甲基丙烯酸酯的制造方法及新的甲基丙烯酸酯合成酶的制作方法
【專利摘要】作為利用生物催化劑的甲基丙烯酸酯的制造方法，提供含有如下工序的甲基丙烯酸酯的制造方法：在來自以下植物的醇?；D(zhuǎn)移酶存在下，使醇或酚類作用于甲基丙烯酰輔酶A而合成甲基丙烯酸酯，所述植物為選自由屬于木犀屬(Osmanthus)的植物、屬于葡萄屬(Vitis)的植物、屬于柑橘屬(Citrus)的植物、屬于榴蓮屬(Durio)的植物、屬于木蘭屬(Magnolia)的植物及屬于果香菊屬(Chamaemelum)的植物組成的組中的植物。
【專利說明】
甲基丙稀酸醋的制造方法及新的甲基丙稀酸醋合成酶
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及使用了生物催化劑的有機酸醋的制法、特別是甲基丙締酸醋的制法。 更詳細而言，設(shè)及使用了具有甲基丙締酸醋生成能力的醇酷基轉(zhuǎn)移酶的甲基丙締酸醋的制 造方法，進而設(shè)及運些醇酷基轉(zhuǎn)移酶及其利用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 甲基丙締酸醋主要用作丙締酸類樹脂的原料，作為涂料、粘接劑、樹脂改性劑等領(lǐng) 域的共聚單體也有很多需求。作為工業(yè)性制法，有若干種方法，已知例如W丙酬及氯化氨為 原料的ACH(丙酬氯醇)法、W異下締及叔下醇為原料的直接氧化法。運些化學(xué)方式的制造方 法依賴于化石原料，此外需要大量的能量。
[0003] 近年來，從防止地球溫暖化及環(huán)境保護的觀點出發(fā)，使用生物質(zhì)原料代替目前的 化石原料作為碳源而制造各種化學(xué)制品的技術(shù)受到關(guān)注。也期待由生物質(zhì)原料制造甲基丙 締酸醋，但尚未報道使用生物催化劑由生物質(zhì)原料制造的具體制造例。
[0004] 例如，提出了利用天然存在的微生物，由糖等天然物質(zhì)生產(chǎn)作為甲基丙締酸的前 體的2-徑基異下酸及3-徑基異下酸的方法(參照專利文獻1、2及非專利文獻1)。但是，運些 方法中，使前體脫水生成甲基丙締酸的工序依然依賴于化學(xué)方法。
[0005] 另外，雖然已經(jīng)提出了使用導(dǎo)入有多個酶基因的、非天然存在的重組微生物，由葡 萄糖生成甲基丙締酸的方法，但是運些不過是將已知的酶反應(yīng)及由此類推的假想酶反應(yīng)組 合，并未進行實際驗證(參照專利文獻3~5)。特別是，專利文獻5雖然例示了具有一般的醋 生成活性的多種生物催化劑(水解酶、蠟醋合成酶、醇乙酷轉(zhuǎn)移酶），但所例示的生物催化劑 是否具有甲基丙締酸醋合成活性尚不明確。
[0006] 進而，專利文獻6公開了在丙締酷輔酶A和醇的存在下，使水解酶起作用來制造丙 締酸醋的方法。該文獻中給出了甲基丙締酸醋也可W同樣制造的啟示。但是，若考慮生物催 化劑的多樣性、底物特異性，則其不過公開了通過一部分水解酶能夠制造丙締酸醋，而結(jié)構(gòu) 不同的甲基丙締酸醋是否能夠同樣地通過水解酶制造尚不明確。進而，是否能夠通過反應(yīng) 機理不同的其它種類的生物催化劑來制造也是完全不明確的。另外，通過專利文獻6所述的 水解酶合成醋時，可W預(yù)想生成的醋直接由于水解活性而被分解，很難認為是有效的制造 方法。
[0007] 另一方面，醇酷基轉(zhuǎn)移酶作為果味(fruity flavor)合成酶而已知。專利文獻7鑒 定了特定果實中所含的該酶的基因，提出作為果實味道的各種醋的合成方法。但是，關(guān)于甲 基丙締酸醋是否能夠通過運些酶來合成則沒有報道，因此運點并不明確。
[0008] 如上所述，雖然提出若干方案或者進行了若干研究，但并不存在實際利用酶反應(yīng) 來制造甲基丙締酸醋的例子，期待建立有效的制造方法。
[0009] 現(xiàn)有技術(shù)文獻 [0010] 專利文獻
[0011] 專利文獻1:國際公開第2007/110394號小冊子
[0012] 專利文獻2:國際公開第2008/145737號小冊子
[0013] 專利文獻3:國際公開第2009/135074號小冊子
[0014] 專利文獻4:國際公開第2011/031897號小冊子 [0015] 專利文獻5:國際公開第2012/135789號小冊子
[0016] 專利文獻6:國際公開第2007/039415號小冊子
[0017] 專利文獻7:國際公開第00/32789號小冊子
[0018] 專利文獻8:日本特開2011-200133號公報
[0019] 專利文獻9:日本特開平5-64589號公報
[0020] 專利文獻10:日本特開平10-337185號
[0021] 專利文獻11:日本特開平10-24867號
[0022] 非專利文獻
[0023] 非專利文獻l:Green Chemistry，2012，14，1942-1948
[0024] 非專利文獻2:Methods in Enzymology，2000,324,73_79
[00巧]非專利文獻3:Botanical Journal of the Linnean Society,2009,161，105 - 121
[00%]非專利文獻 4:Microbiology ,1999,145,2323-23:34

【發(fā)明內(nèi)容】

[0027] 發(fā)明要解決的課題
[0028] 本發(fā)明的目的在于，提供一種利用生物催化劑的甲基丙締酸醋的制造方法。另外， 本發(fā)明的目的在于，提供具有甲基丙締酸醋合成活性的新的醇酷基轉(zhuǎn)移酶。
[0029] 用于解決課題的手段
[0030] 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，來自特定植物的醇酷基轉(zhuǎn)移酶具有甲基丙締酸醋的合成活性，直 至完成了本發(fā)明。進而，成功地由植物體的懸濁液獲得新的醇酷基轉(zhuǎn)移酶，直至完成了本發(fā) 明。即，本發(fā)明如下所述。
[0031] [1] -種甲基丙締酸醋的制造方法，其含有如下工序:在來自W下植物的醇酷基轉(zhuǎn) 移酶存在下，使醇或酪類作用于甲基丙締酷輔酶A而合成甲基丙締酸醋，所述植物為選自由 屬于唇形目化amiales)的植物、屬于葡萄目（Vitales)的植物、屬于無患子目（Sapindales) 的植物、屬于錦葵目（Malvales)的植物、屬于木蘭目（Magnoliales)的植物及屬于菊目 (Asterales)的植物組成的組中的植物。
[0032] [2] -種甲基丙締酸醋的制造方法，其含有如下工序:在來自W下植物的醇酷基轉(zhuǎn) 移酶存在下，使醇或酪類作用于甲基丙締酷輔酶A而合成甲基丙締酸醋，所述植物為選自由 屬于木犀科(Oleaceae)的植物、屬于葡萄科(Vitaceae)的植物、屬于蕓香科(Rutaceae)的 植物、屬于錦葵科(Malvaceae)的植物、屬于木蘭科(Magnol iaceae)的植物及屬于菊科 (Asteraceae)的植物組成的組中的植物。
[0033] [3] -種甲基丙締酸醋的制造方法，其含有如下工序:在來自W下植物的醇酷基轉(zhuǎn) 移酶存在下，使醇或酪類作用于甲基丙締酷輔酶A而合成甲基丙締酸醋，所述植物為選自由 屬于木犀屬(Osman thus)的植物、屬于葡萄屬(Vitis)的植物、屬于相橘屬(Citrus)的植物、 屬于惱蓮屬(Durio)的植物、屬于木蘭屬(Ma即olia)的植物及屬于果香菊屬(化amaemelum) 的植物組成的組中的植物。
[0034] [4]根據(jù)[1]~[3]的甲基丙締酸醋的制造方法，其中，植物為從木犀(Osmanthus fragrans)、葡萄（Vitis vinifera)、葡萄抽（Citrus X paradisi)、惱蓮（Durio zibethinus)、含笑(Michelia f igo)及羅馬洋甘菊(Qiamaemelum nobile)中選擇的植物。
[0035] [5] -種甲基丙締酸醋的制造方法，其含有如下工序:在具有W下的（1)~（3)的理 化學(xué)性質(zhì)的醇酷基轉(zhuǎn)移酶存在下，使醇或酪類作用于甲基丙締酷輔酶A而合成甲基丙締酸 醋。
[0036] (1)在醇或酪類的存在下，作用于甲基丙締酷輔酶A而生成甲基丙締酸醋。
