提取用于生產(chǎn)生物燃料的脂質(zhì)的方法
【專利摘要】用于從發(fā)酵培養(yǎng)液提取適于生產(chǎn)生物燃料的脂質(zhì)的方法和系統(tǒng)可以包括加熱以預(yù)處理發(fā)酵培養(yǎng)液從而易于從培養(yǎng)液中的含油微生物提取產(chǎn)物。此外或可替換地，可以用包含淀粉酶、1?4甘露糖苷酶、和1?3甘露糖苷酶的酶組合來分解含油微生物的細(xì)胞壁?？苫厥諝堄嗟呐囵B(yǎng)液水分并用作洗滌加工原料的吸入水(imbibition water)以提取糖。
【專利說明】
提取用于生產(chǎn)生物燃料的脂質(zhì)的方法
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求申請(qǐng)日為2013年12月20日的序列號(hào)為61/918,850的美國臨時(shí)專利申 請(qǐng)的權(quán)益。 陶]合作研究協(xié)議的各方名稱
[0004] 出于確定現(xiàn)有技術(shù)的目的，BP Biofuels UK Limited和Biosciences Corporation之間于2008年12月18日在生物燃料領(lǐng)域中執(zhí)行了一項(xiàng)合作研究協(xié)議。同樣出 于確定現(xiàn)有技術(shù)的目的，BP Biofuels UK Limited和Ma;rtek Biosciences Corporation之 間于2009年8月7日在生物燃料領(lǐng)域中執(zhí)行了一項(xiàng)合作研究協(xié)議。同樣出于確定現(xiàn)有技術(shù)的 目的，BP Bio 化 els UK Limited 和 DSM Biobased Products and Services B.V.之間于 2012年9月1日在生物燃料領(lǐng)域中執(zhí)行了一項(xiàng)合作研究協(xié)議。
技術(shù)領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明設(shè)及針對(duì)提取用于生物燃料生產(chǎn)的材料的方法和系統(tǒng)。本發(fā)明的方面設(shè)及 從含油微生物提取材料。
[00(?] 發(fā)明背景
[0007]已開發(fā)了一些用于將原料轉(zhuǎn)化為生物燃料的技術(shù)。然而，即使有運(yùn)些技術(shù)上的進(jìn) 步，仍然需要并渴求改進(jìn)將可再生碳源轉(zhuǎn)變?yōu)槿剂系慕?jīng)濟(jì)可行性。
[000引植物油來源的生物燃料可能具有益處，例如其是可再生的、生物可降解的、無毒 的，并且在一些情況下既不含硫也不含芳香族化合物。但植物油來源的生物燃料一個(gè)潛在 的缺點(diǎn)是高成本，其大多數(shù)是緣于植物油原料的成本。因此，生物燃料生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)方面至少 在某種程度上受到了植物油原材料的成本，W及植物油原材料受限的供應(yīng)的限制。
[0009] 用于在營養(yǎng)產(chǎn)品中使用的脂質(zhì)可W在微生物中產(chǎn)生。例如，藻類中脂質(zhì)的生產(chǎn)可 W包括培育藻類，將其干燥，并從其提取細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)。從微生物之內(nèi)提取材料可W是困難 的。
[0010] 類似地，酵母(包括油性酵母)具有多糖細(xì)胞壁來保護(hù)其抵抗環(huán)境壓力，如剪切力、 滲透壓失衡、干燥、捕食者，等等。保護(hù)性的細(xì)胞壁使得收獲油性酵母中能轉(zhuǎn)化為生物燃料 的細(xì)胞內(nèi)代謝物(如脂質(zhì))變得困難。
[0011] 用異養(yǎng)微生物采用水或溶劑提取段(extraction section)將糖轉(zhuǎn)化為生物燃料 是可能的，其中部分的微生物溶解于水或另一溶劑中，從而使產(chǎn)物脂質(zhì)能從發(fā)酵培養(yǎng)液去 除或直接回收。可W用機(jī)械力、熱力、滲透壓力、和酶促力的組合從油性生物的內(nèi)隔室回收 產(chǎn)物，產(chǎn)生由輕脂質(zhì)、去脂生物質(zhì)、和水殘留物及其他細(xì)胞殘留物組成的多相產(chǎn)物流。單次 經(jīng)過(once-t虹ough)加工通常產(chǎn)生相當(dāng)?shù)膹U物和/或副產(chǎn)物流。
[0012] 需要且渴求用于從含油微生物提取材料的方法和系統(tǒng)，其產(chǎn)生高產(chǎn)量/得率 (yield)的用非溶劑/水提取技術(shù)提取的材料。還需要和渴求用于從含油微生物提取材料的 方法和系統(tǒng)，其將殘余加工流再循環(huán)，而不是依賴于單次經(jīng)過加工。
[001引發(fā)明概述
[0014] 本發(fā)明設(shè)及用于從含油微生物提取材料的方法和系統(tǒng)，W及用于從提取的材料生 產(chǎn)生物燃料的方法和系統(tǒng)。
[0015] 根據(jù)一些實(shí)施方案，溫度可W用作預(yù)處理步驟W提高提取來自油性生物的產(chǎn)物的 產(chǎn)量/得率。更具體而言，從全發(fā)酵培養(yǎng)液提取適于生產(chǎn)生物燃料的脂質(zhì)的方法可W包括預(yù) 處理全發(fā)酵培養(yǎng)液，所述預(yù)處理通過將所述培養(yǎng)液加熱至大于約90°C，如約90°C至約150 °C，或約100°C至約150°C，或約110°C至約150°C，或約120°C至約150°C，或約130°C至約150 °C的溫度進(jìn)行，其中所述培養(yǎng)液含有含油微生物，并隨后從所述含油微生物提取產(chǎn)物?？蒞 加熱全發(fā)酵培養(yǎng)液多于約3小時(shí)。在一些實(shí)施方案中，通過將含有含油微生物的全發(fā)酵培養(yǎng) 液在少于60分鐘內(nèi)從45°C加熱至80°CW將所述含有含油微生物的全發(fā)酵培養(yǎng)液在45°C至 80°C之間所花費(fèi)的時(shí)間減至最小。此外或可替換地，可約0.1至約80攝氏度每分鐘的平 均速率加熱所述全發(fā)酵培養(yǎng)液。在運(yùn)個(gè)過程中，可W通過添加酸或堿來調(diào)整所述全發(fā)酵培 養(yǎng)液的抑。
[0016] 在進(jìn)一步的實(shí)施方案中，可W將所述全發(fā)酵培養(yǎng)液冷卻至大于約6(TC、或大于約 70°C、或大于約80°C、或大于約85°C、或大于約90°CW允許進(jìn)一步等溫(恒溫)加工，如應(yīng)用 機(jī)械破壞。可約1至約80攝氏度每分鐘的平均速率所述全發(fā)酵培養(yǎng)液。可約10cm每 秒至約240cm每秒的葉輪尖端速度攬拌所述全發(fā)酵培養(yǎng)液。可W在加熱后干燥所述全發(fā)酵 培養(yǎng)液。
[0017] 在一些實(shí)施方案中，在預(yù)處理過程中可W將含有所述全發(fā)酵培養(yǎng)液的系統(tǒng)中的壓 強(qiáng)維持在約lOpsi至約150psi，或約20psi至約150psi，或約30psi至約150psi，或約50psi至 約150psi。
[0018] 在所述預(yù)處理過程中含有所述全發(fā)酵培養(yǎng)液的系統(tǒng)中可W存在鹽，其在系統(tǒng)中導(dǎo) 致估計(jì)約0.01M至約2M的離子強(qiáng)度。所述全發(fā)酵培養(yǎng)液可W包含與濃度大于0.05g/L的鹽和 離子相關(guān)的粗制糖源。所述鹽和離子可W包括化、1(^3、1肖、211、和氯化物、硫酸鹽、憐酸鹽、 硝酸鹽，及其組合。運(yùn)些鹽和離子可W積累至0.5至40g/L的濃度。此外，在當(dāng)產(chǎn)物從機(jī)械和/ 或靜電聚并器(coalescer)中的含油微生物釋放時(shí)，已經(jīng)存在的鹽和離子可W幫助通過促 進(jìn)聚并（coalescence )、絮凝(f locculation)、密度變化和/或?qū)⑿纬傻娜橐喝シ€(wěn)定化而回 收油相。
[0019] 本文的方法還可W包括將所述含油微生物進(jìn)行裂解，導(dǎo)致液滴或碎片粒度分布， 其中至少80%或至少95%的體積的釋放產(chǎn)物油滴和碎片具有直徑大于O.lum的尺寸。此外， 可W通過W大于120cm/s的葉輪尖端速度混合來作為連續(xù)相回收所述油和細(xì)胞碎片液滴。
[0020] 在將油性細(xì)胞壁分解后，例如可W從所述油性細(xì)胞壁收獲細(xì)胞內(nèi)代謝物(包含脂 質(zhì)）?？蒞將所述細(xì)胞內(nèi)代謝物轉(zhuǎn)化為生物燃料，如生物來源的柴油。可W將收獲所述細(xì)胞 內(nèi)代謝物后剩余的水性提取流出物進(jìn)行再循環(huán)?？蒞用再循環(huán)的提取水作為吸入水用于洗 涂加工原料W提取糖。
[0021] 在預(yù)處理后，可W對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)液減壓并冷卻W在進(jìn)一步加工之前濃縮培養(yǎng)液中的 固體。此外或可替換地，在預(yù)處理后，可W包括蒸發(fā)器或干燥器W產(chǎn)生帶有細(xì)胞的濃縮的濕 培養(yǎng)液或干混合物?？蒞添加溶劑至干細(xì)胞或裂解發(fā)酵培養(yǎng)液W形成混合物。所述溶劑可 W包括己燒，十二燒，癸燒，柴油，一種或多種醇，或其組合?？蒞攬拌所述裂解發(fā)酵培養(yǎng)液 和溶劑的混合物W從含油微生物接觸或提取油?？蒞從所述裂解發(fā)酵培養(yǎng)液分離溶劑和 油，如通過使用離屯、機(jī)來進(jìn)行分離?？蓋使所述溶劑和油反應(yīng)w使至少一部分的油轉(zhuǎn)化為 燃料組分。此外，可W將所述溶劑和殘余的油轉(zhuǎn)化為包含生物燃料的燃料?？蒞將用過的培 養(yǎng)液用作作物的肥料、動(dòng)物飼料、酵母提取物、酵母水解產(chǎn)物、或碳源/營養(yǎng)源。
[0022] 在一些實(shí)施方案中，含有含油微生物的全發(fā)酵培養(yǎng)液可W包含糖原料。所述含有 含油微生物的全發(fā)酵培養(yǎng)液和糖原料可W包含約50至約250克脂質(zhì)每升發(fā)酵罐培養(yǎng)液，約0 至約50克糖每升發(fā)酵罐培養(yǎng)液，約0至約40克鹽每升發(fā)酵罐培養(yǎng)液，和約10至約100克無脂 質(zhì)干生物質(zhì)每升發(fā)酵罐培養(yǎng)液。
[0023] 根據(jù)一些實(shí)施方案，作為預(yù)處理的一部分，所述方法還可W包括對(duì)含有含油微生 物的全發(fā)酵培養(yǎng)液進(jìn)行己氏消毒，例如將所述全發(fā)酵培養(yǎng)液加熱到約4(TC至約8(TC約1分 鐘至約3小時(shí)來進(jìn)行。相比之下，在預(yù)處理加熱過程中，可W將全發(fā)酵培養(yǎng)液保持在約90°C 至約150°C，或約100°C至約150°C，或約110°C至約150°C，或約120°C至約150°C，或約130°C 至約150°C的溫度約30分鐘至約18小時(shí)，或多于3小時(shí)至約18小時(shí)，或多于3小時(shí)至約8小時(shí)。 可W在加熱間隔過程中攬拌所述全發(fā)酵培養(yǎng)液?？蒞將酸、堿、或酸和堿二者添加至所述全 發(fā)酵培養(yǎng)液。
