核酸檢測方法和試劑盒的制作方法
【專利摘要】提供了用于檢測靶標(biāo)核酸的方法和試劑盒，其中擴增的核酸與例如順磁性珠的顆粒結(jié)合形成絮凝型復(fù)合物，所述絮凝型復(fù)合物可以通過視覺觀察檢測。可以被檢測的核酸樣本的體積低至幾微升。該方法可以應(yīng)用于實地或照護(hù)點診斷，用于快速確定靶標(biāo)核酸的存在或不存在。還可以確定靶標(biāo)核酸的甲基化狀態(tài)。所述方法和試劑盒具有在植物和動物中檢測疾病、環(huán)境檢測以及食品和其它可食用產(chǎn)品污染檢測的普遍適用性。
【專利說明】
核酸檢測方法和試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及核酸檢測。更具體地，本發(fā)明設(shè)及使用相對小體積的核酸樣本快速檢 測核酸，其中通過視覺觀察檢測核酸。
【背景技術(shù)】
[0002] 高度需求在現(xiàn)場或照護(hù)點（p〇int-〇f-care，POC)W最低限度的設(shè)備進(jìn)行的、快速 且低成本的核酸生物測定。雖然為實現(xiàn)運一目標(biāo)進(jìn)行了很多嘗試，目前在實踐中沒有實現(xiàn)。 已知用于檢測疾病DNA生物標(biāo)記物的技術(shù)和方法，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和連接酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)化CR)i。然而，運些方法需要在熱循環(huán)儀上進(jìn)行熱循環(huán)W實現(xiàn)快速指數(shù)DNA擴增，且因 此不適合用于實地(field)或現(xiàn)場應(yīng)用。但是，最近已經(jīng)出現(xiàn)多種用W克服運種限制的等溫 的DNA擴增方法2'3。例如，為實現(xiàn)P0C應(yīng)用，通過重組酶聚合酶擴增(RPA)4或依賴解旋酶擴增 化DA)5擴增的病原體DNA已被調(diào)整而用于在橫向流條和便攜式巧光針上進(jìn)行檢測6又然而， 運種讀取方法雖然方便，但仍然依賴于使用相對復(fù)雜的設(shè)備，W及可能對于全世界的操作 者仍然存在資金障礙。此外，在實地進(jìn)行采樣，即使有的話，也極少被討論。具體的，使用最 少的人操作和現(xiàn)場設(shè)施始終產(chǎn)生固定量的樣本DNA用于下游應(yīng)用。運個重要問題對任何測 定的性能具有顯著的影響。因此，用于現(xiàn)場的核酸檢測應(yīng)用的實地即用(field-ready)綜合 測定仍然是難W實現(xiàn)的愿望。
[0003] -個可W受益于低成本現(xiàn)場測定的領(lǐng)域是在農(nóng)業(yè)中。農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)是世界經(jīng)濟主要的 貢獻(xiàn)者(估計每年1.5萬億美元）。然而，農(nóng)作物疾病爆發(fā)是在依賴農(nóng)業(yè)的經(jīng)濟中的主要問 題，特別是在發(fā)展中國家中，估計每年農(nóng)作物損失2200億美元W。目前，一旦疾病爆發(fā)傳播超 過某個闊值，則沒有辦法挽救受害的農(nóng)作物。控制疾病爆發(fā)的理想的方法是通過在其傳播 之前在實地早期檢測。農(nóng)作物疾病管理的有效性高度依賴于診斷方法的快捷性、敏感性和 特異性。傳統(tǒng)上疾病鑒定是通過視覺檢查受影響的植物組織的疾病表型而進(jìn)行的。然而，運 需要有經(jīng)驗的植物病理學(xué)家并且是相對主觀的11。許多敏感的用W提高疾病鑒定診斷的方 法，例如已經(jīng)開發(fā)了酶聯(lián)免疫吸附測定化LISA)i2'i\免疫印跡M'ls、免疫巧光測試W和基于 PCR測定的多種迭代（iterations)i7'"用W促進(jìn)疾病診斷。然而，所有運些檢測方法需要昂 貴且復(fù)雜的設(shè)備，并且僅能在實驗室中通過訓(xùn)練有素的技術(shù)人員進(jìn)行。此外，缺乏快速的現(xiàn) 場檢測導(dǎo)致部署疾病控制措施的延遲，反過來導(dǎo)致農(nóng)作物進(jìn)一步損失。因此，有必要開發(fā)新 的可在實地的應(yīng)用的疾病診斷技術(shù)，不需要使用專業(yè)的實驗室設(shè)備。此外，運些技術(shù)應(yīng)該是 廉價的、敏感的、可重復(fù)的，并且不需要專業(yè)人員，其最終目標(biāo)是允許每個農(nóng)民檢測他或她 自己的農(nóng)作物。相似地，早期檢測農(nóng)場動物病原體對避免疾病的傳播是至關(guān)重要的，尤其是 在使用密集生產(chǎn)方法的現(xiàn)代農(nóng)場中。此外，早期診斷和檢測人疾病，W及不依賴于復(fù)雜的技 術(shù)需求的可用的P0C方法，在發(fā)達(dá)W及發(fā)展中國家中，特別是在自然災(zāi)害情況(例如臺風(fēng)、海 嘯或地震)后，可W挽救無數(shù)生命。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明人意識到對簡單的、可靠的、快速的和廉價的核酸檢測方法的需求。因此，本 發(fā)明廣泛的提供了一種用于W相對小的樣本大小快速檢測核酸的方法和試劑盒，其中核酸 的存在和/或不存在可W通過視覺檢測到。本方法的優(yōu)勢在于，W優(yōu)選的形式，其排除了對 設(shè)備的需求，例如離屯、機、熱循環(huán)儀和分光光度計，所有運些需要利用主電力（main electricity)或電池形式的能。在具體的實施方案中，所述方法或試劑盒可W用于檢測植 物、人和非人動物的一種或多種非致病性或致病性生物。
[0005] 在第一方面，本發(fā)明提供了一種檢測核酸的方法，所述方法包括使分離的核酸與 顆粒結(jié)合的步驟，其中所述分離的核酸與所述顆粒能夠形成可W通過視覺觀察而被檢測的 復(fù)合物。
[0006] 合適地，與在沒有或相對低的量或濃度的核酸中觀察到的相比，通過存在或相對 增加水平的可視覺檢測的復(fù)合物指示核酸的存在或相對量。
[0007] 在一個實施方案中，所述顆粒是順磁性顆粒。在一個優(yōu)選的實施方案中，所述顆粒 是SPRI顆粒。優(yōu)選地，所述顆粒在pH<7中與分離的核酸形成復(fù)合物。在一個優(yōu)選的實施方案 中，抑在約3.6-5.5的范圍，或者更優(yōu)選地約抑4.4。根據(jù)本實施方案，通過核酸-顆粒復(fù)合 物的絮凝形成復(fù)合物。