[0037] (2)對甲基丙締酷輔酶A的活性高于對乙酷輔酶A的活性。
[0038] (3)對甲基丙締酷輔酶A的Km值為0.5mMW下。
[0039] [6]-種醇酷基轉(zhuǎn)移酶或該酶的組合物，所述醇酷基轉(zhuǎn)移酶具有W下的（1)~（5) 的理化學(xué)性質(zhì)。
[0040] (1)在醇或酪類的存在下，作用于甲基丙締酷輔酶A而生成甲基丙締酸醋。
[0041] (2)對甲基丙締酷輔酶A的活性高于對乙酷輔酶A的活性。
[0042] (3)對異下酷輔酶A的活性高于對乙酷輔酶A的活性。
[0043] (4)對甲基丙締酷輔酶A的Km值為0.5mMW下。
[0044] (5) W甲基丙締酷輔酶A及正下醇為底物時，最適抑為8~9。
[0045] [7]根據(jù)[6]的醇酷基轉(zhuǎn)移酶或該酶的組合物，其來自屬于菊目（Asterales)的植 物。
[0046] [引根據(jù)[7]的醇酷基轉(zhuǎn)移酶或該酶的組合物，其來自屬于菊科(Asteraceae)的植 物。
[0047] [9]根據(jù)[8]的醇酷基轉(zhuǎn)移酶或該酶的組合物，其來自屬于果香菊屬 (Qiamaemelum)的植物。
[0048] [10]根據(jù)[9]的醇酷基轉(zhuǎn)移酶或該酶的組合物，其來自羅馬洋甘菊(Chamaemelum nobile)。
[0049] [11]-種有機酸醋的制造方法，其使用[6]~[10]中任一項的醇酷基轉(zhuǎn)移酶或該 酶的組合物。
[0050] [12]-種醇酷基轉(zhuǎn)移酶，其來自選自由屬于唇形目化amiales)的植物、屬于葡萄 目（Vitales)的植物、屬于無患子目（Sapindales)的植物、屬于錦葵目（Malvales)的植物、 屬于木蘭目（Magnoliales)的植物及屬于菊目（Asterales)的植物組成的組中的植物，且具 有在醇或酪類的存在下作用于甲基丙締酷輔酶A而生成甲基丙締酸醋的能力。
[0051] [13]根據(jù)[12]的醇酷基轉(zhuǎn)移酶，其中，上述植物為屬于木犀科(Oleaceae)的植物、 屬于葡萄科(Vitaceae)的植物、屬于蕓香科(Ru化ceae)的植物、屬于錦葵科(Malvaceae)的 植物、屬于木蘭科(Magnoliaceae)的植物及屬于菊科(Asteraceae)的植物。
[0052] [14]根據(jù)[13]的醇酷基轉(zhuǎn)移酶，其中，上述植物為屬于木犀屬（Osmanthus)的植 物、屬于葡萄屬(Vitis)的植物、屬于相橘屬(Citrus)的植物、屬于惱蓮屬(Durio)的植物、 屬于木蘭屬(1曰旨11〇11曰）的植物及屬于果香菊屬(化曰111曰61]161加1)的植物。
[0053] [15]根據(jù)[14]的醇酷基轉(zhuǎn)移酶，其中，上述植物為從木犀(Osmanthus fragrans)、 葡萄（Vitis vinifera)、葡萄抽（Citrus X paradisi)、惱蓮（Durio zibethinus)、含笑 (Michelia figo)及羅馬洋甘菊(Qiamaemelum nobile)中選擇的植物。
[0054] [16]根據(jù)[1引的醇酷基轉(zhuǎn)移酶，其具有W下的（1)~(6)的理化學(xué)性質(zhì)。
[0055] (1)在醇或酪類的存在下，作用于甲基丙締酷輔酶A而生成甲基丙締酸醋。
[0056] (2)對甲基丙締酷輔酶A的活性高于對乙酷輔酶A的活性。
[0057] (3)對異下酷輔酶A的活性高于對乙酷輔酶A的活性。
[0058] (4)對丙酷輔酶A的活性高于對乙酷輔酶A的活性。
[0化9 ] (5)對甲基丙締酷輔酶A的Km值為0.5mM W下。
[0060] (6) W甲基丙締酷輔酶A及正下醇為底物時，最適抑為8~9。
[0061] [17]根據(jù)[16]的醇酷基轉(zhuǎn)移酶，其來自屬于菊科(Asteraceae)的植物。
[0062] [1引根據(jù)[17]的醇酷基轉(zhuǎn)移酶，其來自屬于果香菊屬(化amaemehim)的植物。
[0063] [19]根據(jù)[18]的醇酷基轉(zhuǎn)移酶，其來自羅馬洋甘菊(Chamaemelum nobile)。
[0064] 發(fā)明的效果
[0065] 根據(jù)本發(fā)明，能夠利用生物催化劑進行甲基丙締酸醋的制造。通過將本發(fā)明的制 造方法和生物體內(nèi)代謝組合，還能夠?qū)崿F(xiàn)甲基丙締酸醋的發(fā)酵生產(chǎn)。其結(jié)果是，與W往的化 學(xué)制造工藝相比，能夠在極大地降低能量、資源及環(huán)境負擔(dān)的條件下制造甲基丙締酸醋。另 夕h通過利用本發(fā)明的新的酶，能夠更高效地制造甲基丙締酸醋等有機酸醋。
【附圖說明】
[0066] 圖1為示出利用DEAE - T0Y0PEA化柱(第2次)進行的純化(洗脫曲線)的圖表。
[0067] 圖2為示出利用誕京脂糖柱進行的純化(洗脫曲線)的圖表。
[006引圖3為示出利用MonoQ 5/50(iL柱進行的純化(洗脫曲線）的圖表。
[0069] 圖4為示出利用Superdex 200 10/300化柱的純化(洗脫曲線）的圖表。
[0070] 圖5為示出來自羅馬洋甘菊的AAT的最適抑的測定結(jié)果的圖表。
[0071] 圖6為示出來自羅馬洋甘菊的AAT的底物濃度和反應(yīng)速度的關(guān)系的圖表。（A)表示 甲基丙締酷輔酶A的結(jié)果、(B)表示乙酷輔酶A的結(jié)果。
【具體實施方式】
[0072] W下參照【附圖說明】用于實施本發(fā)明的優(yōu)選方式。需要說明的是。W下所說明的實 施方式是示出本發(fā)明的代表性實施方式的一個例子，不可基于此對本發(fā)明的范圍作狹義解 釋。
[0073] 1.利用醇酷基轉(zhuǎn)移酶的甲基丙締酸醋的制造方法
[0074] [甲基丙締酸醋]
[0075] 本發(fā)明中，甲基丙締酸醋是指式1所示的化合物。式1中，R表示直鏈或支鏈的碳數(shù) 為1~20的控基?？鼗蒞是飽和或不飽和的非環(huán)式，也可W是飽和或不飽和的環(huán)式。優(yōu)選 直鏈或支鏈的碳數(shù)為1~10的非取代的烷基、芳烷基或芳基。特別優(yōu)選甲基、乙基、正丙基、 異丙基、正下基、異下基、仲下基、叔下基、正戊基、異戊基、叔戊基、正己基、異己基、2-己 基、二甲基下基、乙基下基、庚基、辛基、2-乙基己基之類的碳數(shù)1~8的烷基、芐基或苯基。
[0076] C 出= C(CH3)C00_R (式 1)
[0077] "甲基丙締酸"（IUPAC名：2-甲基一2-丙締酸)是指具有下述式的化合物，還包括 其的任意的鹽或離子化的形態(tài)。作為甲基丙締酸的鹽，可w列舉例如鋼鹽、鐘鹽、巧鹽及儀 鹽等。
[007引 C 出= C(CH3)C00H
[0079] [甲基丙締酷輔酶A]
[0080] 本發(fā)明中，甲基丙締酷輔酶A是指W下結(jié)構(gòu)式所示的化合物。已知的是，在生物體 內(nèi)，甲基丙締酷輔酶A為鄉(xiāng)氨酸的代謝中間體。本發(fā)明中使用的甲基丙締酷輔酶A可W是利 用公知的或新的方法制造的甲基丙締酷輔酶A。作為其合成方法，已知通過有機化學(xué)方式合 成甲基丙締酸酢和輔酶A的方法(Methods in Enzymology .324,73 -79(2000))或使用酶反 應(yīng)合成的方法。
[00川[化學(xué)式。
[0082]
[0083] 在本發(fā)明中，運些之中可W優(yōu)選使用W異下酷輔酶A為原料、在酷基輔酶A脫氨酶 化C 1.3.99.3)(W下稱為ACD)的作用下轉(zhuǎn)變得到的甲基丙締酷輔酶A或在締酷輔酶A水合 酶化C 4.2.1.17)( W下稱為ECH)的作用下由3-徑基異下酷輔酶A轉(zhuǎn)變得到的甲基丙締酷 輔酶A。進而，本發(fā)明中使用的甲基丙締酷輔酶A還可W使用由2-氧代異戊酸經(jīng)由異下酷輔 酶A而制造的甲基丙締酷輔酶A。即，本發(fā)明的方法中，通過使用由異下酷輔酶A或3-徑基異 下酷輔酶A制造的甲基丙締酷輔酶A，利用酶所引起的連續(xù)反應(yīng)而使收率提高并抑制雜質(zhì)， 并且能夠在不經(jīng)由或不副產(chǎn)對生物體毒性強的甲基丙締酸的條件下直接合成甲基丙締酸 醋。通過上述方法，能夠?qū)崿F(xiàn)利用環(huán)境負擔(dān)小的生物體內(nèi)連續(xù)反應(yīng)(代謝發(fā)酵)而制造甲基 丙締酸醋。