[0024] 可W將全發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)過珠磨機(jī)、均質(zhì)機(jī)、孔板、高剪切混合機(jī)、或其他剪切力或 機(jī)械破壞設(shè)備至少一次、兩次、或更多次。在一些實(shí)施方案中，可W于約70°C至約100°C攬拌 所述容器中的全發(fā)酵培養(yǎng)液，任選包括回流約1至約60小時(shí)?？蒞將鹽，如化C1，KC1，K2S化， 或化2S化添加至所述容器中的全發(fā)酵培養(yǎng)液，或是可W在原位產(chǎn)生所述鹽，例如通過添加 化0H或K0H，加此S〇4。例如，可W添加例如多至按重量計(jì)約2 %的鹽?？蒞添加酸或堿W將所 述容器中的全發(fā)酵培養(yǎng)液的pH調(diào)整到約3至約11。上文列出的酸和堿的組合所產(chǎn)生的熱還 可W有助于減少加熱培養(yǎng)液所需的能量?？蒞通過合適的固-液-液分離方案從含水發(fā)酵培 養(yǎng)液分離脂質(zhì)，所述方案包括一個(gè)或多個(gè)步驟如重力分離、水力旋流器、過濾器、和/或離屯、 機(jī)?？赏ㄟ^離屯、從所述全發(fā)酵培養(yǎng)液分離低于20%脂肪酸的油。運(yùn)種提取適于生產(chǎn)微生物 油的脂質(zhì)的方法可產(chǎn)生人工低金屬的油，因?yàn)樗蕴崛?aqueous extraction)工藝濃縮了 發(fā)酵培養(yǎng)液中的金屬，與油相比其比率至少為2。該方法還可包括用殘留培養(yǎng)液水將生物質(zhì) 固體再循環(huán)。
[0025] 含油微生物可W包含按重量計(jì)至少40%脂肪。例如，所述含油微生物可W是含油 酵母細(xì)胞。
[00%]根據(jù)一些實(shí)施方案，可W用包含淀粉酶，1-4甘露糖巧酶，和1-3甘露糖巧酶的酶組 合來分解含油微生物的油性細(xì)胞壁。所述酶組合還可W包含至少一種輔助酶，即硫酸醋酶， 蛋白酶，殼多糖酶，或運(yùn)些酶的任何組合。淀粉酶可W特異性針對(duì)al-4連接的葡萄糖。所述 酶組合包含按重量計(jì)約5%至約30%的淀粉酶、按重量計(jì)約5%至約45%的1-4甘露糖巧酶， 按重量計(jì)約5%至約45%的1-3甘露糖巧酶，或運(yùn)些參數(shù)的任何組合。所述酶組合還可W包 含至少一種輔助酶，如硫酸醋酶，蛋白酶，殼多糖酶，或運(yùn)些酶的任何組合。所述酶組合可與 近玫色鎖擲酵母MK29404(Spo;ridioboluspara;roseusMK29404)-起使用。如上文所述，在 分解油性細(xì)胞壁后，例如可W從所述油性細(xì)胞壁收獲細(xì)胞內(nèi)代謝物(包括脂質(zhì)）。
[0027]根據(jù)一些實(shí)施方案，從全發(fā)酵培養(yǎng)液提取適于生產(chǎn)生物燃料的脂質(zhì)的方法可W包 括對(duì)含有含油微生物的全發(fā)酵培養(yǎng)液應(yīng)用酶組合W分解所述含油微生物的細(xì)胞壁，其中所 述酶包括淀粉酶，1-4甘露糖巧酶，和1-3甘露糖巧酶，隨后從所述含油微生物回收產(chǎn)物。所 述酶組合還可w包含至少一個(gè)輔助酶，如硫酸醋酶，蛋白酶，殼多糖酶，或運(yùn)些酶的任何組 合。淀粉酶可W特異性針對(duì)al-4連接的葡萄糖。所述酶組合可W包含按重量計(jì)約5%至約 30 %的淀粉酶、按重量計(jì)約5 %至約45 %的1-4甘露糖巧酶、按重量計(jì)約5 %至約45 %的1-3 甘露糖巧酶，或運(yùn)些參數(shù)的任何組合。
[0028] 所述方法還可W包括在分解細(xì)胞壁后從含油微生物收獲細(xì)胞內(nèi)代謝物，如脂質(zhì)。 所述細(xì)胞內(nèi)代謝物可W轉(zhuǎn)化為生物燃料，如生物來源的柴油。此外，可W將收獲所述細(xì)胞內(nèi) 代謝物后剩余的水性提取流出物進(jìn)行再循環(huán)?？蒞用再循環(huán)的提取水作為吸入水用于洗涂 加工原料W提取糖。
[0029] 根據(jù)一些實(shí)施方案，從含水發(fā)酵培養(yǎng)液提取適于生產(chǎn)生物燃料的脂質(zhì)的方法可W 包括從所述含水發(fā)酵培養(yǎng)液提取脂質(zhì)，其中所述培養(yǎng)液含有含油微生物或甘薦，或含油微 生物和甘薦二者，留下生物質(zhì)固體和殘余的培養(yǎng)液水;和用所述殘余的培養(yǎng)液水作為吸入 水用于洗涂加工原料W提取糖。所述方法還可W包括對(duì)所述含水發(fā)酵培養(yǎng)液進(jìn)行己氏消 毒，如通過將所述含水發(fā)酵培養(yǎng)液加熱到約40°C至約80°C約1分鐘至約3小時(shí)來進(jìn)行己氏消 毒。在一些實(shí)施方案中，所述方法可W包括將所述含水發(fā)酵培養(yǎng)液加熱到約9(TC至約150 °C，或約100°C至約150°C，或約110°C至約150°C，或約120°C至約150°C，或約130°C至約150 °C的溫度并將所述培養(yǎng)液在選擇的范圍內(nèi)保持約30分鐘至約18小時(shí)，或多于3小時(shí)至約18 小時(shí)，或多于3小時(shí)至約8小時(shí)?？蒞在加熱間隔過程中攬拌所述含水發(fā)酵培養(yǎng)液?？蒞添加 酸、堿、或酸和堿二者至所述含水發(fā)酵培養(yǎng)液?？蒞將所述含水發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)過珠磨機(jī)或其 他其他機(jī)械破碎設(shè)備一次、兩次、或更多次。
[0030] 附圖簡述
[0031] 所附的附圖并入本文并構(gòu)成本說明書的一部分，其描繪了本發(fā)明的實(shí)施方案，與 說明書一起用來解釋本發(fā)明的特征、優(yōu)點(diǎn)、和原理。在附圖中：
[0032] 圖1是工藝流程圖，其描繪了水提取工藝的一個(gè)實(shí)施方案，其使用溫度預(yù)處理并包 括酵母提取物的生產(chǎn)。
[0033] 圖2是工藝流程圖，其描繪了整合的糖-至-柴油工藝的一個(gè)實(shí)施方案，其包括再循 環(huán)。
[0034] 圖3是工藝流程圖，其描繪了實(shí)施例2中使用的水性提取工藝。
[0035] 圖4是實(shí)施例3中的裂解后釋放的油和細(xì)胞碎片的粒度分布的圖示。
[0036] 圖5是實(shí)施例3中的油產(chǎn)物回收后的油和細(xì)胞碎片的粒度分布的圖示。
[0037] 發(fā)明詳述
[0038] 本發(fā)明提供用于從含油微生物提取材料的方法和系統(tǒng)，W及用于從提取的材料生 產(chǎn)生物燃料的方法和系統(tǒng)。從微生物生產(chǎn)生物燃料可W相對(duì)于從植物(包括油巧)生產(chǎn)生物 燃料具有許多優(yōu)勢，如循環(huán)周期短，勞力需求少，不依賴季節(jié)和溫度，W及更容易放大。
[0039] 如下文更詳述的，在油提取之前通過直接加熱培養(yǎng)液至相對(duì)較高的溫度來預(yù)處理 發(fā)酵培養(yǎng)液能增加從含油微生物提取的油的量，所述提取通過熱降解細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)來進(jìn)行， 從而增加通透性并且油能更容易地?cái)U(kuò)散。此外或可替換地，可W用包含淀粉酶，1-4甘露糖 巧酶，和1-3甘露糖巧酶的酶組合來分解含油微生物的油性細(xì)胞壁。在本文所述的任何方法 中，可W將脂質(zhì)去除后剩余的水性提取流出物進(jìn)行再循環(huán)至前端糖回收操作。
[0040] 如本文所用的，術(shù)語"預(yù)處理(pre-treat r和"預(yù)處理（pre-treatment r意指在從 微生物內(nèi)物理分離任何材料之前在所述微生物上實(shí)施的工藝步驟。
[0041] 如本文所用的，術(shù)語"可再生材料"優(yōu)選為意指至少部分來源于至少能部分由天然 生態(tài)循環(huán)和/或資源所更換的來源和/或工藝的物質(zhì)和/或物品。可再生材料可W廣泛包括 例如化學(xué)品，化學(xué)中間體，溶劑，粘合劑，潤滑劑，單體，寡聚物，聚合物，生物燃料，生物燃料 中間體，生物汽油，生物汽油共混原料，生物柴油，綠色柴油，可再生柴油，生物柴油共混原 料，生物饋出物，生物炭(biochar )，生物焦炭(biocoke )，生物油，可再生的建筑物料，等等。 更具體舉例而言，所述可再生材料可W包括但不限于如下的一個(gè)或多個(gè)：甲燒，乙醇，正下 醇，異下醇，2-下醇，脂肪醇，異下締，異戊二締，甘油=醋，脂類，脂肪酸，乳酸，乙酸，丙二 醇，下二醇。根據(jù)一些實(shí)施方案，所述可再生材料可W包括一種或多種生物燃料組分。例如， 所述可再生材料可W包括醇(如乙醇，下醇，或異下醇），或脂質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，所述可 再生材料可W來源于活生物，如藻類、細(xì)菌、真菌，等等。根據(jù)一些實(shí)施方案，所述可再生材 料是脂質(zhì)，如碳鏈長度概貌(profile)至少某種程度上與菜巧油相似的脂肪酸。
[0042] 術(shù)語"生物燃料"優(yōu)選為意指適于用作燃料和/或火源的至少部分來源于可再生來 源的組分和/或流(streams)。生物燃料可W持續(xù)生產(chǎn)和/或具有減少凈碳排放的和/或沒有 凈碳排放(總碳循環(huán)周期)至大氣，如與化石燃料相比時(shí)。根據(jù)一些實(shí)施方案，可再生來源可 W包括例如從地下開采或鉆探出的材料。在一些實(shí)施方案中，可再生來源可W包括單細(xì)胞 生物、多細(xì)胞生物、植物、真菌、細(xì)菌、藻類、耕作農(nóng)作物、非耕作農(nóng)作物、木材，等等。
[0043] 根據(jù)一些實(shí)施方案，可再生來源包括微生物。生物燃料可W適于用作運(yùn)輸燃料，如 用于陸地交通工具、海洋交通工具、航空交通工具，等等。更具體而言，所述生物燃料可W包 括汽油、柴油、噴氣燃料、煤油，等等。生物燃料可W適于用于產(chǎn)生能量（power generation)，如提升蒸汽(raising steam)，用合適的熱轉(zhuǎn)移介質(zhì)來交換能量，產(chǎn)生合成氣 (syngas)，產(chǎn)生氨，發(fā)電，等等。根據(jù)一些實(shí)施方案，所述生物燃料是生物柴油和石油柴油的 共混物。
[0044] 如本文所用的，術(shù)語"生物柴油"和"生物來源的柴油"可互換地使用，且意指適于 直接使用和/或共混于柴油匯集物(diesel pool)和/或來源于可再生源的嫁蠟燒供應(yīng)物的 組分或流。合適的生物柴油分子可W包括脂肪酸醋。生物柴油可用于壓燃式發(fā)動(dòng)機(jī)，如汽車 柴油內(nèi)燃機(jī)，卡車重載柴油發(fā)動(dòng)機(jī)，等等。作為選擇地，生物柴油還可W用于燃?xì)鉂M輪機(jī)，加 熱器，鍋爐，等等。根據(jù)一些實(shí)施方案，生物柴油和/或生物柴油共混物滿足或符合工業(yè)上可 接受的燃料標(biāo)準(zhǔn)，如 85、87、810、815、820、840、860、880、899.9、8100、等等。
[0045] 如本文所用的，術(shù)語"脂質(zhì)"意指油，脂肪，蠟，油脂，膽固醇，甘油醋，醬醇，憐脂，腦 巧脂，脂肪酸，脂肪酸相關(guān)化合物，衍生化合物，其他油性物質(zhì)，等等。脂質(zhì)通常包含相對(duì)高 的能量含量，例如基于重量而言。
