動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液、以及培養(yǎng)容器的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液，其可以充分地發(fā)揮高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器的性能、能夠獲得高的細(xì)胞增殖效率。本發(fā)明的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液是用于提高在動(dòng)物細(xì)胞的呼吸中進(jìn)行的TCA循環(huán)(tricarboxylic acid cycle)的代謝活性的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液，以2.3mmol/L～6.0mmol/L的濃度作為有效成分含有屬于構(gòu)成TCA循環(huán)的要素的被代謝為琥珀酰輔酶A的氨基酸。
【專利說(shuō)明】
動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液、以及培養(yǎng)容器
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)，特別涉及用于提高動(dòng)物細(xì)胞的增殖效率的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液、以及培養(yǎng)容器。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，在醫(yī)藥品的生產(chǎn)、基因治療、再生醫(yī)療、免疫細(xì)胞療法等領(lǐng)域中，要求在人工環(huán)境下高效地大量培養(yǎng)細(xì)胞和組織、微生物等。
[0003]在這樣的狀況下，向由氣體透過(guò)性膜構(gòu)成的培養(yǎng)容器中封入細(xì)胞和培養(yǎng)液，在封閉系統(tǒng)中大量培養(yǎng)細(xì)胞。
[0004]本
【申請(qǐng)人】為了在這樣的細(xì)胞培養(yǎng)中獲得優(yōu)異的細(xì)胞增殖效率，開(kāi)發(fā)出具有高氣體透過(guò)性的多層膜，已經(jīng)完成了使用了該多層膜的高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器(參照專利文獻(xiàn)I)。可以認(rèn)為，若使用該高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，則可以高效地進(jìn)行細(xì)胞的呼吸中所必需的氣體交換，因而細(xì)胞增殖效率有望大幅度提高。
[0005]因此，本
【申請(qǐng)人】使用圖1中所示的作為高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器的培養(yǎng)容器A(氧透過(guò)度9300ml/m2.day.atm)、和由以往的氣體透過(guò)性膜構(gòu)成的通常的培養(yǎng)容器B(氧透過(guò)度5200ml/m2.day.atm)，進(jìn)行了用于使人的淋巴細(xì)胞增殖的細(xì)胞培養(yǎng)(對(duì)應(yīng)于后述的比較例1、2)。其結(jié)果是，如圖2所示，在培養(yǎng)容器A和培養(yǎng)容器B中，得到顯示細(xì)胞增殖效率基本上沒(méi)有變化的數(shù)據(jù)。
[0006]其理由雖然并不確定，然而可以推測(cè)可能是因?yàn)?，在?xì)胞培養(yǎng)中沒(méi)有進(jìn)行能夠盡可能充分地發(fā)揮高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器的性能的氧呼吸。另外，作為無(wú)法進(jìn)行充分氧呼吸的理由，可以認(rèn)為可能是因?yàn)樵谂囵B(yǎng)中所用的培養(yǎng)液中對(duì)于氧呼吸而言所必需的營(yíng)養(yǎng)素不足。
[0007]此處，細(xì)胞在增殖時(shí)，利用了因呼吸而產(chǎn)生的能量，然而在該呼吸中，有糖酵解和氧化磷酸化，利用這些來(lái)進(jìn)行ATP(三磷酸腺苷)的生產(chǎn)。
[0008]糖酵解是厭氧的代謝，在將葡萄糖變換為丙酮酸的過(guò)程中，每I個(gè)分子葡萄糖生產(chǎn)2ATP，由丙酮酸生成乳酸。一旦生成乳酸，培養(yǎng)液的pH就會(huì)下降，增殖效率降低。
[0009]氧化磷酸化是好氧的(利用氧的)代謝，將丙酮酸變換為乙酰輔酶A而提供給TCA循環(huán)(tricarboxylic acid cycle，三羧酸循環(huán))，不生成乳酸，而將TCA循環(huán)中產(chǎn)生的NADH(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide))等提供給電子傳遞系統(tǒng)，每I個(gè)分子葡萄糖生產(chǎn)38個(gè)ATP。通過(guò)像這樣在好氧的環(huán)境下進(jìn)行氧化磷酸化，能量生產(chǎn)效率就會(huì)提高，因此葡萄糖的消耗量減少。
[0010]但是，即使是進(jìn)行好氧呼吸的細(xì)胞，有時(shí)也未必要使用氧。例如，癌細(xì)胞在好氧的環(huán)境下也不是利用氧化磷酸化，而是利用糖酵解來(lái)生產(chǎn)ATP。對(duì)此可以認(rèn)為，由于癌細(xì)胞旺盛地進(jìn)行分裂，因此與有利于能量生產(chǎn)的氧化磷酸化相比，還是要使用有利于核酸、NADPH(煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate))的生產(chǎn)的糖酵解(包含戊糖-磷酸路徑)。[0011 ]前述的淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)中，可以推測(cè)可能是，由于產(chǎn)生大量的乳酸，因此積極地使用糖酵解，沒(méi)有進(jìn)行可以充分地發(fā)揮高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器的性能的氧化磷酸化。
[0012]然而，若進(jìn)行可以充分地發(fā)揮高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器的性能的氧化磷酸化，能否像期待那樣提高細(xì)胞的增殖效率也并不確定。另外，對(duì)于如何操作才能提高細(xì)胞的呼吸中的氧化磷酸化的比例也并不明確。
[0013]作為有關(guān)于這樣的提高細(xì)胞的呼吸中的氧化磷酸化的比例的記載的現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)，可以舉出專利文獻(xiàn)2及專利文獻(xiàn)3。
[0014]專利文獻(xiàn)2中，公開(kāi)過(guò)減少哺乳類細(xì)胞的增殖時(shí)的葡萄糖消耗、減少乳酸鹽形成的方法。具體而言公開(kāi)過(guò):在I?50mmol/L的檸檬酸或檸檬酸鹽的存在下利用在不含血清的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)的哺乳類細(xì)胞的培養(yǎng)來(lái)產(chǎn)生蛋白質(zhì)的方法。根據(jù)該方法，由于可以減少細(xì)胞的增殖時(shí)的葡萄糖消耗和乳酸鹽形成，因此認(rèn)為細(xì)胞的呼吸中的氧化磷酸化的比例提尚O
[0015]另外，專利文獻(xiàn)3中，公開(kāi)過(guò)如下的培養(yǎng)基，是用于不使用血清而僅利用有限的氨基酸的添加來(lái)改善細(xì)胞增殖的無(wú)血清培養(yǎng)用培養(yǎng)基，添加有精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、纈氨酸。
[0016]現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0017]專利文獻(xiàn)
[0018]專利文獻(xiàn)1:日本專利第5191970號(hào)公報(bào)
[0019]專利文獻(xiàn)2:日本專利第5344094號(hào)公報(bào)
[0020]專利文獻(xiàn)3:日本特開(kāi)2004 — 275047號(hào)公報(bào)
【發(fā)明內(nèi)容】
[0021]發(fā)明所要解決的問(wèn)題
[0022]然而，這些專利文獻(xiàn)中記載的技術(shù)中，很難充分地發(fā)揮高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器的性能而大幅度提高細(xì)胞的增殖效率。
[0023]因而，本發(fā)明人等進(jìn)行了深入研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過(guò)在培養(yǎng)液中以2.3mmol/L?6.0mmol/L的濃度作為有效成分含有被代謝為屬于構(gòu)成TCA循環(huán)的要素的琥珀酰輔酶A的氨基酸，就可以提高細(xì)胞的呼吸中的TCA循環(huán)的代謝活性，提高氧化磷酸化的比例。此外，在使用填充有該培養(yǎng)液的高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的情況下，與使用了通常的氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器的情況相比，成功地明顯提高細(xì)胞增殖效率，從而完成了本發(fā)明。
[0024]即，本發(fā)明的目的在于，提供可以充分地發(fā)揮高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器的性能、能夠獲得高的細(xì)胞增殖效率的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液、以及培養(yǎng)容器。
[0025]用于解決問(wèn)題的方法
[0026]為了達(dá)成上述目的，本發(fā)明的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液是用于提高在動(dòng)物細(xì)胞的呼吸中進(jìn)行的TCA循環(huán)(tricarboxylic acid cycle)的代謝活性的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液，采用了以2.3mmol/L?6.0mmol/L的濃度作為有效成含有被代謝為屬于構(gòu)成TCA循環(huán)的要素的琥?白酰輔酶A的氨基酸的構(gòu)成。
[0027]另外，本發(fā)明的培養(yǎng)容器采用了在氣體透過(guò)性容器中填充有本發(fā)明的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液的構(gòu)成。
[0028]發(fā)明效果