[0008] 在另一個實施方案中，所述方法可W包括使用著色劑W促進(jìn)、幫助或提高核酸-顆 粒復(fù)合物的視覺檢測。合適地，所述著色劑結(jié)合核酸，并且提供在視覺范圍的波長（即約 390nm至約700nm)的光學(xué)特征（signature)。光學(xué)特征可W包括在視覺范圍內(nèi)的波長的光 (包括憐光和/或巧光)的吸收或發(fā)射。
[0009] 合適地，分離的核酸是通過在核酸樣本中存在的模板核酸的核酸序列擴增獲得 的。典型地，模板核酸的核酸序列擴增包括一種或多種引物，其至少部分特異于模板核酸。 在優(yōu)選的形式中，通過等溫核酸序列擴增獲得分離的核酸。
[0010] 在一個實施方案中，等溫核酸序列擴增是重組酶聚合酶擴增(RPA)。
[0011] 在另一個實施方案中，等溫核酸序列擴增是滾環(huán)擴增(RCA)。
[0012] 合適地，模板核酸存在于核酸樣本，所述核酸樣本可從任何生物或其他來源的核 酸獲得。在優(yōu)選的形式中，模板核酸通過W下一個或多個步驟獲得，包括：（a)包含祀標(biāo)核酸 的核酸樣本的重力過濾；（b)使祀標(biāo)核酸與顆粒結(jié)合;和(C)從顆粒洗脫祀標(biāo)核酸。
[0013] 在典型實施方案中，在步驟(b)和/或步驟(C)中祀標(biāo)核酸的體積是約10化。
[0014] 在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測核酸的試劑盒，所述試劑盒包含能夠與 分離的核酸形成復(fù)合物的顆粒，所述復(fù)合物能夠通過視覺觀察檢測。所述試劑盒可進(jìn)一步 包含W下的一種或多種：用于核酸序列擴增的核酸聚合酶;一種或多種用于核酸序列擴增 的引物;磁體;用于核酸提取的試劑;過濾器;著色劑;和/或一種或多種反應(yīng)容器。
[0015] 所述方法和/或試劑盒可W用于檢測任何來源的核酸，包括人和其它動物、植物、 致病性和非致病性生物，包括原生生物、古菌、細(xì)菌、病毒、酵母、真菌、蠕蟲和其它無脊椎動 物，但不限于此。
[0016] 在具體的實施方案中，所述方法和試劑盒可W用于檢測核酸，所述核酸與人、非人 動物和植物的疾病和病癥有關(guān)，與環(huán)境檢測有關(guān)，與食物、飲料和其它消費品的檢測有關(guān)， W及與法醫(yī)分析有關(guān)，但不限于此。
[0017]在本說明書中，除非另有指示，所使用的"包含(comprise)"、"包括(comprises)" 和"含有（comprising)"是包含地而不是排他地，所W，闡述的整數(shù)或整數(shù)的組可W包括一 個或多個其它未闡述的整數(shù)或整數(shù)的組。
【附圖說明】
[0018] 此處，參考W下附圖描述本發(fā)明的非限制性的實施方案。
[0019] 圖1:單滴基因組學(xué)測定的示意圖。在現(xiàn)場通過簡單的核酸提取方法將感興趣的樣 本加工至窄的濃度范圍。然后檢測病原體核酸，并通過重組酶聚合酶擴增等溫地進(jìn)行擴增。 最后通過新的絮凝測定可視化測定結(jié)果。
[0020] 圖2:精確的核酸提取過程。（A)提取過程的圖示。圖片顯示用于提取的可能的樣 本，使用一次性研鉢和巧手工浸潰(maceration)樣本，并且使用普通的過濾移液器頭清除 裂解物的細(xì)胞碎片。（B)四個獨立提取的DNA樣本的凝膠電泳。高分子量表明提取的DNA的良 好的完整性。（C)提取的核酸的光譜分析。上面:DNA，下面:RNA。
[0021] 圖3:絮凝測定。(A)DNA介導(dǎo)的SPRI顆粒的絮凝的概念表征。（B)過量的引物不介導(dǎo) 絮凝。（C)僅10%或更高的擴增導(dǎo)致絮凝。(D)擴增的DNA的截斷濃度依賴于抑。
[0022] 圖4:單滴基因組學(xué)在檢測S種植物病原體中的性能。（A)鑲刀霉菌（Fusarium 0巧sporum f. sp. conglutinans)，（B)灰葡萄抱菌（Botiytis cinerea)，（C)下香假單胞菌 (Pseudomonas syringae)，（D)模擬的S重感染。上排:在不同感染階段SI至S5的葉的照片。 H:健康樣本。Pos:陽性對照。NoT:無模板對照。中間排:對相同的葉進(jìn)行相應(yīng)的RPA反應(yīng)的凝 膠電泳圖。下排:對應(yīng)于RPA反應(yīng)的絮凝測定的照片。
[0023] 圖5: W提取自不同感染階段的葉的5ng的DNA中，qPCR定量鑲刀霉菌(F0C)。用圖4 中用于RPA的相同引物，從階段3感染W(wǎng)后可檢測到病原體DNA。
[0024] 圖6:單滴基因組學(xué)用于檢測來自交叉多種宿主界的多種病原體。（A)香蕉莖中的 香蕉枯萎菌(F.oxysporum cubense；L(B)水中的大腸桿菌，使用下香假單胞菌作為無關(guān)陰 性對照。（C)在培養(yǎng)細(xì)胞中的HIV前病毒DNAd(D)血培養(yǎng)的鑲狀追原蟲（Plasmodium Falciparum)?；┰诜讶~中的黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus) oRT:逆轉(zhuǎn)錄酶。 (F)在牛細(xì)胞中的牛瘤疹病毒1型(Bovine Herpesvirus 1)，使用祀向酪氨酸激酶1、TK1基 因和糖蛋白B基因的引物。(G)培養(yǎng)的結(jié)核分枝桿菌(Tuberculosis mycobacteria)，使用革己 向CFP10和ESAT-6基因的引物。大腸桿菌用作陰性對照。化)在培養(yǎng)介質(zhì)中的流感病毒H1N1。 上排:RPA反應(yīng)的凝膠電泳圖。下排:對應(yīng)于RPA反應(yīng)的絮凝測定的照片。Pos:陽性(感染的） 樣本。Neg:陰性(未感染的)樣本。NoT:沒有模板的對照。RT:逆轉(zhuǎn)錄酶。
[0025] 圖7:測定的示意圖。1)基因組DNA是酶促片段化為與甲基結(jié)合域(MBD)富集相匹配 的大小。2)在冰上(4°C)進(jìn)行快速高嚴(yán)格度甲基化DNA的富集。3)通過等溫方法擴增感興趣 的區(qū)域。4)存在的長的擴增的DNA誘導(dǎo)橋接絮凝，其指示存在感興趣的高差異甲基化區(qū)域 (HDMR)o
