4,94.4,94.3,94.1,94.0， 74.4,74.3,73.8,73.7,73.0,72.0,71.2,70.8,70.7,70.1,69.9,69.4,68.0,60.3,60.2， 60.0,53.7,53.6,53.5,53.4,39.4,28.2,26.7,25.3,24.8,22.1,22.0,21.8.
[01化]6-氨基己基（2-乙酷氨基-2-脫氧-a-D-化喃葡糖基憐酸醋）-(1 一 4)-(2-乙酷氨 基-2-脫氧-a-D-化喃葡糖基憐酸醋）-(1 一 4)-(2-乙酷氨基-2-脫氧-a-D-化喃葡糖基憐酸 醋)-(1 一4)-2-乙酷氨基-2-脫氧-a-D-化喃葡糖巧，=鋼鹽(Men X四聚體1):
[01<
[0167] 在惰性氣氛下在室溫下，向甲醇：水7:3(30mL)中的的四聚體徑基化合物（lOOmg， 0.042mmol)溶液中，添加 Pd(0H)2/C(20mol%)。將反應混合物在氨氣氛下WeOpsi攬拌化。 反應完成后(通過化C監(jiān)測），將反應混合物通過娃藻±柱床過濾。將該娃藻±柱床W30mL的 此0洗涂=次。將分離的濾液在減壓下濃縮。將粗制物料通過溶劑處理純化。將殘留物通過 DCM洗涂，隨后通過冷甲醇洗涂（5mL * 2)次。隨后將純產物通過使其與水（5mL)中的Dowex 50W Na+形式（2g)在室溫下反應化經受化離子交換。隨后將反應物料通過Whatmann濾紙過 濾。將濾液在減壓下濃縮。將粗制物料在真空下干燥化得到白色固體化合物。精確質量： 1235.28;分離產率:38mg，71 %，HP沈C純度:98 %。
[0168] IR: ：34：34，2067，16：34，1383，1221，1043.
[0169] 1h 醒 R(500MHz，D2〇):如 5.41(bs，3H)，4.39(bs，lH)，3.63-3.91(m，2W)，3.43 (bs，4H)，2.86(bs，2H)，1.94(s，12H)，1.45-1.53(m，4H)，1.25(bs，4H).
[0170] "C NMR(126MHz，D2〇):Sc 177,103.6,96.9,96.8,96.6,77.4,76.7,76.3,75.4, 74.5,73.2,72.8,72.5,71.9,62.9,62.7,62.5,57.9,55.9-56.2,41.9,30.8,29.1,27.7， 27,24.5.
[0171] 分析檢測：
[0172] 利用合成Men-X四聚體制備的寡聚體和綴合物(Men-X四聚體-IT綴合物)抗原性質 的確定
[0173] 將合成Men-X四聚體及其與破傷風類毒素的綴合物(Men-X四聚體-TT綴合物）的抗 原性與設及無抗原對照的細菌多糖在競爭性酶聯免疫測定化LISA)中進行比較。在該測定 中，將八千倍稀釋的兔抗腦膜炎奈瑟菌血清組X抗血清(228801;抓)與W10-100化g寡糖/ml 稀釋于憐酸緩沖鹽水（其含有0.1%v/v Brij 35和5%FBS)中的不同抗原（即細菌多糖、 Men-X四聚體（1和1A)和利用合成Men-X四聚體制備的綴合物（1-1T和1A-TT))在96孔微孔板 內（板A)中解育1小時。單獨的板（板B)WMen-X細菌多糖（PS)和甲基化人血清白蛋白（m- HSA)的混合物包被，并且在2-8°C下解育過夜，隨后用5%FBS封閉。對于該板B，添加來自于 板A的抗血清-抗原混合物并在37°C下解育1小時W及在室溫下解育化。將該板WpH 7.4且 含有0.1%化ij 35的憐酸緩沖鹽水洗涂。將該板在室溫下與過氧化物酶標記的抗兔IgG抗 體在PBS、0.1 %化ij 35和5 %FBS中解育60分鐘。再次洗涂該板，并在室溫下與10化1過氧化 物酶底物3，3/，5，5/ -四甲基聯苯胺-出化在乙酸鋼緩沖溶液中解育10分鐘。通過添加50iil的 2M此S化終止反應。在化ISA讀取儀(Tecan微板讀取儀)上記錄A450?？寡逯械目贵w對每種 抗原的百分比抑制如下計算：