[0029]根據(jù)本發(fā)明，能夠提供可以充分地發(fā)揮高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器的性能、能夠獲得高的細(xì)胞增殖效率的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液、以及培養(yǎng)容器。
【附圖說(shuō)明】
[0030]圖1是示出表示高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器及通常的氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器的氧透過(guò)度的圖表的圖。
[0031 ]圖2是示出向高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器及通常的氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器中分別填充以往的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液而進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的結(jié)果的圖。
[0032]圖3是用于說(shuō)明在細(xì)胞的呼吸中進(jìn)行的TCA循環(huán)的圖。
[0033]圖4是示出本發(fā)明的實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液與以往的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液的氨基酸組成的圖。
[0034]圖5是示出表示借助使用了分別填充有本發(fā)明的實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液和以往的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液的高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器及通常的氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器的細(xì)胞培養(yǎng)得到的培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)的比較結(jié)果的折線圖的圖。
[0035]圖6是示出表示借助使用了分別填充有本發(fā)明的實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液和以往的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液的高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器及通常的氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器的細(xì)胞培養(yǎng)得到的培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)的比較結(jié)果的條形圖的圖。
[0036]圖7是示出表示借助使用了分別填充有本發(fā)明的實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液和以往的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液的高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器及通常的氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器的細(xì)胞培養(yǎng)得到的葡萄糖消耗率的比較結(jié)果的條形圖的圖。
[0037]圖8是示出表示借助使用了分別填充有本發(fā)明的實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液和以往的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液的高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器及通常的氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器的細(xì)胞培養(yǎng)得到的乳酸產(chǎn)生率的比較結(jié)果的條形圖的圖。
[0038]圖9是示出本發(fā)明的實(shí)施方式的各動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液和以往的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液的氨基酸組成的圖。
[0039]圖10是示出表示借助使用了分別填充有本發(fā)明的實(shí)施方式的各種動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液和以往的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液的高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器的細(xì)胞培養(yǎng)得到的細(xì)胞增殖率的比較結(jié)果的條形圖的圖。
[0040]圖11是示出表示兩種的高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器及通常的氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器的氧透過(guò)度的圖表的圖。
[0041]圖12是示出表示借助使用了分別填充有本發(fā)明的實(shí)施方式的各種動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液和以往的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液的兩種的高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器及通常的氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器的細(xì)胞培養(yǎng)得到的細(xì)胞增殖率的比較結(jié)果的條形圖的圖。
[0042]圖13是示出本發(fā)明的實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液和以往的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液等的氨基酸組成的圖。
[0043]圖14是示出本發(fā)明的實(shí)施方式的各動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液的組成的圖。
[0044]圖15是示出表示借助使用了分別填充有本發(fā)明的實(shí)施方式的各種動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液和以往的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液的高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器的細(xì)胞培養(yǎng)得到的細(xì)胞增殖率的比較結(jié)果的條形圖的圖。
【具體實(shí)施方式】
[0045]以下，對(duì)本發(fā)明的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液的一個(gè)實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0046]本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液是用于提高動(dòng)物細(xì)胞的呼吸中進(jìn)行的TCA循環(huán)的代謝活性的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液，以6.0mmol/L?15mmol/L的濃度作為有效成分含有必需氨基酸。
[0047]本實(shí)施方式的必需氨基酸是指包括完全必需氨基酸和準(zhǔn)必需氨基酸的12種氨基酸，具體而言，是半胱氨酸、蘇氨酸、色氨酸、亮氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、酪氨酸、以及苯丙氨酸。在本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液中，含有這些全部的必需氨基酸。
[0048]不一定是動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液中的必需氨基酸的含量越多，細(xì)胞增殖效率就越是提高。即因?yàn)?，在氨基酸被代謝時(shí)作為氮系排泄物產(chǎn)生氨，因此當(dāng)它在培養(yǎng)液中蓄積時(shí)，培養(yǎng)液的PH就會(huì)升高而使培養(yǎng)環(huán)境惡化，細(xì)胞的增殖受到阻礙。因而，在制成動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液時(shí)，最好壓低氨基酸的總含量。
[0049]從這樣的觀點(diǎn)考慮，為了合適地提高細(xì)胞增殖效率，更優(yōu)選將本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液中的必需氨基酸的含有比例設(shè)為6.5mmol/L?13mmol/L，進(jìn)一步優(yōu)選設(shè)為
6.Qmmol /I,?11mmol /L
[0050]細(xì)胞的呼吸中的TCA循環(huán)如圖3所示，作為其構(gòu)成分子，具有琥珀酰輔酶A(Succinyl CoA)、α-酮戊二酸、丙酮酸等羧酸。
[0051]根據(jù)本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液，通過(guò)在上述的濃度范圍中含有必需氨基酸，與以往的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液相比，使得被代謝為屬于TCA循環(huán)的構(gòu)成分子的羧酸的碳源的供給量增加，能夠使細(xì)胞的呼吸中的氧化磷酸化活化。
[0052]而且，由此，本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液使得細(xì)胞的氧需要增加，成為可以實(shí)現(xiàn)與氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器的性能相稱的細(xì)胞增殖效率的培養(yǎng)液。
[0053]在本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液中所含的必需氨基酸中，優(yōu)選以2.3mmol/L?
