用于純化多糖的新的下游方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用于純化細(xì)菌多糖的新方法。其是用于從腦膜炎奈瑟茵(Neisseria meningitidis)血清組C(Men?C)多糖中去除雜質(zhì)的高效且可擴(kuò)展的方法，所述多糖能夠以衍生化形式原樣使用或與其他分子相連接以用于制備疫苗(更特別地，針對(duì)腦膜炎奈瑟茵感染的綴合物疫苗)。
【專利說(shuō)明】
用于純化多糖的新的下游方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明設(shè)及用于純化腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)多糖的快速方法。 更具體地，本發(fā)明設(shè)及制備腦膜炎奈瑟菌血清組C型(N.meningitidis serogroup typeC， MenC)多糖的方法，所述多糖能夠原樣使用或能夠被衍生化或與其他血清組相組合W制備 針對(duì)腦膜炎奈瑟菌的疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002] 多糖(尤其是抗原性多糖)被用于制備疫苗。含有一種、兩種或更多種多糖及其綴 合物的單價(jià)、二價(jià)和多價(jià)疫苗市售可得，用于預(yù)防由多種微生物（例如肺炎鏈球菌 (Sheptococcus pneumoniae)、流感嗜血桿菌（Haemophilus inf luenzae)和腦膜炎奈瑟 菌）引起的某些疾病或感染，并且已證明在預(yù)防各疾病中有顯著程度的價(jià)值。引進(jìn)疫苗沛兒 (Prevenar)后數(shù)年間收集的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)已清楚地證明，美國(guó)嬰兒中的侵襲性肺炎球菌疾病如 所預(yù)期地降低。盡管進(jìn)行了若干關(guān)于運(yùn)些多糖及綴合物的研究，但持續(xù)性研究證明，在行業(yè) 中總是存在改善該多糖產(chǎn)率W及質(zhì)量(純度)的需求。
[0003] 腦膜炎被認(rèn)為是全球性的威脅，并且該疾病負(fù)擔(dān)仍然保持在公共健康的首要位 置。腦膜炎的臨床定義為腦膜(腦的膜)的炎癥。如未治療，該疾病可導(dǎo)致致命性結(jié)果。已經(jīng) 確定了腦膜炎奈瑟菌的總共十=個(gè)血清組，并且在運(yùn)十=個(gè)血清組中的六個(gè)血清組(A、B、 C、W135、X和Y)為引發(fā)全球性的感染主要原因。腦膜炎奈瑟菌具有廣泛范圍的臨床表現(xiàn)，范 圍從短暫的輕度喉痛到致命性的腦膜炎或腦膜炎球菌敗血癥。腦膜炎和敗血癥為該疾病最 常見(jiàn)的表現(xiàn)。
[0004] 從許多研究發(fā)現(xiàn)中收集的證據(jù)限定了多糖綴合物疫苗的免疫原性方面。此外，有 研究論文和專利描述了Men C芙膜多糖的生產(chǎn)和純化，但其中沒(méi)有一篇限定了穩(wěn)健、可擴(kuò)展 且可重復(fù)的時(shí)間流程(time line)極度縮短的純化方法。
[0005] 純化Men C的生產(chǎn)是與載體蛋白質(zhì)的有效綴合及其作為綴合物疫苗開(kāi)發(fā)的首要需 求。Men C的培養(yǎng)和純化的成本通常很高，并且因?yàn)槠湓O(shè)及一系列生產(chǎn)和純化步驟而設(shè)及較 長(zhǎng)的工作時(shí)間。多糖生產(chǎn)中一個(gè)或更多個(gè)步驟的改善將為整體的綴合物疫苗生產(chǎn)帶來(lái)顯著 變化，并因此使該方法變得相對(duì)成本有效。
[0006] 然而，盡管關(guān)于運(yùn)些多糖有幾項(xiàng)研究已在進(jìn)行，總是存在為了生產(chǎn)高質(zhì)量疫苗而 改善該多糖產(chǎn)率和質(zhì)量/純度的需求。
[0007] 有一些專利描述了用于純化Men-c多糖的方法。描述于美國(guó)專利no7,491，517，B2 中的用于WCTAB沉淀Men-C多糖的現(xiàn)有技術(shù)已被發(fā)現(xiàn)設(shè)及在4°C解育過(guò)夜。此外，去除污染 物需要使用高成本的酶蛋白酶K。除此W外，該方法還需要用于純化Men-C多糖的凝膠過(guò)濾。 所述整個(gè)過(guò)程需要大量時(shí)間用于純化，并且該方法也因酶的使用變得成本很高。