[0046] 如本文所用的，術(shù)語"微生物"意指微觀的生物，其可W是單細(xì)胞(單細(xì)胞的），細(xì)胞 簇，或多細(xì)胞的相對(duì)復(fù)雜的生物。微生物可W包括藻類、真菌(包括酵母）、細(xì)菌、藍(lán)細(xì)菌(藍(lán) 藻）、原生生物，等等。
[0047] 在一個(gè)實(shí)施方案中，所述微生物可W是真菌界的單細(xì)胞成員，例如酵母?？蒞使用 的含油真菌的例子包括但不限于牧草紅酵母(化odotorula ingeniosa)或近玫色鎖擲酵母 (Sporidiobolus pararoseus)，W及來自如下屬的成員：曲霉屬（Aspergillus)、念珠菌屬 (Candida)、隱球菌屬（Cryptococcus )、德己利酵母屬（Debaromyces)、擬內(nèi)抱霉屬 (Endomycopsis)、鑲抱屬（Fusarium)、地霉屬（Geotrichum)、生絲畢赤酵母屬 化yphopichia)、油脂酵母屬(Xipomyces)、毛霉屬(Mucor)、青霉屬（Penicillium)、畢赤酵 母屬(Pichia)、擬酵母屬(Pseudozyma)、根霉屬(Rhizopus)、紅酵母屬(Rhodotorula)、紅冬 抱酵母屬（Rodosporidium)、擲抱酵母屬（Sporobolomyces)、Starmerella、有抱圓酵母屬 (Torulaspora)、絲抱酵母屬（Trichosporon)、威克漢姆酵母(Wickerhamomyces)、耶氏酵母 屬（Yarrowia)、接囊菌屬（Zygoascus)、和Zygolipomyces。更具體而言，所述含油真菌可W 包括例如任何如下：Apiotrichum curvatum、蜂生念珠菌（Candida apicola)、Candida bombi CO la、橄攬念珠菌(Candida oleophi la)、念珠菌屬菌種(Candida sp ?)、熱帶念珠菌 (Candida tropicalis)、淺白隱球菌（Cryptococcus a化idus)、彎曲隱球菌（Cryptococcus curvatus)、陸生隱球菌（CiTptococcus terricolus)、漢遜德己利酵母（Debaromyces hansenii)、Endomycopsis vernalis^Geotrichum carabidarum、Geotrichum cucujoidarum、Geotrichum histendarum、林生地霉（Geotrichum silvicola)、麥生地霉 (Geotrichum vulgare)、Hyphopichia burtonii、產(chǎn)油油月旨酉孝母（Lipomyces lipofer)、 Lipomyces orentalis、斯達(dá)油脂酵母(Xipomyces starkeyi)、四抱子油脂酵母（Lipomyces tetrasporous)、墨西哥畢赤酵母（Pichia mexicana)、球紅冬抱酵母（Rhodosporidium sphaerocarpum)、圓紅冬抱酵母（Rhodosporidium toruloides)、紅酵母屬菌種 (Rhodotorula sp.)黃參王酉孝母(民hodotorula aura打tiaca)、民hodotorula daire打e打sis、 流散紅酵母（Rhodotorula diffluens)、膠粘紅酵母（Rhodotorula glutinus)、 加 odotorula glutinis、纖細(xì)紅酵母（加 odotorula gracilis)、牧草紅酵母（加 odotorula graminis)、小紅酵母（加 odotorula minuta)、膠紅酵母（加 odotorula mucilaginosa)、膠 紅酵母（Rhodotorula mucilaginosa)、深紅酵母（Rhodotorula rubra)、Rhodotorula terpenoidalis、Rhodotorula toruloides、淺紅擲抱酵母（Sporobolomyces a化orubescens)、Starmerella bombicola、戴爾有抱圓酵母（Torulaspora de化ruekii)、 Torulaspora pretoriensis、產(chǎn)油球擬酵母（Torulopsis lipof era)、球擬酵母屬菌種 (Toruposis sp.)、貝雷絲抱酉孝母(Trichosporon behrend) ^Trichosporon brassicae、頭 狀絲抱酵母（Trichosporon capitatum)、皮狀絲抱酵母（Trichosporon cutaneum)、 Trichosporon domesticum、親負(fù)己克絲抱酉孝母(Trichosporon laibachii) >Trichosporon loubieri、Trichosporon montevideense、35牙絲？S酉孝母(Trichosporon pullulans)、絲抱 酵母屬菌種（Trichosporon sp.)、Wickerhamomyces canadensis、解脂耶氏酵母（化rrowia lipolytica)、Zygoascus meyerae、和Zygolipomyces lactosus。
[0048] 本文所述的提取方法可^應(yīng)用于幾乎所有含油微生物。所述微生物可^在任何合 適的條件下運(yùn)作，發(fā)揮功能，和/或生存，所述條件如厭氧，好氧，光合，異養(yǎng)，等等的條件。根 據(jù)一些實(shí)施方案，所述酵母可^培養(yǎng)在異養(yǎng)的有空氣存在的條件下。
[0049] 如本文所用的，術(shù)語"含油/油性的（oleaginous)"意指帶油的、含油的和/或產(chǎn)油 的脂質(zhì)、脂肪和/或其他油樣的物質(zhì)。含油可^包括產(chǎn)生微生物總重量的按重量計(jì)至少約百 分之20的油、按重量計(jì)至少約百分之30的油、按重量計(jì)至少約百分之40的油、按重量計(jì)至少 約百分之50的油、按重量計(jì)至少約百分之60的油、按重量計(jì)至少約百分之70的油、按重量計(jì) 至少約百分之80的油，等等的微生物。含油可^意指在培養(yǎng)、脂質(zhì)積累、收獲條件處等等過 程中的微生物。
[0050] 可W從全發(fā)酵培養(yǎng)液提取適于用于生產(chǎn)生物燃料的微生物，所述全發(fā)酵培養(yǎng)液含 有含油微生物的富油微生物細(xì)胞。根據(jù)一些實(shí)施方案，所述全發(fā)酵培養(yǎng)液可W包含糖原料。 例如，所述全發(fā)酵培養(yǎng)液可W包含約50至約250克脂質(zhì)每升發(fā)酵罐培養(yǎng)液，約0至約50克糖 每升發(fā)酵罐培養(yǎng)液，約0至約40克鹽每升發(fā)酵罐培養(yǎng)液，和約10至約100克無脂質(zhì)干生物質(zhì) 每升發(fā)酵罐培養(yǎng)液。在一些實(shí)施方案中，所述含油微生物可W包含按重量計(jì)至少40%脂肪， 按重量計(jì)約40 %至約80 %脂肪，或重量計(jì)約50 %至約75 %脂肪。
[0051] 在熱預(yù)處理之前可W對(duì)所述全發(fā)酵培養(yǎng)液W使細(xì)胞酶失活并消除生產(chǎn)微生物的 存活W避免在儲(chǔ)存時(shí)復(fù)制。己氏消毒還提供充分控制措施來將目的產(chǎn)物的損害減至最小， 在運(yùn)種情況下也可W通過使脂肪酶失活來進(jìn)行。己氏消毒還可W通過如下方法來進(jìn)行:將 全發(fā)酵培養(yǎng)液加熱至低于約90°C (如約40°C至約80°C)低于3小時(shí)(如約1分鐘至約正好低于 3小時(shí)）。
[0052] 如所述，可W來通過用熱來預(yù)處理全發(fā)酵培養(yǎng)液W增加提取的油的量。所述全發(fā) 酵培養(yǎng)液的預(yù)處理包括熱處理伴隨加工pH的同時(shí)變化，其意在影響細(xì)胞壁組成中的熱-化 學(xué)變化。更具體而言，通過將所述培養(yǎng)液直接加熱至大于90°C的溫度(例如約9(TC至約150 °C，或約9rc至約150°C，或約100°C至約150°C，或約110°C至約150°C，或約120°C至約150 °C，或約130°C至約150°C的溫度)大于3小時(shí)，細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)經(jīng)歷了熱降解，其增加細(xì)胞壁的通 透性，從而使油能在隨后從含油微生物的產(chǎn)物提取過程中更容易地分散。變化的確切性質(zhì) 取決于生產(chǎn)菌株的細(xì)胞壁化學(xué)性質(zhì)。對(duì)于油性酵母，已觀察到預(yù)處理導(dǎo)致的包含細(xì)胞壁的 糖類(單體）的釋放。例如，伴隨用葉輪溫和攬拌將全發(fā)酵培養(yǎng)液保持在12rC正好超過3小 時(shí)至約8小時(shí)，可^通過增加細(xì)胞的多孔性來提供80-85%可提取率(6義化日(：1日13；[1;[17)。雖 然不是必要的，但可W將系統(tǒng)排放至大氣W通過蒸發(fā)促使發(fā)酵培養(yǎng)液濃縮從80%降低至 70%水含量。為了將脂肪分解活性減至最小，可能需要將含有含油微生物的全發(fā)酵培養(yǎng)液 在45°C至80°C所花費(fèi)的時(shí)間減至最小?？蒞通過在低于60分鐘內(nèi)將所述含有含油微生物的 全發(fā)酵培養(yǎng)從45°C加熱至80°C來實(shí)現(xiàn)所述減至最小。在一些實(shí)施方案中，可約0.1至約 80攝氏度每分鐘的平均速率加熱所述全發(fā)酵培養(yǎng)液。
[0053] 在預(yù)處理期間，還可W通過添加酸或堿來調(diào)整全發(fā)酵培養(yǎng)液的抑。例如，通過首先 添加酸然后添加堿，運(yùn)種處理可W導(dǎo)致油的早期釋放。通過使用試劑和其他酸，用酸、堿、 鹽、或酸、堿、或鹽的任何組合可W將抑調(diào)整至約0.5至14的范圍內(nèi)的任何水平。例如，可W 添加酸將pH調(diào)整到約3.0至約6.0。又例如，可W添加堿將調(diào)整到約8.0至約10.5。在一些實(shí) 施方案中，在預(yù)處理過程中鹽可W存在于含有所述全發(fā)酵培養(yǎng)液的系統(tǒng)中，在系統(tǒng)中產(chǎn)生 估算為約0.01M至約2.0M的離子強(qiáng)度。預(yù)處理步驟是工藝中最激進(jìn)的（aggressive)延長的 熱處理步驟，并且大多數(shù)的化學(xué)反應(yīng)發(fā)生在運(yùn)個(gè)階段過程中。隨后的機(jī)械裂解步驟將油釋 放至相對(duì)惰性的無反應(yīng)性的環(huán)境中?？蒞將經(jīng)過該預(yù)處理的發(fā)酵培養(yǎng)液在少于8小時(shí)內(nèi)聚 并，合適的是伴隨4小時(shí)的超過9(TC的額外加熱W及單獨(dú)混合。相比之下，單獨(dú)經(jīng)過己氏消 毒的培養(yǎng)液可能需要大量的額外混合，如多于8小時(shí)的額外混合，在9(TCW允許對(duì)油相的分 離。
[0054] 根據(jù)一些實(shí)施方案，全發(fā)酵培養(yǎng)液可W包含粗制糖源，其與濃度大于約0.05g/L的 鹽和離子相關(guān)。如本文所用的，術(shù)語"粗制糖"意指含有一個(gè)或多個(gè)二糖或單糖的糖提取物， 其來源于復(fù)雜的可再生原料(包括甘薦、甜高梁、和糖甜菜)或濃縮形式的糖提取物，包括糖 汁、原汁、稠汁、和糖蜜。粗制糖可W含有大于15wt%直到95wt%的二糖和單糖與形成殘余 物的水、鹽、礦物質(zhì)、原料殘留物、和復(fù)雜生物質(zhì)的任何組合?；蛘?，粗制糖可W描述為在干 物質(zhì)中含有60%-99%的糖單體對(duì)其他固體的比率。干物質(zhì)的其他非糖組分可W包括鹽、礦 物質(zhì)、原料殘留物、和復(fù)雜生物質(zhì)。