6.0mmol/L的濃度含有被代謝為屬于TCA循環(huán)的構(gòu)成分子的琥珀酰輔酶A的氨基酸，更優(yōu)選設(shè)為2.3mmol/L ?5.0mmo 1/L，進(jìn)一步優(yōu)選設(shè)為2.7mmol/L ?4.0mmol/L。
[0054]本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液中，通過(guò)在這樣的濃度范圍中含有被代謝為琥珀酰輔酶A的氨基酸，能夠使細(xì)胞增殖效率特別提高。
[0055]作為被代謝為琥珀酰輔酶A的氨基酸，優(yōu)選使用異亮氨酸、纈氨酸、以及蛋氨酸的至少任意一種，更優(yōu)選使用它們的全部。
[0056]在本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液中所含的必需氨基酸中，通過(guò)使被代謝為屬于TCA循環(huán)的構(gòu)成分子的α-酮戊二酸的氨基酸的含量，也能夠使細(xì)胞增殖效率提高。
[0057]作為被代謝為α-酮戊二酸的氨基酸，優(yōu)選使用精氨酸、以及組氨酸的至少任意一種，更優(yōu)選使用它們的全部。
[0058]在本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液中所含的必需氨基酸中，通過(guò)使被代謝為屬于TCA循環(huán)的構(gòu)成分子的丙酮酸的氨基酸的含量增加，也能夠使細(xì)胞增殖效率提高。
[0059]作為被代謝為丙酮酸的氨基酸，優(yōu)選使用半胱氨酸、蘇氨酸、以及色氨酸的至少任意一種，更優(yōu)選使用它們的全部。
[0060]此處，對(duì)于通過(guò)在本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液中在上述的濃度范圍含有被代謝為琥珀酰輔酶A的氨基酸可以使細(xì)胞增殖效率特別提高的理由并不確定，然而可以認(rèn)為反應(yīng)很難推進(jìn)到TCA循環(huán)中的琥珀酰輔酶A是原因之一。
[0061]S卩，由于在緊前面有2個(gè)作為TCA循環(huán)的調(diào)節(jié)酶的異檸檬酸脫氫酶(將異檸檬酸變換為α-酮戊二酸)、氧代戊二酸脫氫酶(將α-酮戊二酸變換為琥珀酰輔酶A)的調(diào)節(jié)代謝的酶，因此反應(yīng)很難推進(jìn)到琥珀酰輔酶Α。根據(jù)該動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液，可以認(rèn)為，由于大量地供給被代謝為琥珀酰輔酶A的氨基酸，因此TCA循環(huán)中的容易停滯的部分的反應(yīng)容易推進(jìn)，從而使細(xì)胞增殖效率特別提高。
[0062]另外，可以認(rèn)為，被代謝為琥珀酰輔酶A的氨基酸被作為經(jīng)過(guò)TCA循環(huán)合成的物質(zhì)的碳源供給也是原因之一。特別是可以認(rèn)為，這些氨基酸在被代謝為琥珀酰輔酶A后，被用于氨基乙酰丙酸合成。氨基乙酰丙酸經(jīng)過(guò)卟啉合成被變換為亞鐵血紅素，被用于電子傳遞系統(tǒng)中所必需的細(xì)胞色素c等的合成。由于電子傳遞系統(tǒng)是消耗在TCA循環(huán)中產(chǎn)生的NADH、生產(chǎn)ATP的代謝路徑，因此通過(guò)強(qiáng)化細(xì)胞色素的合成，可以更加迅速地生產(chǎn)能量。此外可以認(rèn)為，由于過(guò)多的NADH會(huì)阻礙TCA循環(huán)，因此通過(guò)利用電子傳遞系統(tǒng)強(qiáng)化來(lái)消耗NADH，整個(gè)TCA循環(huán)就會(huì)沒(méi)有停滯地流動(dòng)。
[0063]從這樣的觀點(diǎn)考慮，通過(guò)在本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液中，含有能夠向TCA循環(huán)供給琥珀酰輔酶A的其他的各種營(yíng)養(yǎng)素，也會(huì)使細(xì)胞增殖效率提高。
[0064]作為這樣的營(yíng)養(yǎng)素，例如可以舉出上述的供給α-酮戊二酸的氨基酸，除了精氨酸、以及組氨酸以外，還可以舉出谷氨酰胺、谷氨酸、脯氨酸等。
[0065]另外，作為這樣的營(yíng)養(yǎng)素，還可以舉出奇數(shù)碳脂肪酸和含有它的脂質(zhì)(甘油三酯、磷脂)、酯。奇數(shù)碳脂肪酸是指碳鏈為奇數(shù)個(gè)的脂肪酸，可以舉出丙酸、壬酸等。
[0066]使用本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞沒(méi)有特別限定，然而例如可以舉出人工多能性干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)、胚性干細(xì)胞(ES細(xì)胞)、間充質(zhì)干細(xì)胞、造血干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞、上皮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、心肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、胰島辟田胞等。根據(jù)本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液，特別是能夠合適地使來(lái)自于人的淋巴細(xì)胞等淋巴細(xì)胞、產(chǎn)生單克隆抗體等的雜交瘤等增殖。
[0067]使用本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液進(jìn)行的細(xì)胞培養(yǎng)能夠適用于流加培養(yǎng)、分批培養(yǎng)、以及連續(xù)培養(yǎng)的任意一種。
[0068]本實(shí)施方式的培養(yǎng)容器的特征在于，在氣體透過(guò)性容器中填充有本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液。
[0069]特別是通過(guò)將本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液填充于高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器中進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，能夠明顯地提高細(xì)胞培養(yǎng)效率。
[°07°]作為這樣的高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器的氧透過(guò)度，優(yōu)選設(shè)為6000ml/m2.day.atm以上，更優(yōu)選設(shè)為7500ml/m2.day.atm以上，進(jìn)一步優(yōu)選設(shè)為9000ml/m2.day.atm以上。
[0071]如上說(shuō)明所示，根據(jù)本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液及培養(yǎng)容器，可以利用給定的濃度的必需氨基酸使TCA循環(huán)活化而增加細(xì)胞的氧需要，可以充分地發(fā)揮氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器的性能，其結(jié)果是，能夠獲得與其氣體透過(guò)性相稱的高的細(xì)胞增殖效率。特別是，在將本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液填充于高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器中使用的情況下，可以更大地發(fā)揮該效果，能夠?qū)崿F(xiàn)優(yōu)異的細(xì)胞增殖效率。