[0026] 圖8: (A)使用ESR1引物的RPA產(chǎn)物的凝膠電泳圖，其證實與在室溫(RT)進(jìn)行的測定 相比，在低溫(4°C )時沒有失去性能的提高M(jìn)DB富集的嚴(yán)格度。M:甲基化對照，U:未甲基化的 對照。（B)上排:對于W不同甲基化水平的DNA投入(input),使用ESR1引物的RPA反應(yīng)的凝膠 電泳圖。下排:照片顯示來自低至10%的甲基化樣本發(fā)生的絮凝。
[0027] 圖9:7種人癌癥細(xì)胞系對于(A化SR1、（B)GSTP1和(C)NPY的甲基化譜。列入未甲基 化的對照(U-Ctrl)W驗證測定的嚴(yán)格度。（D)來自兩例前列腺癌樣本(PCI和PC2)W及匯集 來自25例女性供體的正常血液(NB) DNA的ESR1、GSTP1和NYP的全血甲基化譜。上:RPA反應(yīng)的 凝膠電泳圖。下:顯示絮凝代表甲基化狀態(tài)的照片。
[0028] 圖10:在RT-RPA后Du化P RNA擴增子的DNA測序。使用SPRI磁性珠純化提取的Du化P RNA的RT-RPA擴增子，并且測序W驗證祀標(biāo)TMPRSS2: ERG區(qū)域的擴增。
[0029] 圖11:從患者尿液標(biāo)本中提取的RNA的RT-PCR。使用RT-PCR對從10例轉(zhuǎn)移性去勢 (cas trate )抵抗性前列腺癌患者和健康患者的尿液標(biāo)本提取的RNA進(jìn)行擴增W檢測 TMPRSS2:ERG區(qū)域。RT-PCR擴增子在瓊脂糖凝膠上可視化，并且用于驗證對同樣的患者群進(jìn) 行我們的測定的篩選結(jié)果(圖11c)。
[0030] 圖12:比較在全尿和尿沉渣中RNA的穩(wěn)定性。在標(biāo)本收集后0、2和12小時之時提取 患者全尿和尿沉渣RNA的RT-RPA。
[0031] 圖13:對于使用總投入5ng的DNA，在擬南芥(Arabidopsis thaliana)DNA中的不同 百分比的下香假單胞菌DNA(0 %-10 % )的RCA-SDG檢測極限。NoT:無模板的對照。上排:對應(yīng) 于進(jìn)行的RCA反應(yīng)的凝膠電泳圖。下排:對應(yīng)于RCA反應(yīng)的絮凝測定圖片。
[0032] 圖14:通過RCA檢測下香假單胞菌中單滴基因組學(xué)的性能。上排:在感染后不同時 間的葉的照片，S1至S5"H:健康樣本。NoT:無模板的對照。中間排:對相同的葉進(jìn)行相應(yīng)的 RCA反應(yīng)的凝膠電泳圖。下排:對應(yīng)于RCA反應(yīng)的絮凝測定的照片。
【具體實施方式】
[0033] 本發(fā)明設(shè)及一種快速的、在現(xiàn)場90分鐘內(nèi)檢測DNA的方法和試劑盒。根據(jù)本發(fā)明使 用的DNA樣本大小可W低至10化(即單滴）。在優(yōu)選的形式中，使用固相可逆固定化(SPRI)顆 粒用于核酸的精確取樣，所述核酸被純化至精確地濃度范圍，因此避免了進(jìn)一步定量的需 要，此外確保下游加工的最佳性能。然后將純化的核酸提交至任何合適的核酸序列擴增系 統(tǒng)，例如等溫核酸序列擴增，然后使用SPRI顆粒的DNA絮凝試驗進(jìn)行可視化，所述SPRI顆粒 在合適的抑條件下使DNA絮凝。本發(fā)明人證實了該方法可W準(zhǔn)確地檢測在不同感染階段的 擬南芥(Arabidopsis thaliana)中的不同的植物病原體。我們還能夠在感染有經(jīng)濟重要的 病原體的商業(yè)香蕉樣本中區(qū)分健康的和感染的組織。最后，為證實該方法的多功能性，所述 方法被用于檢測在感染的組織中的植物RNA病毒、滲有大腸桿菌的水樣本、感染HIV的細(xì)胞、 感染追疾的血液、感染細(xì)胞中的流感病毒、在牛細(xì)胞中的牛瘤疹病毒1型（Bovine herpesvirus 1) W及結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)細(xì)菌。因此，本發(fā)明提 供了一種方法和試劑盒，其可W用于W快速的方式與最低限度的設(shè)備檢測來自任何來源的 DNA，因此理想地適于照護(hù)點(P0C)或其它現(xiàn)場應(yīng)用，包括提供一種用于檢測在人和非人類、 動物和植物中出現(xiàn)的新爆發(fā)的新興疾病的快速響應(yīng)系統(tǒng)。
[0034] 在一個方面，本發(fā)明提供了一種檢測核酸的方法，所述方法包括使分離的核酸與 顆粒結(jié)合的步驟，其中所述分離的核酸與所述顆粒能夠形成可W通過視覺觀察而被檢測的 復(fù)合物。
[0035] 在另一方面，本發(fā)明提供了一種用于檢測核酸的試劑盒，所述試劑盒包含能夠與 分離的核酸形成復(fù)合物的顆粒，所述復(fù)合物能夠通過視覺觀察檢測。所述試劑盒可W進(jìn)一 步包含W下的一種或多種：用于核酸序列擴增的核酸聚合酶;一種或多種用于核酸序列擴 增的引物;磁體;用于核酸提取的試劑;過濾器;和/或一種或多種反應(yīng)容器。
[0036] 合適地，所述試劑盒可用于根據(jù)在上文中描述的方法。因此，如本文公開的，所述 試劑盒提供了方便制備和視覺檢測核酸的一種或多種聚合酶、顆粒、緩沖液、容器和其它成 分。
[0037] 對于本發(fā)明的目的，"分離的"意指已經(jīng)從其天然狀態(tài)移除，或經(jīng)歷了人的操作的 物質(zhì)。分離的物質(zhì)實質(zhì)上或基本上不含在其天然狀態(tài)中通常伴有的成分，或者可能被操作 從而與在其天然狀態(tài)中通常伴有的成分一起存在于人工狀態(tài)中。分離的物質(zhì)可W是天然 的、化學(xué)的、合成的或重組的形式。
[003引如文中使用的術(shù)語"核酸"指單和雙鏈的DNA和RNA，包括cDNA、基因組DNA、mRNA、 3麻、01?魁、11111?魁、*1?魁，但不限于此。核酸包含核巧酸序列，所述核巧酸序列典型地包括包 含A、G、C、T或師咸基的核巧酸。然而，核巧酸序列可W包括其他堿基，例如肌巧、甲基胞喀晚、 徑甲基胞喀晚、甲基肌巧、甲基腺巧和/或硫尿核巧，但不限于此。
[0039] 如本文中所使用的，"多核巧酸"是具有八十（80)個或更多個相鄰的核巧酸的核 酸，然而"寡核巧酸"具有少于八十(80)個相鄰的核巧酸。"探針"是單或雙鏈寡核巧酸或多 核巧酸，合適地，其被標(biāo)記用于例如在Nodhern或Southern印記中檢測互補序列的目的。 "引物'通常是單鏈寡核巧酸，優(yōu)選具有15-50個連續(xù)核巧酸，其能夠退火至互補的核酸"模 板'，并且通過DNA聚合酶(例如化q聚合酶、依賴RNA的DNA聚合酶或Sequenase?)的作用，W 依賴模板的方式延伸。"模板核酸"是經(jīng)核酸擴增的核酸。