[0084] [醇.酪類]
[0085] 成為本發(fā)明中的甲基丙締酸醋的制造的原料的醇或酪類為W下的式2所示的化合 物。由于醇或酪類的結(jié)構(gòu)與甲基丙締酸醋是對應(yīng)的，因此其結(jié)構(gòu)的定義與上述式1的R相同， 表示直鏈或支鏈的碳數(shù)為1~20的控基?？鼗蒞為飽和或不飽和的非環(huán)式，也可W為飽和 或不飽和的環(huán)式。優(yōu)選直鏈或支鏈的碳數(shù)為1~10的非取代的醇、芳烷基醇或酪類，更優(yōu)選 甲醇、乙醇、正丙醇、異丙醇、正下醇、異下醇、仲下醇、叔下醇、正戊醇、異戊醇、叔戊醇、正己 醇、異己醇、2-己醇、二甲基下醇、乙基下醇、庚醇、辛醇、2-乙基己醇之類的碳數(shù)1~8的燒 基醇、芐基醇或酪。特別優(yōu)選甲醇、乙醇、正下醇、異下醇、正己醇。
[0086] R-OH (式 2)
[0087] [醇酷基轉(zhuǎn)移酶]
[0088] 本發(fā)明的醇酷基轉(zhuǎn)移酶下稱為AAT)是具有如下催化作用的酶，所述催化作用 為將酷基輔酶A的酷基轉(zhuǎn)移給醇或酪類而合成醋。據(jù)說AAT參與各種水果中的醋的生成。已 知AAT存在于姜目（香蕉）、菩薇目（草替、蘋果、梨、桃）、葫蘆目（甜瓜）、茶目（雜猴桃）、唇形 目（橄攬）、茄目（番茄）、無患子目（梓樣、芒果)等植物中。
[0089] 本發(fā)明中使用的AAT為來自選自由屬于唇形目化amiales)、葡萄目（Vitales)、無 患子目（Sapindales)、錦葵目（Malvales)、木蘭目（Magnoliales)及菊目（Asterales)各目 的植物組成的組中的植物的AAT，只要具有^甲基丙締醜輔酶A與醇或m類為原料而制造甲 基丙締酸醋的能力，則沒有特別限定，對其種類及起源沒有限制。
[0090] 用于本發(fā)明的AAr^W通過^下方法由上述植物容易地獲得。根據(jù)需要將組織的 適當部位切斷，從而可獲得。在該切斷部位添加含有甲基丙締醜輔酶A和式2所示的醇或m 類的溶液，振蕩并使其反應(yīng)一定時間。通過利用GC(氣相色譜)確認反應(yīng)液中有無甲基丙締 酸醋，能夠?qū)铣苫钚赃M行確認。具體而言，例如，將葉、花、花蕾、果肉或果皮切斷，在其中 添加含有0.01~lOmM的甲基丙締醜輔酶A及2~50倍摩爾量的正下醇的溶液，在3(TC振蕩1 ~10小時。反應(yīng)結(jié)束后，用GC確認有無甲基丙締酸醋，由此可^獲得能夠用于本發(fā)明的AAT。
[0091] 作為用于本發(fā)明的AAT的酶源，為屬于選自唇形目（Lamiales)、葡萄目（Vitales)、 無患子目（Sapindales)、錦葵目（Maivales)、木蘭目（Magnoliales)及菊目（Asterales)組 成的組中的任意目的植物。
[0092] 作為屬于唇形目的植物，優(yōu)選爵床科(Acanthaceae)、紫蔵科（Bignoniaceae)、腺 毛草科（871311(130636)、荷包花科（〔31〇6〇131'130636)、四角果科（〔31'1611131111130636)、苦宦 苔科（Gesneriaceae)、唇形科化amiaceae)、母草科（Linderniaceae)、狐藻科 (Lentibulariaceae)、角胡麻科（Martyniaceae)、木犀科（Oleaceae)、列當科 (Orobanchaceae)、泡桐科（Paulowniaceae)、胡麻科（Pedaliaceae)、透骨草科 (戶11巧11130 636)、車前科（？1311巾3旨；[1130636)、戴繆木科（？10(3 03961'1113巾30 636)、夷地黃科 (5(3]116容61130636)、玄參科（5(31'091111131'130636)、密穗草科（5^化30636)、四粉草科 (Tetrachon虹aceae)、猩猩茶科（Thomandersiaceae)及馬鞭草科（Verbenaceae)的植物D
[0093] 作為屬于葡萄目的植物，優(yōu)選葡萄科(Vitaceae)的植物。
[0094] 作為屬于無患子目的植物，優(yōu)選漆樹科（Anacardi aceae)、熏倒?？?(Biebersteiniaceae)、橄攬科（Burseraceae)、番苦木科化irkiaceae)、棟科（Meliaceae)、 白刺科（Nitrariaceae)、蕓香科（Rutaceae)、無患子科（Sapindaceae)及苦木科 (S imaroubaceae)的植物 D
[009日]作為屬于錦葵目的植物，優(yōu)選紅木科(Bixaceae)、半日花科(Cistaceae)、簇花草 科（〔7巾；[113 0636)、龍腦香科（019巾61'003巧30636)、錦葵科（]\131￥30636)、文定果科 (Muntingiaceae)、沙霉科（Neuradaceae)、旋花樹科（Sarcolaenaceae)、球霉樹科 (Sphaerosepalaceae)及瑞香科（扣711161363〇636)的植物。
[0096]作為屬于木蘭目的植物，優(yōu)選番蒜枝科（Annonaceae)、單室木蘭科 (Degeneriaceae) >ifi(Eupomatiaceae) >^*>i￡^f4(Himantandraceae) > (Magnoliaceae)及肉豆蘿科（Myristicacea)的植物 D
[0097]作為屬于菊目的植物，優(yōu)選假海桐科（Alseuosmiaceae)、雪葉科 (Argophyllaceae)、菊科（Asteraceae)、頭花草科（Calyceraceae)、枯?？?(Campanulaceae )、海桐科（Goodeniaceae)、睡萊科（Menyanthaceae)、五膜草科 化611巾3911則旨1113巾30636)、石冬青科化11611；[1130636)、盧梭木科化0113 3630636)及花柱草科 (Stylidiaceae)的植物 D
[0098] 其中，更優(yōu)選屬于木犀科、葡萄科、蕓香科、錦葵科、木蘭科或菊科的植物。
[0099] 具體而言，作為屬于木犀科的植物，優(yōu)選木犀屬(Osmanthus)及橄攬屬(Olea)、素 馨屬(Jasminum)、連翅屬(Forsythia)、下香屬(Syringa)、流蘇樹屬(Qiionanthus)、白蠟樹 屬（Fraxinus)及女貞屬化igustrum)的植物；作為屬于馬鞭草科的植物，優(yōu)選美女樓屬 (Glandularia)的植物;作為屬于唇形科的植物，優(yōu)選鼠尾草屬(Salvia)的植物。
[0100] 作為屬于葡萄科的植物，優(yōu)選葡萄屬(Vitis)、蛇葡萄屬(Ampelopsis)、烏蔥替屬 (Cayratia)、白粉藤屬（Cissus)、葡萄瓷屬（Cyphostemma)、火筒樹屬化eea)、地錦屬 。日1'1：11日]10。133113)及崖爬藤屬巧日付日31：1旨1]1日）的植物。
[0101 ]作為屬于蕓香科的植物，優(yōu)選相橘屬（Ci trus )、木橘屬（Aegl e )、花椒屬 (Zanthoxylum)、九里香屬(Murraya)、蕓香屬（Ru1:a)、臭常山屬（Orixa)、茵芋屬（Skimmia) 吳榮英屬（Euodia)、黃築屬"!1日11〇(1日]1(11'〇]1)、波羅尼亞屬（8〇1'〇]11日）、山油相屬 (Acronychia)、黃皮屬（Clausena)、考來木屬（Correa)、山小枯屬(Glycosmis)及蜜榮英屬 (Mel icope)的植物;作為屬于無患子科的植物，優(yōu)選慕枝屬化itchi)的植物;作為屬于漆樹 科的植物，優(yōu)選化果屬(Mangifera)的植物。
[0102]作為屬于錦葵科的植物，優(yōu)選惱蓮屬（Durio)、可可屬（Theobroma)、荷麻屬 (Abutilon)、秋葵屬（Abelmoschus)、棉屬（Gossypium)、孔雀葵屬（Pavonia)、木穫屬 化ibis州S)、黃花捻屬(Sida)及錦葵屬(Malva)的植物。