[0072]另外，通過(guò)使TCA循環(huán)活化，可以抑制代謝排泄物(乳酸)的產(chǎn)生，還能夠抑制糖(葡萄糖)的消耗。
[0073]此外，可以抑制代謝排泄物的產(chǎn)生和糖的消耗，其結(jié)果是，還能夠減少培養(yǎng)中所必需的培養(yǎng)液的量。
[0074][實(shí)施例]
[0075]以下，對(duì)于為了確認(rèn)本發(fā)明的實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液及培養(yǎng)容器的效果而進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，參照?qǐng)D4?圖12進(jìn)行說(shuō)明。
[0076][實(shí)驗(yàn)I]
[0077]分別在以下的條件下進(jìn)行了使用了填充有本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液的高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器的細(xì)胞培養(yǎng)(實(shí)施例1)、使用了填充有本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液的通常的氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器的細(xì)胞培養(yǎng)(實(shí)施例2)、使用了填充有以往的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液的高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器的細(xì)胞培養(yǎng)(比較例I )、和使用了填充有以往的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液的通常的氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器的細(xì)胞培養(yǎng)(比較例2)。
[0078](I)動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液
[0079]首先，作為以往的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液，使用了ALyS培養(yǎng)基(ALyS505N_7，株式會(huì)社細(xì)胞科學(xué)研究所制)。將其氨基酸組成表示于圖4的“ALyS”一欄中。ALyS培養(yǎng)基中的必需氨基酸的濃度為6.05mmol/L，被代謝為琥珀酰輔酶A的氨基酸的濃度為1.8mmol/L。
[0080]然后，作為本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液，使用了在ALyS培養(yǎng)基中以達(dá)到給定濃度的方式添加了必需氨基酸12種的培養(yǎng)液。將其氨基酸組成表示于圖4的“+必需氨基酸”一欄中(以下，有時(shí)將本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液稱作+必需氨基酸)。+必需氨基酸中的必需氨基酸的濃度為9.51mmol/L，被代謝為琥珀酰輔酶A的氨基酸的濃度為2.7mmol/L。[0081 ] (2)培養(yǎng)容器
[0082]作為高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器，使用了圖1中記載的高氣體培養(yǎng)容器A(氧透過(guò)度9300ml/m2.day.atm)。高氣體培養(yǎng)容器A是LLDPE(直鏈狀低密度聚乙烯)制且尺寸為200mmX 200mm。
[0083]另外，作為通常的氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器，使用了同圖中記載的培養(yǎng)容器B(氧透過(guò)度5200ml/m2.day.atm)。培養(yǎng)容器B是EVA(乙稀一乙酸乙稀酯共聚樹(shù)脂)制且尺寸為200mmX 200mm。
[0084](3)實(shí)驗(yàn)方法
[0085]首先，在細(xì)胞的增殖培養(yǎng)之前，進(jìn)行了細(xì)胞的活化培養(yǎng)。具體而言，在聚苯乙烯制盤子中將抗CD3抗體固相化，作為培養(yǎng)液使用了向ALyS培養(yǎng)基中添加了血清的培養(yǎng)液(ALyS505N-7+血清 10%)。將人末梢血單核細(xì)胞(hPBMC，Cell Applicat1ns.Inc制)296 X14ceIls與所述培養(yǎng)液一起播種在所述盤子中。此后，在37°C、5%C02濃度下，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)了妖。
[0086]然后，進(jìn)行了被活化的細(xì)胞的增殖培養(yǎng)。具體而言，對(duì)各實(shí)施例及比較例的每一個(gè)，分別向前述的培養(yǎng)容器中注入經(jīng)過(guò)活化的細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液500ml，在37 °C、5 %CO2濃度下，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)了 11天。
[0087]此后，在從包括活化的培養(yǎng)開(kāi)始起72.5小時(shí)后、145.5小時(shí)后、238.5小時(shí)后、以及336.5小時(shí)后，計(jì)數(shù)出細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞數(shù)的計(jì)數(shù)使用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行。
[0088]另外，在培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)和培養(yǎng)期間結(jié)束時(shí)(336.5小時(shí)后)，測(cè)定出葡萄糖濃度及乳酸濃度。葡萄糖濃度的測(cè)定是使用i STAT CG8+ (扶桑藥品工業(yè)株式會(huì)社制)進(jìn)行，乳酸濃度的測(cè)定是使用iSTAT CG4+(扶桑藥品工業(yè)株式會(huì)社制)進(jìn)行。此后，算出每個(gè)單位細(xì)胞增殖(18ceIls)的葡萄糖消耗量(mg)及乳酸產(chǎn)生量(mg)，由此算出葡萄糖消耗率及乳酸產(chǎn)生率。
[0089](4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0090]如圖5所示，在使用本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液(+必需氨基酸)的情況下，可知在高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器(高氣體培養(yǎng)容器A)中培養(yǎng)出的細(xì)胞數(shù)(實(shí)施例1)與在通常的氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器(培養(yǎng)容器B)中培養(yǎng)出的細(xì)胞數(shù)(實(shí)施例2)相比大幅度增加。