[000引另外，專利申請(qǐng)No.W0 2011/148382 A1描述了制備純芙膜多糖的方法，此方法使 用帶有醇的憐酸侶用于純化流感嗜血桿菌b、腦膜炎奈瑟菌(例如血清組A、C、Y、W-135)的芙 膜多糖和其他產(chǎn)自革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性微生物的類似芙膜多糖。所述已發(fā)表的現(xiàn)有技 術(shù)公開(kāi)的用于多糖純化的時(shí)間為16-20小時(shí)。
[0009] 另一個(gè)專利EP 0658118B1描述了平均時(shí)間為16小時(shí)的血清組C腦膜炎球菌多糖 (Group C Meningococcal化lysaccha;ride，GCMP)的0-脫乙酷化方法。該方法也要求大量 時(shí)間用于純化。
[0010] 目前，用于生產(chǎn)和純化MenC多糖的多種方法都占用相對(duì)長(zhǎng)的培養(yǎng)和純化時(shí)間，并 且也設(shè)及使用高成本的酶。盡管運(yùn)些種類的方法產(chǎn)出純多糖，但它們?cè)诎幢壤龜U(kuò)大(scale- up) 期間會(huì) 同時(shí)提高生產(chǎn) 成本。
[0011] 此外，上述公開(kāi)的現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)的方法在低溫中更加高效，從而需要受控的環(huán)境， 導(dǎo)致研究和生產(chǎn)中的額外成本。
[0012]發(fā)明目的
[0013] 因此，本發(fā)明的主要目的是提供用于純化Men C多糖的新方法。
[0014] 本發(fā)明的另一目的是提供用于純化Men C多糖同時(shí)在非常短的時(shí)間內(nèi)通過(guò)簡(jiǎn)單、 高效、改進(jìn)且商業(yè)上可擴(kuò)展的方法清除雜質(zhì)的快速方法。
[0015] 然而本發(fā)明的另一個(gè)目的是生產(chǎn)達(dá)到相關(guān)W冊(cè)規(guī)格的高質(zhì)量多糖。
[0016] 發(fā)明概述
[0017] 本發(fā)明設(shè)及用于純化Men C多糖的方法。所述方法描述了新的、迅速、成本有效且 可擴(kuò)展的方法，其中Men C多糖W顯著縮短的時(shí)間純化。
[0018] 本發(fā)明所述方法設(shè)及選擇免疫活性的細(xì)菌菌株，制備用于繁殖所述免疫活性菌株 的培養(yǎng)基，W及接種在甘油膽液培養(yǎng)物中的所選擇的細(xì)菌菌株，W及在預(yù)設(shè)的溫度下W預(yù) 設(shè)的每分鐘轉(zhuǎn)速(revolution per minute，rpm)解育最佳時(shí)間。所選擇的細(xì)菌菌株在發(fā)酵 罐中在優(yōu)化的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并且所述方法繼續(xù)將發(fā)酵收獲物離屯、W清除發(fā)酵液 (fermen化tionbrothJB)中的細(xì)胞碎片，隨后通過(guò)利用分子量截留膜超濾將FB濃縮。
[0019] 隨后，在高溫下在高濃度堿性溶液存在下，將經(jīng)超濾濃縮的上清液或經(jīng)處理的FB 脫乙酷化。使經(jīng)脫乙酷的粗制多糖經(jīng)受通過(guò)正切流動(dòng)過(guò)濾(Tangential Flow Filhation, TFF)的緩沖液交換。通過(guò)疏水相互作用色譜法（hydrophobic interaction chromatography，HIC)將經(jīng)滲濾脫乙酷化的粗制多糖進(jìn)一步純化，隨后通過(guò)滲濾和濃縮W 獲得最終純化的多糖。特別相關(guān)的是，根據(jù)本發(fā)明的方法包括用堿性溶液處理濃縮的提取 物和/或分離的細(xì)菌細(xì)胞。除了提取CPS，該堿提取還引起N-乙酷基的脫乙酷化?？赏ㄟ^(guò)調(diào)整 反應(yīng)條件使該脫乙酷化的程度變化。隨后從細(xì)胞組分中分離所提取的CPSW獲得CPS(優(yōu)選 通過(guò)色譜分離）。