[01 03 ]作為屬于木蘭科的植物，優(yōu)選木蘭屬(Magno 1 i a)的植物。
[0104]作為屬于菊科的植物，優(yōu)選屬于果香菊屬(化amaemelum)、著屬(4。]1；[11日日）、紫錐 菊屬巧chinacea)、母菊屬(Matricaria)、菊葛屬（Tanacetum)、蒲公英屬（Taraxa州m)、葛屬 (Artemisia)、蜂斗菜屬（Petasites)、蠟菊屬巧elichrysum)、檀香艾屬（Santolina)、菜劑 屬（切11日抑）、水飛劑屬（5;[171311111)、金盞花屬（〔日1日]1(1111日）、菊宦屬（(：;[。1101'；[11111)、紅花屬 (&;rthamus)及菊屬（化巧santhemum)的植物。
[0105] 其中，特別優(yōu)選屬于木犀屬、葡萄屬、相橘屬、惱蓮屬、木蘭屬或果香菊屬的植物。
[0106] 進而，具體而言，作為屬于木犀屬的植物，優(yōu)選木犀(銀木犀、金木犀、淡黃木犀、白 木犀）（Osmanthus fragrans)、格樹（Osmanthus heterophyllus)、厚邊木犀（Osmanthus marginatus)、齒葉木犀（Osmanthus Xf〇；rtunei)及島蝸木犀（Osmanthus insularis);作為 屬于橄攬屬的植物，優(yōu)選油橄攬(Olea europaea);作為屬于鼠尾草屬的植物，優(yōu)選一串紅 (Salvia splendens)、作為屬于美女樓屬的植物，優(yōu)選美女樓(Glandularia X hybrida)。
[0107] 作為屬于葡萄屬的植物，優(yōu)選葡萄（Vitis vinifera、Vitis labrusca)、夏葡萄 (Vitis aestivalis)、山葡萄(Vitis coignetiae)及桑葉葡萄(Vitis ficifolia)。
[0108] 作為屬于相橘屬的植物，優(yōu)選巧樣(Citrus limon)、酢橘(Citrus sudachi)、臭澄 (Citrus sphaerocarpa)、葡萄抽（Citrus x paradisi )、抽子（Citrus junos)、萊姆 (Citrus aurantifolia)、溫州蜜相（Citrusunshiu)及澄（Citrus sinensis)的植物；作為 屬于木橘屬的植物，優(yōu)選木橘(Aegle marmelos)的植物;作為屬于慕枝屬的植物，優(yōu)選慕枝 (Litchi chinensis)的植物;作為屬于化果屬的植物，優(yōu)選芒果(Mangifera indica)。
[0109] 作為屬于惱蓮屬的植物，優(yōu)選惱蓮（Durio zibethinus、Du;rio testudinarius、 Durio kutejensis、Durio oxley曰nus、Durio gr曰veolens、Durio dulcis)的植物；作為屬 于可可屬的植物，優(yōu)選可可(Theobroma cacao)。
[0110] 作為屬于木蘭屬的植物，優(yōu)選含笑（Magnolia figo)、臺灣含笑（Magnolia compressa)、黃玉蘭（Magnolia champaca)、紫玉蘭（Magnolia liliif lora)、日本辛夷 (Magnolia kobus)、厚樸（Magnolia obovata及Magnolia laevifolia) 〇
[0111] 作為屬于果香菊屬的植物，優(yōu)選羅馬洋甘菊(化amaemelum nobile及化amaemelum fuscatum)。
[0112] 其中，特別優(yōu)選木犀、葡萄、葡萄抽、惱蓮、含笑或羅馬洋甘菊。
[0113] 需要說明的是，在直接使用植物作為酶源而進行合成反應(yīng)時，在W碳數(shù)為1~2的 醇為底物時，特別是使用屬于葡萄屬或惱蓮屬的植物是更為優(yōu)選的（參照后述實施例的"表 n〇
[0114] 本發(fā)明中，植物的分類是按照APG植物分類體系第3版(Botanical Journal of the Linnean Society,2009,161,105121)進行的。
[0115] 本發(fā)明中，將AAT供于反應(yīng)時，只要顯示出上述催化劑活性則對其使用形態(tài)沒有特 別限定，也可W直接使用含有AAT的生物組織或其處理物。作為運樣的生物組織，可W使用 植物體整體、植物器官（例如果實、葉、花瓣、莖、種子等）、植物組織（例如果實表皮、果肉 等）。作為生物組織的處理物，可W列舉從生物組織中提取的AAT的粗酶液或純化酶等。
[0116] 對純化AAT的方法沒有特別限定，優(yōu)選通過W下方法進行分離。將上述植物的具有 AAT活性的組織破碎后，懸浮于化is-肥1緩沖液、憐酸緩沖液等緩沖液中。對該粗酶液，單 獨使用酶的純化中常用的（1)基于沉淀的分級、（2)各種色譜、（3)基于透析、超濾等的低分 子物質(zhì)的除去方法等，或?qū)⑦\些方法適當組合而用。
[0117] 純化AAT的具體優(yōu)選方式如下。將生物組織用液氮等凍結(jié)并磨碎后，用5倍量的含 有DTT(二硫蘇糖醇)及甘油等的化is-HCl緩沖液提取。然后，將粗酶提取液供于離子交換 色譜，將其非吸附部分回收，從而獲得酶提取液。對幾種調(diào)制粗酶提取液的方法進行了研 究，結(jié)果明確了 ：根據(jù)該方法，能夠排除植物中所含的多酪的影響，穩(wěn)定且高效地獲得酶提 取液。另外還明確了：利用硫酸錠等進行沉淀的分級方式會誘發(fā)酶活性的喪失。
[0118] 對于獲得的酶提取液，通過使用離子交換色譜、凝膠過濾柱等，能夠高效地純化酶 蛋白。
[0119] 基于所純化的AAT蛋白，通過基因工程手法能夠獲得基因信息。通過公知方法對該 基因信息進行分離或全合成，將其導(dǎo)入常見的宿主載體系統(tǒng)，通過用該載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的微 生物表達候選蛋白，能夠用于本發(fā)明的甲基丙締酸醋的制造。
[0120] [適合制造甲基丙締酸醋的AAT的酶學(xué)性質(zhì)]
[0121] 本發(fā)明的AAT在醇或酪類的存在下作用于甲基丙締酷輔酶A而催化生成甲基丙締 酸醋的反應(yīng)。AAT優(yōu)選在W甲基丙締酷輔酶A為底物時具有高反應(yīng)性的AAT。具體而言，優(yōu)選 對甲基丙締酷輔酶A的活性高于對乙酷輔酶A的活性、且對甲基丙締酷輔酶A的Km值為0.5mM W下的AAT。根據(jù)具有運樣的性質(zhì)的AAT，能夠選擇性良好地生產(chǎn)甲基丙締酸醋。
[0122] (1)底物特異性
[0123] 作為本發(fā)明中優(yōu)選的AAT，在W對甲基丙締酷輔酶A的反應(yīng)性為基準時，至少對乙 酷輔酶A的反應(yīng)性低即可。更具體而言，將W正下醇為底物時對甲基丙締酷輔酶A的反應(yīng)性 設(shè)為100%時，本發(fā)明的優(yōu)選的AAT優(yōu)選對乙酷輔酶A的反應(yīng)性為同等W下，更優(yōu)選為50% W 下，進而優(yōu)選為40% W下?；?qū)正己醇為底物時對甲基丙締酷輔酶A的反應(yīng)性設(shè)為100% 時，優(yōu)選對乙酷輔酶A的反應(yīng)性為同等W下、更優(yōu)選為70 % W下，進而優(yōu)選為50 % W下。
[0124] (2)對甲基丙締酷輔酶A的親和性
[0125] 本發(fā)明的AAT優(yōu)選對甲基丙締酷輔酶A的親和性高。對底物的親和性可W通過米氏 常數(shù)化m)來進行評價。對甲基丙締酷輔酶A的Km為按照后述實施例測定、計算而獲得的值。
[0126] 作為本發(fā)明優(yōu)選的AAT的對甲基丙締酷輔酶A的Km值，為對乙酷輔酶A的Km值W下 即可，優(yōu)選為0.5mMW下，更優(yōu)選為0.2mMW下，進而優(yōu)選為0.1 mMW下，特別優(yōu)選為0.05mMW 下。通過親和性高，即使作為原料的甲基丙締酷輔酶A的濃度低的情況下，也能夠進行上述 催化反應(yīng)，能夠更高效地制造甲基丙締酸醋。
[0127] [AAT活性表達用重組微生物]