[005日]運(yùn)些與粗制糖源相關(guān)的鹽和離子可W包括化,1(、〔曰、]\%、2]1、加、]/[]1少6、(：〇、和氯化 物、硫酸鹽、憐酸鹽、硝酸鹽，及其組合。因此，可W將運(yùn)些鹽和離子引入高于微生物的發(fā)酵 生長所需濃度的濃度。例如，所述鹽和離子可W積累至0.5至40g/L的濃度。尤其獨(dú)特的是鐘 和巧，其可W積累至比大多數(shù)其他元素更高的濃度并且與通常的發(fā)酵培養(yǎng)液基質(zhì)不同。運(yùn) 些獨(dú)特的特性可W促進(jìn)脂質(zhì)和水相的分離。更具體而言，鐘濃度適當(dāng)?shù)馗哂阡摑舛取Ｔ谝恍?實(shí)施方案中，巧濃度可W大于Ig/L。在一些實(shí)施方案中，鐘濃度可W大于2.5g/L。在組合的 (built-up)濃度處，當(dāng)產(chǎn)物油從微生物細(xì)胞釋放時(shí)，引入的鹽和離子幫助通過聚并回收油 相。此外，在組合的濃度處，引入的鹽和離子消除了對(duì)額外的鹽和離子的需要，通常需要所 述額外的鹽和離子來幫助通過聚并回收油相，即誘導(dǎo)劑（inducer)或去乳化劑。因此，發(fā)酵 培養(yǎng)液在聚并階段過程中W及其他下游步驟過程中可W含有與預(yù)處理過程中相同的離子 比率或濃度。例如，發(fā)酵培養(yǎng)液可W在聚并期間具有0.5至40g/L的鹽和離子濃度。
[0056] 可W將改進(jìn)提取的添加劑的鹽添加至發(fā)酵培養(yǎng)液，或添加至糖源的洗涂水，或發(fā) 酵培養(yǎng)液和糖源的洗涂水二者。與鹽和離子一道，還可W將營養(yǎng)飼料，粗制的和純化的營養(yǎng) 源，氮或碳，粗制的或部分精制的糖源，和/或不同水源添加至發(fā)酵培養(yǎng)基。
[0057] 當(dāng)在含有粗制糖的發(fā)酵培養(yǎng)液上實(shí)施提取方法時(shí)，可W回收粗制油，所述粗制油 與利用全干生物質(zhì)和/或溶劑來回收粗制油的提取技術(shù)相比金屬和無機(jī)元素低，如化、K、P、 0曰、1邑、2]1，等等。
[005引同樣在預(yù)處理過程中，可W在含有全發(fā)酵培養(yǎng)液的系統(tǒng)中維持約lOpsi至約 150psi，或約20psi至約150psi，或約30psi至約150psi，或約50psi至約150psi的壓強(qiáng)。如果 用蒸汽噴射器將系統(tǒng)保持在真空下的話，運(yùn)種有效溫度和壓強(qiáng)可W更低。
[0059] 在加熱后，可W將全發(fā)酵培養(yǎng)液冷卻或干燥，或冷卻和干燥二者，W允許進(jìn)一步的 等溫(恒溫)加工。更具體而言，本文的"等溫加工"意指不需要額外加熱或冷卻的加工。對(duì)于 冷卻和/或干燥而言，例如可W將全發(fā)酵培養(yǎng)液冷卻至大于約60°C，或大于約70°C，或大于 約80°C，或大于約85°C，或大于約90°C。還可W將發(fā)酵培養(yǎng)液減壓與冷卻組合W在進(jìn)一步加 工之前濃縮培養(yǎng)液中的固體。進(jìn)一步加工可W包括應(yīng)用機(jī)械破碎，其使用例如如下的設(shè)備 進(jìn)行一次經(jīng)過、兩次經(jīng)過或更多次經(jīng)過：珠磨機(jī)、均質(zhì)機(jī)、孔板、高剪切混合機(jī)、壓制機(jī) (pres S )、擠出機(jī)(extruder )、壓力破碎、濕磨、干磨、或其他剪切力或機(jī)械破壞設(shè)備。例如， 兩次經(jīng)過珠磨機(jī)可W提供大于90%的可提取率。進(jìn)一步添加酸可W促進(jìn)聚并。例如，可W將 全發(fā)酵培養(yǎng)液W約0.2至約80,或約0.2至約1攝氏度每分鐘的平均速率進(jìn)行冷卻。此外或可 替換地，可W用閃蒸器(flash evaporator)來濃縮培養(yǎng)液中的固體。
[0060] 為了提供額外的攬拌，例如可W在容器中于約7(TC至約10(TC的溫度攬拌全發(fā)酵 培養(yǎng)液，其任選地包括回流約1至約60小時(shí)，從而提供60至85%油回收。如果需要的話，可W 保持W約10至約300cm每秒，或約120至約240cm每秒的葉輪尖端速度攬拌全發(fā)酵培養(yǎng)液。運(yùn) 種攬拌可W用例如徑向或軸向流式葉輪（如拉什頓葉輪(Rushton impeller)或海用葉輪 (marine impeller))的任何有利組合來進(jìn)行。任選地，在攬拌過程中還可W進(jìn)行進(jìn)一步的 溫度調(diào)整、抑調(diào)整、鹽添加或運(yùn)些行為的任何組合。例如，可w在容器中向全發(fā)酵培養(yǎng)液添 加多至按重量計(jì)約2%的鹽，如化C1、KC1、K2S04、或化2S〇4,或是作為選擇地，可W將在原位 產(chǎn)生所述鹽，例如通過添加 NaOH或KOH，加出S化來產(chǎn)生。又例如，可W添加酸或堿將容器中全 發(fā)酵培養(yǎng)液的抑調(diào)整到約3至約11。從上文列出的酸和堿的組合產(chǎn)生的熱還可W有助于降 低加熱所述培養(yǎng)液所需的能量。
[0061] 作為額外的預(yù)處理步驟，可W對(duì)含油微生物進(jìn)行裂解，其產(chǎn)生油體(oil body)和 細(xì)胞碎片粒度分布，其中至少80%或至少95%體積的釋放產(chǎn)物油體和碎片具有直徑大于 O.lum的尺寸，所述直徑是穿過所述液滴、顆粒、或體的最大距離?？蒞用粒度分析儀 (化；rticle Size Analyzer)來測量所述直徑，所述粒度分析儀可從Malvern Instruments Ltd of Worcestershire,UK獲得。更具體而言，熱預(yù)處理有助于裂解，其在生物質(zhì)一旦被消 化掉時(shí)釋放油。由于運(yùn)種粒度分布，可W容易地通過單一混合聚并步驟W連續(xù)相回收所述 油和細(xì)胞碎片液滴，所述混合是在例如3英寸(7.62cm)拉什頓型葉輪上W大于120cm每秒的 葉輪尖端速度進(jìn)行的。聚并的脂質(zhì)可W產(chǎn)生聚并的脂質(zhì)粒度分布，例如其中至少80%或至 少95%體積的聚并的脂質(zhì)具有直徑大于40um的尺寸。
[0062] 在加熱后可W將溶劑添加至干細(xì)胞或裂解發(fā)酵培養(yǎng)液W形成混合物。合適的溶劑 的例子包括己燒，十二燒，癸燒，柴油，醇，極性溶劑，非極性溶劑，及其組合。然后可W攬拌 混合物W允許溶劑接觸并從含油微生物的全細(xì)胞提取油。在一段合適的時(shí)間后，可W分離 流，如通過離屯、機(jī)、沉降槽、旋流(cyclone),或運(yùn)些技術(shù)的任意組合，W從發(fā)酵培養(yǎng)液分離 溶劑和油。然后可W使所述溶劑和油流反應(yīng)W將油轉(zhuǎn)化為燃料組分，然后將溶劑和油的殘 余物轉(zhuǎn)化為包含生物燃料的燃料。運(yùn)種提取適于生產(chǎn)微生物油的脂質(zhì)的方法產(chǎn)生人工低金 屬的油，因?yàn)樗崛」に嚌饪s了發(fā)酵培養(yǎng)液中的金屬，與油相比其比率至少為2。
[0063] 由本文所述熱預(yù)處理產(chǎn)生的殘余的生物成分(biomeal)和用過的培養(yǎng)液可W包括 水溶液中的細(xì)胞壁多糖和蛋白，包括基質(zhì)和產(chǎn)生的鹽，W及去溶劑化的細(xì)胞壁碎片，無論是 裂解的或未裂解的。殘余的去脂生物成分或用過的培養(yǎng)液可W用作例如作物的肥料、動(dòng)物 飼料、酵母提取物、或碳源/營養(yǎng)源。更具體而言，由于發(fā)酵培養(yǎng)液中高水平的鐘，可W將用 過的培養(yǎng)液再循環(huán)為鐘源W肥料形式用于糖領(lǐng)域(sugar fields)或其他作物。使用水工 藝，殘余生物成分可W是與非水工藝產(chǎn)生的殘余生物成分相比更佳的形式，用于運(yùn)些其他 潛在的用途。
[0064] 圖1描繪了水提取工藝的一個(gè)例子，所述工藝施用溫度預(yù)處理且包括酵母提取物 的生產(chǎn)。所述工藝用發(fā)酵培養(yǎng)液10開始，可W(任選地）向其添加堿12。當(dāng)在容器14中將發(fā)酵 培養(yǎng)液10加熱至12rc并維持該溫度約8小時(shí)時(shí)，可W(任選地)添加酸16。在加熱處理后，隨 即在冷卻設(shè)備20中將預(yù)處理的培養(yǎng)液18冷卻（例如，如通過快速冷卻(flash-cooling))至 6(TC，并在該過程中釋放水蒸氣22。然后將濃縮的培養(yǎng)液24轉(zhuǎn)移至離屯、機(jī)26,其將培養(yǎng)液24 分離為油流28和水提取殘余流30。其他類型的分離技術(shù)(如沉降槽或旋流)也可W單獨(dú)或互 相組合使用。將水提取殘余流30引向加壓器32(或蒸發(fā)器），來自壓力的水34從其釋放，并且 形成酵母餅36并將其向水解器38前進(jìn)，所述水解器38中添加酸40。結(jié)果是水解的酵母餅42。
[0065] 可W對(duì)其實(shí)施本文的工藝的微生物包括但不限于藻類、真菌、和細(xì)菌。例如，合適 的真菌可W包括油性酵母，如屬于紅酵母屬、擬酵母屬、或鎖擲酵母屬的那些。
[0066] 根據(jù)一些實(shí)施方案，所述酵母屬于近玫色鎖擲酵母（Sporidiobolus pararoseus) 屬。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，公開的微生物是對(duì)應(yīng)于ATCC保藏號(hào)PTA-12508的微生物 (MK29404(化yl-13J)株）。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述微生物是對(duì)應(yīng)于ATCC保藏號(hào)PTA- 12509的微生物(MK29404(化yl-182J)株）。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述微生物是對(duì)應(yīng)于 ATCC保藏號(hào)PTA-12510的微生物(MK29404(Dryl-173N)株）。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述 微生物是對(duì)應(yīng)于ATCC保藏號(hào)PTA-12511的微生物(MK29404扣巧55)株）。在另一個(gè)具體實(shí)施 方案中，所述微生物是對(duì)應(yīng)于ATCC保藏號(hào)PTA-12512的微生物(MK29404(Dry41)株）。在另一 個(gè)具體實(shí)施方案中，所述微生物是對(duì)應(yīng)于ATCC保藏號(hào)PTA-12513的微生物(MK29404 (化y 1) 株）。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述微生物是對(duì)應(yīng)于ATCC保藏號(hào)PTA-12515的微生物 (MK29404(Dryl-147D)株）。在另一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述微生物是對(duì)應(yīng)于ATCC保藏號(hào) PTA-12516的微生物(M29404(Dryl-72D)株）。