[0020] 該方法展現(xiàn)出優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的一些優(yōu)勢(shì)，例如提供了制備Men C多糖的新的且快 速的方法。該方法因其降低了步驟總數(shù)目且需要單次色譜篩選，所W是成本有效的。另一個(gè) 優(yōu)勢(shì)是該方法為整體可擴(kuò)展的。
[0021] 附圖簡(jiǎn)述
[0022] 圖-1描述了用于MenC-PS純化和回收的工藝流程(process flow)。
[0023] 圖-2描述了MenC斗S的HPLC色譜圖。
[0024] 圖-3描述了MenC斗S的NMR譜。
[00劇發(fā)明詳述
[0026]如圖1所示，本發(fā)明公開(kāi)了兩個(gè)步驟，其已經(jīng)被優(yōu)化W使得能夠在更短時(shí)間內(nèi)純化 MenC多糖（MenC polysaccharide，MenC-PS)。
[0027]將細(xì)菌多糖的菌株接種于含有細(xì)菌生長(zhǎng)所需的合適培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中。在達(dá)到最 大光密度后(范圍為8至10,其說(shuō)明大量的細(xì)菌生長(zhǎng)），通過(guò)添加預(yù)先確定濃度的甲醒將其終 止，并獲得所產(chǎn)生的FB。隨后將FB高速離屯、W清除FB中的細(xì)胞碎片，隨后利用分子量截留膜 滲濾并濃縮。
[002引將經(jīng)滲濾和濃縮的具有粗制多糖的FB用化0H在高溫(例如高達(dá)80°C )下處理W脫 乙酷化。將粗制多糖用聚酸諷（polyether sulfone，陽(yáng)S)膜，用milliQ水(milliQ water， MQW)，隨后通過(guò)化is HCl緩沖液(pH7.4±0.1)進(jìn)行濃縮和滲濾。在滲濾后將粗制多糖濃縮 并W 0.22皿濾器過(guò)濾。
[0029] 將脫乙酷化的粗制多糖通過(guò)疏水相互作用色譜法化1C)技術(shù)進(jìn)一步純化。
[0030] 基于極性差異將混合物中兩種或更多種組分分離是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例 如，使用疏水相互作用色譜，具有相對(duì)較大疏水性的化合物相對(duì)于更加親水的化合物在柱 上保留時(shí)間更長(zhǎng)。相反，使用親水相互作用色譜，親水化合物相對(duì)于更疏水的化合物保留在 柱上的時(shí)間更長(zhǎng)。連續(xù)使用運(yùn)兩種方法允許將相對(duì)于目標(biāo)化合物極性更弱和極性更強(qiáng)的兩 類雜質(zhì)除去。
[0031] 可將存在于堿性提取試劑中的所提取的WS通過(guò)色譜法從來(lái)自于細(xì)胞組分的雜質(zhì) 中分離。色譜分離方法的非限制性實(shí)例是離子交換（陽(yáng)離子或陰離子）、親水相互作用、疏水 相互作用或凝膠滲透色譜法。更優(yōu)選為在苯基瓊脂糖凝膠(phenyl S邱harose)上的疏水相 互作用色譜法化1C)，其會(huì)從堿性提取物中除去大多數(shù)高分子量、紫外活性的(uv-active) 污染物。芙膜多糖從一開(kāi)始會(huì)被洗脫，而更疏水的蛋白質(zhì)和核酸會(huì)被保留。本發(fā)明中的優(yōu)選 方法是疏水相互作用色譜法。
[0032] 對(duì)多糖進(jìn)行進(jìn)一步的濃縮和滲濾W促進(jìn)蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)的去除，并且隨后將多 糖樣品用MQW洗涂。
[0033] 隨后進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾W獲得圖2和圖3所描述的純化Men C多糖。
[0034] 可從表1中方便地理解W上所使用操作的確證，表1清楚地示出了所純化多糖的規(guī) 格滿足WHO標(biāo)準(zhǔn)。
[00對(duì)表-1: W下示出所純化的Men-C多糖規(guī)格符合W冊(cè)規(guī)范 [00361