[0128] 進而，在將AAT供于反應(yīng)時，還可W將上述AAT的基因分離并導(dǎo)入例如常見的宿主 載體系統(tǒng)，而利用用該載體系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的微生物。作為宿主，若為細菌，可W列舉大腸桿菌、紅 球菌屬（I^iodococcus)、假單胞菌屬（Pseudomonas)、棒狀桿菌屬（Corynebacterium)、芽抱 桿菌屬（8日。;[11113)、鏈球菌屬（5付日91:0(30(3州3)、鏈霉菌屬（5付日91:01117。日3)等，若為酵母，可 W列舉酵母菌屬（Saccharomyces)、念珠菌屬（Candida)、裂殖酵母屬 (化izosaccha;romyces)、畢赤酵母屬（Pichia)，若為絲狀真菌，可W列舉曲霉菌屬 (Aspe巧i 1 lus)等。其中，特別是利用大腸桿菌簡便且效率也高，故而優(yōu)選。
[0129] 已經(jīng)公開了若干種運些植物的AAT基因。可W基于該信息制作DNA探針，例如制作 用于PCR的引物并進行PCR，從而分離該基因。另外，還可W通過常規(guī)方法對AAT基因的堿基 序列進行全合成。關(guān)于運些基因信息為己知的AAT是否具有甲基丙締酸醋的合成活性，可W 通過上述方法同樣地確認。另一方面，對于基因信息尚不明確的AAT，可W純化AAT，基于其 蛋白質(zhì)通過基因工程手法獲得基因信息。
[0130] 本發(fā)明中，作為優(yōu)選的AAT基因，只要是來自選自由屬于唇形目化amiales)、葡萄 目（Vitales)、無患子目（Sapindales)、錦葵目（Maivales)、木蘭目（Magnoliales)及菊目 (Asterales)的各目的植物組成的組中的植物、且其翻譯產(chǎn)物具有生成甲基丙締酸醋的能 力，貝峨有特別限定，可W從上述AAT酶源中適當選擇。
[0131] 需要說明的是，在本發(fā)明中，AAT基因還含有編碼如下蛋白的基因，所述蛋白含有 在野生型的氨基酸序列中置換、缺失或附加1個或數(shù)個氨基酸的氨基酸序列，且具有由甲基 丙締酷輔酶A和醇生成甲基丙締酸醋的活性。
[0132] 運里，"數(shù)個"是指1~40個、優(yōu)選1~20個、更優(yōu)選10個W下。為了在基因中導(dǎo)入變 異，可W通過Kunkel法、Gapped dupler法等公知手法，使用利用位點特異性突變誘導(dǎo)法的 變異導(dǎo)入用試劑盒、例如如化OiangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit(Stra1:agene公 司）、GeneTailorTM Site -Directed Mutagenesis System( Invitrogen公司）、TaKaRa Site -Directed Mutagenesis System(Mutan-K、Mutan -Super Express Km等：寶生物公 司）等?；蛘撸部蒞人工合成具有含有變異的序列的整個基因。
[0133] 本發(fā)明中，DNA的堿基序列的確認可W通過利用慣用的方法進行序列確定來進行。 例如，還可W基于桑格(Sanger)法使用適當?shù)腄NA測序儀對序列進行確認。
[0134] 另外，本發(fā)明中，AAT基因還含有編碼如下蛋白的基因，所述蛋白與由野生型的氨 基酸序列構(gòu)成的蛋白顯示90% W上、優(yōu)選95% W上、更優(yōu)選99.5% W上、進而優(yōu)選99.9% W 上的同源性，且具有由甲基丙締酷輔酶A和醇生成甲基丙締酸醋的活性。
[0135] 進而，本發(fā)明中，AAT基因還包括如下基因，所述基因與具有和野生型的堿基序列 互補的堿基序列的多聚核巧酸在嚴格條件下雜交，且編碼具有由甲基丙締酷輔酶A和醇生 成甲基丙締酸醋的活性的蛋白。作為上述嚴格條件，可W列舉例如:將固定有DNA的尼龍膜 在含有6 X SSC( 1 X SSC為在1升水中溶解氯化納8.76g、巧樣酸鋼4.41g而成的溶液）、1 % SDS、100μg/ml魚精DNA、0.1%牛血清白蛋白、0.1%聚乙締基化咯燒酬、0.1%尸山〇11的溶液 中于65°C與探針一起保溫20小時而進行雜交的條件，但并非僅限于此。本領(lǐng)域技術(shù)人員可 W在運樣的緩沖液的鹽濃度、溫度等條件的基礎(chǔ)上考慮其它的探針濃度、探針長度、反應(yīng)時 間等各項條件來設(shè)定雜交的條件。作為雜交后的洗涂條件，可W列舉例如"2XSSC、0.1% SDS、42°Cr'、"lXSSC、0.1%SDS、37°Cr'，作為更嚴格的條件，可W列舉例如"1XSSC、0.1% SDS、65 XT'、％. 5 X SSC、0.1 % SDS、50 XT' 等條件。
[0136] 關(guān)于雜交法的詳細步驟，可W參照Molecular Cloning,A Laboratory Manual 2nd ed.(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)))、Current Protocols in Molecular BiologyQohn Wiley&Sons(1987 -1997))等。
[0137] 進而，本發(fā)明中，AAT基因還包括如下基因，所述基因由使用BLAST等(例如默認值， 即初始設(shè)定的參數(shù))計算時與野生型的堿基序列具有80% W上、更優(yōu)選90% W上、最優(yōu)選 95% W上的同源性的堿基序列構(gòu)成，且編碼具有由甲基丙締酷輔酶A和醇生成甲基丙締酸 醋的活性的蛋白質(zhì)。另外，上述AAT基因的密碼子可W根據(jù)轉(zhuǎn)化中使用的微生物宿主的密碼 子使用頻率進行轉(zhuǎn)變。
[0138] 運里，序列的"同源性"是指:在為堿基序列時，按照欲比較的2個堿基序列的堿基 盡量多地達到一致的方式將兩個堿基序列對齊，將一致的堿基數(shù)除W全部堿基數(shù)而得的值 W百分率表示。進行上述對齊時，根據(jù)需要，在進行比較的2個序列的一者或兩者中適當插 入間隔。運樣的序列的對齊化可W使用例如BLAST、FASTA、&USTALW等公知的程序來進行。 在插入間隔時，上述全部堿基數(shù)為將1個間隔作為1個堿基計數(shù)時的堿基數(shù)。運樣計數(shù)獲得 的全部堿基數(shù)在進行比較的2個序列間不同的情況下，同源性（％ )通過用一致的堿基數(shù)除 W較長的序列的全部堿基數(shù)而算出。關(guān)于氨基酸序列的同源性也同樣。
[0139] 在甲基丙締酸醋合成反應(yīng)中，可W直接使用對上述重組微生物進行培養(yǎng)而獲得的 培養(yǎng)液，或者使用通過離屯、分離等收集菌體的操作從該培養(yǎng)液獲得的菌體或其處理物等。 作為菌體處理物，可W列舉用丙酬、甲苯等處理過的菌體、冷凍干燥菌體、菌體破碎物、將菌 體破碎而獲得的無細胞提取物、從運些之中提取酶而獲得的粗酶或純化酶等。
[0140] 導(dǎo)入了AAT基因的微生物中，還可W根據(jù)需要導(dǎo)入ACD基因、ECH基因、BCKAD(2-氧 代異戊酸脫氨酶)基因等，由異下酷輔酶A、3-^基異下酷輔酶A或2-氧代異戊酸等的前體 而合成甲基丙締酸醋。
[0141] "前體"是指能夠衍生為甲基丙締酷輔酶A的化合物，表示異下酷輔酶A或3-徑基 異下酷輔酶A、進而能夠衍生為運巧巾化合物的物質(zhì)。
[0142] 能夠衍生為巧巾化合物的物質(zhì)可列舉出例如2-氧代異戊酸、異下酸、3-徑基異下 酸、乙酸、丙酬酸、乳酸、乙酷乙酸、下酸、丙酸、蘋果酸、富馬酸、巧樣酸及班巧酸等酸，鄉(xiāng)氨 酸、丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸及谷氨酸等氨基酸類，葡萄糖、果糖及木糖等糖類等。
[0143] 為了由運些前體生成甲基丙締酸醋，還可W直接利用宿主微生物本來具有的各種 代謝系統(tǒng)。還可W根據(jù)需要進行基因的導(dǎo)入或敲除。
[0144] 2.甲基丙締酸醋的合成工序
[0145] 甲基丙締酸醋的制造可W按照W下的方法進行。在溶劑中添加甲基丙締酷輔酶A 及式2表示的醇或酪類，使其溶解或懸浮。然后，使AAT與該溶液或懸濁液接觸，在控制溫度 等條件的同時使甲基丙締酷輔酶A與醇或酪類反應(yīng)。通過上述反應(yīng)，將甲基丙締酷輔酶A的 甲基丙締酷基轉(zhuǎn)移給式2的醇或酪類而生成甲基丙締酸醋。
