具有增加的酶活性的新型細(xì)胞色素p450多肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及包含與SEQ ID NO:1至少80%相同的氨基酸序列或由該氨基酸序列構(gòu)成的分離的P450酶，其中所述序列包含在對(duì)應(yīng)于位置225的位置處的蘇氨酸和/或在對(duì)應(yīng)于位置289的位置處的天冬氨酸突變。本發(fā)明還涉及包含編碼所述酶的序列的分離的核酸，包含所述核酸的載體，和含有所述核酸或所述載體的宿主細(xì)胞。還提供了用于制備所述酶的方法和使用在本發(fā)明中表征的酶或宿主細(xì)胞產(chǎn)生類固醇激素前體的方法。
【專利說(shuō)明】具有増加的酶活性的新型細(xì)胞色素 P450多化
[0001 ]本發(fā)明設(shè)及具有增加的酶活性的細(xì)胞色素 P450單加氧酶。
[0002] 哺乳動(dòng)物線粒體P450構(gòu)成細(xì)胞色素的一個(gè)小家族，其在線粒體內(nèi)執(zhí)行特定的反應(yīng) 并在大量疏水化合物的代謝中發(fā)揮重要作用。例如，P450cUbeta和P450C11AS(由CYP11B1 和CYP11B2基因編碼）分別執(zhí)行糖皮質(zhì)激素和鹽皮質(zhì)激素生物合成的最后一步。 P450cllbeta是一個(gè)經(jīng)典的類固醇lie徑化酶，其將11脫氧皮質(zhì)醇轉(zhuǎn)變成氨化可的松，而 P450C11AS通過(guò)S個(gè)連續(xù)的步驟催化脫氧皮質(zhì)酬轉(zhuǎn)變成醒固酬。CYP27A1是線粒體內(nèi)P450的 另一個(gè)例子，其是固醇27-徑化酶和維生素025徑化酶。最后，最具代表性的線粒體P450是 P450SCC(側(cè)鏈切割酶），由CYP11A1基因編碼，其切割膽固醇側(cè)鏈，從而通過(guò)兩個(gè)連續(xù)的徑基 化和最終的切割將膽固醇轉(zhuǎn)變成孕締醇酬。P450SCC通過(guò)將固醇轉(zhuǎn)變成類固醇，執(zhí)行類固醇 生物合成的第一個(gè)關(guān)鍵步驟。
[0003] P450催化大量底物的區(qū)域、化學(xué)和立體特異性氧化的能力，反映了它們的生物學(xué) 作用，使它們成為生物技術(shù)應(yīng)用中的重要候選物。特別地，類固醇激素被廣泛用作抗炎、避 孕和抗增殖藥物。在哺乳動(dòng)物中，運(yùn)些類固醇的合成開(kāi)始于膽固醇向孕締醇酬轉(zhuǎn)變的側(cè)鏈 切割反應(yīng)。孕締醇酬作為基礎(chǔ)用于生產(chǎn)進(jìn)一步的類固醇激素，例如氨化可的松，并且由于它 可W從廉價(jià)的底物例如膽固醇及其植物來(lái)源類似物進(jìn)行大規(guī)模工業(yè)轉(zhuǎn)化，因此獲得了極大 的關(guān)注。然而，膽固醇成為孕締醇酬的側(cè)鏈切割反應(yīng)是整個(gè)類固醇過(guò)程中的限制性步驟。在 哺乳動(dòng)物中，它是由膜結(jié)合的CYP11A1酶催化的。
[0004] 然而，由于多種原因，P450的生物技術(shù)和工業(yè)使用是難W實(shí)現(xiàn)的，并且不令人滿 意。線粒體P450使用由兩種蛋白（即鐵氧還蛋白還原酶(FdxR)和鐵氧還蛋白（Fdxl)，也稱為 腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白還原酶(AdR)和腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白（Adx))構(gòu)成的特殊電子傳遞 者鏈。在體內(nèi)自然狀態(tài)下，F(xiàn)dxR從NADPH獲得電子，而Fdx 1將電子從FdxR運(yùn)送到線粒體P450。 已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了一種體外系統(tǒng)，其中FdxR處于催化濃度(0.5山〇而Fdxl處于飽和濃度（10山〇。 為了使運(yùn)種體外系統(tǒng)有效，電子必須適當(dāng)?shù)亓飨颍╢ luxed) P450。
[0005] 為了嘗試克服運(yùn)些困難，一些作者使用可變的較鏈或連接子序列融合了 P450SCC (或P450C1 Aeta)、Fdxl和FdxR運(yùn)S個(gè)膚。即使運(yùn)種S重融合產(chǎn)生了有功能的蛋白質(zhì)，但是 其效力與"真實(shí)的（bona fide)"多膚相比要低，并且不能夠工業(yè)規(guī)模使用。而且，線粒體環(huán) 境難W在微生物重組系統(tǒng)中被模擬。例如，P450SCC多膚能夠被適當(dāng)?shù)仂攵ǖ浇湍傅木€粒 體。然而，由于線粒體中不存在底物和/或P450SCC的不當(dāng)折疊或祀定，所祀定的多膚不能夠 將固醇變成孕締醇酬。
[0006] 不同的重組系統(tǒng)被用來(lái)從植物固醇產(chǎn)生生物合成的孕締醇酬。例如，在酵母釀酒 酵母（Saccharomyces cerevisiae)中開(kāi)發(fā)了一種生物合成系統(tǒng)。在運(yùn)個(gè)系統(tǒng)中，P450scc與 FdxR和Fdxl-起被祀定在線粒體外部的質(zhì)膜上，并且在該膜上遵循固醇途徑來(lái)生產(chǎn)固醇。 此外，P450cUbeta可W和Fdx和FdxRl-起被祀定到線粒體上，在那里它可W將11-脫氧皮 質(zhì)醇轉(zhuǎn)變成皮質(zhì)醇。在巨大芽抱桿菌(Bacillus megaterium)中開(kāi)發(fā)出了一種生物轉(zhuǎn)化系 統(tǒng)。在運(yùn)個(gè)系統(tǒng)中，膽固醇能夠被成熟形式的P450SCC、Fdxl和FdxRl轉(zhuǎn)變成孕締醇酬。生物 合成仍然是工業(yè)規(guī)模下最有吸引力的技術(shù)，因?yàn)榈孜锟蒞通過(guò)宿主作為可溶性分子從簡(jiǎn)單 的碳源制造，從而避免了使用去污劑的負(fù)擔(dān)。
[0007] 最近，人們已經(jīng)做出努力W產(chǎn)生新的具有改進(jìn)特征的P450SCC多膚。例如，已經(jīng)創(chuàng) 制了攜帶K193E突變的重組P450SCC突變體。運(yùn)種突變體比重組的野生型多膚可溶性更好， 因此較不容易聚集。因此，使用運(yùn)種突變體可W獲得更高的表達(dá)水平，而不會(huì)改變其酶特 征。然而，仍然需要具有增加的酶活性的改進(jìn)P450SCC多膚，W允許優(yōu)化類固醇激素的生產(chǎn)， 特別是適合于工業(yè)化過(guò)程。
[000引本發(fā)明人開(kāi)發(fā)了一種攜帶特定突變的新型P450SCC多膚。運(yùn)種突變體在將底物轉(zhuǎn) 變成類固醇激素的方面顯示了出人意料的改善的酶活性。
[0009] 因此，本發(fā)明設(shè)及一種新的分離的P450酶，其包含與SEQ ID NO: 1至少80%相同的 氨基酸序列或者由該氨基酸序列構(gòu)成，其中所述序列包含在對(duì)應(yīng)于位置225的位置處的蘇 氨酸和/或在對(duì)應(yīng)于位置289的位置處的天冬氨酸。在一些實(shí)施方案中，該新型P450酶與SEQ ID NO: 1 至少85%、90%、95%、98%或99%相同。
[0010] 本發(fā)明還設(shè)及一種分離的核酸，其包含編碼所述酶的核巧酸序列或者由編碼所述 酶的核巧酸序列構(gòu)成，并設(shè)及包含與表達(dá)調(diào)控序列操作連接的所述核酸的載體，和包含所 述核酸或所述載體的宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞是例如微生物。
[0011] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種遺傳工程化的微生物，其能夠?qū)⒌孜镛D(zhuǎn)變 成類固醇激素前體。該底物可W是，例如具有脂肪族側(cè)鏈的多環(huán)、不飽和一元醇，例如膽固 醇、膽固醇類似物或膽固醇衍生物。該遺傳工程化的微生物包含，例如，編碼本發(fā)明表征的 新型P450酶的核酸，和任選的編碼腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白（Adx)的核酸序列和/或編碼腎上 腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白還原酶(AdR)的核酸序列。
[0012] 在另一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了一種用于制備本發(fā)明表征的P450酶的體外方法， 所述方法包括如下步驟：
[0013] a)在適合于獲得P450酶表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞;和
[0014] b)回收所表達(dá)的酶。
[0015] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明表征的P450酶用于產(chǎn)生類固醇激素前體。
[0016] 本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)及用于產(chǎn)生類固醇激素前體的方法，包括如下步驟：
[0017] a)提供表達(dá)本發(fā)明所表征的P450酶的微生物，
[0018] b)在允許該P(yáng)450酶表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述微生物，
[0019] C)在允許微生物從所述底物產(chǎn)生類固醇激素前體的條件下，使在步驟b)獲得的微 生物培養(yǎng)物與選自下組的底物接觸:具有脂肪族側(cè)鏈的多環(huán)和不飽和一元醇，例如膽固醇、 膽固醇類似物和膽固醇衍生物，和
[0020] d)回收所產(chǎn)生的類固醇激素前體。