[0037]鑒于本發(fā)明的特征化allmark)為新的、迅速且可擴(kuò)展的純化工藝方案，其可于6± 1小時(shí)內(nèi)完成并且如此生產(chǎn)的PS符合W冊(cè)所設(shè)標(biāo)準(zhǔn)，因而特別感興趣的觀察結(jié)果是純化Men C多糖所需時(shí)間顯著少于現(xiàn)有技術(shù)中所公開(kāi)的時(shí)間。
[0038] 分析操作：
[0039] 持續(xù)監(jiān)測(cè)在不同步驟中所獲得的多糖并分析其純度和產(chǎn)率。已經(jīng)報(bào)道了不同的分 析操作，但優(yōu)選方案總結(jié)如下：
[0040] 通過(guò)比色法確定MenC-PS的總唾液酸。該測(cè)定基于在100°C下，在鹽酸和銅（II)離 子存在下，唾液酸與間苯二酪反應(yīng)30分鐘;運(yùn)導(dǎo)致形成藍(lán)紫色絡(luò)合物，其表現(xiàn)出在564nm的 強(qiáng)吸光度。該總唾液酸濃度通過(guò)使用一系列唾液酸標(biāo)準(zhǔn)所獲得的校準(zhǔn)曲線確定 [(Svenne;rholm，1957)]。脂多糖（lipopolysaccha;ride，LPS)使用緊湊且簡(jiǎn)單的 EndOSafe&'-PTS?設(shè)備確定。蛋白質(zhì)雜質(zhì)通過(guò)Lowry方法[化OW巧等，1951)]，利用牛血清白 蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)并記錄75化m吸光度來(lái)確定。核酸(nucleic acids，NA)在260皿評(píng)估，并且假 定吸光度為1. 〇A = 50iig/mL來(lái)計(jì)算該量[(化asch，1990)]。
[0041 ] 化bPRP的相對(duì)平均分子大?。∕w)通過(guò)利用高效液相色譜化igh-peWormance liquid chromatography，冊(cè)LC)來(lái)確定（Alliance，Waters)。所使用的柱為PWXレ4000和 PWXkSOOO聯(lián)用（Tosoh Bioscience)。此外，一系列f5kD至800kD的短梗霉聚糖（pullulan， Shodex)用作MenC-PS的標(biāo)準(zhǔn)。利用0.1 M硝酸鋼W30分鐘的運(yùn)行時(shí)間、1ml/分鐘的流量進(jìn)行 該HPLC。通過(guò)iH-NMR譜驗(yàn)證MenC-PS的身份。NMR產(chǎn)生磁敏感的原子核(例如1h)譜。
[0042] 通過(guò)與針對(duì)每種多糖的參考抗血清組合，從血清學(xué)上確定MenC-PS。根據(jù)W冊(cè)規(guī)格 [胖冊(cè)，2004]，基于干重確定純度并表征多糖，先將16此斗5凍干并隨后檢測(cè)。水分含量被如 此減除，從而獲得精確的干重。凍干塊狀物的水分含量通過(guò)來(lái)自于Perkin Elmer的熱重分 析儀（Thermo Gravimehic Analyzer，TGA)確定。MenC-PS的分析結(jié)果在表-1中給出，并且 其符合WHO的規(guī)定。
[0043] 所述Men C多糖可用于制備多糖-蛋白質(zhì)綴合物疫苗。
[0044] 如上所詳述的本發(fā)明多個(gè)方面現(xiàn)通過(guò)一些非限制性實(shí)施例來(lái)舉例說(shuō)明。
[0045] 實(shí)施例-1
[0046] 利用陰離子去垢劑Wtris緩沖液和疏水相互作用色譜法化1C)進(jìn)行多糖純化：
[0047] 經(jīng)滲濾和濃縮的具有粗制多糖的FB用陰離子去垢劑（例如濃度為0.3 %至0.6 % (w/v)的脫氧膽酸鋼)處理并在50°C至60°C下解育1小時(shí)。隨后將其冷卻至低于40°C，隨后將 粗制多糖用0.1m2的聚酸諷(陽(yáng)S)膜，用6至8倍體積的milliQ水(MQW)濃縮并滲濾。