[0040] 根據(jù)本發(fā)明，核酸樣本可W從任何來源獲得或提取，包括動物和植物，動物和植物 的細(xì)胞、組織、流體和子細(xì)胞細(xì)胞器，細(xì)菌，古菌，原生生物，真菌，病毒，W及環(huán)境樣本，例如 飲用水、污水、游泳池水、河水或溪水、海水等，W及獲自食物(例如肉、乳制品等)和其它消 費品的樣本。運些來源可W是W病理樣本的形式，包括體液(例如腦脊液、血液、血清、血漿、 精液、尿液、淋己液等）、腫瘤、組織或器官活檢、宮頸樣本和PAP涂片，但不限于此。其它來源 包括疑似含有可檢測的核酸的法醫(yī)樣本。植物樣本可W取自葉、莖、皮、種子、果實、花或花 成分(例如花瓣、花藥、花粉、雄蕊等）、根W及任何其它植物細(xì)胞或組織。植物可W是植物界 的任何成員，包括可收獲花、果仁、種子、油、木材或果實的農(nóng)作物植物，例如谷物、豆科植 物、甘薦植物，用于生物量生長的植物，例如藻、柳枝稷、大麻和亞麻，W及任何農(nóng)藝的、美學(xué) 的、生態(tài)或商業(yè)價值的其它植物。動物可W是任何脊椎或無脊椎動物，包括魚、鳥和哺乳動 物。在具體的應(yīng)用中，動物可W是人、非人哺乳動物或其它有商業(yè)價值的動物，例如禽、魚和 甲殼綱動物。非人哺乳動物包括家畜（例如牛、羊、豬、馬）、家庭寵物(例如貓和狗）W及表演 動物(例如賽馬、駱駝），但不限于此。細(xì)菌、古菌、原生生物、真菌和病毒可W是致病性的或 非致病性的生物。"致病性"意指與植物或動物疾病或病癥有關(guān)，或?qū)е轮参锘騽游锛膊』?病癥的生物。病原體非限制性的實例可包括:包括RNA和DNA病毒的病毒、原生動物、真菌、蠕 蟲包括腸蟲化elminth)、咖蟲(roundworm) W及環(huán)節(jié)動物和細(xì)菌包括革蘭氏陽性和革蘭氏 陰性細(xì)菌。
[0041] 核酸提取可W通過任何現(xiàn)有技術(shù)中已知的方法進(jìn)行。典型地，通過提取緩沖液促 進(jìn)核酸提取，所述提取緩沖液典型地包含非離子型洗涂劑、鹽、pH緩沖液W及離液劑。后文 更詳細(xì)的提供了提取緩沖液的非限制性實例。如此獲得的或提取的核酸在本文中被稱為 "核酸樣本"。典型地，核酸樣本通過提取自例如前文中描述的來源獲得，提取的核酸沒有經(jīng) 受離屯、或其它很大g的力，或者施加非大氣壓力（例如真空）w促進(jìn)移除不期望的顆粒物質(zhì) 或碎片。優(yōu)選地，提取的核酸在重力或人工產(chǎn)生的壓力下過濾，W促進(jìn)移除不期望的顆粒物 質(zhì)或碎片。在特別優(yōu)選的實施方案中，使用顆粒至少部分純化核酸樣本，所述顆?？赡娴亟Y(jié) 合在核酸樣本中的祀標(biāo)核酸，如將在后文中更詳細(xì)描述的。合適地，隨后可W通過核酸擴增 技術(shù)擴增祀標(biāo)核酸。
[0042] 熟練的技術(shù)人員（addressee)熟知核酸擴增技術(shù)，并且包含但不限于聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)(PCR);鏈置換擴增(SDA);滾環(huán)擴增(RCA);核酸序列依賴性擴增(NASBA)，Q-e復(fù)制酶擴 增；依賴解旋酶擴增化AD);環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP);切日酶擴增反應(yīng)(肥AR似及重組酶聚 合酶擴增(RPA)，但不限于此。如本文通常所使用的"擴增產(chǎn)物"指通過核酸擴增技術(shù)產(chǎn)生的 核酸產(chǎn)物。
[0043] 很多核酸擴增技術(shù)通過每一輪擴增期間不同的溫度(例如95°C變性，72°C引物退 火W及42°C模板延伸），使核酸序列擴增程序循環(huán)，從而該技術(shù)需要熱循環(huán)儀。然而，一些核 酸擴增技術(shù)可W是等溫的，例如SDA、LAMP、肥AR、HAD、RCA和RPA，從而無需熱循環(huán)儀。因此， 在優(yōu)選的實施方案中，所述方法和試劑盒使用等溫核酸序列擴增。等溫核酸序列擴增的具 體的實施方案是例如通過TwistDX?系統(tǒng)提供的RPA，但不限于此。表1提供了用于通過RPA的 等溫核酸擴增的引物的非限制性實例。等溫核酸序列擴增的另一個具體的實施方案是RCA， 其在W下實施例中將更詳細(xì)的描述。
[0044] 然而，還應(yīng)理解在次優(yōu)選的實施方案中，核酸擴增可W使用熱循環(huán)儀進(jìn)行，或者通 過包括在擴增的每一個循環(huán)期間W不同溫度的核酸序列擴增的重復(fù)循環(huán)的方法進(jìn)行。
[0045] 合適地，隨后固定擴增產(chǎn)物，并且然后通過與顆粒形成復(fù)合物而可視化。在另一個 實施方案中，可W使用著色劑W促進(jìn)、幫助或提高核酸-顆粒復(fù)合物的視覺檢測。合適地，所 述著色劑結(jié)合核酸，并且提供優(yōu)選在視覺范圍的波長（即約390nm至約700nm)的光學(xué)特征。 光學(xué)特征可W包括在視覺范圍內(nèi)的波長的光(包括憐光和/或巧光)的吸收或發(fā)射。
[0046] 從前述可W理解，所述方法和試劑盒使用能夠結(jié)合核酸例如DNA、優(yōu)選雙鏈DNA (dsDNA)的顆粒。顆粒能夠結(jié)合在核酸樣本制備之后的模板核酸，和/或能夠與分離的核酸 形成復(fù)合物，而被視覺觀察所檢測。
[0047] 在本發(fā)明的一般情況中，"顆粒"可W是任何能夠結(jié)合分離的核酸的基質(zhì)、珠或底 物。在優(yōu)選的形式中，顆粒選擇性結(jié)合具有至少100個連續(xù)核巧酸的分離的核酸。運種性質(zhì) 促進(jìn)了從核酸序列擴增引物(典型地比100個連續(xù)的核巧酸短得多）W及更短的、不完整的、 非特異性的或縮短的擴增產(chǎn)物中選擇具有至少100個連續(xù)核巧酸的擴增產(chǎn)物。合適地，顆粒 包含帶電的表面，其能夠促進(jìn)與分離的核酸的結(jié)合或相互作用。優(yōu)選地，帶電的表面包含正 電，其促進(jìn)與帶負(fù)電的分離核酸的結(jié)合或相互作用。