[0021] 本發(fā)明還設(shè)及用于產(chǎn)生類固醇激素前體的方法，例如體外方法，包括如下步驟：
[0022] a)在允許所述底物被轉(zhuǎn)變成類固醇激素前體的條件下，使本發(fā)明所表征的P450酶 與分離的腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白（Adx)多膚、分離的腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白還原酶(AdR)多 膚和選自下組的底物接觸:具有脂肪族側(cè)鏈的多環(huán)和不飽和一元醇，例如膽固醇、膽固醇類 似物和衍生物，和
[0023] b)回收所獲得的類固醇激素前體。
[0024] 類固醇激素被廣泛用作抗炎、避孕和抗增殖藥物。本發(fā)明能夠用于生產(chǎn)類固醇激 素前體，并幫助合成用于人類的類固醇激素。類固醇激素前體，例如孕締醇酬，作為基礎(chǔ)用 于生產(chǎn)進(jìn)一步的類固醇激素，例如氨化可的松，并且由于它可W進(jìn)行工業(yè)大規(guī)模轉(zhuǎn)化，因此 獲得了極大的關(guān)注。
[00劇發(fā)明詳述
[0026] 酶
[0027] "分離的"酶或多膚，其意指所述酶或多膚不再處原始表達(dá)它的生物體內(nèi)的天然環(huán) 境下。當(dāng)設(shè)及酶或多膚時(shí)，"純化的"意思是所指分子在基本上不存在相同類型的其它生物 大分子的條件下存在。如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"純化的"意思是存在按重量計(jì)至少75%的，按 重量計(jì)至少85%的，按重量計(jì)至少95%的，或按重量計(jì)至少98%的相同類型的生物大分子。
[0028] 術(shù)語(yǔ)"細(xì)胞色素 P450酶"或'中450酶"是指能夠催化某些反應(yīng)的單加氧酶，例如在下 列文獻(xiàn)中綜述的那些酶:化n Bogaed et曰1，2011，陽(yáng)BS J.278(2):206-221或者Urlacher and Girhard,2011,Trends in Biotechnology 30(1) :26-36,或者在網(wǎng)站 dmelson. uthsc. edu/切toch;romeP450 .html。作為運(yùn)種野生型P450酶的一個(gè)實(shí)例，序列SEQ ID N0:4代表了牛(Bos tau;rus)CYPllAl的成熟形式。包含轉(zhuǎn)運(yùn)膚（transit P邱tide)的牛 CYP11A1的完整序列在UniProtKB/Swiss-Prot數(shù)據(jù)庫(kù)中被稱作P00189(最后序列更新：1986 年7月21日）。
[0029] 本發(fā)明中表征的細(xì)胞色素 P450酶在其各自的原始宿主中可W是膜結(jié)合的（不溶 的）或細(xì)胞質(zhì)的（可溶的）。作為一個(gè)非限制性實(shí)例，例如，P450scc(SEQ ID N0:4)催化具有 脂肪族側(cè)鏈的多環(huán)和不飽和一元醇例如膽固醇、膽固醇類似物及其衍生物的側(cè)鏈切割反 應(yīng)，使之變成孕締醇酬或其它類固醇激素前體和衍生物。
[0030] 本發(fā)明人開(kāi)發(fā)了一種具有改善的酶活性的序列SEQ ID N0:1的新型P450酶。與SEQ ID N0:4(在位置225處具有R并且在位置289處具有N的野生型SCC酶）相比，該氨基酸序列 SEQ ID N0:1包含兩個(gè)突變:在對(duì)應(yīng)于序列SEQ ID N0:4的位置225的位置處精氨酸成為蘇 氨酸的突變，和在對(duì)應(yīng)于序列SEQ ID N0:4的位置289的位置處天冬酷胺成為天冬氨酸的突 變。
[0031] 在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明表征的新型P450酶顯示單加氧酶活性，其催化膽固 醇轉(zhuǎn)變成孕締醇酬。在一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，該新型P450酶顯示的單加氧酶活性是序列 沈Q ID NO:4的P450酶的至少80%或者更多，特別地，至少85%、90%、95%、100%、125%、 150%、175%、200%、225%、250%、275%，更特別地至少300%或者更多。
[0032] 本發(fā)明表征的分離的P450酶包含與SEQ ID NO: 1至少80%相同的氨基酸序列或者 由與SEQ ID NO: 1至少80%相同的氨基酸序列構(gòu)成，其中所述序列包含在對(duì)應(yīng)于位置225的 位置處的蘇氨酸和/或在對(duì)應(yīng)于位置289的位置處的天冬氨酸。在一些實(shí)施方案中，該新型 P450酶與沈Q ID N0:1 至少85%、90%、95%、98%或99%相同。
[0033] 通過(guò)向編碼該酶的核酸序列中取代、缺失或插入一個(gè)或多個(gè)密碼子導(dǎo)致該酶的氨 基酸序列中的改變，由此可W在氨基酸序列中引入變異。氨基酸取代可W是保守的或不保 守的。在一些實(shí)施方案中，取代是保守取代，其中一個(gè)氨基酸被另一個(gè)具有相似結(jié)構(gòu)和/或 化學(xué)性質(zhì)的氨基酸取代。
[0034] "保守的氨基酸取代"是其中一個(gè)氨基酸殘基被另一個(gè)具有化學(xué)性質(zhì)(例如電荷或 疏水性)相似的側(cè)鏈R基的氨基酸殘基取代的氨基酸取代。大體上，保守氨基酸取代不會(huì)實(shí) 質(zhì)性改變蛋白質(zhì)的功能特性。具有化學(xué)性質(zhì)相似的側(cè)鏈的氨基酸組的實(shí)例包括1)脂肪族側(cè) 鏈:甘氨酸，丙氨酸，鄉(xiāng)氨酸，亮氨酸和異亮氨酸;2)脂肪族-徑基側(cè)鏈:絲氨酸和蘇氨酸;3) 含酷胺側(cè)鏈:天冬酷胺和谷氨酷胺;4)芳香族側(cè)鏈:苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸；5)堿性側(cè) 鏈:賴氨酸，精氨酸，和組氨酸;6)酸性側(cè)鏈:天冬氨酸和谷氨酸;和7)含硫側(cè)鏈:半脫氨酸和 甲硫氨酸。保守氨基酸取代組是:鄉(xiāng)氨酸-亮氨酸-異亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，賴氨酸-精 氨酸，丙氨酸-鄉(xiāng)氨酸，谷氨酸-天冬氨酸，W及天冬酷胺-谷氨酷胺。
[0035] 例如，與SEQ ID N0:1至少80%相同的氨基酸序列可W是在特定氨基酸殘基處具 有至少一個(gè)取代的多膚。在一些實(shí)施方案中，與SEQ ID NO: 1至少80%相同的氨基酸序列與 序列沈Q ID N0:1 具有至少大約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 的氨基酸序列同一性。氨基酸序 列同一性被定義為，在比對(duì)序列并引入缺口（如果必要的話）W實(shí)現(xiàn)最大的序列同一性百分 比之后，并且不將任何保守取代考慮作為序列同一性的一部分，在與SEQ ID NO: 1至少80% 相同的序列中與參考序列SEQ ID NO: 1中的氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比。序列 同一性可W在至少80%相同的序列的全長(zhǎng)上，在參考序列的全長(zhǎng)上，或在兩者上進(jìn)行確定。 氨基酸序列同一性的百分比可W如下地進(jìn)行計(jì)算，即根據(jù)化edleman-Wunsch比對(duì)算法沿著 它們的全長(zhǎng)進(jìn)行成對(duì)全局比對(duì)，W發(fā)現(xiàn)兩個(gè)序列的最佳對(duì)齊方式（包括缺口），例如使用 Needle,并使用BL0SUM62矩陣，缺口開(kāi)放罰分為10,缺口延伸罰分為0.5。
[0036] 在包含與SEQ ID NO: 1至少80%相同的氨基酸序列或者由與SEQ ID NO: 1至少 80%相同的氨基酸序列構(gòu)成的P450酶中，與SEQ ID NO: 1相比的氨基酸修飾通常位于不會(huì) 顯著破壞酶的生物活性的位置。確實(shí)，與SEQ ID NO: 1至少80%相同的細(xì)胞色素 P450氨基酸 序列展現(xiàn)出與序列SEQ ID NO: 1的多膚至少相同的生物活性。
[0037] "相同的生物活性"可W指示相同的生物學(xué)功能。因此，與序列SEQ ID NO: 1的多膚 具有相同生物學(xué)活性的多膚可W是，例如，具有單加氧酶活性的多膚。確定酶的單加氧酶活 性的技術(shù)是技術(shù)人員眾所周知的。作為一個(gè)非限制性實(shí)例，例如，與序列SEQ ID N0:1的多 膚具有相同生物學(xué)活性的多膚可W是如下的多膚，其能夠催化具有脂肪族側(cè)鏈的多環(huán)和不 飽和一元醇例如膽固醇、膽固醇類似物和衍生物的側(cè)鏈切割反應(yīng)，從而變成孕締醇酬或其 他類固醇激素前體和衍生物。在運(yùn)種情況下，化合物的催化活性能夠在體外（如Woods, S.T.,J.Sadleir,et al.(1998)"Expression of catalytically active human cytochrome p450scc in Escherichia coli and mutagenesis of isoleucine-462； Arch Biochem Biophys 353( 1): 109-15所示）或體內(nèi)（如Dupo;rt ,C. ,R. Spagnoli ,et al. (1998)^'Self-sufficient biosynthesis of pregnenolone and progesterone in engineered yeast.";化t Biotechnol 16(2): 186-9所示）由本領(lǐng)域的技術(shù)人員通過(guò)例如 實(shí)施例1中所述的實(shí)驗(yàn)方案容易地進(jìn)行評(píng)估。