[004引隨后將粗制多糖用0.5M氨氧化鋼(化0H)在50°C下進(jìn)行脫乙酷化10小時(shí)。隨后將其 冷卻至低于40°C，隨后將粗制多糖同時(shí)用6至8倍體積的MQW和20mM Tris HC1緩沖液，利用 0.1 m2的PES膜滲濾并濃縮。隨后該多糖通過(guò)疏水相互作用色譜法化1C)(例如苯基瓊脂糖凝 膠6快流速(Fast Flow))進(jìn)一步純化。最后，將純化的多糖用0.1m2的PES膜、用6至8倍體積 的MQW進(jìn)行濃縮和滲濾。相應(yīng)地，W0.22皿濾器進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾，并將最終純化的多糖儲(chǔ)存于- 20°C。利用上述方法純化多糖(包括HIC色譜法)所用的總時(shí)間為16至18小時(shí)。
[0049] 實(shí)施例-2:
[0050] 利用陰離子去垢劑W肥陽(yáng)S(4-(2-徑基乙基)-1-贓嗦乙橫酸)緩沖液 [0化1]和疏水相互作用色譜法化1C)進(jìn)行多糖純化：
[0052]經(jīng)滲濾和濃縮的具有粗制多糖的FB用陰離子去垢劑處理（例如濃度為0.3%至 0.6%(w/v)的脫氧膽酸鋼)并在50°C至60°C下解育1小時(shí)。隨后將其冷卻至低于40°C，隨后 將粗制多糖用0.W的聚酸諷(陽(yáng)S)膜，用6至8倍體積的MQW濃縮并滲濾。
[0053] 隨后將粗制多糖用0.5M氨氧化鋼(化0H)在50°C下進(jìn)行脫乙酷化10小時(shí)。隨后將其 冷卻至低于40°C，隨后將粗制多糖同時(shí)用6至8倍體積的MQW和含有3M化C1的20mM肥PES緩 沖液，利用0.1m2的PES膜滲濾并濃縮。隨后該多糖通過(guò)疏水相互作用色譜法化1C)(例如苯 基瓊脂糖凝膠6快流速)進(jìn)一步純化。將純化的多糖用0.1m2的PES膜，用6至8倍體積的MQW進(jìn) 行濃縮和滲濾。隨后，用0.22WI1濾器進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾，并將最終純化的多糖儲(chǔ)存于-20°C。利用 上述方法純化多糖(包括HIC色譜法)所用的總時(shí)間為16至18小時(shí)。
[0054] 實(shí)施例-3:
[0055] 利用氨氧化鋼W皿PES(4-(2-^乙基)-1-贓嗦乙橫酸）緩沖液和疏水相互作用色 譜法化1C)進(jìn)行多糖純化：
[0056] 經(jīng)滲濾和濃縮的具有粗制多糖的FB用0.8M NaOH在80°C下進(jìn)行脫乙酷化6小時(shí)。隨 后將其冷卻至低于40°C，隨后將粗制多糖同時(shí)用6至8倍體積的MQW和含有3M化C1的20mM 肥PES，利用0.1 m2的PES膜滲濾并濃縮。隨后該多糖通過(guò)疏水相互作用色譜法化IC)(例如苯 基瓊脂糖凝膠6快流速)進(jìn)一步純化。將純化的多糖用0.1m2的PES膜，用6至8倍體積的MQW進(jìn) 行濃縮和滲濾。隨后，W0.22WI1濾器進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾，并將最終純化的多糖儲(chǔ)存于-20°C。利用 上述方法純化多糖(包括HIC色譜法)所用的總時(shí)間為10至12小時(shí)。此外，用上文中所述方法 部分地純化多糖。該方法可需要幾個(gè)更多的步驟W完成多糖純化，并且可能不是成本有效 的方法。
[0057] 實(shí)施例-4:
[005引利用氨氧化鋼WTris緩沖液和疏水相互作用色譜法化1C)進(jìn)行多糖純化：
[0059] 經(jīng)滲濾和濃縮的具有粗制多糖的FB用0.8M NaOH在80°C下進(jìn)行脫乙酷化6小時(shí)。隨 后使其冷卻至低于40°C，隨后將粗制多糖同時(shí)用6至8倍體積的MQW和20mM Tris HCI緩沖 液，利用0.1m2的PES膜滲濾并濃縮。隨后該多糖通過(guò)疏水相互作用色譜法化1C)(例如苯基 瓊脂糖凝膠6快流速)進(jìn)一步純化。將純化的多糖用0.1m2的PES膜，用6至8倍體積的MQW進(jìn)行 濃縮和滲濾。相應(yīng)地，用0.22WI1濾器進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾，并將最終純化的多糖儲(chǔ)存于-20°C。利用 上述方法純化多糖(包括HIC色譜法)所用的總時(shí)間為10至12小時(shí)。此外，用上文中所述方法 部分地純化多糖。該方法可需要幾個(gè)更多的步驟W完成多糖純化，并且可能不是成本有效 的方法。
[0060] 實(shí)施例-5:
[0061] 利用氨氧化鋼WTris緩沖液和疏水相互作用色譜法化1C)進(jìn)行多糖純化：