[0146] 含有甲基丙締酷輔酶A及式2表示的醇或酪類的溶液，通常用緩沖液等水性介質(zhì)來 調(diào)制。運里，為了使反應(yīng)順利進行，可W用滲透壓調(diào)節(jié)劑等對摩爾滲透壓濃度和/或離子強 度進行控制。作為滲透壓調(diào)節(jié)劑，只要是出于調(diào)節(jié)為相對于細胞內(nèi)部等的溶液的滲透壓為 等滲或高滲的目的而添加的水溶性物質(zhì)即可，例如為鹽或糖類，優(yōu)選為鹽。作為鹽，優(yōu)選為 金屬鹽，更優(yōu)選為堿金屬鹽，進一步優(yōu)選為堿金屬面化物，可W列舉例如氯化鋼、氯化鐘。作 為糖類，優(yōu)選為單糖類或寡糖類，更優(yōu)選為單糖類或二糖類，可W列舉例如葡萄糖、薦糖、甘 露醇等。滲透壓調(diào)節(jié)劑優(yōu)選WlmMW上的濃度進行添加，特別優(yōu)選調(diào)節(jié)為與所使用的生物細 胞內(nèi)的溶液相比為等滲或高滲。
[0147] 另外，出于將生成的甲基丙締酸醋分離的目的，還可W預(yù)先添加有機溶劑，W2相 體系進行反應(yīng)。作為有機溶劑，可W單獨使用例如直鏈狀、支鏈狀或環(huán)狀的、飽和或不飽和 的脂肪族控、飽和或不飽和的芳香族控等，或?qū)⑺鼈兊那山鞼上混合使用。具體而言，可W列 舉例如控系溶劑(例如戊燒、己燒、環(huán)己燒、苯、甲苯、二甲苯等）、面化控系溶劑(例如二氯甲 燒、氯仿等）、酸系溶劑(例如乙酸、丙酸、異丙酸、下酸、叔下基甲基酸、二甲氧基乙燒等）、醋 系溶劑(例如甲酸甲醋、乙酸甲醋、乙酸乙醋、乙酸下醋、丙酸甲醋)等。通過預(yù)先添加運些有 機溶劑，生成的甲基丙締酸醋進入有機相，有時反應(yīng)能夠高效進行。
[0148] 反應(yīng)液中的甲基丙締酷輔酶A及式2表示的醇或酪類的摩爾比、濃度是任意的，沒 有特別限定。另外，AAT的使用量或反應(yīng)條件可W根據(jù)使用的原料適當確定。通常，關(guān)于各原 料的濃度，為甲基丙締酷輔酶A時，設(shè)定在0.0000001~10質(zhì)量％的范圍，醇或酪類則按照相 對于所使用的甲基丙締酷輔酶A為0.1~1000倍摩爾、優(yōu)選為0.5~500倍摩爾的濃度進行添 加。
[0149] 此外的反應(yīng)溫度或反應(yīng)時間等各種條件可W根據(jù)所使用的原料、酶的活性等適當 確定，沒有特別限定，通常5~80°C使其反應(yīng)1小時~1周即可。優(yōu)選在10~70°C反應(yīng)1~120 小時，更優(yōu)選1小時W上，進而優(yōu)選3小時W上。關(guān)于反應(yīng)液的pH，只要反應(yīng)高效地進行就沒 有特別限定，例如為pH4~10的范圍，優(yōu)選5.0~9.0。溫度、時間及反應(yīng)液的抑等優(yōu)選選擇反 應(yīng)可完成的條件。
[0150] 作為合適條件，在pH5.5~9.0的條件下按照使甲基丙締酷輔酶A的濃度直接或間 接地達到0.000001~1質(zhì)量％的范圍方式來調(diào)制，醇或酪類的濃度則按照相對于所使用的 甲基丙締酷輔酶A達到1~500倍摩爾的方式來調(diào)整。然后，將溫度調(diào)制到20~40°C的范圍使 其反應(yīng)1小時W上。對于運些原料(底物），還可W連續(xù)地進行供給W使其達到上述范圍，通 過運種方式能夠提高產(chǎn)物的累積濃度。
[0151] 在減壓下或通氣條件下實施本反應(yīng)也是有效的。運是由于在上述條件下，可W連 續(xù)地將生成的甲基丙締酸醋分離，其結(jié)果是，有時反應(yīng)能夠高效進行。
[0152] 在使用W異下酷輔酶A為原料通過ACD的作用轉(zhuǎn)變成的甲基丙締酷輔酶A或由3- 徑基異下酷輔酶A通過ECH的作用轉(zhuǎn)變成的甲基丙締酷輔酶A來制造甲基丙締酸醋時，也優(yōu) 選調(diào)整至上述條件的范圍而實施。需要說明的是，通過ACD或ECH合成甲基丙締酷輔酶A的反 應(yīng)可W根據(jù)公知的方法來實施（例如，作為ACD的反應(yīng)條件，可W是Microbiology (1999)， 145,2323-2334記載的條件）。進而，通過與其他生物反應(yīng)組合，能夠?qū)崿F(xiàn)甲基丙締酸醋在 生物體內(nèi)的連續(xù)反應(yīng)(發(fā)酵生產(chǎn)）。
[0153] 3.甲基丙締酸醋的回收
[0154] 培養(yǎng)基中或反應(yīng)液中生成的甲基丙締酸醋及其生成量可W使用高效液相色譜及 LC-MS等常規(guī)方法來檢測、測定。另外，揮發(fā)到培養(yǎng)容器或反應(yīng)容器的氣相部(頂空部)的甲 基丙締酸醋及其生成量可W使用氣相色譜等常規(guī)方法檢測、測定。
[0155] 甲基丙締酸醋從反應(yīng)液中的分離可W根據(jù)需要將過濾、離屯、分離、真空濃縮、離子 交換或吸附色譜、溶劑提取、蒸饋及結(jié)晶等公知的操作適當組合而進行。另外，獲得的甲基 丙締酸醋可W通過常規(guī)方法聚合，毫不遜色地用于W往的用途。
[0156] 如此獲得的甲基丙締酸醋及其聚合物能夠極大地降低對能量、資源及環(huán)境的負 擔(dān)，與W石油制品為起始原料的W往的化學(xué)制造品相比，作為一種環(huán)境負擔(dān)低的材料具有 非常大的社會價值。
[0157] 4.新的AAT及使用其進行的有機酸醋的制造
[0158] W下，對作為本發(fā)明的一個方面的新的AAT及使用其進行的有機酸醋的制造進行 詳細說明。
[0159] 本發(fā)明的AAT是在醇或酪類的存在下作用于酷基輔酶A而催化生成有機酸醋的反 應(yīng)的酶。
[0160] 本發(fā)明中的酶組合物只要含有具有甲基丙締酸醋的合成活性的AAT即可，沒有特 另順定，可W列舉含有AAT的生物組織或其處理物、由生物組織提取的AAT粗酶液或純化酶 等。進而，可W例示出培養(yǎng)上述基因重組生物而獲得的培養(yǎng)液、由該培養(yǎng)液獲得的菌體或其 處理物、由運些提取酶而獲得的粗酶或純化酶等。
[0161] (1)底物特異性
[0162] 作為本發(fā)明的AAT，對作為底物的甲基丙締酷輔酶A、丙酷輔酶A及異下酷輔酶A具 有高反應(yīng)性。即，對甲基丙締酷輔酶A、丙酷輔酶A及異下酷輔酶A的活性高于對乙酷輔酶A的 活性。更具體而言，將W正下醇為底物時對甲基丙締酷輔酶A的反應(yīng)性設(shè)為100%時，本發(fā)明 的AAT對丙酷輔酶A及異下酷輔酶A的反應(yīng)性為同等程度，且對乙酷輔酶A的反應(yīng)性為其W 下、更優(yōu)選為50% W下、進而優(yōu)選為40% W下。進而，相對于運巧巾底物（甲基丙締酷輔酶A、 丙酷輔酶A及異下酷輔酶A)，對下酷輔酶A及己酷輔酶A的反應(yīng)性與乙酷輔酶A同樣地低，為 50% W下。
[0163] (2)對甲基丙締酷輔酶A的親和性
[0164] 本發(fā)明的AAT對甲基丙締酷輔酶A的親和性高。對底物的親和性可W通過米氏常數(shù) 化m)來進行評價。對甲基丙締酷輔酶A的Km為按照后述實施例測定、計算而獲得的值。
[0165] 作為本發(fā)明的AAT的對甲基丙締酷輔酶A的Km值，為對乙酷輔酶A的Km值W下，優(yōu)選 為0.5mMW下，更優(yōu)選為0.2mMW下，進而優(yōu)選為0.1 mMW下，特別優(yōu)選為0.05mM W下。通過親 和性高，即使作為原料的甲基丙締酷輔酶A的濃度低的情況下，也能夠進行上述催化反應(yīng)， 能夠更高效地制造甲基丙締酸醋。
[0166] (3)最適反應(yīng)抑
[0167]本發(fā)明的AAT在各抑下的反應(yīng)性可W在抑6~10.5的比較寬的范圍內(nèi)確認到。作為 該反應(yīng)的最適pH，在7~9的范圍內(nèi)。更具體而言，在8~9附近，特別是在使用抑8.5的 徑基甲基氨基甲燒)一鹽酸緩沖液時顯示最高的活性。
[016引（4)來源
[0169] 本發(fā)明的AAT可W從選自上述的屬于唇形目的植物、屬于葡萄目的植物、屬于無患 子目的植物、屬于錦葵目的植物、屬于木蘭目的植物及屬于菊目的植物組成的組中的植物 中分離。優(yōu)選來自屬于菊科的植物。進而優(yōu)選來自屬于果香菊屬的植物。特別優(yōu)選來自羅馬 洋甘菊。