[0048] 在一些實施方案中，顆?？蒞是順磁性珠。典型地，順磁性珠包含聚合物核屯、（例 如聚苯乙締），順磁性殼(例如磁鐵礦或其它含鐵的順磁性物質(zhì)，例如包括蒙脫石和綠脫石、 黑云母、菱鐵礦、黃鐵礦的黏±)W及包含一種或多種化學(xué)基團(tuán)的涂層，其在合適的條件下 結(jié)合核酸(例如含有簇基的基團(tuán)）。非限制性的實例包括SRPI顆粒W及AMPureXP?顆粒。優(yōu)選 的順磁性顆粒是SRPI顆粒。
[0049] 在其他實施方案中，顆?？蒞包括金屬顆粒例如金(例如DNAdel?金載體顆粒）、金 屬氨氧化物例如水滑石化T)和徑憐灰石(HA)、娃酸鹽例如娃藻±，但不限于此。
[0050] 在核酸樣本制備之后的結(jié)合模板核酸的情況中，合適地，顆粒能夠可逆地結(jié)合核 酸。因此，在合適的條件下顆粒結(jié)合核酸，然后所述核酸可W在促進(jìn)洗脫或核酸釋放的條件 下從顆粒洗脫或釋放。優(yōu)選地，通過提供一致的顆粒的量或濃度，而結(jié)合和洗脫可重復(fù)的量 或濃度的核酸。
[0051] 如上文所描述的，能夠可逆地結(jié)合模板核酸的顆粒的一個非限制性的實例是SPRI 顆粒。
[0052] 在顆粒結(jié)合核酸的情況中，例如核酸序列擴增之后的dsDNA擴增產(chǎn)物，合適地，形 成核酸:顆粒復(fù)合物可W通過視覺觀察被檢測、觀察或測量。運意味著具有實質(zhì)上裸眼視力 (unaided vision)的人觀察者至少能夠看見顆粒和核酸之間形成的復(fù)合物的存在或不存 在。視覺檢測可W提供核酸:顆粒復(fù)合物定性的、半定量的或定量的測量。通過視覺觀察半 定量或定量確定或測量可W至少提供顆粒和核酸之間形成的復(fù)合物的近似的量或濃度。作 為實例，定量可W通過參考滴定參考標(biāo)準(zhǔn)而確定，所述滴定參考標(biāo)準(zhǔn)包含不同量或濃度的 核酸:顆粒復(fù)合物。通過視覺觀察檢測的能夠與dsDNA形成復(fù)合物的顆粒的一個非限制性實 例是SPRI顆粒，如前所述。根據(jù)本實例，核酸:SPRI顆粒復(fù)合物是作為絮凝復(fù)合物而可視的。 典型地，使用磁體處理時形成相對澄清或無色的溶液，是絮凝復(fù)合物容易被磁體吸附的結(jié) 果。運與不存在核酸:SPRI顆粒復(fù)合物相反，核酸:SPRI顆粒復(fù)合物導(dǎo)致著色或渾濁的溶液。 例如當(dāng)對比已知量或濃度的核酸滴定時，運種相對澄清或無色可W測量核酸的量或濃度。 一種優(yōu)選的方法可W是滴定pH直至絮凝減少或不存在，并且添加的堿的量是核酸量的近似 或估計。
[0053] 然而，還應(yīng)該理解所述方法不排除使用幫助檢測、觀察或測量核酸:顆粒復(fù)合物形 成的儀器、裝置或設(shè)備。儀器、裝置或設(shè)備的非限制性實例包括懸液計、濁度計和分光光度 計，但不限于此。
[0054] 在一些實施方案中，W非核巧酸序列特異性的方式使顆粒結(jié)合核酸。重要地，顆粒 通過與核酸的物理化學(xué)相互作用結(jié)合核酸(例如核酸擴增產(chǎn)物）。作為實例，運可能包括帶 負(fù)電的核酸與帶負(fù)電的顆粒之間的靜電或電荷相互作用，例如通過涂布在SPRI顆粒上的含 簇基基團(tuán)的方式協(xié)助。還可W使用帶正電的顆粒，例如但不限于含有胺的基團(tuán)所包被的顆 粒。
[0055] 在其它實施方案中，W核巧酸序列特異性的方式使顆粒結(jié)合核酸。作為實例，顆粒 可W偶聯(lián)至寡核巧酸探針，所述探針包含能夠與核酸擴增產(chǎn)物雜交的核巧酸序列。運種核 巧酸序列特異性檢測可W識別核巧酸序列多態(tài)性，例如不同的等位基因形式、SNP和其它感 興趣的核巧酸序列變體，例如與特定的植物或動物疾病有關(guān)的那些。
[0056] 在前述一般的實施方案的情況中，所述方法的具體的實施方案包括W下步驟：
[0057] (a)獲得核酸樣本；
[0058] (b)使核酸樣本進(jìn)行等溫核酸序列擴增，如果核酸樣本中存在，從而從模板核酸產(chǎn) 生核酸擴增產(chǎn)物;和
[0059] (C)使核酸擴增產(chǎn)物與順磁性顆粒結(jié)合，其中分離的核酸和顆粒能夠形成通過視 覺觀察能夠被檢測到的復(fù)合物。
[0060] 在步驟(a)中，優(yōu)選是通過從例如上文所描述的來源提取而獲得核酸樣本，沒有使 核酸樣本進(jìn)行離屯、或其它很大g的力、真空或高壓下（樣本可W經(jīng)受低壓，例如通過人工操 作的注射器的方式）w促進(jìn)移除不期望的顆粒物質(zhì)或碎片。合適地，核酸樣本在重力下過 濾，從而移除不期望的顆粒物質(zhì)或碎片。在一些實施方案中，過濾器是微量移液器頭或其它 的至少部分填充有過濾材料(例如脫脂棉（cotton wool))的管（例如玻璃吸管、套管或?qū)?管）。隨后，在合適的緩沖液中，使核酸樣本與例如SPRI顆粒的順磁性顆粒結(jié)合，從而形成核 酸和順磁性顆粒間的復(fù)合物。典型地，盡管不是排他地，所述緩沖液包含聚乙二醇、鹽和pH 緩沖液。典型地，結(jié)合順磁性顆粒的核酸樣本的體積實質(zhì)上低于通過從來源提取獲得的核 酸樣本的體積。結(jié)合有順磁性顆粒的核酸樣本的體積可W是從來源提取獲得的核酸樣本的 體積的至多20 %、至多10%、至多5%或至多4%、3 %、2 %或1 %。合適地，所述體積可能至多 約50化、至多約40化、至多約30化、至多約20化或至多約5-10化，包括扣L、化L、化L、祉L和化 L。
[0061] 合適地，隨后通過磁體固定復(fù)合物，移除緩沖液，并且從顆粒洗脫核酸?？蒞使用 洗脫液例如水實現(xiàn)洗脫，但不限于此。合適地，洗脫體積可W是少的，但至多約50化、至多約 2化L、或者至多約5-10化，包括扣L、化L、化L、祉L和化L。確定最佳的結(jié)合核酸樣本的順磁性 顆粒的量、濃度、比例或相對比例，從而從順磁性顆粒洗脫期望的量或濃度的核酸。例如在 10化洗脫中期望產(chǎn)出3-5ng/化的高分子重量的DNA。
[0062] 在步驟(b)中，優(yōu)選通過RPA進(jìn)行等溫核酸序列擴增，優(yōu)選地，在約37°C進(jìn)行，但不 限于此。在步驟(b)中使用引物，其提供了對在核酸樣本中的祀標(biāo)核酸的特異性，借此如果 在核酸樣本中存在則祀標(biāo)核酸被優(yōu)先擴增。引物非限制性的實例在表1中描述。