[0067] 酵母具有多膚細(xì)胞壁來保護(hù)它們抵抗環(huán)境壓力，如剪切力、滲透壓失衡、干燥、捕 食者，等等。保護(hù)性的細(xì)胞壁使得收獲油性酵母中能轉(zhuǎn)化為生物燃料的細(xì)胞內(nèi)代謝物(如脂 質(zhì))變得困難。
[0068] 糖巧酶可用于分解多膚，從而用于降解酵母細(xì)胞壁。糖巧酶通常對(duì)多糖內(nèi)的特定 糖W及單體糖之間的特定連接是有作用的。例如，它們能區(qū)分0-1-4連接的葡萄糖(直鏈淀 粉巧郵-1-4連接的葡萄糖(纖維素）。然而，酵母不是全部由相同的多糖組成的，而是在糖單 體的類型和比率上W及單糖之間的連接類型上相差很大。
[0069] 因此，最適于細(xì)胞壁降解的糖巧酶的混合物取決于生物體。在糖-至-柴油轉(zhuǎn)化中 使用的一個(gè)具體的油性酵母(近玫色鎖擲酵母MK29404Dryl)具有尤其新的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。許 多酵母中普遍的結(jié)構(gòu)連接是e-1-3葡聚糖。然而，MK29404Dryl僅顯示出極少的1-3連接的葡 萄糖，代之Wa-1-4葡聚糖作為主要的糖連接。酵母細(xì)胞壁的另一個(gè)普遍組分是甘露糖，其 通常由1-6連接的甘露糖單體組成。相比之下，MK29404化yl含有的1-6-甘露糖非常少，而是 含有1-3和1-4連接的甘露糖二者。
[0070] 由于MK29404Dryl酵母細(xì)胞壁的具體組成，需要特定的酶組合來有效地降解該微 生物細(xì)胞壁。已發(fā)現(xiàn)包含淀粉酶，1-4甘露糖巧酶，和1-3甘露糖巧酶的酶組合對(duì)于分解含油 微生物(包括MK29404Dryl)的油性細(xì)胞壁特別有效。具體而言，所述酶組合可W包含按重量 計(jì)約5 %至約30 %，或約6 %至約25 %，或約7 %至約20 %的淀粉酶；按重量計(jì)約5 %至約 45 %，或約10 %至約35 %，或約15 %至約30 %的1-4甘露糖巧酶；和按重量計(jì)約5 %至約 45%，或約10%至約35%，或約15%至約30%的1-3甘露糖巧酶。
[0071] 所述酶組合還可W包含一種或多種輔助酶，如蛋白酶，硫酸醋酶，殼多糖酶，或運(yùn) 些酶的任何組合，W提高酶性能和脂質(zhì)回收。
[0072] 在用酶組合分解含有含油微生物的全發(fā)酵培養(yǎng)液內(nèi)的油性細(xì)胞壁之前或之后，可 W對(duì)所述全發(fā)酵培養(yǎng)液進(jìn)行如上文所述的熱預(yù)處理。更具體而言，可W將培養(yǎng)液加熱到約 90°C至約150°C的溫度超過3小時(shí)。
[0073] 在用酶組合分解含有含油微生物的全發(fā)酵培養(yǎng)液內(nèi)的油性細(xì)胞壁之后，可W從所 述油性細(xì)胞壁收獲細(xì)胞內(nèi)代謝物。合適的所述細(xì)胞內(nèi)代謝物含有脂質(zhì)。提取的脂質(zhì)可W用 于生產(chǎn)生物燃料，例如生物來源的柴油。
[0074] 更具體而言，如下文進(jìn)一步詳述的，可W添加溶劑（如己燒，十二燒，癸燒，柴油， 醇，或運(yùn)些溶劑的任何組合)至干細(xì)胞或裂解發(fā)酵培養(yǎng)液W形成混合物?？蒞攬拌所述培養(yǎng) 液和溶劑的混合物w從油性細(xì)胞壁接觸并提取油。隨后可w例如通過使用離屯、機(jī)從培養(yǎng)液 分離所述溶劑和油。可W使所述溶劑和油反應(yīng)W使至少一部分的油轉(zhuǎn)化為燃料組分?？蒞 將所述溶劑和殘余的油轉(zhuǎn)變?yōu)槿剂希瓷锶剂?。還可W將用過的培養(yǎng)液用作作物的肥料、 動(dòng)物飼料、酵母提取物、酵母水解產(chǎn)物、或碳源/營養(yǎng)源。
[0075] 如下文進(jìn)一步詳述的，可將收獲細(xì)胞內(nèi)代謝物后剩余的任何水性提取流出物再循 環(huán)。例如，可用再循環(huán)的提取水作為吸入水用于洗涂加工原料W提取糖。
[0076] 圖2是整合的糖-至-柴油工藝流程，其顯示了脂質(zhì)去除后剩余的水性提取流出物 是如何再循環(huán)至前端糖回收操作的。更具體而言，將再循環(huán)的提取水用作吸入水用于洗涂 加工原料W提取糖。此類整合是有益的，因?yàn)樵诮o料物質(zhì)上實(shí)現(xiàn)了更大的產(chǎn)量/得率，W及 廢物管理資金和加工成本的減少。
[0077] 雖然對(duì)于再循環(huán)廢物流通常是感興趣的，但關(guān)鍵是在工藝流程內(nèi)鑒定適當(dāng)?shù)脑傺?環(huán)點(diǎn)，其將回收值增至最大，同時(shí)還要考慮到再循環(huán)是如何影響整合的工藝流程的動(dòng)力學(xué) 和最佳操作的。
[0078] 如上文所述，可W將糖轉(zhuǎn)化為生物燃料(包括柴油），其是用例如異養(yǎng)微生物用水 提取段來進(jìn)行的，由此直接從含水發(fā)酵培養(yǎng)液移除并回收產(chǎn)物脂質(zhì)。通過熱力、機(jī)械力、滲 透壓力、和酶促力的組合從油性生物的內(nèi)部組分回收產(chǎn)物，其產(chǎn)生含有較不粘稠的脂質(zhì)、殘 余的培養(yǎng)液水、和去脂生物質(zhì)的多相產(chǎn)物流。如圖2中所示，可W將殘余的培養(yǎng)液水再循環(huán) 并用作吸入水用于洗涂加工原料來提取糖。
[0079] 圖2的工藝流程顯示了甘薦100和吸入水102給料至磨104。從磨104將糖溶液106給 料至處理設(shè)備108,同時(shí)將甘薦渣110分離出來。從處理設(shè)備10則尋MEV(多效蒸發(fā)器)原料112 送至蒸發(fā)器114,同時(shí)將泥渣(mud)116分離出來。從蒸發(fā)器114,將蒸汽/氣體118給料至種子 發(fā)酵設(shè)備124,同時(shí)將濃縮的糖流120給料至主發(fā)酵設(shè)備126,并將水122分離出來。隨著濃縮 的糖流120,將空氣128也添加至主發(fā)酵設(shè)備126。從主發(fā)酵設(shè)備126,將培養(yǎng)液130給料至水 性提取設(shè)備134,同時(shí)釋放水蒸氣和C〇2 132。從水性提取設(shè)備134,將產(chǎn)物油136分離出來， 將蒸發(fā)水138釋放，并將廢水140再循環(huán)至吸入水流102中。表1顯示了主流的樣品流量級(jí) (flow ma即itudes)W及圖2的糖-至-柴油工藝流程中的組分?；诒?中的數(shù)據(jù)計(jì)算出了 40%的吸入水減少，而該減少可歸因于再循環(huán)廢水。此外，計(jì)算出了對(duì)甘薦渣的5%的固體 補(bǔ)充，其也可歸因于再循環(huán)廢水。
[0080] 表1:糖-至-柴油工藝流程中主流和組分的流量級(jí)
[0081]

LUUBZ」 將版豕冉循許刃W八豕W 一部分廣生J步里頂巧個(gè)判W泣化，化巧：
[0083] 1.回收有機(jī)碳，其能進(jìn)一步轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物(參見益處5)
[0084] 2.從非脂質(zhì)生物質(zhì)和降低的(reduced)第一目的營養(yǎng)飼料(例如氨)至少部分回收 有機(jī)和無機(jī)營養(yǎng)物
[0085] 3.通過與甘薦渣共混合(comingling)從溶液分離未還原的非脂質(zhì)生物質(zhì)
[0086] 4.通過共混合甘薦渣和未回收的非脂質(zhì)生物質(zhì)得到額外的鍋爐料(boiler feed) 和能量產(chǎn)生
[0087] 5.降低發(fā)酵操作的嚴(yán)格性，其通過再循環(huán)允許更大的有機(jī)碳滑動(dòng)（slippage)和回 收(參見益處1)
[0088] 6.優(yōu)化糖流106和120,其用作針對(duì)種子和主發(fā)酵罐的特定料流
[0089] 7.通過使用再循環(huán)水用于吸入而降低新鮮水需求
[0090] 8.降低廢物處理的資金和操作成本
[0091] 再循環(huán)流可W在前述方法中實(shí)施，W提高關(guān)鍵成分的回收和轉(zhuǎn)變和提高總效率。 例如，在從含水發(fā)酵培養(yǎng)液提取適于生產(chǎn)生物燃料的脂質(zhì)的方法中（其中所述培養(yǎng)液含有 含油微生物或甘薦，或含油微生物和甘薦二者），可W對(duì)所述含水發(fā)酵培養(yǎng)液進(jìn)行己氏消 毒，如通過將所述含水發(fā)酵培養(yǎng)液加熱到約4(TC至約8(TC約1分鐘直至接近3小時(shí)來進(jìn)行己 氏消毒?？蒞對(duì)所述含水發(fā)酵培養(yǎng)液進(jìn)行熱預(yù)處理，所述熱預(yù)處理是通過將所述培養(yǎng)液加 熱到約90°C至約150°C，或約100°C至約150°C，或約110°C至約150°C，或約120°C至約150°C， 或約130°C至約150°C的溫度約30分鐘至約18小時(shí)，或多于3小時(shí)至約18小時(shí)，或多于3小時(shí) 至約8小時(shí)來進(jìn)行的?？蒞在加熱間隔過程中攬拌所述含水發(fā)酵培養(yǎng)液。可W括添加酸、堿 或酸和堿二者至所述含水發(fā)酵培養(yǎng)液?？蒞將所述含水發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)過珠磨機(jī)或其他機(jī)械 設(shè)備至少一次、或至少兩次、或更多次?？蒞在容器中于約70°C至約100°C在回流下攬拌所 述含水發(fā)酵培養(yǎng)液約1至約60小時(shí)。還可W添加鹽(如按重量計(jì)2%的鹽，如化C1、KC1、K2S化、 或化2S化)至容器中的含水發(fā)酵培養(yǎng)液，或者可W在原位產(chǎn)生所述鹽，例如通過添加化0H或 K0H，加出S化來產(chǎn)生?？蒞添加酸或堿來將容器中的含水發(fā)酵培養(yǎng)液的抑調(diào)整到約3至約11。 可W通過合適的固-液-液分離策略從含水發(fā)酵培養(yǎng)液分離脂質(zhì)，所述策略包括一個(gè)或多個(gè) 步驟如重力分離、水力旋流器、過濾器、和/或離屯、機(jī)，留下生物質(zhì)固體和殘余的培養(yǎng)液水。 可W用殘余的培養(yǎng)液水作為吸入水用于洗涂加工原料W提取糖。此外，可W將生物質(zhì)固體 與殘余的培養(yǎng)液水一起再循環(huán)。
[0092] 例如，可W通過使用氨化處理或轉(zhuǎn)醋作用W將脂質(zhì)轉(zhuǎn)化為生物燃料。
[0093] 根據(jù)一些實(shí)施方案，本發(fā)明還可W針對(duì)用于生產(chǎn)生物燃料的制造設(shè)備。根據(jù)一些 實(shí)施方案，所述制造設(shè)備包括脂質(zhì)提取單元。此外，所述制造設(shè)備可W包括熱預(yù)處理單元。 在一些實(shí)施方案中，所述制造設(shè)備可W包括使其能夠再循環(huán)殘留的培養(yǎng)液水的裝置。
[0094]根據(jù)一些實(shí)施方案，本發(fā)明可W針對(duì)可再生材料或生物燃料，或可再生材料和生 物燃料二者，其根據(jù)本文所述的任何方法而制得。
[00%]根據(jù)一些實(shí)施方案，本文的方法可W導(dǎo)致微生物的油提取產(chǎn)量/得率的增加。例 如，該方法可W導(dǎo)致微生物的油提取產(chǎn)量/得率增加至少約10個(gè)重量百分點(diǎn)。根據(jù)一些實(shí)施 方案，所述油提取產(chǎn)量/得率的增加可W是至少約10個(gè)重量百分點(diǎn)、至少約15個(gè)重量百分 點(diǎn)、或至少約20個(gè)重量百分點(diǎn). 實(shí)施例