[0038] 通常，催化活性可W在體外轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中進(jìn)行測(cè)試，其中150mM肥PES緩沖液被調(diào)節(jié) 到pH 7.4并含有0.05 %吐溫-20和ImM MgCl2，其被用作反應(yīng)緩沖液。1單位葡萄糖-6-憐酸 脫氨酶和5mM作為底物的葡萄糖-6-憐酸，可用作NADPH再生體系。通常，CYP11A1、Adx和AdR 的濃度分別可為化M、20yM和0.5咖，或者0.25iiM、5iiM和0.125測(cè)。溶解于45%2-徑丙基-0-環(huán) 糊精中的20測(cè)膽固醇可W用作CYP11A1的底物。通常，將樣品預(yù)熱到37°C，并通過(guò)添加 NADPH 至終濃度為lOOyM來(lái)啟始反應(yīng)。混合物可在37°C伴隨攬拌溫育30s。通過(guò)將樣品在水中煮沸 30s來(lái)終止反應(yīng)。為了能夠在240nm下進(jìn)行光度檢測(cè)，可使用來(lái)自諾卡氏菌(Nocardia spec) 的膽固醇氧化酶將類固醇轉(zhuǎn)變成其3-酬-A 4衍生物。通常，向樣品添加20iU膽固醇氧化酶 溶液(5mg膽固醇氧化酶和5mg化-馨合劑溶解在含有0.05%吐溫-20的5ml 50mM皿陽(yáng)S緩 沖液中，pH 7)。在37°C溫育化之后，可向反應(yīng)混合物中添加11-脫氧皮質(zhì)酬(D0C)，作為內(nèi)部 標(biāo)準(zhǔn)，隨后用等體積的乙酸乙醋萃取2次。蒸發(fā)后，將萃取物溶解在乙臘/水中。
[0039] 催化活性還可W在體內(nèi)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中測(cè)定，其中300yM膽固醇向孕締醇酬的轉(zhuǎn)變通 常在24h后通過(guò)HPLC進(jìn)行評(píng)估。巨大芽抱桿菌可W被培養(yǎng)在含有l(wèi)Oiig/ml四環(huán)素的TB培養(yǎng)基 中，37°C，180巧m震蕩?？赏ㄟ^(guò)添加溶于ImL水的0.25g木糖誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，隨后再添加溶于 2-徑丙基-0-環(huán)糊精中的底物。
[0040] 可W將序列沈Q ID NO: 1與和沈Q ID NO: 1至少80%相同的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。 因?yàn)檫\(yùn)兩條序列具有高百分比同一性，所W它們大部分的氨基酸是相同的。因此，可W用如 下的方式為兩條序列定義氨基酸編號(hào)，使位于兩條序列中具有相同編號(hào)的位置處的氨基酸 有至少80%是相同的（如果有必要，引入缺口 W實(shí)現(xiàn)最大的序列同一性百分比）。在本文的 上下文中，序列SEQ ID NO: 1的"對(duì)應(yīng)于位置X的位置"是指在與SEQ ID NO: 1至少80%相同 的序列中帶有所述編號(hào)X的位置。因此，序列SEQ ID N0:1可W被當(dāng)作"參考序列"，用于在同 與SEQ ID NO: 1至少80%相同的氨基酸序列進(jìn)行的比對(duì)中對(duì)氨基酸位置進(jìn)行編號(hào)，其方式 使得位于兩條比對(duì)序列"對(duì)應(yīng)位置"處的氨基酸有至少80%是相同的。
[0041] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明表征的分離的P450酶包含與SEQ ID NO: 1至少80%相 同的氨基酸序列或者由與SEQ ID NO: 1至少80%相同的氨基酸序列構(gòu)成，其中所述序列同 時(shí)包含在對(duì)應(yīng)于位置225的位置處的蘇氨酸和/或在對(duì)應(yīng)于位置289的位置處的天冬氨酸。
[0042] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明表征的P450酶包含選自下組的序列或由選自下組的 序列構(gòu)成：56910^:1、56910^:2和沈〇10^:3。
[0043] 在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明表征的P450酶由序列SEQ ID NO: 1構(gòu)成。
[0044] 本發(fā)明表征的酶可W包含一個(gè)或多個(gè)標(biāo)簽，其可W方便其純化。例如，標(biāo)簽可W是 聚組氨酸(聚-His)標(biāo)簽。
[0045] 產(chǎn)生酶的核酸、載體、宿主細(xì)胞和方法
[0046] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明表征了一種分離的核酸，其包含編碼本發(fā)明表征的 P450酶的序列或者由編碼本發(fā)明表征的P450酶的序列構(gòu)成。
[0047] 本發(fā)明表征的分離的核酸，也稱作多核巧酸，可W是DNA或RNA分子，其編碼在"酶" 部分定義的P450酶，同時(shí)考慮到遺傳編碼的簡(jiǎn)并性。分離的核酸可W通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員 眾所周知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)獲得，例如通過(guò)體外DNA擴(kuò)增或聚合，體外基因合成，寡核巧酸連接，或 通過(guò)運(yùn)些技術(shù)的組合。
[0048] 本發(fā)明表征的核酸有利地處于分離或純化的形式。術(shù)語(yǔ)"純化的"和"分離的"具有 與如上定義相同的含義。
[0049] 本領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)理解，在一些情況下產(chǎn)生具有在天然核巧酸分子中非天然存 在的密碼子的編碼多膚的核巧酸分子可能是有利的。例如，特定原核生物或真核生物宿主 偏好的密碼子可W被選擇用于提高重組多膚表達(dá)率。
[0050] 本發(fā)明表征的核酸還可W包含編碼標(biāo)簽、載體蛋白、信號(hào)膚的序列或非轉(zhuǎn)錄或翻 譯的序列，其提高分子的表達(dá)或穩(wěn)定性。
[0051] 本發(fā)明表征的核酸可用于在合適的表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生重組P450酶。術(shù)語(yǔ)"表達(dá)系統(tǒng)" 意指在合適的條件下的宿主細(xì)胞和相容載體，例如對(duì)于表達(dá)由該載體攜帶并且被引入到該 宿主細(xì)胞內(nèi)的外來(lái)核酸編碼的蛋白質(zhì)是合適的。
[0052] 通常，核酸可W包含在任何合適的載體內(nèi)。
[0053] 因此，在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明表征了一種載體，其包括如上面定義的并且與表 達(dá)調(diào)控元件可操作連接的核酸，和一種含有所述核酸或所述載體的宿主細(xì)胞。
[0054] 術(shù)語(yǔ)"載體"、"克隆載體"和"表達(dá)載體"意思是如下的攜載工具(vehicle)，通過(guò)它 能夠?qū)NA或RNA序列(例如外來(lái)基因）引入到宿主細(xì)胞中，從而轉(zhuǎn)化該宿主并促進(jìn)所引入序 列的表達(dá)(例如轉(zhuǎn)錄和翻譯）。
[0055] 可W使用任何表達(dá)載體，例如質(zhì)粒、粘粒、附加體(邱isome)、人工染色體、隧菌體 或病毒載體。質(zhì)粒的實(shí)例包括含有復(fù)制原點(diǎn)的復(fù)制質(zhì)粒，或整合質(zhì)粒，例如pUC、pcDNA、pBR 等。
[0056] 載體的其他實(shí)例包括用于動(dòng)物細(xì)胞的載體，例如pAGE107(Miyaji H et al.1990)、pAGE103(Mizukami T et al.1987)、pHSG274(Brady G et al.1984)、pKCR(0' 化re K et al.l981)、pSG化eta d2-4-(Miyaji H et al.l990)等。
[0057] 病毒載體的實(shí)例包括腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、瘤疹病毒和AAV載體。重組病毒可W通 過(guò)本領(lǐng)域已知的技術(shù)產(chǎn)生，例如通過(guò)轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞或通過(guò)用輔助質(zhì)粒或病毒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。病 毒包裝細(xì)胞的典型實(shí)例包括PA317細(xì)胞、PsiCRIP細(xì)胞、GPenv+細(xì)胞、293細(xì)胞等。用于產(chǎn)生運(yùn) 種復(fù)制缺陷型重組病毒的詳細(xì)方案可W在例如W0 95/14785、W0 96/22378、US 5,882,877、 US 6,013,516、US 4,861，719、US 5,278,056和WO 94/19478中發(fā)現(xiàn)。
[0058] 表達(dá)載體可W包含一個(gè)功能表達(dá)盒，例如含有與表達(dá)調(diào)控序列可操作連接的編碼 本發(fā)明表征多膚的核酸序列的表達(dá)盒。