[0062] 經(jīng)滲濾和濃縮的具有粗制多糖的FB用1M化0H在75±5°C下進(jìn)行脫乙酷化2小時(shí)。 隨后將脫乙酷化的多糖冷卻至低于40°C的溫度。冷卻之后，將粗制經(jīng)脫乙酷化多糖用 lOOKDa的PES膜（0.1m2)，用20至25倍體積的MQW、隨后8至10倍體積的Tris HC1緩沖液 (pH7.4±0.1)進(jìn)行濃縮和滲濾。隨后，用0.22皿的陽(yáng)S膜(0.1 m2)進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾。
[0063] 將經(jīng)滲濾脫乙酷化的多糖W疏水相互作用色譜法化1C)，通過(guò)用苯基瓊脂糖6快流 速(Fast Flow,FF)填裝的XK-16柱，利用色譜系統(tǒng)進(jìn)一步純化。將該柱用含有20%硫酸錠的 20mM Tris HC1緩沖液(pH7.4±0.1)平衡。該材料W60cm/小時(shí)的速度加載，并收集流經(jīng)的 含有純化多糖的流。最后，用20mM Tris肥1緩沖液(pH 7.4±0)將柱再生，并在20%的乙醇 中保存W備用。將純化的多糖用1 OOKDa的PES膜(0.1 m2)，用6至8倍體積的MQW進(jìn)行濃縮和滲 濾，并W0.22WI1濾器進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾，并將最終純化的多糖儲(chǔ)存于-20°C。純化多糖所用的總 時(shí)間為6 ± 1小時(shí)，并且該P(yáng)S質(zhì)量達(dá)到W冊(cè)規(guī)格要求。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于純化Men c-多糖的方法，其中所述方法包括以下步驟： (a) 將發(fā)酵收獲物離心以使發(fā)酵液澄清； (b) 通過(guò)超濾濃縮發(fā)酵上清液； (c) 脫乙?；⒃诟邷叵路跤襟E(b)的所述經(jīng)濃縮上清液； (d) 收集步驟(c)的上清液，并使其經(jīng)受滲濾和濃縮； (e) 通過(guò)色譜法純化步驟(d)的經(jīng)滲濾上清液； (f) 滲濾并濃縮以獲得純化的多糖； (g) 對(duì)所述純化的多糖進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾； 其中所述純化方法在6 ± 1小時(shí)內(nèi)迅速完成。2. 如權(quán)利要求1(a)所述的方法，其中發(fā)酵收獲物的所述離心以4500 Xg至5000 Xg進(jìn) 行。3. 如權(quán)利要求1(b)所述的方法，其中所述超濾通過(guò)lOOKDa分子截留膜進(jìn)行。4. 如權(quán)利要求1(c)所述的方法，其中所述脫乙?；脻舛葹?至1.5M的NaOH溶液進(jìn)行。5. 如權(quán)利要求1(c)所述的方法，其中所述溫度為70°C至80°C。6. 如權(quán)利要求1(c)所述的方法，其中用于脫乙?；目偡跤龝r(shí)間為1小時(shí)30分鐘至2小 時(shí)30分鐘。7. 如權(quán)利要求1(d)所述的方法，其中脫乙?；蟮乃鰸B濾用Mili-Q水進(jìn)行20至25 次，隨后用25mM Tris HC1緩沖液進(jìn)行8至10次。8. 如權(quán)利要求1(e)所述的方法，其中所述色譜法為苯基瓊脂糖凝膠6快流速疏水相互 作用色譜法(HIC)。9. 如權(quán)利要求1 (f)所述的方法，其中所述滲濾和濃縮用lOOKDa PES膜(0. lm2)，用6至8 倍體積的Mill i-Q水進(jìn)行。10. 如權(quán)利要求1 (g)所述的方法，其中所述無(wú)菌過(guò)濾用〇. 22μπι PES濾膜進(jìn)行。
【文檔編號(hào)】C08B37/00GK106062006SQ201580010062
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2015年2月24日
【發(fā)明人】達(dá)溫德·吉爾, 馬諾伊·庫(kù)馬爾·奇卡拉, 桑迪普·夏爾馬, 薩爾馬德·哈尼夫, 尼拉伊·喬希
【申請(qǐng)人】默沙東和惠康基金會(huì)合資的希勒曼實(shí)驗(yàn)室私人有限公司