[0096] 用于表征所述微生物性能的一個(gè)度量標(biāo)準(zhǔn)是脂肪酸可提取率，或FAE。根據(jù)本發(fā)明 任何微生物的FAE可W根據(jù)下式來計(jì)算：
[0097]
[0098] 其中b是細(xì)胞破碎之后的總生物質(zhì)，通常W克來測量；
[0099] 姑嫩是細(xì)胞破碎之前的FAME的百分比，其中(?頻W總克數(shù)FAME相對(duì)于(over)總克 數(shù)生物質(zhì)來計(jì)算;如本文所用的，術(shù)語"FAME"意指脂肪酸甲醋。
[0100] 均胃是細(xì)胞破碎之后FAME的百分比，其中姑鄉(xiāng)汾W總克數(shù)FAME相對(duì)于總克數(shù)生物 成分來計(jì)算;并且
[0101] 1是細(xì)胞破碎之后但在油回收步驟之前的油的總質(zhì)量，通常W克來測量。從微生物 或發(fā)酵培養(yǎng)液獲得運(yùn)些值在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力之內(nèi)。
[0102] 根據(jù)一些實(shí)施方案，本文所述方法可W導(dǎo)致微生物的油或脂肪酸可提取率指數(shù)的 增加。例如，所述方法可W導(dǎo)致微生物的FAE指數(shù)增加至少約10個(gè)重量百分點(diǎn)。
[0103] 在一些實(shí)施方案中，在用己燒回收油后，測量油的質(zhì)量化）。在用己燒回收油后還 測量FAME。在一些實(shí)施方案中，在FAME測量之前在樣品上進(jìn)行如本領(lǐng)域所知的真空蒸發(fā)。
[0104] 根據(jù)本發(fā)明任何微生物的提取產(chǎn)量/得率可W通過下式計(jì)算：
[0105]
[0106] 其中B是細(xì)胞破碎之前的總生物質(zhì)，通常W克來測量；
[0107] 姑嫩是細(xì)胞破碎之前的FAME的百分比，其中(?頻W總克數(shù)FAME相對(duì)于總克數(shù)生物 質(zhì)來計(jì)算；
[0108] C油是細(xì)胞破碎和油回收之后FAME的百分比，其中C油W總克數(shù)FAME相對(duì)于總克數(shù)油 來計(jì)算；W及
[0109] L是細(xì)胞破碎和油回收之后油總質(zhì)量，通常W克來測量。從微生物或發(fā)酵培養(yǎng)液獲 得運(yùn)些測量值在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的能力之內(nèi)。
[0110] 根據(jù)一些實(shí)施方案，本文所述的方法可W導(dǎo)致微生物的油提取產(chǎn)量/得率的增加。 例如，該方法可W導(dǎo)致微生物的油提取產(chǎn)量/得率增加至少約10個(gè)重量百分點(diǎn)。
[01川實(shí)施例1
[0112]使用含有糖汁的復(fù)雜糖源的油性酵母株發(fā)酵產(chǎn)出了未經(jīng)己氏消毒的全培養(yǎng)液用 于進(jìn)一步加工。通過在容器中將所述全培養(yǎng)液于30分鐘內(nèi)從27°C加熱至80°C并在80°C保持 3小時(shí)，對(duì)其進(jìn)行己氏消毒。經(jīng)己氏消毒的培養(yǎng)液顯示出16.8%的脂肪酸可提取率(FAE)。在 臺(tái)式離屯、機(jī)中W4500rpm(4000g)將己氏消毒的未裂解培養(yǎng)液離屯、5分鐘時(shí)，沒有可回收的 油相。
[0113] 將己氏消毒的培養(yǎng)液的等分試樣在帶有夾套(jacketed)并配有2個(gè)拉什頓葉輪的 2化罐中于106°C預(yù)處理8小時(shí)。溫度從26°C升至106°C在約45分鐘發(fā)生，其速率為約1.8°C/ 分鐘。預(yù)處理的培養(yǎng)液顯示出脂肪酸可提取率升高（80.75%)。在臺(tái)式離屯、機(jī)中W4500rpm 將己氏消毒的未裂解培養(yǎng)液離屯、5分鐘時(shí)，沒有可回收的油相。結(jié)果顯示于表2中。
[0114] 表2:實(shí)施例1的水提取條件和結(jié)果
[0115]
[i
[0117] 己氏消毒的和預(yù)處理的培養(yǎng)液各自W不同的流速裂解，即在KDL Pilot珠磨機(jī) (1.化容器，用0.5mm二氧化娃-氧化錯(cuò)介質(zhì)填充至85 %填滿體積）中W80ml/分鐘或380ml/ 分鐘經(jīng)過1次或2次。預(yù)處理的培養(yǎng)液W最小的磨中停留時(shí)間超過了己氏消毒的培養(yǎng)液的脂 肪酸可提取率(FAE)。^最高速(380ml/分鐘)經(jīng)過1次的預(yù)處理的培養(yǎng)液的可提取率與W最 低速(80ml/分鐘)經(jīng)過多次來加工的己氏消毒的培養(yǎng)液的可提取率是相當(dāng)?shù)摹?br>[0118] 將具有~95%脂肪酸可提取率的己氏消毒的或預(yù)處理的裂解培養(yǎng)液的樣品（200- 300g)用3N硫酸調(diào)整至pH 4。W成批模式在回流（帶有攬拌棒的500ml Erlenmeyer燒瓶）下 將樣品聚并。通過在臺(tái)式離屯、機(jī)中W4500巧m(4000g)離屯、15-50ml等分試樣5分鐘來監(jiān)測聚 并。
[0119] 在離屯、時(shí)聚并的培養(yǎng)液顯示出明顯不同的分離油層，其較低層包含用過的培養(yǎng) 液。預(yù)處理的裂解培養(yǎng)液的聚并在16小時(shí)內(nèi)完成。己氏消毒的裂解培養(yǎng)液需要超過40小時(shí) 來聚并。
[0120] 離屯、管頂部從回收油層W評(píng)估提取產(chǎn)量/得率。預(yù)處理的培養(yǎng)液的提取產(chǎn)量/得率 為84.1 %而己氏消毒的培養(yǎng)液的提取產(chǎn)量/得率為69.9%。
[0121] 油質(zhì)量一般通過經(jīng)滴定的游離脂肪酸(FFA)水平來確定。從己氏消毒的培養(yǎng)液和 預(yù)處理的培養(yǎng)液二者回收的粗制油的游離脂肪酸水平是相似的（1.2-1.3% )。
[0122] 實(shí)施例2
[0123] 使用含有糖汁的復(fù)雜糖源的油性酵母株發(fā)酵產(chǎn)出了未經(jīng)己氏消毒的全培養(yǎng)液用 于進(jìn)一步加工。本實(shí)施例的流程圖示于圖3中。如圖3中所示，用方案來提取未經(jīng)己氏消毒的 全培養(yǎng)液210,所述方案包括在攬拌的帶有夾套的容器214中于8(TC將所述培養(yǎng)液210己氏 消毒3小時(shí)。然后用硫酸將己氏消毒的培養(yǎng)液216調(diào)整至pH 4并將其送至預(yù)處理階段218,在 12rc，30psi (15psig)的壓強(qiáng)8小時(shí)。用1.8°C分鐘的溫度斜坡（temperature ramp)來加熱 培養(yǎng)液；W〇. 23°C/分鐘的速率冷卻培養(yǎng)液。然后將預(yù)處理的培養(yǎng)液220送至裂解階段222， 用珠磨機(jī)W200ml/分鐘進(jìn)行兩次經(jīng)過。然后將裂解的培養(yǎng)液224送至聚并階段226,其處于 9(TC ,70%濕度的充分?jǐn)埌枭w中。然后將聚并的培養(yǎng)液228送至固-液分離階段230,其中通 過二相(two-phase)或S相(three-phase)離屯、來離屯、所述聚并的培養(yǎng)液228 W回收粗制油 232。該工藝還產(chǎn)出用過的培養(yǎng)液相（其被分離至用過的重相234中），W及多種組合的 (assorted)固體流236。
[0124] 通過ICP分析來分析了未經(jīng)己氏消毒的全培養(yǎng)液的樣品中、回收的油中W及各個(gè) 排出流(包括用過的重相和固體）中的金屬濃度。未經(jīng)己氏消毒的全培養(yǎng)液中與回收的粗制 油中金屬的濃度比率顯示，起始全培養(yǎng)液具有回收自所述工藝的油的至少兩倍的金屬濃度 (排除Si和Cu)?；厥兆运龉に嚨拇种朴团c全發(fā)酵培養(yǎng)液相比顯著地耗盡了化、Mg、P、K、 化、]\1]1^6、和化。
[0125] 回收自所述提取工藝的粗制油與提取后從該工藝排出的其他流也顯著地耗盡了 船、1旨、？、1(、化、111^6、和211，所述其他流例如用過的重相和固體。
[0126] 表3:全培養(yǎng)液對(duì)回收自水性提取工藝的粗制油中的金屬濃度比較
[01271
[i
[0129] 實(shí)施例3
[0130] 在攬拌的容器中將油性酵母株的全發(fā)酵培養(yǎng)液加熱至12rC4小時(shí)。其后將培養(yǎng)液 冷卻至60°C并經(jīng)珠磨機(jī)化化Pilot，Glen 11113，咐)分別^3個(gè)不同流速（38〇1111/分鐘、 200ml/分鐘、和80ml/分鐘)運(yùn)行裂解W釋放細(xì)胞內(nèi)油產(chǎn)物。在磨制機(jī)中裂解后釋放的油的 粒度分布和細(xì)胞碎片顯示于圖4中。所有可測量的裂解細(xì)胞和油滴體積均超過0.1微米，說 明了在進(jìn)一步的加工中使用如離屯、的工藝來分離油和固相的潛力。
[0131] 油級(jí)分中的油產(chǎn)物可W通過在80°C或更高溫度混合來回收。W380ml/m裂解的化 各個(gè)培養(yǎng)液被置于用兩個(gè)3英寸（7.62cm)拉什頓葉輪混合的容器中。W15化pm的攬拌器速 度（尖端速度= 60cm/s，Tower NBS16)或WSOOrpm的攬拌器速度（尖端速度= 200cm/s， Tower NBS17)混合裂解培養(yǎng)液。在6小時(shí)混合結(jié)束時(shí)的油和細(xì)胞碎片的分布顯示于圖5中。 來自容器W500rpm，200cm/s的尖端速度的產(chǎn)物在臺(tái)式（bench top)離屯、機(jī)中W4500;rpm (4000g)離屯、5分鐘時(shí)顯示了明顯的分離的油相。來自容器Wl5化pm，60cm/s的尖端速度的 產(chǎn)物未顯示出游離油并且在離屯、時(shí)呈現(xiàn)出乳化相。