[0174] 抑制％ = (0Dnac-0Da)/(0^ac-0Db) X 100
[0175] 其中，ODnac為無抗原對照組的光密度，0化為空白孔的光密度。受試抗原(Men-X四 聚體和Men-X四聚體-TT綴合物)和陽性對照的光密度指代為ODa。圖1中，a端基異構體（1)的 數據表示為一式=份進行的測量的平均值±50,對于0端基異構體(1A)觀測了相似的數據。
[0176] 該抑制性化ISA結果示出了與"無抗原對照組"相比的基于合成Men X四聚體的TT 綴合物的抗原性。如圖1中所示，合成Men-X四聚體及其TT綴合物能夠顯著程度地中和存在 于血清中的特異性針對腦膜炎奈瑟菌血清組X多糖的抗體(分別高達68 %和89%)并抑制抗 體與板上所包被的細菌Men-X多糖的結合。
【主權項】
1. 合成寡聚體的新方法，所述方法包括以下步驟： -合成半縮醛化合物（10)， -合成延伸單元（12)以及末端單元（14)和（14A)， -在偶聯試劑的存在下，將所述延伸單元（12)與所述末端單元（14)偶聯，并將所述延伸 單元(12)與所述末端單元(14A)偶聯，以分別產生化合物(15)和(15A)， -將所述化合物（15)和（15A)與脫乙?；噭┓磻垣@得化合物（16)和（16A)，并且隨 后利用所述偶聯試劑將化合物(16)和(16A)偶聯以獲得化合物(17)和(17A)， -在所述脫乙?；噭┖退雠悸撛噭┑拇嬖谙碌磻援a生新的高級合成寡聚體 (18、18A、19、19A、1、1A、X、XA)， -通過還原性N-乙?；噭┮徊竭€原，利用所述脫乙?；噭┻M行脫乙?；⑼ㄟ^氫 化進行芐基和Cbz的最終脫保護， 使得所述方法產生具有更好產率、高純度和增強效力的新的高級合成寡聚體(X)和 (XA)〇2. 如權利要求1所述的合成寡聚體的新方法，其中所述新的高級合成寡聚體(X)和(XA) 為四聚體(1)和(1A)。3. 如權利要求1和權利要求2所述的合成寡聚體的新方法，其中合成所述四聚體（1)和 (1A)所用時間為225小時至276小時，優(yōu)選257小時。4. 如權利要求1和權利要求2所述的合成寡聚體的新方法，其中通過氫化對化合物（1) 進行所述最終脫保護所需的時間為10小時至15小時，且對于化合物（1A)為6小時至8小時。5. 如權利要求1所述的合成寡聚體的新方法，其中所述半縮醛化合物（10)通過以下合 成： a. 使化合物(2)的糖經受重氮基轉移試劑和隨后乙?；垣@得化合物(3)， b. 使化合物(3)與供體基團反應以獲得化合物(4)， c. 使所述化合物(4)在有機溶劑中與脫乙酰化試劑反應以獲得化合物(5)， d. 使所述化合物(5)經受亞芐基保護，產生化合物(6)， e. 使所述化合物(6)經受芐基保護以獲得化合物(7)， f. 使如此獲得的所述化合物(7)經受區(qū)域選擇性亞芐基開環(huán)試劑以獲得化合物(8)，使 其經受?；噭┮垣@得化合物(9)， g. 使所述化合物(9)在0°C至室溫下經受硫代甲苯基脫保護以獲得半縮醛化合物（10)。6. 