[0091]S卩，可知在使用了以往的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液(ALyS)的情況下，在高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器中培養(yǎng)出的細(xì)胞數(shù)(比較例I)、與在通常的氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器中培養(yǎng)出的細(xì)胞數(shù)(比較例2)基本上沒(méi)有變化，然而通過(guò)使用本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液，可以充分地發(fā)揮高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器的性能，可以進(jìn)一步提高細(xì)胞的增殖效率。
[0092]圖6是比較了各實(shí)施例及比較例的培養(yǎng)期間結(jié)束時(shí)的培養(yǎng)細(xì)胞數(shù)的條形圖。在使用了本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液的情況下，在高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器中培養(yǎng)出的細(xì)胞數(shù)(實(shí)施例1:141,600 X 14)與在通常的氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器中培養(yǎng)出的細(xì)胞數(shù)(實(shí)施例2:111 ,800 X 14)相比，多了將近30%。
[0093]另外，該在通常的氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器中培養(yǎng)出的細(xì)胞數(shù)(實(shí)施例2)與使用了以往的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液時(shí)的在通常的氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器中培養(yǎng)出的細(xì)胞數(shù)(比較例2:91,300 X 14)相比，多了20% 以上。
[0094]即可知，通過(guò)使用本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液，可以提高借助通常的氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器的細(xì)胞增殖效率，可以進(jìn)一步提高借助高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器的細(xì)胞增殖效率。
[0095]另外，使用了本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液時(shí)的在高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器中培養(yǎng)出的細(xì)胞數(shù)(實(shí)施例1)與使用了以往的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液時(shí)的在高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器中培養(yǎng)出的細(xì)胞數(shù)(比較例1:86,300 X 14)相比，多了60%以上。
[0096]因而可知，根據(jù)本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液，可以充分地發(fā)揮高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器的性能，可以使細(xì)胞增殖效率明顯增加。
[0097]此處，細(xì)胞的增殖受培養(yǎng)容器的氣體透過(guò)度和細(xì)胞的呼吸活性(氧利用能力)的低的一方控制。
[0098]可以認(rèn)為，在使用了以往的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液的情況下，細(xì)胞的呼吸活性在高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器及通常的氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器雙方的氣體透過(guò)度以下，因此在比較例I和比較例2中基本上沒(méi)有產(chǎn)生差別。
[0099]另一方面可以認(rèn)為，在使用了本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液的情況下，細(xì)胞的呼吸活性得到提高而超過(guò)氣體透過(guò)度，其結(jié)果是，在實(shí)施例1和實(shí)施例2中細(xì)胞增殖效率提尚O
[0100]另外可以認(rèn)為，對(duì)于通常的氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器，在使用了以往的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液的情況下，低呼吸活性是細(xì)胞增殖效率的限制要因，然而通過(guò)使用本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液，細(xì)胞的呼吸活性得到提高而使培養(yǎng)容器的氣體透過(guò)度變?yōu)榧?xì)胞增殖效率的限制要因，其差別量作為從比較例2到實(shí)施例2的細(xì)胞增殖效率的提高體現(xiàn)出來(lái)。
[0101]另外，圖7是比較了各實(shí)施例及比較例的培養(yǎng)期間結(jié)束時(shí)的每單位的細(xì)胞增殖量的葡萄糖消耗量(Glc消耗量(mg)/細(xì)胞增殖量(108cellS)，葡萄糖消耗率)的條形圖。
[0102]在使用了本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液(+必需氨基酸)的情況下，由高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器中的細(xì)胞培養(yǎng)造成的葡萄糖消耗率(實(shí)施例1)與由通常的氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器中的細(xì)胞培養(yǎng)造成的葡萄糖消耗率(實(shí)施例2)相比，小了將近20%。另外，實(shí)施例1的葡萄糖消耗率與使用了以往的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液(ALyS)時(shí)的由高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器中的細(xì)胞培養(yǎng)造成的葡萄糖消耗率(比較例I)相比，小了20%以上。
[0103]即可知，通過(guò)使用本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液，葡萄糖的消耗得到抑制，因此細(xì)胞的呼吸中的氧化磷酸化得到活化，細(xì)胞培養(yǎng)中的氧需要升高。
[0104]另外，圖8是比較了各實(shí)施例及比較例的培養(yǎng)期間結(jié)束時(shí)的每單位的細(xì)胞增殖量的乳酸生產(chǎn)量(Lac產(chǎn)生量(mg)/細(xì)胞增殖量(18ceIls),乳酸產(chǎn)生率)的條形圖。