[0059] "表達(dá)調(diào)控序列"是指對(duì)多膚表達(dá)和任選地對(duì)其調(diào)節(jié)而言必需的元件。表達(dá)調(diào)控序 列可W包括例如啟動(dòng)子序列，用于起始和終止翻譯的信號(hào)，W及用于調(diào)節(jié)翻譯的合適區(qū)域， 例如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子等，W導(dǎo)致或指導(dǎo)所述多膚的表達(dá)。
[0060] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明表征的載體還包含標(biāo)記基因，例如使之能夠在被轉(zhuǎn)化 生物體和不含有所轉(zhuǎn)染的外來(lái)DNA的生物體之間進(jìn)行選擇的基因。標(biāo)記基因可W是賦予對(duì) 抗生素的抗性的基因。
[0061] 根據(jù)一個(gè)具體的實(shí)施方案，本發(fā)明表征的載體可W進(jìn)一步包含編碼腎上腺皮質(zhì)鐵 氧還蛋白（Adx)的核酸序列和/或編碼腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白還原酶(AdR)的核酸序列。Adx 和AdR是P450酶的氧化-還原配偶體(0巧do-reduction partner)。
[00創(chuàng) "AdR"是指腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白還原酶化C: 1.18.1.6)或腎上腺皮質(zhì)-NADP+還 原酶，該酶已知是線粒體細(xì)胞色素 P450電子傳遞系統(tǒng)的第一個(gè)組分，并參與所有類固醇激 素的生物合成。
[0063] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述AdR酶選自下組：來(lái)自粟酒裂殖酵母 (Schizosaccharomyces pombe)或來(lái)自釀酒酵母的AR(由arhl基因編碼的NADPH:腎上腺皮 質(zhì)鐵氧還蛋白還原酶化C=1.18.1.6))，和來(lái)自大腸桿菌巧scherichia coli)的FNR(由巧r 基因編碼的鐵氧還蛋白-NADP還原酶化C=1.18.1.2))。
[0064] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，AdR酶是來(lái)自牛的AdR(在UniProt邸/Swiss-Prot中被 稱作P08165,最后更新：1998年7月15日）。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述AdR的蛋白序列 是SEQ ID NO: 7。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述AdR的蛋白序列是SEQ ID NO: 7的變異 體，只要保持其生物活性即可。
[0065] "Adx"的意思是腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白或鐵氧還蛋白1，該蛋白憑借其將電子從腎 上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白還原酶轉(zhuǎn)移到CYP11A1的活性而為人所知。
[0066] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述Adx蛋白選自下組:來(lái)自哺乳動(dòng)物來(lái)源的Fdx，來(lái)自 粟酒裂殖酵母的化plfd，和來(lái)自釀酒酵母的化hi。
[0067] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，Adx蛋白是來(lái)自牛的Adx(在UniProtKB/Swiss-Prot中 被稱作P00257,最后更新：1989年7月1日）。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述Adx的蛋白序 列是SEQ ID N0:8。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述Adx的蛋白序列是SEQ ID N0:8的變 體，只要保持其生物活性即可。
[0068] 本發(fā)明表征的載體或核酸能夠用于根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的技術(shù)轉(zhuǎn)化宿主細(xì) 胞。所述載體插入到宿主細(xì)胞中可W是瞬時(shí)的或穩(wěn)定的。
[0069] 載體還可W含有編碼特定信號(hào)的序列，其觸發(fā)所翻譯的蛋白質(zhì)分泌或者氣祀定到 細(xì)胞室或細(xì)胞器。運(yùn)些不同的控制信號(hào)可W根據(jù)宿主細(xì)胞進(jìn)行選擇，并可W插入到能夠在 宿主細(xì)胞中自我復(fù)制的載體中，或者插入到整合在所述宿主基因組中的載體中。
[0070] 宿主細(xì)胞可W是原核生物或真核生物的宿主細(xì)胞，包括但不僅限于細(xì)菌，酵母，植 物細(xì)胞，動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞和哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括可W商業(yè)獲得的細(xì)胞系。在一些實(shí)施方 案中，表達(dá)宿主細(xì)胞是大腸桿菌、乳桿菌化actobaci 11 i)、芽抱桿菌(Baci 1 lus)，特別是巨 大芽抱桿菌，益生菌（probiotic bacteria)，己斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)，釀酒酵 母，昆蟲(chóng)細(xì)胞，植物細(xì)胞，COS細(xì)胞和CH0細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是原核細(xì)胞，特 別是細(xì)菌細(xì)胞。在另一個(gè)特殊的實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是真核細(xì)胞，例如酵母細(xì)胞，例如釀 酒酵母的細(xì)胞。
[0071] 常用的表達(dá)系統(tǒng)包括細(xì)菌宿主細(xì)胞和質(zhì)粒載體，昆蟲(chóng)宿主細(xì)胞和桿狀病毒 (Baculovirus)載體，和哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞和載體。具體的實(shí)例包括大腸桿菌，巨大芽抱桿 菌，克魯維酵母化luyveromyces)或釀酒酵母，哺乳動(dòng)物細(xì)胞系（例如，Vero細(xì)胞，C冊(cè)細(xì)胞， 3T3細(xì)胞，COS細(xì)胞等），W及原代或已建立的哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物(例如，從淋己母細(xì)胞、成 纖維細(xì)胞、胚胎細(xì)胞、上皮細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等產(chǎn)生的）。實(shí)例還包括小鼠 SP2/0- Agl4細(xì)胞(ATCC C化1581)，小鼠 P3X63-Ag8.653細(xì)胞(ATCC C化1580)，C冊(cè)細(xì)胞，其中二氨葉 酸還原酶基因（也稱為可冊(cè)R基因是有缺陷的（Urlaub G et al;1980)，大鼠 YB2/ 3HL. P2. G11.16Ag. 20細(xì)胞(ATCC CRL1662，也被稱為"YB2/0細(xì)胞"），等等。
[0072] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明表征的細(xì)胞已經(jīng)被本文提供的核酸和/或載體轉(zhuǎn)染、 感染或轉(zhuǎn)化。因此，本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)及含有本文所述核酸和/或載體的宿主細(xì)胞，W及運(yùn)些 宿主細(xì)胞的后代和/或衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，宿主細(xì)胞是遺傳工程化的微生物。
[007引如本文所使用的，"微生物"可W是大腸桿菌、地衣芽抱桿菌（Bacillus licheniformis)、巨大芽抱桿菌（Bacillus megaterium)、枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis)、乳酸克魯維酵母化luyveromyces lactis)、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)或粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe)。
[0074]如Woods,S.T.,J.Sadleir,et al.(1998)化xpression of catalytically active human cytochrome p450scc in Escherichia coli and mutagenesis of isoleucine-462 .Arch Biochem Biophys 353(1): 109-15)所示，在大腸桿菌中表達(dá)成熟形 式的人P450scc，W提供人類酶的更便利來(lái)源，并能夠用定點(diǎn)誘變進(jìn)行結(jié)構(gòu)-功能研究。運(yùn)種 表達(dá)系統(tǒng)能夠產(chǎn)生比先前已經(jīng)從胎盤(pán)線粒體中分離的更大量的活性細(xì)胞色素。將所表達(dá)的 P450SCC純化到接近均質(zhì)，并顯示具有與從人類胎盤(pán)純化的酶相當(dāng)?shù)拇呋再|(zhì)。成熟形式的 人類腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白也在大腸桿菌中表達(dá)，并支持膽固醇側(cè)鏈切割活性，其Vmax與 使用牛腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白觀察到的相同，但具有更高的Km。人P450SCC中，Ile-462突變 為L(zhǎng)eu導(dǎo)致W膽固醇為底物的催化速率常數(shù)化cat)降低，對(duì)22R-徑基膽固醇的Km增加，但不 影響20a-徑基膽固醇的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。