如權利要求1所述的合成寡聚體的新方法，其中所述延伸單元（12)通過以下合成:使 所述半縮醛化合物（10)經受亞磷?；噭┮垣@得化合物11，使其經受端基異構化以獲得化 合物12。7. 如權利要求1所述的合成寡聚體的新方法，其中所述末端單元（14、14A)通過以下合 成： -使化合物9經受糖苷化反應，產生接頭連接以獲得化合物13， -使所述化合物13與脫乙?；噭┓磻⒔浭芡ㄟ^已知方法的純化以獲得化合物14和 14A〇8. 如權利要求1所述的合成寡聚體的新方法，其中所述偶聯試劑選自：吡啶存在下的新 戊酰氯、1-金剛烷酰氯。9. 如權利要求1、5和7中所述的合成寡聚體的新方法，其中所述脫乙?；噭┻x自：甲 醇鈉、乙醇鈉。10. 如權利要求1所述的合成寡聚體的新方法，其中所述最終脫保護試劑選自：Pd(OH)2-H2、披 Pd 碳-H2。11. 如權利要求5所述的合成寡聚體的新方法，其中所述糖為葡糖胺(2)，更具體地但不 限于D( ±)葡糖胺HC1化合物(2)。12. 如權利要求5所述的合成寡聚體的新方法，其中所述重氮基轉移試劑選自：1H-咪 唑-1 -磺酰疊氮化物、三氟甲磺酰疊氮化物(Tf N3)。13. 如權利要求5所述的合成寡聚體的新方法，其中所述亞芐基保護通過與例如苯甲醛 二甲基縮醛[PhCH(OMe)2]、苯甲醛的試劑反應獲得。14. 如權利要求5所述的合成寡聚體的新方法，其中所述芐基保護通過與例如芐基溴、 氫氧化鈉的試劑反應獲得。15. 如權利要求5所述的合成寡聚體的新方法，其中所述區(qū)域選擇性開環(huán)試劑選自三乙 基硅烷(Et3SiH)、BF 3.OEt2、硼烷四氫呋喃復合物(BH3.THF)和三氟甲磺酸銅Cu(0Tf) 2的組 合。16. 如權利要求5所述的合成寡聚體的新方法，其中所述酰化試劑為吡啶中的乙酸酐 (Ac20)、4-二甲基氨基吡啶(DMAP)。17. 如權利要求5所述的合成寡聚體的新方法，其中所述硫代甲苯基脫保護通過與例如 N-溴代琥珀酰亞胺(NBS)、N-碘代琥珀酰亞胺(NIS)、三氟甲磺酸銀(AgOTf)的試劑反應獲 得。18. 如權利要求6所述的合成寡聚體的新方法，其中所述亞磷?；瘎┻x自：亞磷酸二苯 酯吡啶、三氯化磷、咪唑、氯代亞磷酸水楊酯、磷酸。19. 通過如權利要求1所述方法制備的新的高級合成寡聚體，其中所述新的高級合成寡 聚體(X)和(XA)為具有較高純度和增強效力的合成莢膜寡聚體。20. 如權利要求1和權利要求19所述的新的合成寡聚體，其中所述新的高級合成寡聚體 (X)為具有高于95%純度和增強效力的四聚體(1)，其具有以下結構式：21. 如權利要求1和權利要求19所述的新的合成寡聚體，其中所述新的高級合成寡聚體 (XA)為具有高于95%純度和增強效力的四聚體(1A)，其具有以下結構式：22. 如權利要求20和21所述的新的寡聚體，其中所述新的高級合成寡聚體（1)和（1A)通 過所述接頭與糖環(huán)直接連接。23. 如權利要求19至22所述的新的寡聚體（1)和（1Α)，其中所述寡聚體能夠原樣使用或 以衍生化形式使用或與載體蛋白質綴合使用以形成針對由于腦膜炎奈瑟菌 (N. meningitidis)血清組X之腦膜炎的疫苗。
【文檔編號】C07H1/02GK106061986SQ201580010063
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2015年2月24日
【發(fā)明人】達溫德·吉爾, 基肖爾·哈拉萊, 馬諾伊·庫馬爾·奇卡拉
【申請人】默沙東和惠康基金會合資的希勒曼實驗室私人有限公司