[0105]在使用了本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液(+必需氨基酸)的情況下，由高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器中的細(xì)胞培養(yǎng)造成的乳酸產(chǎn)生率(實(shí)施例1)與由通常的氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器中的細(xì)胞培養(yǎng)造成的乳酸產(chǎn)生率(實(shí)施例2)相比，小了將近20%。另外，實(shí)施例1的乳酸產(chǎn)生率與使用了以往的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液(ALy S)時(shí)的由高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器中的細(xì)胞培養(yǎng)造成的乳酸產(chǎn)生率(比較例I)相比，小了30%以上。
[0106]即可知，通過(guò)使用本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液，乳酸的產(chǎn)生得到抑制，因此細(xì)胞的呼吸中的氧化磷酸化得到活化，細(xì)胞培養(yǎng)中的氧需要升高。
[0107][實(shí)驗(yàn)2]
[0108]在以下的條件下進(jìn)行了如下的實(shí)驗(yàn)，S卩，確認(rèn)在本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液中所含的必需氨基酸中，增加了被代謝為TCA循環(huán)的構(gòu)成分子的給定的氨基酸的含量時(shí)的細(xì)胞增殖效率。
[0109](I)動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液
[0110]作為以往的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液，使用了與實(shí)驗(yàn)I相同的ALyS培養(yǎng)基(比較例3)。
[0111]作為本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液，使用了向ALyS培養(yǎng)基中與實(shí)驗(yàn)I相同地添加了必需氨基酸12種的培養(yǎng)液(+必需氨基酸，實(shí)施例3)、向ALyS培養(yǎng)基中添加了被代謝為琥珀酰輔酶A的必需氨基酸(異亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸)的培養(yǎng)液(以下有時(shí)稱作+琥珀酰輔酶A，實(shí)施例4)、向ALyS培養(yǎng)基中添加了被代謝為α-酮戊二酸的必需氨基酸(精氨酸、組氨酸)的培養(yǎng)液(以下有時(shí)稱作+α_酮戊二酸，實(shí)施例5)、向ALyS培養(yǎng)基中添加了被代謝為丙酮酸的必需氨基酸(半胱氨酸、蘇氨酸、色氨酸)的培養(yǎng)液(以下有時(shí)稱作+丙酮酸，實(shí)施例6)。
[0112]將本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液(+琥珀酰輔酶Α)的氨基酸組成表示于圖9的“+琥I白酰輔酶Α”的一欄中。
[0113]+琥珀酰輔酶A是將與+必需氨基酸中的添加量相同量的異亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸添加到ALy S培養(yǎng)基中而制成。
[0114]另外，對(duì)于+α-酮戊二酸和+丙酮酸，也分別將所添加的氨基酸以與+必需氨基酸中的添加量相同量添加到ALy S培養(yǎng)基中而制成。
[0115](2)培養(yǎng)容器
[0116]作為高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器，使用了圖1中記載的高氣體培養(yǎng)容器A(氧透過(guò)度9300ml/m2.day.atm)。
[0117](3)實(shí)驗(yàn)方法
[0118]與實(shí)驗(yàn)I相同地將人末梢血單核細(xì)胞(hPBMC，Cell Applicat1ns.Inc制)活化后，進(jìn)行了增殖培養(yǎng)。但是，由于是與實(shí)驗(yàn)I不同的批次的細(xì)胞，因此細(xì)胞的呼吸活性(氧利用能力)與實(shí)驗(yàn)I不同。
[0119]此后，計(jì)數(shù)出培養(yǎng)期間結(jié)束時(shí)的細(xì)胞數(shù)，算出相對(duì)于培養(yǎng)期間開(kāi)始時(shí)的細(xì)胞數(shù)而言的增殖率。
[0120](4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0121]如圖10所示，比較例3的增殖率為346.5倍。另外，+必需氨基酸的增殖率為383.6倍(實(shí)施例3)，+琥珀酰輔酶A的增殖率為410.8倍(實(shí)施例4)，+α-酮戊二酸的增殖率為375.1倍(實(shí)施例5)，+丙酮酸的增殖率為364.5倍(實(shí)施例6)。
[0122]S卩，對(duì)于使用了本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液時(shí)的細(xì)胞增殖率的相對(duì)于比較例3而言的上升率，就+必需氨基酸而言為1.7 % (實(shí)施例3)，就+琥珀酰輔酶A而言為18.6 %(實(shí)施例4)，就+α-酮戊二酸而言為8.3% (實(shí)施例5)，就+丙酮酸而言為5.2% (實(shí)施例6)。
[0123]由該結(jié)果可知，相對(duì)于以往的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液，在僅添加了必需氨基酸中的上述給定的氨基酸的情況下，也可以提高細(xì)胞增殖效率。
[0124]特別是，由添加了異亮氨酸、纈氨酸、以及蛋氨酸的+琥珀酰輔酶A造成的細(xì)胞增殖效率的上升率與+必需氨基酸相比大了70%以上。
[0125]因而可知，根據(jù)本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液(+琥珀酰輔酶Α)，可以明顯地提高細(xì)胞增殖效率。
[0126][實(shí)驗(yàn)3]
[0127]在以下的條件下進(jìn)行了用于確認(rèn)由本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液(+琥珀酰輔酶Α)帶來(lái)的細(xì)胞增殖效率的提高效果的實(shí)驗(yàn)。
[0128](I)動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液
[0129]作為以往的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液，使用了與實(shí)驗(yàn)I相同的ALyS培養(yǎng)基(比較例4?6)。
[0130]作為本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液，使用了向ALyS培養(yǎng)基中與實(shí)驗(yàn)I相同地添加了必需氨基酸12種的培養(yǎng)液(+必需氨基酸，實(shí)施例7?9)、向ALyS培養(yǎng)基中與實(shí)驗(yàn)I相同地添加了作為被代謝為琥珀酰輔酶A的必需氨基酸的異亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸的培養(yǎng)液(+琥珀酰輔酶A，實(shí)施例10?12)、向ALyS培養(yǎng)基中添加了實(shí)驗(yàn)I的2倍量的作為被代謝為琥珀酰輔酶A的必需氨基酸的異亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸的培養(yǎng)液(以下有時(shí)稱作+琥珀酰輔酶AΧ2，實(shí)施例13?15)。