[0132]對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，在不偏離本發(fā)明的范圍或主旨前提下，可W對(duì) 本發(fā)明的結(jié)構(gòu)和方法進(jìn)行多種修改和變化。具體而言，任何一個(gè)實(shí)施方案的描述可W任意 地與其他實(shí)施方案的描述組合W產(chǎn)生兩個(gè)或更多個(gè)要素或限定的組合和/或變化。通過考 慮本文公開的本發(fā)明的說明書和實(shí)踐，本發(fā)明的其他實(shí)施方案對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)是顯 而易見的。意欲將說明書和實(shí)施例僅看作例示性，而本發(fā)明真正的范圍和精神通過所附的 權(quán)利要求書來指示。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種從全發(fā)酵培養(yǎng)液提取適于生產(chǎn)生物燃料的脂質(zhì)的方法，包括： 預(yù)處理所述全發(fā)酵培養(yǎng)液，所述預(yù)處理通過將所述培養(yǎng)液加熱至約90°C至約150°C，或 約100°C至約150°C、或約110°C至約150°C、或約120°C至約150°C、或約130°C至約150°C的溫 度來進(jìn)行，其中所述培養(yǎng)液含有含油微生物;和 隨后從所述含油微生物提取產(chǎn)物。2. 權(quán)利要求1的方法，其包括加熱所述全發(fā)酵培養(yǎng)液約30分鐘至約18小時(shí)，或多于約3 小時(shí)至約18小時(shí)，或多于3小時(shí)至約8小時(shí)。3. 權(quán)利要求1或2的方法，其包括通過將所述含有含油微生物的全發(fā)酵培養(yǎng)液在少于60 分鐘內(nèi)從45 °C加熱至80 °C而將所述含有含油微生物的全發(fā)酵培養(yǎng)液在45 °C至80 °C之間所 花費(fèi)的時(shí)間減至最小。4. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，包括以約0.1至約80攝氏度每分鐘的平均速率加熱所 述全發(fā)酵培養(yǎng)液。5. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括通過添加酸或堿調(diào)整所述全發(fā)酵培養(yǎng)液 的pH。6. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括將所述全發(fā)酵培養(yǎng)液冷卻至大于約60 。(:、或大于約70 °C、或大于約80 °C、或大于約85 °C、或大于約90 °C以允許進(jìn)一步等溫加工。7. 權(quán)利要求6的方法，其中所述進(jìn)一步等溫加工包括應(yīng)用機(jī)械破碎。8. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其包括以約0.2至約80攝氏度每分鐘的平均速率冷卻 所述全發(fā)酵培養(yǎng)液。9. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括在加熱后干燥所述全發(fā)酵培養(yǎng)液。10. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括以約l〇cm每秒至約240cm每秒的葉輪尖 端速度攪拌所述全發(fā)酵培養(yǎng)液。11. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括在預(yù)處理過程中將含有所述全發(fā)酵培 養(yǎng)液的系統(tǒng)中的壓強(qiáng)維持在約lOpsi至約150psi，或約20psi至約150psi，或約30psi至約 150psi，或約50psi至約 150psi。12. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中在所述預(yù)處理過程中在含有所述全發(fā)酵培養(yǎng)液 的系統(tǒng)中存在鹽，其在所述系統(tǒng)中導(dǎo)致約0.01M至約2M的離子強(qiáng)度。13. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括將所述含油微生物進(jìn)行裂解，產(chǎn)生液滴 或碎片粒度分布，其中至少80%體積的釋放產(chǎn)物油滴和碎片具有直徑大于O.lum的尺寸。14. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其進(jìn)一步包括將所述含油微生物進(jìn)行裂解，產(chǎn)生液滴 或碎片粒度分布，其中至少95%體積的釋放產(chǎn)物油滴和碎片具有直徑大于O.lum的尺寸。15. 權(quán)利要求14的方法，其進(jìn)一步包括通過以大于120cm/s的葉輪尖端速度混合來作為 連續(xù)相回收所述油和細(xì)胞碎片液滴。16. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中可通過將發(fā)酵培養(yǎng)液在超過90°C再加熱30分鐘 至約8小時(shí)而在少于8小時(shí)內(nèi)將經(jīng)過預(yù)處理的發(fā)酵培養(yǎng)液進(jìn)行聚并。17. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述提取過程以與油相比至少2的比率濃縮所述 全發(fā)酵培養(yǎng)液中的金屬。18. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其包括將所述方法實(shí)施于粗制糖并回收金屬和無機(jī) 元素較低的粗制油，所述金屬和無機(jī)元素較低是與利用全干生物質(zhì)和/或溶劑以回收粗制 油的提取技術(shù)相比。19. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述全發(fā)酵培養(yǎng)液包含與濃度>0.05g/L的鹽和 離子相關(guān)的粗制糖源。20. 權(quán)利要求19的方法，其中所述鹽和離子選自下組:Na、K、Ca、Mg、Zn、和氯化物、硫酸 鹽、磷酸鹽、硝酸鹽，及其組合。21. 權(quán)利要求19的方法，其中所述鹽和離子包括鉀、鈣，或其組合。22. 權(quán)利要求19至21任一項(xiàng)的方法，其中所述鹽和離子累積至0.5至40g/L的濃度。23. 權(quán)利要求19至22任一項(xiàng)的方法，其中所述鹽和離子包含濃度比鈉更高的鉀。24. 權(quán)利要求19至22任一項(xiàng)的方法，其中所述鹽和離子包含濃度大于lg/L的鈣。25. 權(quán)利要求19至23任一項(xiàng)的方法，其中所述鹽和離子包含濃度大于2.5g/L的鉀。26. 權(quán)利要求19至25任一項(xiàng)的方法，其中當(dāng)產(chǎn)物從含油微生物釋放時(shí)，所述鹽和離子幫 助通過聚并回收油相。27. 權(quán)利要求26的方法，其中所述發(fā)酵培養(yǎng)液在聚并過程中包含0.5至40g/L的鹽和離 子濃度。28. 權(quán)利要求26的方法，其中所述聚并導(dǎo)致聚并的脂質(zhì)粒度分布，其中至少80%體積的 聚并的脂質(zhì)具有直徑大于40um的尺寸。29. 權(quán)利要求26的方法，其中所述聚并導(dǎo)致聚并的脂質(zhì)粒度分布，其中至少95%體積的 聚并的脂質(zhì)具有直徑大于40um的尺寸。30. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其還包括在加熱之后對(duì)所述發(fā)酵培養(yǎng)液減壓，并冷卻 所述全發(fā)酵培養(yǎng)液以在進(jìn)一步加工之前濃縮培養(yǎng)液中的固體。31. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其還包括在加熱后添加溶劑至干細(xì)胞或裂解發(fā)酵培 養(yǎng)液以形成混合物。32. 權(quán)利要求31的方法，其中所述溶劑選自下組：己烷，十二烷，癸烷，柴油，醇，及其組 合。33. 權(quán)利要求31或32的方法，其還包括攪拌所述裂解發(fā)酵培養(yǎng)液和溶劑的混合物以從 含油微生物接觸并提取油。34. 權(quán)利要求33的方法，其還包括從所述裂解發(fā)酵培養(yǎng)液分離所述溶劑和油。35. 權(quán)利要求34的方法，其包括用離心機(jī)從所述裂解發(fā)酵培養(yǎng)液分離所述溶劑和油。36. 權(quán)利要求34或35的方法，其還包括使所述溶劑和油反應(yīng)以使至少一部分的油轉(zhuǎn)化 為燃料組分。37. 權(quán)利要求36的方法，其還包括將所述溶劑和殘余的油轉(zhuǎn)化為包含生物燃料的燃料。38. 權(quán)利要求34至37任一項(xiàng)的方法，其還包括將用過的培養(yǎng)液用作作物的肥料、動(dòng)物飼 料、酵母提取物、酵母水解產(chǎn)物、或碳源/營養(yǎng)源。39. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中含有所述含油微生物的全發(fā)酵培養(yǎng)液包含糖原 料。40. 權(quán)利要求39的方法，其中所述含有含油微生物的全發(fā)酵培養(yǎng)液和糖原料包含約50 至約250克脂質(zhì)每升發(fā)酵罐培養(yǎng)液，約0至約50克糖每升發(fā)酵罐培養(yǎng)液，約0至約40克鹽每升 發(fā)酵罐培養(yǎng)液，和約10至約100克無脂質(zhì)干生物質(zhì)每升發(fā)酵罐培養(yǎng)液。41. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述含油微生物包含按重量計(jì)至少40 %脂肪。42. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其還包括對(duì)含有所述含油微生物的全發(fā)酵培養(yǎng)液進(jìn) 行巴氏消毒。43. 權(quán)利要求42的方法，其包括通過將所述全發(fā)酵培養(yǎng)液加熱到約40°C至約80°C約1分 鐘至約3小時(shí)而對(duì)所述全發(fā)酵培養(yǎng)液進(jìn)行巴氏消毒。44. 權(quán)利要求43的方法，其還包括將所述全發(fā)酵培養(yǎng)液保持在約90°C至約150°C，或約 100°C至約150°C，或約110°C至約150°C，或約120°C至約150°C，或約130°C至約150°C的溫度 約30分鐘至約18小時(shí)，或多于3小時(shí)至約18小時(shí)，或多于3小時(shí)至約8小時(shí)。45. 權(quán)利要求44的方法，其還包括在加熱間隔過程中攪拌所述全發(fā)酵培養(yǎng)液。46. 權(quán)利要求44或45的方法，其還包括添加酸至所述全發(fā)酵培養(yǎng)液。47. 權(quán)利要求44至46任一項(xiàng)的方法，其還包括添加堿至所述全發(fā)酵培養(yǎng)液。48. 權(quán)利要求44至47任一項(xiàng)的方法，其還包括將所述全發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)過珠磨機(jī)、均質(zhì) 機(jī)、孔板、高剪切混合機(jī)、壓制機(jī)、擠出機(jī)、壓力破碎、濕磨、干磨、或其他剪切力或機(jī)械破壞 設(shè)備至少一次。49. 權(quán)利要求48的方法，其包括將所述全發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)過珠磨機(jī)、均質(zhì)機(jī)、孔板、高剪切 混合機(jī)、壓制機(jī)、擠出機(jī)、壓力破碎、濕磨、干磨、或其他剪切力或機(jī)械破碎設(shè)備至少兩次。50. 權(quán)利要求48或49的方法，其還包括在容器中于約70°C至約100°C攪拌所述裂解發(fā)酵 培養(yǎng)液約1至約60小時(shí)。51. 權(quán)利要求50的方法，其還包括添加鹽至所述容器中的裂解發(fā)酵培養(yǎng)液。52. 權(quán)利要求51的方法，其包括添加多至按重量計(jì)約2 %的所述鹽。53. 權(quán)利要求51或52的方法，其中所述鹽是似(：1，1((：1，1(23〇4，似23〇4，或衍生自至少一個(gè) NaOH和KOH加 H2S〇4的組合。54. 權(quán)利要求50至53任一項(xiàng)的方法，其還包括添加堿以將所述容器中的裂解發(fā)酵培養(yǎng) 液的pH調(diào)整到約3至約11。