[0063] 在步驟(C)中，在步驟(b)產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物與順磁性顆粒結(jié)合，例如SPRI顆粒。典型 地，在絮凝緩沖液中使擴增產(chǎn)物與順磁性顆粒結(jié)合，所述絮凝緩沖液促進(jìn)可W被視覺檢測 到的順磁性顆粒和擴增產(chǎn)物的復(fù)合物的形成。合適地，絮凝緩沖液具有低于7的pH。優(yōu)選地， pH在3-6的范圍，或者更優(yōu)選地在約pH3.6-5.5的范圍，包括pH3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、 4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3和5.4，或者在運些所述的抑值之間 的任何范圍。如后文中所描述的，非限制性的實例是pH 4.4。作為實例，絮凝緩沖液可W是 或可W包含一種或多種醋酸鹽、巧樣酸鹽、憐酸鹽或憐酸二氨鹽，但不限于此。如后文中更 詳細(xì)地描述的，絮凝緩沖液的非限制性實例是pH 4.4的醋酸鋼緩沖液。
[0064] 盡管不希望被任何特定的理論束縛，建議核酸:顆粒絮凝可W通過提高絮凝緩沖 液抑而可逆，運與絮凝是膠體的可逆非共價聚集相一致。因此，在更高的抑，例如DNA的核酸 帶更多的負(fù)電，并且因此越可能排斥來自涂布簇酸的顆粒(例如SPRI顆粒)表面的其它帶負(fù) 電的核酸?？蒞利用運種抑依賴性，根據(jù)核酸的濃度精細(xì)地調(diào)整方法的敏感性。絮凝后滴定 pH也可W用作核酸濃度的近似或估計。
[0065] 如W前描述的，可W使用著色劑促進(jìn)、幫助或提高核酸-顆粒復(fù)合物的視覺檢測。 合適地，所述著色劑結(jié)合核酸，并且提供在視覺范圍的波長（即約390皿至約7(K)nm)的光學(xué) 特征。光學(xué)特征可W包括或產(chǎn)生在視覺范圍內(nèi)的波長的光(包括憐光和/或巧光）的吸收或 發(fā)射。
[0066] 典型地已知的運種著色劑可W為"DNA染料"，非限制性的實例是結(jié)晶紫、結(jié)晶紫/ 甲基澄混合物、亞甲藍(lán)或Visual Violet?。
[0067] 本發(fā)明的方法和試劑盒提供了 "平臺"技術(shù)，其在核酸檢測領(lǐng)域可W具有大量的應(yīng) 用。更具體的，本發(fā)明的方法和試劑盒提供了在實地或在"照護(hù)點"中敏感且成本有效的用 于檢測核酸的方式。在優(yōu)選的形式中，本發(fā)明至少最大程度地減少或完全消除了對設(shè)備的 需要，例如熱循環(huán)儀、離屯、機、分光光度計等。作為實例，本發(fā)明可用于植物和動物疾病病原 體的檢測、檢測植物或動物對特定的遺傳性狀或疾病的遺傳易感性、分析食物和其它消費 品被真菌或細(xì)菌污染的損害檢測、水質(zhì)監(jiān)測、法醫(yī)樣本的分析、植入前基因分析、性別確定 和DNA指紋，但不限于此。
[0068] 本發(fā)明的具體的實施方案設(shè)及檢測植物或動物疾病病原體。
[0069] 在運種情況中，所述方法的具體實施方案包括W下步驟：
[0070] (I)從植物或動物來源獲得核酸樣本；
[0071 ] (II)使核酸樣本經(jīng)受等溫核酸序列擴增，如果樣本中存在，從模板核酸產(chǎn)生核酸 擴增產(chǎn)物，其中所述模板核酸包含病原體的核巧酸序列，所述病原體導(dǎo)致植物或動物的疾 病或病癥，或者與植物或動物的疾病或病癥有關(guān);和
[0072] (III)如果存在，使核酸擴增產(chǎn)物與順磁性顆粒結(jié)合，其中核酸擴增產(chǎn)物和顆粒能 夠形成通過視覺觀察能夠被檢測到的復(fù)合物，其中核酸擴增產(chǎn)物的存在指示病原體的存 在。
[0073] 因此，在一些實施方案中，本發(fā)明可W用于醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)學(xué)診斷，用W確定與動物的 疾病或病癥有關(guān)、或?qū)е聞游锛膊』虿“Y的病原體的存在或不存在。在運種情況中，動物可 W包括人和非人哺乳動物（例如家畜和寵物）、魚、甲殼綱動物和鳥（例如家禽），但不限于 此。病原體可W包括病毒包括RNA和DNA病毒、原生動物、蠕蟲包括腸蟲、咖蟲和環(huán)節(jié)生物、真 菌、原生生物、古菌和細(xì)菌。如將在實施例中更詳細(xì)描述的，所述方法檢測由病毒(例如HIV 和流感）、原生動物（例如鑲狀追原蟲Plasmodium falciparum)和細(xì)菌（例如大腸桿菌 E.coli和結(jié)核分枝桿菌Mycobacterium tuberculosis)引起的人疾病的病原體的核酸。
[0074] 根據(jù)本發(fā)明，還預(yù)期檢測真菌、病毒和/或細(xì)菌植物病原體。植物可W包括單子葉 的和雙子葉的植物、農(nóng)作物、谷物、水果、稻科植物(grasses)、樹和藤本植物，但不限于此。 如在實施例中更詳細(xì)的描述的，植物病原體的非限制性實例包括DNA和RNA病毒，比如RNA病 毒黃瓜花葉病毒、細(xì)菌例如下香假單胞菌(Pseudomonas syringae)和真菌例如鑲刀霉菌 (F.oxysporum f.sp.conglutinans)和灰葡萄抱菌（Botrytis cinerea)。
[0075] 然而，應(yīng)理解本發(fā)明可W廣泛地實踐用于獲得自任何生物的核酸樣本，無論是人 和非人動物或植物的非致病性生物，還是病原體。
[0076] 本發(fā)明的一個具體的應(yīng)用設(shè)及在人或動物群或在植物群例如農(nóng)作物中的新的疾 病的爆發(fā)。正如近期發(fā)生的禽流感和其它流感W及SARS，出現(xiàn)的新的病原體株或變體是基 因上可區(qū)別的。運種新的病原體株或變體的基因組可W被快速地測序并且產(chǎn)生適合用于根 據(jù)本發(fā)明的核酸序列擴增引物。使用核酸序列擴增引物，本發(fā)明的方法和試劑盒因此立即 適合用于提供快速的和簡單的新的病原體株或變體的檢測。
[0077] 本發(fā)明的其它具體實施方案設(shè)及檢測與特定的疾病或病癥有關(guān)的生物標(biāo)記物。
[0078] 在運種情況中，所述方法的具體的實施方案包括W下步驟：
[0079] (I)從人或非人動物獲得核酸樣本；