[0170] 如上所述，具有優(yōu)異特性的本發(fā)明的AAT作為碳數(shù)3~4的飽和或不飽和的有機酸 醋的合成酶極為有用。即，根據(jù)本發(fā)明的AAT，即使原料中存在作為雜質(zhì)的乙酷輔酶A時，也 能夠選擇性地生成目標有機酸醋。因此，該酶在預(yù)期存在雜質(zhì)或擔(dān)屯、存在雜質(zhì)的用途(利用 生物質(zhì)原料等進行醋的發(fā)酵生產(chǎn)等）中具有優(yōu)異效果。
[0171] 實施例
[0172] W下通過實施例對本發(fā)明進行具體說明，但本發(fā)明的范圍不受運些實施例的范圍 限定。
[0173] [實施例1:利用木犀進行的甲基丙締酸下醋的合成]
[0174] 將Ig切碎的金木犀(Osmanthus fragrans)葉量取到20ml容積的GC頂空用瓶（23 X 75mm、National Scientif ic制）中。加入1ml底物溶液（50mM Tris -HC1 (P服.5)、正下醇 40mM、甲基丙締酷基輔酶A 0.125mM)并密閉，于30°C反應(yīng)12小時。反應(yīng)結(jié)束后，加入lOiil作 為內(nèi)標的1 OmM 2-己酬后，通過SPME(固相微萃取)法用GC-MS對產(chǎn)物進行分析。SPME中使 用Carboxen/PDMS(75um、化sed Silica、西格瑪奧德里奇公司制），在30°C吸附10分鐘。
[0175] GC-MS分析條件
[0176] 柱：TC-70(內(nèi)徑0.25mmX60m、0.25皿、GL Sciences公司）
[0177] 柱溫：50°C ? 5min一7.5°C/min一20(TC ? lOmin
[0178] 載氣:氮
[0179] 流量：1.13ml/min
[0180] 進樣（Inject) :250°C
[0181] 另外，使用O.lmM甲基丙締酸下醋溶液(50mM化is-HCl、p冊.5)來確認利用金木 犀葉進行的甲基丙締酸醋的水解反應(yīng)。反應(yīng)在30°C進行12小時。
[0182] 甲基丙締酸醋的量是通過內(nèi)標法制作標準曲線而算出的。通過相同的容量及容器 調(diào)制各濃度的標準溶液，加入lOyl作為內(nèi)標的lOmM 2-己酬，然后通過SPME法及GC-MS進 行分析(n = 3)。產(chǎn)物的確認通過將保留時間及質(zhì)譜圖與標品進行比較而進行。另外，同時進 行了空白試驗(無底物），確認沒有甲基丙締酸下醋生成。將結(jié)果示于表1。確認通過金木犀 生成0.7iiM的甲基丙締酸下醋。
[0183] [表 1]
[0184]

[0185] 將金木犀葉的甲基丙締酸下醋的分解活性示于表2。確認甲基丙締酸下醋顯著減 少，暗示來自金木犀的AAT的作用下的甲基丙締酸醋產(chǎn)生速度超過該植物組織中含有的醋 分解酶等引起的甲基丙締酸醋分解速度。
[0186] [表 2]
[0187]
L〇188」[實施例2:利用葡萄進行的甲基丙篩酸甲醋的合成]
[0189] 將Ig的帶著皮一起切碎的葡萄（紅提:Vitis vinifera)果實量取到瓶中。加入 0.5ml底物溶液(50mM Tris-肥1 (P冊.5)、甲醇40mM、甲基丙締酷基輔酶AlOmM)，密閉后，在 30°C反應(yīng)12小時。與實施例1同樣實施分析，確認生成0.祉M的甲基丙締酸甲醋(表1)。
[0190] 另外，使用O.lmM甲基丙締酸甲醋溶液(50mM化is-HCl、p冊.5)確認甲基丙締酸醋 的水解反應(yīng)。反應(yīng)在30°C進行3小時。將結(jié)果示于表2。
[0191] [實施例3:利用葡萄進行的甲基丙締酸下醋的合成]
[0192] 使用正下醇來代替甲醇，除此W外與實施例2同樣實施。其結(jié)果是，確認生成9.OiiM 的甲基丙締酸下醋。也與實施例2同樣地確認了甲基丙締酸醋的水解反應(yīng)。
[0193] [實施例4:利用葡萄抽進行的甲基丙締酸己醋的合成]
[0194] 將2g摘出的葡萄抽(Citrus X paradisi)果實的果飄量取到瓶中。加入0.5ml底物 溶液（50mM lYis-肥1(抑8.5)、正己醇4〇11^、甲基丙締酷基輔酶41〇11^)，密閉后，在30°(：反 應(yīng)12小時。與實施例1同樣實施分析，確認生成0.3咖的甲基丙締酸己醋。
[0195] [實施例5:利用惱蓮進行的甲基丙締酸乙醋的合成]
[0196] 將Ig切碎的惱蓮(Durio zibethinus)果實量取到瓶中。加入0.5ml底物溶液(50mM 化is-HCl(抑8.5)、乙醇40mM、甲基丙締酷基輔酶A 0.125mM)，密閉，在30°C反應(yīng)3小時。與 實施例1同樣實施分析，確認生成6.7iiM的甲基丙締酸乙醋。
[0197] 另外，使用O.lmM甲基丙締酸乙醋溶液(50mM化is-HCl、p冊.5)確認甲基丙締酸 醋的水解反應(yīng)。反應(yīng)在30°C進行3小時。將結(jié)果示于表2。
[0198] [實施例6:利用惱蓮進行的甲基丙締酸下醋的合成]
[0199] 使用正下醇代替乙醇，除此W外與實施例5同樣實施。其結(jié)果是，確認生成14iiM的 甲基丙締酸下醋。也與實施例5同樣地確認了甲基丙締酸醋的水解反應(yīng)。
[0200] [實施例7:利用含笑進行的甲基丙締酸下醋的合成]
[0201] 分別將Ig及0.5g的切碎的含笑(Magnolia figo)的葉及花芽量取到瓶中。加入1ml 底物溶液(50mM化is-肥l(抑8.5)、正下醇40mM、甲基丙締酷基輔酶A0.125mM)，密閉，在 30°C反應(yīng)12小時。與實施例1同樣實施分析，確認分別生成4.4iiM及0.4iiM的甲基丙締酸下 醋。
[0202] 另外，使用O.OlmM甲基丙締酸下醋溶液巧OmM化is-肥l、p冊.5)確認了甲基丙締 酸醋的水解反應(yīng)。反應(yīng)在30°C進行12小時。將結(jié)果示于表2。
[0203] [實施例8:利用羅馬洋甘菊進行的甲基丙締酸下醋的合成]
[0204] 將0.5g切碎的羅馬洋甘菊(Chamaemelum nobi le)葉量取到瓶中。加入0.5ml底物 溶液(50mM化is-HCl (P冊.5)、正下醇40mM、甲基丙締酷基輔酶A 0.125mM)，密閉，在30°C 反應(yīng)12小時。與實施例1同樣實施分析，確認生成6.7iiM的甲基丙締酸下醋。
[02化]另外，使用0.111^甲基丙締酸下醋溶液(5〇11^化13-肥1、抑8.5)確認甲基丙締酸 醋的水解反應(yīng)。反應(yīng)在30°C進行3小時。將結(jié)果示于表2。
[0206] [實施例9:來自羅馬洋甘菊的AAT的純化]
[0207] 只要沒有特別聲明，則酶的純化在4 下的溫度進行。各級分的AAT活性的測定 是W正下醇及甲基丙締酷輔酶A為底物、使用GC進行分析的。
[0208] (1)粗酶液的調(diào)制
[0209] 將羅馬洋甘菊(Qiamaemelum nobile)葉38g在液氮中粉末化。將粉末懸浮于190ml 的提取用緩沖液（10%甘油、5mM二硫蘇糖醇化TT)、5%聚乙締基化咯燒酬、250mMTris-HCl (PH7.5))，通過4層紗布而過濾。將濾液在15,000g下離屯、分離15分鐘，獲得粗酶溶液。
[0210] (2)AAT棘性現(xiàn)憶法
[0211] 在2ml容積的螺口瓶(National Scientific制自動進樣瓶）中調(diào)制50化1反應(yīng)液 (50mM Tris-肥1(抑8.0)、40mM正下醇、0.12mM甲基丙締酷輔酶A)。加入W下的（3)~(6)各 階段的純化酶，密閉，在30°C反應(yīng)1小時。
[0212] 反應(yīng)后加入50iil作為內(nèi)標的lOmM 2-己酬，用20化1辛燒進行溶劑提取。將如1的 通過離屯、分離而得的分離液注入GC，測定通過酶反應(yīng)而生成的甲基丙締酸下醋。甲基丙締 酸醋的量是通過內(nèi)標法制作標準曲線而算出的。
[0^3] GC分析條件
[0214] 柱:DB-WAX(內(nèi)徑0.25mmX60m、0.5皿、安捷倫科技有限公司）