[0131](2)培養(yǎng)容器
[0132]將實(shí)驗(yàn)3中所用的培養(yǎng)容器表示于圖11中。
[0133]高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器(高氣體培養(yǎng)容器Α)是與圖1中記載的容器相同的容器(氧透過(guò)度9300ml/m2.day.atm)，通常的氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器(培養(yǎng)容器B)也是與圖1中記載的容器相同的容器(氧透過(guò)度5200ml/m2.day.atm)。
[0134]此外，作為高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器(高氣體培養(yǎng)容器C)，使用了氧透過(guò)度7230ml/m2.day.atm的容器。高氣體培養(yǎng)容器C為L(zhǎng)LDPE(直鏈狀低密度聚乙烯)制，尺寸為200mmX200mmo
[0135](3)實(shí)驗(yàn)方法
[0136]與實(shí)驗(yàn)I相同地將人末梢血單核細(xì)胞(hPBMC，Cell Applicat1ns.Inc制)活化后，進(jìn)行了增殖培養(yǎng)。但是，由于是與實(shí)驗(yàn)I不同批次的細(xì)胞，因此細(xì)胞的呼吸活性(氧利用能力)與實(shí)驗(yàn)I不同。另外，培養(yǎng)期間設(shè)為14天(336小時(shí))。
[0137]此后，計(jì)數(shù)出培養(yǎng)期間結(jié)束時(shí)的細(xì)胞數(shù)，算出相對(duì)于培養(yǎng)期間開(kāi)始時(shí)的細(xì)胞數(shù)的增殖率。
[0138](4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0139]如圖12所示，在使用了以往的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液的情況下，在高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器(高氣體培養(yǎng)容器A)、通常的氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器(培養(yǎng)容器B)、以及高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器(高氣體培養(yǎng)容器C)的每個(gè)容器中，細(xì)胞增殖率分別為880.6倍(比較例4)、790.7倍(比較例5)、853.3倍(比較例6) ο
[0140]另外，在使用了本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液(+必需氨基酸)的情況下，在高氣體培養(yǎng)容器A、培養(yǎng)容器B、以及高氣體培養(yǎng)容器C的每個(gè)容器中，細(xì)胞增殖率分別為910.7倍(實(shí)施例7)、806.4倍(實(shí)施例8)、893.7倍(實(shí)施例9)。
[0141]因而，對(duì)于使用了本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液(+必需氨基酸)時(shí)的細(xì)胞增殖率的相對(duì)于使用了以往的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液時(shí)的上升率，在高氣體培養(yǎng)容器A、培養(yǎng)容器B、以及高氣體培養(yǎng)容器C的每個(gè)容器中，分別為3.4% (實(shí)施例7)、2.0%(實(shí)施例8)、4.7% (實(shí)施例9)。
[0142]另外，在使用了本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液(+琥珀酰輔酶A)的情況下，在高氣體培養(yǎng)容器A、培養(yǎng)容器B、以及高氣體培養(yǎng)容器C的每個(gè)容器中，細(xì)胞增殖率分別為917.3倍(實(shí)施例10)、773.7倍(實(shí)施例11)、899.2倍(實(shí)施例12)。
[0143 ]因而，對(duì)于使用了本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液(+琥珀酰輔酶A)時(shí)的細(xì)胞增殖率的相對(duì)于使用了以往的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液時(shí)的上升率，在高氣體培養(yǎng)容器A、培養(yǎng)容器B、以及高氣體培養(yǎng)容器C的每個(gè)容器中，分別為4.2 % (實(shí)施例10 )、一 2.2 % (實(shí)施例11)、5.4 %(實(shí)施例12)。
[0144]另外，在使用了本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液(+琥珀酰輔酶AX 2)的情況下，在高氣體培養(yǎng)容器A、培養(yǎng)容器B、以及高氣體培養(yǎng)容器C的每個(gè)容器中，細(xì)胞增殖率分別為957.7倍(實(shí)施例13)、788.5倍(實(shí)施例14)、857.7倍(實(shí)施例15)。
[0145]因而，對(duì)于使用了本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液(+琥珀酰輔酶AX 2)時(shí)的細(xì)胞增殖率的相對(duì)于使用了以往的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液時(shí)的上升率，在高氣體培養(yǎng)容器A、培養(yǎng)容器B、以及高氣體培養(yǎng)容器C的每個(gè)容器中，分別為8.7% (實(shí)施例13)、一0.3% (實(shí)施例14)、
0.5%(實(shí)施例15)。
[0146]此處，如前所述，細(xì)胞的增殖受培養(yǎng)容器的氣體透過(guò)度和細(xì)胞的呼吸活性(氧利用能力)的低的一方控制，強(qiáng)烈地受到細(xì)胞的呼吸活性的個(gè)體差別的影響，因而可以認(rèn)為，在實(shí)驗(yàn)3中所使用的細(xì)胞使用了以往的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液的情況下，呼吸活性超過(guò)培養(yǎng)容器B的氣體透過(guò)度。
[0147]因此可以認(rèn)為，在借助培養(yǎng)容器B的細(xì)胞培養(yǎng)(實(shí)施例8、11、14)中，培養(yǎng)容器B的氣體透過(guò)度成為細(xì)胞增殖效率的限制要因，即使使用本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液也不能進(jìn)一步提高細(xì)胞的呼吸活性。
[0148]與之不同，可以認(rèn)為，就高氣體培養(yǎng)容器A和高氣體培養(yǎng)容器C而言，與細(xì)胞的呼吸活性相比，在氣體透過(guò)度方面有余力，可以進(jìn)一步提高細(xì)胞的呼吸活性，其結(jié)果是，可以提高細(xì)胞增殖效率。
[0149]即可以認(rèn)為，在借助高氣體培養(yǎng)容器A的細(xì)胞培養(yǎng)(實(shí)施例7、10、13)、以及借助高氣體培養(yǎng)容器C的細(xì)胞培養(yǎng)(實(shí)施例9、12、15)時(shí)，由于氣體透過(guò)度超過(guò)細(xì)胞的呼吸活性，因此其差量作為細(xì)胞增殖效率的提高體現(xiàn)出來(lái)。
[0150][實(shí)驗(yàn)4]