[00巧]如Dupo;rt,C. ,R.Spagnoli,et al. (1998)(Self-sufficient biosynthesis of pregnenolone and progesterone in engineered yeast.Nat Biotechno1 16(2):186-9) 所示，在釀酒酵母中復(fù)制類固醇合成途徑的前兩個(gè)步驟。固醇生物合成的工程化通過(guò)破壞 del1:a 22-去飽和酶基因并引入擬南芥(Arabidopsis thaliana)的delta 7-還原酶活性并 且共表達(dá)牛側(cè)鏈切割細(xì)胞色素 P450、腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白和腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白還原 酶進(jìn)行，其導(dǎo)致從簡(jiǎn)單的碳源生物合成孕締醇酬。在額外共表達(dá)人泌-徑基類固醇脫氨酶/ 異構(gòu)酶之后，孕締醇酬被進(jìn)一步代謝為孕酬。類固醇的形成似乎與酵母的固醇生物合成相 偶聯(lián)。
[0076] 在Szczebara'F.M.,C.Chandelier,et al.(2003)(Total biosynthesis of hydrocortisone from a simple carbon source in yeast；Nat Biotechno1 21(2):143- 9)中，氨化可的松，哺乳動(dòng)物的主要腎上腺糖皮質(zhì)激素和類固醇藥物合成的重要中間體，被 報(bào)道由重組釀酒酵母菌株從簡(jiǎn)單的碳源產(chǎn)生。人工和完全自給自足的生物合成途徑設(shè)及13 個(gè)工程化基因，其被組裝并在單一酵母菌株中表達(dá)。內(nèi)源的固醇生物合成被改道 (rerouted),從而產(chǎn)生相容的固醇W用作該途徑異源部分的底物。生物合成設(shè)及8種哺乳動(dòng) 物蛋白（成熟形式的CYP11A1、腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白（ADX)和腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白還原 酶(ADR);線粒體形式的ADX和〔￥?1181;30-冊(cè)〇、〔￥?1741和〔￥?2141)。優(yōu)化設(shè)及調(diào)節(jié)兩個(gè)線 粒體系統(tǒng)，和破壞與ATF2、GCY1和YPR1基因產(chǎn)物相關(guān)的不想要的副反應(yīng)。氨化可的松是所產(chǎn) 生的主要類固醇。此項(xiàng)工作證實(shí)了將一個(gè)復(fù)雜的生物合成途徑從高等真核生物轉(zhuǎn)移到微生 物中的可行性。
[0077] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，微生物是巨大芽抱桿菌，尤其是被稱作巨大芽抱桿菌 MS941的菌株。表述"巨大芽抱桿菌MS941菌株"是指在Wittchen and Meinhar化，1995,Appl Microbiol Biotechnol.42:871-877中指稱的菌株，并且其來(lái)自于DSM319菌株（Deutsche Stammsammlung von Mikroorg曰nismen und Zellkulturen)。
[0078] 先前所述的使用大腸桿菌的系統(tǒng)和使用巨大芽抱桿菌的系統(tǒng)是兩種能夠在體外 用大腸桿菌或在細(xì)胞內(nèi)用巨大芽抱桿菌實(shí)現(xiàn)固醇和固醇衍生物轉(zhuǎn)變的系統(tǒng)。運(yùn)些技術(shù)能夠 評(píng)估P450SCC和底物一起發(fā)揮功能的能力。兩種技術(shù)均需要溶解底物的有效方法，從而使它 們能夠?yàn)槊杆?。運(yùn)種溶解在工業(yè)水平上(大體積)會(huì)成為挑戰(zhàn)，無(wú)論是在財(cái)政上還是在科 學(xué)方面。
[0079] 第=種生物體釀酒酵母在運(yùn)個(gè)方面是特別有利的生物體;它的大量發(fā)酵可W在立 方米或更高水平下被良好地控制，并且其具有從簡(jiǎn)單碳源，例如葡萄糖和/或乙醇，生產(chǎn)類 固醇如孕締醇酬的強(qiáng)大能力，從而避免了去污劑或助溶化學(xué)劑如e-環(huán)糊精的使用（參考上 文：Duport,C.,R.Spagnoli,et al.(1998)；Szczebara,F.M.,C.Chandelier,et al. (2003))。為了允許在體內(nèi)合成類固醇，經(jīng)由固醇生物合成產(chǎn)生與P450SCC相容的固醇。
[0080]因?yàn)獒劸平湍赴l(fā)酵可W在大規(guī)模下被良好控制，向合適的途徑定向（routed for) 為菜油固醇或其它作為底物描述的固醇的釀酒酵母中引入新近描述的P450SCC cDNA，在適 當(dāng)電子載體的存在下，可成為用于產(chǎn)生類固醇的有用工具(asset)。運(yùn)種重組的生物體可用 于評(píng)估如本文所述的新型P450SCC cDNA。
[0081 ]因此，在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，微生物是釀酒酵母。
[0082] 術(shù)語(yǔ)"遺傳工程化的"微生物是指任何通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的遺傳工程化技 術(shù)進(jìn)行了修飾的微生物。關(guān)于與特定微生物相關(guān)的方法，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可W求助于參 考手冊(cè)，例如用于酵母的"酵母遺傳學(xué)方法"--實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)（"Methods in yeast genetics''一A laboratory course manual)，M Rose,F Winston和P Hieter. 198頁(yè).Cold Spring 化rbor Laboratoir Press,Cold Spring 化rbor,New 化rk.1990.ISBN 0-87969- 354-1。
[0083] 除非另外指出，否則運(yùn)些技術(shù)是生物信息、細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn) 基因生物學(xué)、微生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)領(lǐng)域中的常規(guī)技術(shù)，它們?cè)诒绢I(lǐng)域的技術(shù)范圍之 內(nèi)。運(yùn)些技術(shù)在文獻(xiàn)中有全面的解釋。
[0084] 如本文所使用的，"遺傳工程化技術(shù)"是指如下的技術(shù)，其允許本領(lǐng)域技術(shù)人員表 達(dá)或過(guò)表達(dá)本領(lǐng)域已知的基因表達(dá)。感興趣基因的表達(dá)或過(guò)表達(dá)可W通過(guò)如下的方法實(shí) 現(xiàn):通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何轉(zhuǎn)化技術(shù)，將包含運(yùn)種感興趣基因的外源核酸序列引 入到細(xì)胞或微生物中。
[0085] 術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)化"或"轉(zhuǎn)染"的意思是，將"外來(lái)"（即異源)基因、DNA或RNA序列引入到宿 主細(xì)胞中，從而使宿主細(xì)胞會(huì)表達(dá)所引入的基因或序列，W產(chǎn)生期望的物質(zhì)，通常是由所引 入基因或序列編碼的蛋白或酶。宿主細(xì)胞的轉(zhuǎn)染可W用任何標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)執(zhí)行，例如化學(xué)轉(zhuǎn)化、 電穿孔、憐酸巧沉淀或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)化技術(shù)還包括，例如，PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù) (Barg et al,2005,Microbial Processes and Products 165-184)。
[0086] "外源核酸序列"是指如下的核酸序列，其在所考慮的微生物中不是原始和/或不 是天然表達(dá)的，或者其表達(dá)方式不是該微生物的天然菌株中原始和/或天然表達(dá)的（例如， 在表達(dá)水平方面），并且使用它轉(zhuǎn)化所述微生物，W便獲得如上所述的遺傳工程化微生物。 在具體的實(shí)施方案中，外源核酸序列來(lái)自于除所考慮微生物之外的另一物種(例如，微生物 或生物體的另一個(gè)種）。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，外源序列來(lái)自于相同的微生物。