[0215] 柱溫：115°C ? 5min一4(TC/min一20(TC ? 2min 載氣:氮
[0217]檢測:FID
[0別引進樣（Inject)溫度：230°C
[0219] 檢測(Detect)溫度:250°C
[0220] (3)利用DEAE - T0Y0PEA化柱的純化(2次）
[0221] 將粗酶溶液供于用含有10%甘油及2mM DTT的250mM化is-HCl(p冊.0)緩沖液平 衡后的DEAE-T0Y0PEA化柱(20ml)。按照常規(guī)回收級分，相對于含有10%甘油及2mM DTT的 20mMTr i S -肥1 (P冊.0)緩沖液（W下稱為緩沖液B)進行透析。
[0222] 進而，將透析級分再次供于用緩沖液B平衡后的DEAE-T0Y0PEA化柱（10ml)。用緩 沖液B充分洗涂后，使緩沖液B的氯化鋼的濃度從0M直線上升到0.3M，進行濃度梯度洗脫。需 要說明的是，將每5.5ml洗脫液作為一個級分。將洗脫曲線示于圖1。將獲得的AAT活性級分 回收，相對于緩沖液B進行透析。圖中，"AAT活性"（白色圓點）是將化分鐘內(nèi)提供化mo 1的醋 的酶量設(shè)為1U。另外，"蛋白質(zhì)濃度"（黑色圓點)是使用W牛血清白蛋白作為標準品的Bio- Rad protein assay Kit(Bio_Rad，USA) 來測定的。
[0223] (4)利用誕京脂糖柱的純化
[0224] 將所獲得的透析后的AAT活性級分供于用緩沖液B平衡后的Q瓊脂糖柱（10ml)。用 緩沖液B充分洗涂后，使緩沖液B的氯化鋼的濃度從0M直線上升到0.3M，進行濃度梯度洗脫。 需要說明的是，將每5.5ml洗脫液作為一個級分。將洗脫曲線示于圖2。將獲得的AAT活性級 分回收，相對于含有2mM DTT的20mMTriS-HC1 (抑8.0)緩沖液（W下稱為緩沖液C)進行透 析。
[0225] (5)利用MonoQ 5/50化柱的純化
[0226] 將通過誕京脂糖柱獲得的透析后的AAT活性級分供于用緩沖液C平衡后的MonoQ 5/ 50化柱（ImL)。使緩沖液C的氯化鋼的濃度從0M直線上升到0.5M，進行濃度梯度洗脫。將洗脫 曲線示于圖3。將獲得的AAT活性級分回收，用Amicon叫tra-0.5mL離屯、式過濾器進行濃 縮。需要說明的是，利用該柱進行的純化是使用AKTA Explorer 10S(通用醫(yī)療集團（GE Healthcare))、在流速0.5ml/分鐘的條件下將每5.5ml作為一個級分。
[0227] (6)利用Superdex 200 10/300化柱的純化
[0。引將通過MonoQ 5/50化柱獲得的AAT活性濃縮級分供于用含有0.3M氯化鋼的緩沖液 C平衡后的Superdex 200 10/300化柱。利用該柱進行的純化是使用AKTA E邱lorer 10S、在 流速0.5ml/分鐘的條件下將每0.5ml作為一個級分。將洗脫曲線示于圖4。將獲得的AAT活性 級分回收，相對于緩沖液B進行透析。
[0229] (7)各純化階段總結(jié)
[0230] 將各純化階段的酶組合物的收量、活性示于表3。通過總計5次的柱分離，獲得活性 純化至209倍、為201恤/mg的AAT。
[023。[表引
[0232]
[02削[實施例10:來自羅馬洋甘菊的AAT的底物特異性]
[0234] 使用利用實施例9記載的MonoQ 5/50化柱獲得的純化級分，評價AAT的底物特異 性。
[0235] 在2ml容積的螺口瓶中，調(diào)制反應(yīng)液（50mM化iS-肥1 (P冊.5)、40mM醇、0.12mM酷 基輔酶A)，加入純化級分，使其達到50化1。密閉，在30°C反應(yīng)1小時。
[0236] 反應(yīng)后，加入50]il作為內(nèi)標的lOmM 2 -己酬，用20化1辛燒或己燒進行溶劑提取。 將祉1的通過離屯、分離而得的分離液注入GC，測定通過酶反應(yīng)而生成的醋。醋的量是通過內(nèi) 標法制作標準曲線而算出的。關(guān)于利用GC測定的條件，除了使柱溫(參照表4)根據(jù)每個測定 對象醋適當變更W外，與實施例9同樣。由于利用該柱時，與正下醇的峰分離不充分，因此丙 酸正下醋的定量按照實施例1記載的GC-MS分析條件(其中，溫度條件變更為80°C1分鐘^ 1 〇°C /分鐘^200°C 5分鐘)通過絕對標準曲線法而實施。
[0237] [表 4]
[023引
[0239] 將結(jié)果示于表5。將甲基丙締酸下醋的比活性設(shè)為100%，W相對活性值來表示。
[0240] [表 5]
[0241]
[0242] *N.D.=檢測不到、N.T.=未實施
[0243] [實施例11:來自羅馬洋甘菊的AAT的最適抑]
[0244] 使用利用實施例9記載的MonoQ 5/50G〇i獲得的純化級分，評價最適抑。
[0245] 使用乙酸緩沖液、PIPES(贓嗦一 1，4-雙(2-乙橫酸））緩沖液、TriS (立徑甲基氨 基甲燒）一鹽酸緩沖液或甘氨酸一氨氧化鋼緩沖液，調(diào)制組成為40mM正下醇及0.12mM甲基 丙締酷輔酶A的反應(yīng)液。任一緩沖液中，緩沖液濃度均設(shè)為50mM。在各反應(yīng)液中加入純化級 分50化1，密閉，在30°C反應(yīng)1小時。
[0246] 反應(yīng)后，通過與實施例9同樣的GC分析，測定通過酶反應(yīng)而生成的甲基丙締酸下 醋。將結(jié)果示于圖5。圖中，圓形記號表示乙酸緩沖液的結(jié)果、四角形記號表示PIPES緩沖液 的結(jié)果、=角型記號表示=(=徑基甲基氨基甲燒）一鹽酸緩沖液的結(jié)果、菱形記號表示甘 氨酸一氨氧化鋼緩沖液的結(jié)果。最適pH為8~9。
[0247] [實施例12:來自羅馬洋甘菊的AAT的Km]
[0248] 使用利用實施例9記載的MonoQ 5/50化柱獲得的純化級分，測定對甲基丙締酷輔 酶A及乙酷輔酶A的Km值。在50mM化iS-HC1 (P冊.5)緩沖液中加入純化級分、40mM正己醇及 各濃度的甲基丙締酷輔酶A或乙酷輔酶A，調(diào)制50化1的反應(yīng)液，密閉，在30°C反應(yīng)2小時。
[0249] 反應(yīng)后，通過與實施例10同樣的GC分析，測定通過酶反應(yīng)而生成的醋。將結(jié)果示于 圖6。將速率常數(shù)化m)代入Michaelis-Menten式，使用皿LINKS公司制的KaleidaGra曲軟件 進行計算。其結(jié)果是，計算出對甲基丙締酷輔酶A的Km值為0.041mM、對乙酷輔酶A的Km值為 0.711mM。
【主權(quán)項】
1. 一種甲基丙烯酸酯的制造方法，其含有如下工序:在來自以下植物的醇酰基轉(zhuǎn)移酶 存在下，使醇或酚類作用于甲基丙烯酰輔酶A而合成甲基丙烯酸酯，所述植物是選自由屬于 木犀屬(Osmanthus)的植物、屬于葡萄屬(Vitis)的植物、屬于柑橘屬(Citrus)的植物、屬于 植蓮屬(Durio)的植物、屬于木蘭屬(Magnolia)的植物及屬于果香菊屬(Chamaemelum)的植 物組成的組中的植物。2. 一種甲基丙烯酸酯的制造方法，其含有如下工序:在來自下述植物的醇?；D(zhuǎn)移酶 存在下，使醇或酚類作用于甲基丙烯酰輔酶A而合成甲基丙烯酸酯，所述植物是選自金木 犀、葡萄、葡萄柚、榴蓮、含笑及羅馬洋甘菊組成的組中的植物。 3 · -種來自屬于果香菊屬（Chamaemelum)的植物的醇?；D(zhuǎn)移酶或該酶的組合物，具 有以下的（1)~(5)的理化學(xué)性質(zhì)， (1) 在醇或酚類的存在下，作用于甲基丙烯酰輔酶A而生成甲基丙烯酸酯， (2) 對甲基丙烯酰輔酶A的活性高于對乙酰輔酶A的活性， (3) 對異丁酰輔酶A的活性高于對乙酰輔酶A的活性， (4) 對甲基丙烯酰輔酶A的Km值為0.05mM以下， (5) 以甲基丙烯酰輔酶A及正丁醇為底物時，最適pH為8~9。4. 一種有機酸酯的制造方法，其使用權(quán)利要求3所述的醇?；D(zhuǎn)移酶或該酶的組合物。
【文檔編號】C12P7/62GK106062204SQ201580010994
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2015年3月5日
【發(fā)明人】淺野泰久, 佐藤榮治, 湯不二夫, 水無涉
【申請人】三菱麗陽株式會社