[0080] (II)使核酸樣本進(jìn)行等溫核酸序列擴增，如果模板核酸存在于樣本中，從模板核 酸產(chǎn)生核酸擴增產(chǎn)物，其中所述模板核酸包含與疾病或病癥有關(guān)的生物標(biāo)記物的核巧酸序 列，或編碼與疾病或病癥有關(guān)的生物標(biāo)記物的核巧酸序列;和
[0081 ] (III)如果存在，使核酸擴增產(chǎn)物與順磁性顆粒結(jié)合，其中核酸擴增產(chǎn)物和顆粒能 夠形成通過視覺觀察能夠被檢測到的復(fù)合物，其中核酸擴增產(chǎn)物的存在指示生物標(biāo)記物的 存在。
[0082] 生物標(biāo)記物可與人或非人動物的任何疾病或病癥有關(guān)，包括癌癥、腫瘤、淋己瘤、 白血病和其它惡性腫瘤，感染性疾病，炎癥性疾病，自體免疫性疾病，呼吸道疾病，胃腸疾 病，神經(jīng)疾病，生殖系統(tǒng)疾病和精神疾病，但不限于此。例如，生物標(biāo)記物可W是或者包括腫 瘤抗原、抑制基因或標(biāo)記物和/或遺傳或表觀遺傳核巧酸序列多態(tài)性、突變修飾或改變例如 體細(xì)胞突變、單核巧酸多態(tài)性(SNP)和其它遺傳多態(tài)性、核巧酸序列插入、缺失、重排、DNA甲 基化和/或DNA徑甲基化事件，但不限于此。在實施例中更詳細(xì)描述的一個具體的實施方案 中，本文公開的方法和/或試劑盒適合用于檢測DNA甲基化。在實施例中更詳細(xì)描述的另一 個具體的實施方案中，本文公開的方法和/或試劑盒適合用于檢測前列腺癌的DNA標(biāo)記物。
[0083] 本發(fā)明的另外的具體的實施方案設(shè)及檢測環(huán)境樣本中的病原體。
[0084] 在運種情況中，所述方法的具體的實施方案包括W下步驟：
[0085] (1)從環(huán)境來源獲得核酸樣本；
[0086] (2)使核酸樣本進(jìn)行等溫核酸序列擴增，如果模板核酸存在于樣本中，從模板核酸 產(chǎn)生核酸擴增產(chǎn)物，其中所述模板核酸包含病原體的核巧酸序列;和
[0087] (3)如果存在，使核酸擴增產(chǎn)物與順磁性顆粒結(jié)合，其中核酸擴增產(chǎn)物和顆粒能夠 形成通過視覺觀察能夠被檢測到的復(fù)合物，其中核酸擴增產(chǎn)物的存在指示病原體的存在。
[0088] 環(huán)境來源或樣本可W是水，包括廢水和污水（例如排水、雨水、礦業(yè)和/或工業(yè)廢 水）、飲用水、游泳池水W及河水、溪水、湖水、池水或海水、空氣樣本和±壤樣本，但不限于 此。
[0089] 參考W下非限制性的實施例，W便更容易實踐本發(fā)明并且產(chǎn)生實際效果。
[0090] 實施例
[0091] 實施例1
[0092] 單滴基因組學(xué) [009引材料和方法
[0094] 對于植物應(yīng)用，使用優(yōu)化的裂解緩沖液巧OmM Tris-HCl pH 8.0，1.5M鹽酸脈，2% w/v PVP40和1 % v/v Tr i ton-X)從單葉（300mg)提取基因組DNA。對于DNA應(yīng)用，將400ng/化 RNA酶A添加至裂解緩沖液，但對于RNA應(yīng)用不添加。在環(huán)境條件解育10分鐘后，使用低成本 的自制過濾裝置使裂解物澄清，所述自制過濾裝置由普通的過濾移液器頭制造。對于非植 物應(yīng)用，使用不含有PVP40的裂解緩沖液。然后使用改進(jìn)的SPRI過程純化核酸w'w。簡要地， 在結(jié)合緩沖液中（10mM化is-肥lpH8.0,20%陽G8000,2.5M化Cl)，單滴（10化)澄清的裂 解物與1.8倍體積的涂布有簇酸的磁珠 (Thermo Fisher)解育5分鐘。然后使用磁體，將DNA 結(jié)合珠從裂解物中分離，并且使用100%異丙醇洗涂兩次，然后通過兩次80%乙醇洗涂，并 且WlOiiL的水洗脫。
[00M] 如制造商推薦的進(jìn)行一些改進(jìn)，使用TwistAmp基礎(chǔ)RPA試劑盒(TwistDX)。簡要地， 使用化1的核酸提取物和480-600碰的每種引物(表1)，在37°(：進(jìn)行12.5化的反應(yīng)持續(xù)30-40 分鐘。對于RNA應(yīng)用，50個單位的MMuLV逆轉(zhuǎn)錄酶添加至RPA反應(yīng)。擴增之后，5化的RPA反應(yīng)物 在凝膠上進(jìn)行電泳W(wǎng)驗證擴增。在絮凝測定中使用另外的扣L與1.8倍體積磁性SPRI珠溶液 解育5分鐘。使用磁體將珠分離后，并且使用80%乙醇洗涂，3化L的絮凝緩沖液（lOOmM醋酸 鋼，pH 4.4)添加到珠中。
[0096]
[0097] 單滴基因組學(xué)概念
[0098] 設(shè)想單滴基因組學(xué)是使用最低限度的設(shè)備，在現(xiàn)場敏感且快速的檢測致病性核酸 的綜合整合解決方案。圖1簡要地描述了 SDG概念，其由=個主要階段組成。第一階段是精確 采樣，其中使用最低限度的設(shè)備，從感興趣的來源將DNA和/或RNA提取至窄的濃度范圍，所 述來源例如單滴未加工的葉提取物。第二階段是使用RPA進(jìn)行致病性核酸的敏感、快速的等 溫擴增。第S且最后的階段是使用SPRI特異性捕獲擴增的DNA，然后實質(zhì)上無需設(shè)備的視覺 觀察在誘導(dǎo)絮凝的緩沖液中相同的SPRI顆粒。
[0099] 精確DNA采樣
[0100] 實地采樣即便有，也極少被討論。始終產(chǎn)生固定量的樣本的重要任務(wù)對任何測定 的性能具有意義。運里我們描述了一種使用普通的過濾移液器頭結(jié)合SPRI技術(shù)W的低成本 DNA純化，W始終提取DNA至精確的濃度，運能夠立即用于下游RPA擴增（圖2A)。基于磁性 SPRI珠的DNA提取理想地用于P0C應(yīng)用，因為其實質(zhì)上無需設(shè)備;僅需要磁體。此外，DNA產(chǎn)量 可W通過簡單地調(diào)整對固定的樣本投入給予的SPRI顆粒的量而被精確的控制。運種方法的 另一個優(yōu)勢是其相對低的成本(每次提取大約10澳分）。使用塑料研鉢，在2(K)化的裂解緩沖 液中，手工浸潰單葉（大約300mg或四個6mm直徑的盤），通過簡單地使裂解物通過過濾移液 器頭，清除植物裂解物的細(xì)胞碎片。然后使用SPRI從單滴（1化L)裂解物中純化DNA，其導(dǎo)致 在10化的洗脫中，始終典型的產(chǎn)出3-5ngAiL的高分子量DNA。由于DNA產(chǎn)量接近光譜測定評 估(化no化op)的檢測極限，DNA產(chǎn)量和完整性通過漠化乙錠染色（圖1B)估算，并且使用巧光 (Qubil某測定)驗證。盡管光譜測定對DNA評估是不可能的，在230nm基線附近的吸光度指示 最小量的污染物（圖2C)。對于RNA提取，典型的產(chǎn)量是在10化的洗脫中30-40ngAiL，260/280 和260/230的比分別是1.9-2.2和1.8-2.3(圖2C)，指示良好的純度。