[0087] 所述外源核酸序列可W編碼感興趣的蛋白質(zhì)，例如細(xì)胞色素 P450和氧化-還原配 偶體AdR和Adx，并且表述"外源DNA"能夠指示每個(gè)單獨(dú)的序列，或者包括含有每個(gè)單獨(dú)序列 的完整序列。作為一個(gè)非限制性實(shí)例，通過(guò)本領(lǐng)域已知的技術(shù)，例如通過(guò)同源重組，將所述 外源核酸序列整合到所述微生物的基因組中。
[0088] 在一個(gè)方面中，本發(fā)明提供了遺傳工程化的微生物，其能夠?qū)⑦x自下組的底物轉(zhuǎn) 變成類固醇激素前體:具有脂肪族側(cè)鏈的多環(huán)和不飽和一元醇，例如膽固醇、膽固醇類似物 和衍生物，其中所述微生物包含在本發(fā)明中表征的核酸，和任選的編碼Adx的外源核酸序列 和/或編碼AdR的外源核酸序列。
[0089] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，遺傳工程化的微生物是釀酒酵母。
[0090] 在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，遺傳工程化的微生物是巨大芽抱桿菌，特別是巨大 芽抱桿菌MS941菌株。
[0091] 本發(fā)明還設(shè)及用于制備本發(fā)明所表征的P450酶的體外方法，所述方法包括如下步 驟：
[0092] a)在適合獲得P450酶表達(dá)的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞;和
[0093] b)回收所表達(dá)的酶。
[0094] "適合獲得P450酶表達(dá)的條件"是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。通常，使用18- (25g/L)、TB-(24g/L酵母提取物，12g/L膜蛋白腺，0.4%甘油，1〇1111憐酸鐘緩沖液）或 化Presso?平板培養(yǎng)基化nPresso?化blet medium)培養(yǎng)宿主細(xì)胞?？蒞通過(guò)用來(lái)自平板 或甘油儲(chǔ)液的細(xì)胞接種50mL含有l(wèi)Oiig/血四環(huán)素的培養(yǎng)基進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)。然后通過(guò)用50化L該 預(yù)培養(yǎng)的樣品接種50mL含有l(wèi)Oiig/mL四環(huán)素的培養(yǎng)基進(jìn)行主培養(yǎng)。主培養(yǎng)物通常生長(zhǎng)至光 密度達(dá)到~0.4。在添加溶解于1ml蒸饋水中的0.25g木糖之后，可W誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)。
[00M] 然后，可W通過(guò)眾所周知的純化程序?qū)450酶進(jìn)行純化:可W通過(guò)如下方法，例如 HPLC色譜、使用特異抗體的免疫親和技術(shù)等，將它從裂解物或細(xì)胞提取物、包涵體，或者從 培養(yǎng)物上清中純化出來(lái)。
[0096] 可選擇地，P450酶可W在體外使用無(wú)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)在細(xì)胞裂解物或重建系 統(tǒng)（例如Rapid Translation System飯、Roche Dia即ostics或Retie Lysate IVT?、 Ambion)中從含有其表達(dá)所需元件的DM或RNA基質(zhì)中表達(dá)。
[0097] 產(chǎn)生類固醇激素前體的方法
[0098] 如實(shí)施例2-4所示，本發(fā)明人開(kāi)發(fā)了一種攜帶特定突變的新型P450SCC酶，其在將 底物轉(zhuǎn)變成類固醇激素前體方面顯示改善的酶活性。
[0099] 因此，在另一個(gè)方面中，本發(fā)明設(shè)及使用本發(fā)明表征的P450酶產(chǎn)生類固醇激素前 體的用途。
[0100] 本發(fā)明進(jìn)一步提供了用于如下所述地生產(chǎn)類固醇激素前體的方法。
[0101] 用于產(chǎn)生類固醇激素前體的第一種方法包括如下步驟：
[0102] a)提供如上所述的微生物，
[0103] b)在允許表達(dá)本發(fā)明表征的P450酶的條件下培養(yǎng)所述微生物，
[0104] C)在允許微生物從所述底物產(chǎn)生類固醇激素前體的條件下，使在步驟b)獲得的微 生物培養(yǎng)物與選自下組的底物接觸:具有脂肪族側(cè)鏈的多環(huán)和不飽和一元醇，例如膽固醇、 膽固醇類似物和膽固醇衍生物，和
[0105] d)回收所產(chǎn)生的類固醇激素前體。
[0106] 根據(jù)一個(gè)具體的實(shí)施方案，步驟b)和C)同時(shí)執(zhí)行。在運(yùn)種情況下，用于產(chǎn)生類固醇 激素前體的方法包括如下步驟：
[0107] a)提供如上所述的微生物，
[0108] b)在允許表達(dá)本發(fā)明所表征的P450酶并允許微生物從所述底物產(chǎn)生類固醇激素 前體的條件下，在選自下組的底物的存在下培養(yǎng)所述微生物:具有脂肪族側(cè)鏈的多環(huán)和不 飽和一元醇，例如膽固醇、膽固醇類似物和膽固醇衍生物，和
[0109] C)回收所產(chǎn)生的類固醇激素前體。
[0110] 用于產(chǎn)生類固醇激素前體的第二種方法包括如下步驟：
[0111] a)在允許所述底物被轉(zhuǎn)變成類固醇激素前體的條件下，使本發(fā)明表征的P450酶與 分離的Adx多膚、分離的AdR多膚和選自下組的底物接觸:具有脂肪族側(cè)鏈的多環(huán)和不飽和 一元醇，例如膽固醇、膽固醇類似物和膽固醇衍生物，和
[0112] b)回收所獲得的類固醇激素前體。
[0113] 如本文所使用的，術(shù)語(yǔ)"底物"包括具有脂肪族側(cè)鏈的多環(huán)和不飽和一元醇，例如 從環(huán)阿屯醇kycloartenol)和羊毛固醇（lanosterol)衍生的植物固醇。在運(yùn)些底物中，"膽 固醇，膽固醇類似物和它們的衍生物"是指選自下組的一系列底物：膽固醇，菜子固醇 (brassicasterol)，菜油固醇（campesterol)，麥角二締醇（ergostadienol)如麥角醬5,22 二締醇（6'旨〇3*曰5,22(116]1〇1)，麥角醬5,24(28)二締醇（6'旨〇31曰 5,24(28)(116]1〇1)，麥角 醬5,24(28)二締 3卵享（6'邑〇31日 5,24(28)(116116 30〇1)，麥角醬5,24(25)二締醇（6'邑〇31日 5,24(25)dienol)，麥角S締醇（ergostahienol)如麥角醬5,22,24(25)^締醇（6'邑〇31曰 5,22,24(25)化1611〇1)，麥角醬5,22,24(28)^締醇（6巧〇3化 5,22,24(28)化1611〇1)，麥角 醬5,7,22^締醇（6'邑〇31:曰5,7,22付16]1〇1)，麥角四締醇（6巧〇31:曰16付6]1〇1)如麥角醬5,7, 22,24(25)或麥角醬5,7,22,24(28)，鏈固醇（(163111〇316'〇1)，0-谷固醇（0-6巧〇31日山611〇1)， generol，氧固醇（0巧sterols)的混合物，豆固醇（stigmasterol)，維生素 D，7-脫氨膽固醇 和麥角固醇。當(dāng)前在工業(yè)過(guò)程中使用的固醇混合也包含在底物的運(yùn)一定義內(nèi)，例如generol 100和ADM90(包括不同比例的菜子固醇(brassicasterol)+菜油固醇+豆固醇+0-谷固醇）。
[0114] 在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，底物選自下組:膽固醇、菜油固醇、鏈固醇和麥角醬5， 24(28)二締3軸享。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，底物是麥角固醇。
[0115] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，"類固醇激素前體"選自下組:孕締醇酬，7-脫氨孕締醇 酬，徑麥角固醇化7化0巧6巧03161'〇1)和徑豆固醇化7化0義731：1旨1]1日3161'〇1)。在另一個(gè)具體 的實(shí)施方案中，所述類固醇激素前體選自下組：徑基化膽固醇類似物和開(kāi)環(huán)醬類化合物 (secosteroids)(例如維生素 D2和D3是膽固醇類似物7-脫氨膽固醇和麥角固醇的衍生物）。 在一個(gè)特定的實(shí)施方案中，類固醇激素前體是孕締醇酬。
[0116] "在底物存在下培養(yǎng)微生物"的意思是使所述微生物與如上定義的底物在物理上 相互作用。運(yùn)種相互作用可W在或者可W不在培養(yǎng)基內(nèi)實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所 述培養(yǎng)基含有用于使根據(jù)本發(fā)明的微生物透化和/或使根據(jù)本發(fā)明的底物溶解的試劑。底 物在運(yùn)些試劑中的溶解可W發(fā)生于添加至微生物培養(yǎng)物之前。
[0117] "使P450酶與底物接觸"的意思是使所述P450酶與如上定義的底物在物理上相互 作用。運(yùn)種相互作用可W在或者可W不在培養(yǎng)基內(nèi)實(shí)現(xiàn)。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述培 養(yǎng)基含有用于使根據(jù)本發(fā)明的底物溶解的試劑。底物在運(yùn)些試劑中的溶解可W發(fā)生于添加 至所述培養(yǎng)基之前。