55. 權(quán)利要求51至54任一項(xiàng)的方法，其還包括通過離心從所述全發(fā)酵培養(yǎng)液分離低于 20 %游離脂肪酸的油。56. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其中所述含油微生物是含油酵母細(xì)胞。57. 前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其還包括用酶組合來分解所述含油微生物的油性細(xì) 胞壁，其中所述酶包括淀粉酶，1-4甘露糖苷酶，和1-3甘露糖苷酶。58. 權(quán)利要求57的方法，其中所述酶組合還包含至少一個(gè)選自下組的輔助酶：硫酸酯 酶，蛋白酶，和殼多糖酶。59. 權(quán)利要求57或58的方法，其中所述淀粉酶特異性針對(duì)al-4連接的葡萄糖。60. 權(quán)利要求57至59任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合包含按重量計(jì)約5 %至約30 %的淀 粉酶。61. 權(quán)利要求57至60任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合包含按重量計(jì)約5 %至約45 %的ΙΑ 甘露糖苷酶。62. 權(quán)利要求57至61任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合包含按重量計(jì)約5 %至約45 %的1-3甘露糖苷酶。63. 權(quán)利要求57至62任一項(xiàng)的方法，其還包括在將所述油性細(xì)胞壁分解后從所述油性 細(xì)胞收獲細(xì)胞內(nèi)代謝物。64. 權(quán)利要求63的方法，其中所述細(xì)胞內(nèi)代謝物包含脂質(zhì)。65. 權(quán)利要求63或64的方法，其還包括將所述細(xì)胞內(nèi)代謝物轉(zhuǎn)化為生物燃料。66. 權(quán)利要求63至65任一項(xiàng)的方法，其還包括將收獲所述細(xì)胞內(nèi)代謝物后剩余的水性 提取流出物進(jìn)行再循環(huán)。67. 權(quán)利要求66的方法，其還包括用再循環(huán)的提取水作為吸入水用于洗滌加工原料以 提取糖。68. -種用于微生物細(xì)胞壁降解的酶組合，其包含： 淀粉酶； 1-4甘露糖苷酶;和 1-3甘露糖苷酶。69. 權(quán)利要求68的酶組合，其中所述淀粉酶特異性針對(duì)al-4連接的葡萄糖。70. 權(quán)利要求68或69的酶組合，其還包含至少一種選自下組的輔助酶:硫酸酯酶，蛋白 酶，和殼多糖酶。71. 權(quán)利要求68至70任一項(xiàng)的酶組合，其中所述組合與近玫色鎖擲酵母ΜΚ29404 (Sporidiobolus pararoseus MK29404)一起使用。72. 權(quán)利要求68至71任一項(xiàng)的酶組合，其包含按重量計(jì)約5 %至約30 %的淀粉酶。73. 權(quán)利要求68至72任一項(xiàng)的酶組合，其包含按重量計(jì)約5%至約45%的1-4甘露糖苷 酶。74. 權(quán)利要求68至73任一項(xiàng)的酶組合，其包含按重量計(jì)約5 %至約45 %的1-3甘露糖苷 酶。75. -種從全發(fā)酵培養(yǎng)液提取適于生產(chǎn)生物燃料的脂質(zhì)的方法，包括： 將酶組合應(yīng)用于含有含油微生物的全發(fā)酵培養(yǎng)液以分解所述含油微生物的細(xì)胞壁，其 中所述酶包括淀粉酶，1-4甘露糖苷酶，和1-3甘露糖苷酶;和 隨后從所述含油微生物提取產(chǎn)物。76. 權(quán)利要求75的方法，其中所述酶組合還包含至少一種選自下組的輔助酶：硫酸酯 酶，蛋白酶，和殼多糖酶。77. 權(quán)利要求75或76的方法，其中所述淀粉酶特異性針對(duì)al-4連接的葡萄糖。78. 權(quán)利要求75至77任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合包含按重量計(jì)約5 %至約30 %的淀 粉酶。79. 權(quán)利要求75至78任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合包含按重量計(jì)約5%至約45%的ΙΑ 甘露糖苷酶。80. 權(quán)利要求75至79任一項(xiàng)的方法，其中所述酶組合包含按重量計(jì)約5 %至約45 %的1-3甘露糖苷酶。81. 權(quán)利要求75至80任一項(xiàng)的方法，其還包括在將所述細(xì)胞壁分解后從所述含油微生 物收獲細(xì)胞內(nèi)代謝物。82. 權(quán)利要求81的方法，其中所述細(xì)胞內(nèi)代謝物包含脂質(zhì)。83. 權(quán)利要求81或82的方法，其還包括將所述細(xì)胞內(nèi)代謝物轉(zhuǎn)化為生物燃料。84. 權(quán)利要求81至83任一項(xiàng)的方法，其還包括將收獲所述細(xì)胞內(nèi)代謝物后剩余的水性 提取流出物進(jìn)行再循環(huán)。85. 權(quán)利要求84的方法，其還包括用再循環(huán)的提取水作為吸入水用于洗滌加工原料以 提取糖。86. 權(quán)利要求75至85任一項(xiàng)的方法，其還包括預(yù)處理所述全發(fā)酵培養(yǎng)液，所述預(yù)處理通 過將所述培養(yǎng)液加熱到約90 °C至約150°C，或約100 °C至約150°C，或約110°C至約150 °C，或 約120°C至約150°C，或約130°C至約150°C的溫度來進(jìn)行。87. 權(quán)利要求75至86任一項(xiàng)的方法，其還包括添加溶劑至所述干細(xì)胞或裂解發(fā)酵培養(yǎng) 液以形成混合物。88. 權(quán)利要求87的方法，其中所述溶劑選自下組：己烷，十二烷，癸烷，柴油，醇，及其組 合。89. 權(quán)利要求87或88的方法，其還包括攪拌所述培養(yǎng)液和溶劑的混合物以從含油酵母 細(xì)胞接觸并提取油。90. 權(quán)利要求89的方法，其還包括從所述培養(yǎng)液分離所述溶劑和油。91. 權(quán)利要求90的方法，其包括用離心機(jī)從所述培養(yǎng)液分離所述溶劑和油。92. 權(quán)利要求90或91的方法，其還包括使所述溶劑和油反應(yīng)以使至少一部分的油轉(zhuǎn)化 為燃料組分。93. 權(quán)利要求92的方法，其還包括將所述溶劑和殘余的油轉(zhuǎn)化為包含生物燃料的燃料。94. 權(quán)利要求75至93任一項(xiàng)的方法，其還包括將用過的培養(yǎng)液用作作物的肥料、動(dòng)物飼 料、酵母提取物、酵母水解產(chǎn)物、或碳源/營養(yǎng)源。95. -種從含水發(fā)酵培養(yǎng)液提取適于生產(chǎn)生物燃料的脂質(zhì)的方法，包括： 從所述含水發(fā)酵培養(yǎng)液提取脂質(zhì)，其中所述培養(yǎng)液含有含油微生物，留下生物質(zhì)固體 和殘余的培養(yǎng)液水;和 用所述殘余的培養(yǎng)液水作為吸入水用于洗滌加工原料以提取糖。96. 權(quán)利要求95的方法，其還包括對(duì)所述含水發(fā)酵培養(yǎng)液進(jìn)行巴氏消毒。97. 權(quán)利要求96的方法，其包括通過將所述含水發(fā)酵培養(yǎng)液加熱到約40 °C至約80 °C約1 分鐘至約3小時(shí)而對(duì)所述含水發(fā)酵培養(yǎng)液進(jìn)行巴氏消毒。98. 權(quán)利要求95至97任一項(xiàng)的方法，其包括將所述含水發(fā)酵培養(yǎng)液加熱約30分鐘至約 18小時(shí)，或多于3小時(shí)至約18小時(shí)，或多于3小時(shí)至約8小時(shí)。99. 權(quán)利要求98的方法，其還包括將所述含水發(fā)酵培養(yǎng)液保持在約90°C至約150°C，或 約100°C至約150°C，或約110°C至約150°C，或約120°C至約150°C，或約130°C至約150°C的溫 度約30分鐘至約18小時(shí)，或多于3小時(shí)至約18小時(shí)，或多于3小時(shí)至約8小時(shí)。100. 權(quán)利要求99的方法，其還包括在加熱間隔過程中攪拌所述含水發(fā)酵培養(yǎng)液。101. 權(quán)利要求95至100任一項(xiàng)的方法，其還包括添加酸至所述含水發(fā)酵培養(yǎng)液。102. 權(quán)利要求95至101任一項(xiàng)的方法，其還包括添加堿至所述含水發(fā)酵培養(yǎng)液。103. 權(quán)利要求95至102任一項(xiàng)的方法，其還包括將所述含水發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)過珠磨機(jī)、均 質(zhì)機(jī)、孔板、高剪切混合機(jī)、壓制機(jī)、擠出機(jī)、壓力破碎、濕磨、干磨、或其他剪切力或機(jī)械破 壞設(shè)備至少一次。104. 權(quán)利要求103的方法，其包括將所述含水發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)過珠磨機(jī)、均質(zhì)機(jī)、孔板、高 剪切混合機(jī)、壓制機(jī)、擠出機(jī)、壓力破碎、濕磨、干磨、或其他剪切力或機(jī)械破碎設(shè)備至少兩 次。105. 權(quán)利要求95至104任一項(xiàng)的方法，其還包括在容器中于約70°C至約100°C攪拌所述 裂解發(fā)酵培養(yǎng)液約1至約60小時(shí)。106. 權(quán)利要求105的方法，其還包括添加鹽至所述容器中的裂解發(fā)酵培養(yǎng)液。107. 權(quán)利要求106的方法，其包括添加多至按重量計(jì)約2%的所述鹽至所述容器中的裂 解發(fā)酵培養(yǎng)液。108. 權(quán)利要求106或107的方法，其中所述鹽是NaCl或Na2S〇4。109. 權(quán)利要求105至108任一項(xiàng)的方法，其還包括添加堿以將所述容器中的裂解發(fā)酵培 養(yǎng)液的pH調(diào)整到約3至約11。110. 權(quán)利要求95至109任一項(xiàng)的方法，其還包括通過離心從所述裂解發(fā)酵培養(yǎng)液分離 脂質(zhì)。111. 權(quán)利要求95至110任一項(xiàng)的方法，其中所述含水發(fā)酵培養(yǎng)液包含甘蔗提取物。112. 權(quán)利要求95至110任一項(xiàng)的方法，其還包括用殘余的培養(yǎng)液水將生物質(zhì)固體再循 環(huán)。
【文檔編號(hào)】C12N9/24GK106062160SQ201480075846
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2014年12月18日
【發(fā)明人】K·阿普特, W·巴克利, M·布萊澤, J·博登, A·布爾扎, D·董, A·杜拉佐, J-C·杜梅尼爾, A·埃奇, J·漢森, A·霍夫勒, D·杰弗斯, C·里昂, V·派, J·W·普法伊費(fèi)爾三世, M·J·塞勒斯, G·尚克, J·斯蒂奇
【申請(qǐng)人】帝斯曼知識(shí)產(chǎn)權(quán)資產(chǎn)管理有限公司