[0151]繼而在以下的條件下進(jìn)行了用于確認(rèn)由本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液(+琥珀酰輔酶A)帶來(lái)的細(xì)胞增殖效率的提高效果的實(shí)驗(yàn)。
[0152](I)動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液
[0153]作為以往的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液，使用了圖13中所示的ALyS培養(yǎng)基(被代謝為琥珀酰輔酶A的必需氨基酸濃度1.8mmoI/L，比較例7)。該ALyS培養(yǎng)基與實(shí)驗(yàn)I中所用的培養(yǎng)基相同。
[0154]另外，作為本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液，如圖14所示，使用了向ALyS培養(yǎng)基中與實(shí)驗(yàn)I相同地添加了作為被代謝為琥珀酰輔酶A的必需氨基酸的異亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸的培養(yǎng)液(+琥珀酰輔酶A X I，被代謝為琥珀酰輔酶A的必需氨基酸濃度2.7mmol/L，實(shí)施例16)、向ALyS培養(yǎng)基中添加了實(shí)驗(yàn)16的追加量的2倍量的作為被代謝為琥珀酰輔酶A的必需氨基酸的異亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸的培養(yǎng)液(以下稱作+琥珀酰輔酶A X 2，被代謝為琥珀酰輔酶A的必需氨基酸濃度3.6mmol/L，實(shí)施例17)、向ALyS培養(yǎng)基中添加了實(shí)驗(yàn)16的追加量的4倍量的作為被代謝為琥珀酰輔酶A的必需氨基酸的異亮氨酸、纈氨酸、蛋氨酸的培養(yǎng)液(以下稱作+琥珀酰輔酶A X 4，被代謝為琥珀酰輔酶A的必需氨基酸濃度5.4mmol/L，實(shí)施例18)。
[0155](2)培養(yǎng)容器
[0156]對(duì)于培養(yǎng)容器，作為高氣體透過(guò)性培養(yǎng)容器，使用了圖1中記載的高氣體培養(yǎng)容器A(氧透過(guò)度9300ml/m2.day.atm)。
[0157](3)實(shí)驗(yàn)方法
[0158]與實(shí)驗(yàn)I相同地將人末梢血單核細(xì)胞(hPBMC，Takara_b1株式會(huì)社制)活化后，進(jìn)行了增殖培養(yǎng)。但是，由于是與實(shí)驗(yàn)I不同批次的細(xì)胞，因此細(xì)胞的呼吸活性(氧利用能力)與實(shí)驗(yàn)I不同。另外，培養(yǎng)期間設(shè)為12天(將活化培養(yǎng)設(shè)為3天，將擴(kuò)增培養(yǎng)設(shè)為9天，合計(jì)284小時(shí))。
[0159]此后，計(jì)數(shù)出培養(yǎng)期間結(jié)束時(shí)的細(xì)胞數(shù)，算出相對(duì)于培養(yǎng)期間開(kāi)始時(shí)的細(xì)胞數(shù)而言的增殖率。
[0160](4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0161 ]如圖15所示，比較例7的增殖率為626.7倍。另外，+琥珀酰輔酶A X I的增殖率為658.1倍(實(shí)施例16)，+琥珀酰輔酶AX2的增殖率為647.1倍(實(shí)施例17)，+琥珀酰輔酶AX4的增殖率為634.8倍(實(shí)施例18)。
[0162]S卩，對(duì)于使用了本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液時(shí)的細(xì)胞增殖率的相對(duì)于比較例7的上升率，就+琥珀酰輔酶A X I而言是5.0 % (實(shí)施例16)，就+琥珀酰輔酶A X 2而言是3.3 %(實(shí)施例17)，就+琥珀酰輔酶A X 4而言是1.3 % (實(shí)施例18)。
[0163]由該結(jié)果再次確認(rèn)，根據(jù)本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液(+琥珀酰輔酶A)，可以提高細(xì)胞增殖效率。
[0164]本發(fā)明并不限定于以上的實(shí)施方式或?qū)嵤├?，?dāng)然可以在本發(fā)明的范圍內(nèi)中實(shí)施各種變更。
[0165]例如，可以使本實(shí)施方式的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液中的被代謝為琥珀酰輔酶A的氨基酸的配合比例與實(shí)施例不同，或者添加被代謝為琥珀酰輔酶A的其他成分等而適當(dāng)?shù)貙?shí)施變更。
[0166]產(chǎn)業(yè)上的可利用性
[0167]本發(fā)明在醫(yī)藥品的生產(chǎn)、或基因治療、再生醫(yī)療、免疫細(xì)胞療法等領(lǐng)域中，可以適用于使用封閉系統(tǒng)的培養(yǎng)容器大量地生產(chǎn)細(xì)胞的情況。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液，用于提高在動(dòng)物細(xì)胞的呼吸中進(jìn)行的TCA循環(huán)的代謝活性，其特征在于， 以2.3mmo I / L?6.0mmo I / L的濃度含有屬于構(gòu)成T C A循環(huán)的要素的被代謝為琥?自酰輔酶A的氨基酸作為有效成分。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液，其特征在于， 所述被代謝為琥珀酰輔酶A的氨基酸為異亮氨酸、纈氨酸、以及蛋氨酸。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液，其特征在于， 所述動(dòng)物細(xì)胞為來(lái)自于人的淋巴細(xì)胞。4.一種培養(yǎng)容器，其特征在于， 在氣體透過(guò)性容器中填充有權(quán)利要求1?3中任一項(xiàng)所述的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)液。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的培養(yǎng)容器，其特征在于， 所述氣體透過(guò)性容器的氧透過(guò)度為6000ml/m2.day.atm以上。
【文檔編號(hào)】C12M1/00GK106062174SQ201580011609
【公開(kāi)日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2015年4月6日 公開(kāi)號(hào)201580011609.1, CN 106062174 A, CN 106062174A, CN 201580011609, CN-A-106062174, CN106062174 A, CN106062174A, CN201580011609, CN201580011609.1, PCT/2015/1920, PCT/JP/15/001920, PCT/JP/15/01920, PCT/JP/2015/001920, PCT/JP/2015/01920, PCT/JP15/001920, PCT/JP15/01920, PCT/JP15001920, PCT/JP1501920, PCT/JP2015/001920, PCT/JP2015/01920, PCT/JP2015001920, PCT/JP201501920
【發(fā)明人】太田恭平, 田中鄉(xiāng)史
【申請(qǐng)人】東洋制罐集團(tuán)控股株式會(huì)社