[0118] 用于溶解底物的試劑可W選自下組：乙醇，吐溫-80，tergitol，聚乙締化咯燒酬 (PVP)，皂巧（例如包含在皂皮樹(shù)Quillaja saponaria的粗提取物中的皂樹(shù)皂角巧 (Quillaja saponin))，環(huán)糊精及其衍生物(如2-徑丙基-0-環(huán)糊精）。在另一個(gè)具體的實(shí)施 方案中，可W使用運(yùn)些試劑的混合物，作為非限制性的實(shí)例，例如乙醇和吐溫-80的混合物， tergitol和乙醇的混合物，皂巧(例如皂樹(shù)皂角巧）和環(huán)糊精的混合物?？蒞使用環(huán)糊精衍 生物，例如2-徑丙基-0-環(huán)糊精。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，底物與聚乙締化咯燒酬(PVP) 共結(jié)晶。
[0119] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，在添加至微生物培養(yǎng)物之前，底物首先溶解于2-徑丙基-0- 環(huán)糊精中，其中所述培養(yǎng)物含有皂樹(shù)皂角巧。在另一個(gè)實(shí)施方案中，底物溶解在溶液中，所 述溶液含有范圍是10-60%，例如20-50%，例如40-50%的2-徑丙基-0-環(huán)糊精和范圍是1- 10%，例如2-8%，例如3-6%的皂樹(shù)皂角巧。在另一個(gè)實(shí)施方案中，底物溶解在含有45%的 2-徑丙基-0-環(huán)糊精和4%皂樹(shù)皂角巧的溶液中。
[0120] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，微生物培養(yǎng)物中2-徑丙基-0-環(huán)糊精的終濃度是1-4%，例 如2-3%，例如2.25%，如實(shí)施例2中舉例的。在另一個(gè)實(shí)施方案中，皂樹(shù)皂角巧在微生物培 養(yǎng)物中的最終濃度是0.05-0.25%，例如0.075-0.225%，例如0.1-0.2%。
[0121] "在允許表達(dá)所述外源核酸序列的條件下培養(yǎng)所述微生物"可W根據(jù)生物技術(shù)領(lǐng) 域中的任何眾所周知的培養(yǎng)和誘導(dǎo)方法執(zhí)行，例如在Bleif et al.(Appl Microbiol Biotechnol(2012)93:1135-1146)或者在Korneli et al. (Journal of Biotechnology 163(2013)87-96)中所述。
[0122] "允許所述底物轉(zhuǎn)化成類固醇激素前體的條件"包括體外條件，例如所用試劑、試 劑濃度、溫度、攬拌的使用、反應(yīng)或溫育的持續(xù)時(shí)間等，其有利于所述底物轉(zhuǎn)化成類固醇激 素前體。運(yùn)些條件可W通過(guò)本發(fā)明技術(shù)人員已知的方法加 W確定和調(diào)整。
[0123] 作為非限制性實(shí)例，反應(yīng)可W在如下條件下執(zhí)行:存在葡萄糖-6-憐酸脫氨酶和葡 萄糖-6-憐酸，通常置于被調(diào)節(jié)到例如pH 7.4的150mM肥PES緩沖液中，其通常含有0.05% 吐溫-20和ImM MgCl2J450酶、Adx和AdR的濃度分別可為例如1咖、20測(cè)和0.5咖，或0.25測(cè)、 5iiM和0.125測(cè)。具有脂肪族側(cè)鏈的多環(huán)和不飽和一元醇，例如膽固醇、膽固醇類似物或膽固 醇衍生物，可W被溶解在45%的2-徑丙基-0-環(huán)糊精中。樣品可W被預(yù)熱到37°C，并可W添 加 NADPH至終濃度為1 OOiiM。該混合物可W在37 °C下攬拌溫育。
[0124] 在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，在用于產(chǎn)生類固醇激素前體的任何方法中使用的類固 醇激素前體是孕締醇酬。如本文所使用的，"孕締醇酬"是指一種又被稱作30-徑基孕醬-5- 締-20-酬（30-hyh(Mypregn-5-en-2〇-〇ne)的類固醇激素。
[01巧]序列簡(jiǎn)述
[01%] SEQ ID N0:1顯示了包含在位置225的蘇氨酸和在位置289的天冬氨酸的CYP11A1 (多膚SA1)的氨基酸序列。
[0127] 學(xué)顯示了包含在位置225的蘇氨酸的CYP11A1的氨基酸序列。
[0128] 學(xué)顯示了包含在位置289的天冬氨酸的CYP11A1的氨基酸序列。
[01 巧]沈Q ID N0:4顯示了WT牛（Bos taurus)CYPllAl(多膚SA4;WT P450scc)的氨基酸 序列。
[0130] 沈Q ID NO:5顯示了編碼沈Q ID NO: 1 的SA1 的質(zhì)粒pSMF2.1_CYP11A1BYM的序列。
[0131] 沈Q ID N0:6顯示了多膚SA6(P450scc-IlA-K193E)的氨基酸序列。
[0132] 沈Q ID N0:7顯示了AdR的氨基酸序列。
[0133] 沈Q ID N0:8顯示了Adx的氨基酸序列。
[0。4] 附圖簡(jiǎn)述
[01巧]圖1:HPLC色譜圖顯示了通過(guò)細(xì)胞色素 P450多膚SAUSEQ ID N0:1)和SA4(具有序 列SEQ ID NO: 4的對(duì)照)進(jìn)行的膽固醇的體外轉(zhuǎn)化。圖例：S:底物，P:主要產(chǎn)物，DOC: 11 - 脫氧皮質(zhì)酬。
[0136] 圖2:由冊(cè)LC-色譜圖得出的孕締醇酬定量，其顯示了通過(guò)細(xì)胞色素 P450多膚SA1 (SEQ ID NO: 1)將不同底物體內(nèi)轉(zhuǎn)化成孕締醇酬。
[0137] 圖3:HPLC色譜圖顯示了通過(guò)細(xì)胞色素 P450多膚SAUSEQ ID N0:1)和SA6(具有序 列SEQ ID N0:6的對(duì)照)體內(nèi)轉(zhuǎn)化300iiM膽固醇2地之后。圖例：化ol.:膽固醇，Prog.:孕締醇 酬。
[013引圖4:通過(guò)細(xì)胞色素 P450多膚SA1(沈Q ID N0:1)和SA6(具有序列SEQ ID N0:6的對(duì) 照)體內(nèi)轉(zhuǎn)化300yM膽固醇的時(shí)間過(guò)程。
[0139] 圖5:編碼SA1 (沈Q ID N0:1)的pSMF2.1_CYPllAlBYM的載體圖。 實(shí)施例
[0140] 實(shí)施例1:材料和方法
[0141] 蛋白合成
[0142] CYP11A1變體通過(guò)基因合成并克隆到PTRC99A中，與聚-His融合而得。C43DE3-大腸 桿菌細(xì)胞用每種載體和編碼伴侶蛋白（chaperone)的pGrolS共轉(zhuǎn)化。純化的執(zhí)行如化nocha et al.(Biochim Bio地ys Ac化.（2011)Jan; 1814( 1):126-31)所述。純度通過(guò)SDS-PAGE進(jìn) 行評(píng)估。純化蛋白的濃度在用連二亞硫酸鋼處理并暴露于CO之后，通過(guò)CO-差示光譜確定。
[0143] Adx和AdR分別根據(jù)Uhlmann et al. (Biochem.Biophys .Res .Commun. , 188(1992), pp. 1131-1138)和Sagara et al. (Biol.Pharm.Bull. ,16(1993)，pp.627-630)純化。
[0144] 體外轉(zhuǎn)化試驗(yàn)
[0145] 對(duì)于體外酶測(cè)定，用含有0.05%吐溫-20和ImM MgCb并調(diào)節(jié)到pH 7.4的150mM 肥PES緩沖液作為反應(yīng)緩沖液。1單位葡萄糖-6-憐酸脫氨酶和5mM作為底物的葡萄糖-6-憐 酸作為NADPH再生系統(tǒng)。
[0146] 對(duì)于WT P450SCC(記為"SA4"，SEQ ID N0:4)和P450SCC-I1A-K193E(記為"SA護(hù)， 569 10肋：6)，〔￥?1141、4如和4(11?的濃度為1礎(chǔ)、20礎(chǔ)和0.扣]\1，而對(duì)于？4503。。-1?2251'- N289D(記為"SAr，SEQ ID NO: 1)，CYP11A1、Adx和AdR的濃度分別為0.25iiM、5iiM和0.125iiM。
[0147] 溶解于45 %的2-徑丙基-e-環(huán)糊精的膽固醇用作CYP11 Al的底物。
[0148] 將樣品預(yù)熱到37°C，并通過(guò)添加 NADPH至終濃度為lOOiiM開(kāi)始反應(yīng)?；旌衔镌?7°C 伴隨攬拌溫育30s。通過(guò)在水中將樣品煮沸30s終止反應(yīng)。
[0149] 為了能夠在240nm進(jìn)行光度檢測(cè)，使用來(lái)自諾卡氏菌(Nocardia spec)的膽固醇氧 化酶將類固醇轉(zhuǎn)化成其3-酬-A 4衍生物。
[0150] 向樣品添加 20iU膽固醇氧化酶溶液(5mg膽固醇氧化酶和5mg化-馨合劑，溶解在 含有0.05%吐溫-20的5ml 50mM肥陽(yáng)S緩沖液中，pH 7)。在37°C溫育化之后，向反應(yīng)混合物 中添加 11-脫氧皮質(zhì)酬(D0C)，作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)，隨后用等體積的乙酸乙醋萃取2次。蒸發(fā)后，將 萃取物溶解在乙臘/水中。
[0巧。體內(nèi)轉(zhuǎn)化試驗(yàn)
[0152] SOOiiM膽固醇向孕締醇酬的體內(nèi)轉(zhuǎn)化在24h后通過(guò)HPLC進(jìn)行評(píng)估。將巨大芽抱桿菌 培養(yǎng)在含有l(wèi)〇μg/ml四環(huán)素的TB培養(yǎng)基中，37°C，180巧m震蕩。通過(guò)添加溶于ImL水的0.25g 木糖誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，隨后添加溶于2-徑丙基-0-環(huán)糊精中的底物。
[0153] 實(shí)施例2:通過(guò)細(xì)胞色素 P450多膚SA1(SEQ ID NO: 1)和SA4(WT對(duì)照，SEQ ID N0:4) 的膽固醇體外轉(zhuǎn)化
[0154] 在快速評(píng)價(jià)(acute evaluation) 了每個(gè)P450sec制備物的濃度之后，將SA1、SA4和 SA6用于下列體外測(cè)定。在作為底物的膽固醇(20山〇和飽和量的Adx和AdR的存在下，將運(yùn)些 同工型（isoform)中的每一個(gè)重建成liiM的濃度。
[0K5] 盡管SA4和SA6顯示相同的活性，但是SA1顯示了與SA4和SA6相比呈2-3倍高的活性 (圖1)。因?yàn)榈孜镌跍赜龝r(shí)間后已經(jīng)被耗盡，所W難W評(píng)估SA1與SA4/SA6多膚在更長(zhǎng)溫育時(shí) 間下的差異。
[0156] 實(shí)施例3:通過(guò)細(xì)胞色素 P450多膚SAUSEQ ID NO: 1)和SA6(對(duì)照，SEQ ID N0:6)的 膽固醇體內(nèi)轉(zhuǎn)化
[0157] 因?yàn)镾A4和SA6之間沒(méi)有觀察到可測(cè)量的差異，所W本發(fā)明人將興趣聚焦于比較 SA1和SA6多膚。新近開(kāi)發(fā)出了一種新系統(tǒng)，其中在溶解的膽固醇存在下，表達(dá)P450scc、Fdxl 和FdxR的重組巨大芽抱桿菌將膽固醇代謝成孕締醇酬。SA巧日SA6的相應(yīng)cDNA被優(yōu)化用于巨 大芽抱桿菌的密碼子偏好，并使用合適的限制位點(diǎn)將其轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒PSFM2.1中。使用經(jīng)典的 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方案將兩種分別攜帶有密碼子優(yōu)化的SA1和SA6的PSFM2.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到巨大芽 抱桿菌MS941中。
[015引在2地和4她后，對(duì)巨大芽抱桿菌中表達(dá)的SA1和SA6多膚的體內(nèi)膽固醇轉(zhuǎn)化活性進(jìn) 行了評(píng)估。
[0159] 根據(jù)體外實(shí)驗(yàn)，SA1目前顯示了與SA6相比2倍高的活性(圖3和4)。
[0160] 實(shí)施例4:通過(guò)細(xì)胞色素 P450多膚SA1 (SEQ ID NO: 1)將不同底物體內(nèi)轉(zhuǎn)化成孕締 醇酬
[0161] 最后，使用改進(jìn)的系統(tǒng)測(cè)試SA1多膚轉(zhuǎn)化如下各種生物技術(shù)上感興趣的底物的能 力:菜油固醇、鏈醬醇、麥角醬-5，24( 28)-二締-30-醇，和各種20，22-OH氧固醇的混合物。
[0162] 每種底物被轉(zhuǎn)化成一種與孕締醇酬具有相同保留時(shí)間的主要產(chǎn)物，表明CYP11A1 能夠切割運(yùn)些底物中每一個(gè)的側(cè)鏈，產(chǎn)生孕締醇酬。
[0163] 對(duì)每種底物的孕締醇酬形成進(jìn)行定量（圖2)。極性氧固醇的轉(zhuǎn)化速度與膽固醇相 當(dāng)（48小時(shí)后~35mg/L)。更疏水的固醇菜油固醇、鏈醬醇和麥角二締醇在48小時(shí)后僅W與 膽固醇相比大約19%的速度發(fā)生轉(zhuǎn)化。
[0164] 總之，運(yùn)些結(jié)果顯示，所有測(cè)試的類固醇能夠滲透通過(guò)巨大芽抱桿菌的細(xì)胞膜，并 被CYP11A1SA1突變體轉(zhuǎn)化成孕締醇酬。
[0165] 本發(fā)明人因此在本文中報(bào)告了一種新型P450SCC蛋白，命名為SA1，其對(duì)包括膽固 醇的各種固醇顯示增加的轉(zhuǎn)化活性。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種分離的P450酶，其包含與SEQ ID NO: 1至少80%相同的氨基酸序列或由該氨基 酸序列構(gòu)成，其中所述序列包含在對(duì)應(yīng)于位置225的位置處的蘇氨酸和/或在對(duì)應(yīng)于位置 289的位置處的天冬氨酸。2. 根據(jù)權(quán)利要求1的酶，其包含選自下組的序列或由選自下組的序列構(gòu)成：SEQ ID NO: 1，SEQIDN0:2和SEQIDN0:3。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2的酶，由序列SEQ ID NO: 1構(gòu)成。4. 一種分離的核酸，其包含如下的核苷酸序列或者由如下的核苷酸序列構(gòu)成，所述核 苷酸序列編碼如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所限定的酶。5. -種載體，其包含如權(quán)利要求4所限定的核酸，其與表達(dá)調(diào)控序列可操作地連接。6. 根據(jù)權(quán)利要求5的載體，進(jìn)一步包含編碼腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白（adrenodoxin) (Adx)的核酸序列和/或編碼腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白還原酶(adrenodoxin reductase) (AdR)的核酸序列。7. -種宿主細(xì)胞，其包含如權(quán)利要求4所限定的核酸或者如權(quán)利要求5或6所限定的載 體。8. 根據(jù)權(quán)利要求7的宿主細(xì)胞，其是遺傳工程化的微生物。9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8的宿主細(xì)胞，其是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。10. -種遺傳工程化的微生物，其能夠?qū)⑦x自下組的底物轉(zhuǎn)變成類固醇激素前體:具有 脂肪族側(cè)鏈的多環(huán)和不飽和一元醇，例如膽固醇、膽固醇類似物和膽固醇衍生物，其中所述 微生物包含如權(quán)利要求4所限定的核酸，和任選的編碼腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白（Adx)的核酸 序列和/或編碼腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白還原酶(AdR)的核酸序列。11. 一種用于制備如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所限定的酶的體外方法，所述方法包括如下 步驟： a) 在適合于如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所限定的酶得到表達(dá)的條件下培養(yǎng)如權(quán)利要求7-9中任一項(xiàng)所限定的宿主細(xì)胞;和 b) 回收所表達(dá)的酶。12. 如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所限定的酶用于產(chǎn)生類固醇激素前體的用途。13. -種用于產(chǎn)生類固醇激素前體的方法，包括如下步驟： a) 提供如權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)所限定的微生物， b) 在允許如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所限定的酶表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述微生物， c) 在允許微生物從底物產(chǎn)生類固醇激素前體的條件下，使在步驟b)獲得的微生物培養(yǎng) 物與選自下組的底物接觸:具有脂肪族側(cè)鏈的多環(huán)和不飽和一元醇，例如膽固醇、膽固醇類 似物和膽固醇衍生物，和 d) 回收所產(chǎn)生的類固醇激素前體。14. 一種用于產(chǎn)生類固醇激素前體的方法，包括如下步驟： a) 在允許底物被轉(zhuǎn)變成類固醇激素前體的條件下，使如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所限定 的酶與分離的腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白（Adx)多肽、分離的腎上腺皮質(zhì)鐵氧還蛋白還原酶 (AdR)多肽和選自下組的底物接觸:具有脂肪族側(cè)鏈的多環(huán)和不飽和一元醇，例如膽固醇、 膽固醇類似物和膽固醇衍生物，和 b) 回收所獲得的類固醇激素前體。15.根據(jù)權(quán)利要求13或14的方法，其中該類固醇激素前體是孕烯醇酮。
【文檔編號(hào)】C07K14/435GK106061996SQ201580012460
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2015年1月19日 公開(kāi)號(hào)201580012460.9, CN 106061996 A, CN 106061996A, CN 201580012460, CN-A-106061996, CN106061996 A, CN106061996A, CN201580012460, CN201580012460.9, PCT/2015/50866, PCT/EP/15/050866, PCT/EP/15/50866, PCT/EP/2015/050866, PCT/EP/2015/50866, PCT/EP15/050866, PCT/EP15/50866, PCT/EP15050866, PCT/EP1550866, PCT/EP2015/050866, PCT/EP2015/50866, PCT/EP2015050866, PCT/EP201550866
【發(fā)明人】M·伯廷, B·杜馬斯
【申請(qǐng)人】賽諾菲