[0101] DNA絮凝測定
[0102] 聚集(aggregation)測定具有多個好處，例如無需標(biāo)記和無需設(shè)備的生物分子檢 測，并且最近已經(jīng)使用金納米顆粒進(jìn)行了證實2^3。本文中，根據(jù)我們所知，我們首次證實了 使用涂布有簇酸磁性顆粒SPRI的絮凝測定用于DNA檢測（圖3A)。使用磁性SPRI顆粒具有S 個好處：（1)結(jié)合RPA擴增的DNA，（2)移除過量的dNTP、引物和引物二聚物，（3)促進(jìn)絮凝的緩 沖液的變化。W目前的SPRI條件排除了小于l(K)bp"的DNA，多達(dá)600nM的過量引物(推薦用于 RPA的最大引物濃度)不導(dǎo)致凝集（圖3B)。然而凝集（陽性反應(yīng))僅在存在擴增的DNA時發(fā)生 (圖3C)。此外，需要低至10%的擴增效率W產(chǎn)生（illicit)視覺上有差異的陽性反應(yīng)。通過 假設(shè)在反應(yīng)中擴增產(chǎn)物的最大量與初始引物量(480nM)相當(dāng)而估算。W不同的產(chǎn)物比引物 的比例混合，W確定誘導(dǎo)絮凝所需要的最小擴增。另一個感興趣的測定的特征是其對pH改 變的敏感性（圖3D)。在pH 4.4時，可W檢測低至0.5ngAiL(5化體積）的擴增產(chǎn)物。然而在 抑5.4,凝集的截斷濃度提高100倍達(dá)SOngAiL (扣L體積）。因此，運種特征可W提供某種水平 的"調(diào)整(tuning)"，并且可能有利于某些應(yīng)用?？紤]到運些觀察，我們認(rèn)為導(dǎo)致凝集的機制 可能是DNA介導(dǎo)的SPRI顆粒的絮凝。24
[0103]使用單滴基因組學(xué)檢測在不同感染階段的植物病原體
[0104] 我們選擇通過檢測植物病原體證實SDG的可行性，因為由于晚期疾病的診斷導(dǎo)致 的農(nóng)作物損失是重要的問題W。此外，目前缺乏用于農(nóng)業(yè)應(yīng)用的實地測定。使用我們的精確 采樣程序，基于擬南芥的癥狀發(fā)展，在不同的感染階段，從接種病原體的擬南芥收集DNA。使 用SDG早在第一階段感染可W檢測到下香假單胞菌接種的植物，甚至在癥狀顯現(xiàn)之前（圖 4C)。此外，從癥狀開始變得明顯的感染的第二階段，SDG檢測到在接種的植物中鑲刀霉菌和 灰葡萄抱菌（圖4A和圖4B)。我們還嘗試使用qPC閲金證我們對于鑲刀霉菌的SDG結(jié)果，然而， 使用與RPA方法相同量的初始材料，僅在階段3至5可W檢測到（圖5)。為證實=重檢測測定， 來自接種有不同病原體的=種植物的葉子，在它們各自的感染階段匯集到一起，用于模擬 S重感染。在第一階段，SDG可W檢測到病原體的存在（圖4D)。運些結(jié)果不僅證實了 SDG測定 的可行性，還證實了在植物感染的早期檢測中的敏感性，即當(dāng)表型癥狀剛開始顯現(xiàn)時。
[0105] 雖然SDG在擬南芥植物模型系統(tǒng)中表現(xiàn)良好，我們想知道該測定是否對其它宿主 植物系統(tǒng)適用。為此，我們對香蕉莖切斷物（來自商業(yè)上重要的品種)應(yīng)用SDG，W檢測香蕉 枯萎菌(F. 0巧sporum cubense)。SDG能夠很容易區(qū)分健康與患病樣本，進(jìn)一步支持SDG作為 用于農(nóng)業(yè)應(yīng)用可行的現(xiàn)場實地測試的潛能（圖6A)。
[0106] 單滴基因組學(xué):多類應(yīng)用
[0107] 雖然我們成功地檢測了植物病原體DNA，但對于RNA病毒檢測RNA也是有用的。為 此，改進(jìn)SDG采樣過程，用W提取RNA而非DNA，用于植物病原體黃瓜花葉病毒(CMV)。然后將 匪LV逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)添加到RPA混合物中，W允許等溫、單步驟的病毒RNA的RT-RPA擴增25'26。 然后使用絮凝測定確定成功擴增，并通過凝膠電泳驗證。正如所預(yù)期的，當(dāng)RPA反應(yīng)中包括 RT酶時，僅病毒感染的樣本產(chǎn)出陽性結(jié)果，而健康植物沒有(圖6E)。
[0108] 為證實其他的可能的農(nóng)業(yè)應(yīng)用，我們將注意力轉(zhuǎn)移到養(yǎng)牛業(yè)。養(yǎng)牛場趨于坐落于 地理位置偏遠(yuǎn)地區(qū)。因此用于牛疾病例如牛瘤疹病毒1型的現(xiàn)場診斷對產(chǎn)業(yè)有益。感染的與 未感染的牛細(xì)胞經(jīng)SDG，并且使用針對病毒酪氨酸激酶1和糖蛋白B基因的引物，我們成功地 區(qū)分了健康與疾病樣本(圖6F)。
[0109] 接下來，SDG用于檢測在水中的大腸桿菌DNA。培養(yǎng)普通的實驗室大腸桿菌株 One化ot Machl至00 = 0.5。然就將其稀釋10倍，并且10化用于0臟提取。然后將提取的0魁的 化L用于使用祀向uidA基因中的大腸桿菌特異性序列的引物27的擴增步驟。使用下香假單胞 菌(P. syr ingae)曲NA作為非特異性對照W及缺少DNA模板的對照(NoT)證明擴增的特異性。 僅對于運種應(yīng)用，即使在采取了用W避免污染的很多預(yù)防措施之后，在NoT對照中總是觀察 到RPA產(chǎn)物。此外，在無關(guān)的DNA模板中觀察到相似水平的擴增，因此，我們認(rèn)為RPA試劑盒具 有低水平的污染大腸桿菌DNA，并且在NoT對照中的擴增水平可W被認(rèn)為是基線。然而，因為 即使大腸桿菌陰性樣本產(chǎn)生擴增子，將導(dǎo)致絮凝試驗中的假陽性。為克服運個缺點，我們通 過將絮凝緩沖液的抑從4.5提高至5而"調(diào)整"測定。在運個條件下，我們可W解釋(account for)背景擴增，并且成功地檢測大腸桿菌陽性樣本，在對照樣本中沒有錯誤檢測（圖6B)。
[0110] 最后，將SDG延伸至導(dǎo)致人疾病的病原體，例如HIV、追疾、結(jié)核病和流感。為此，使 用相同SDG過程，我們從健康細(xì)胞中成功地區(qū)分了HIV感染的細(xì)胞(前病毒DNA)(圖6C)。在感 染的血液樣本中也成功地檢測到追原蟲DNA的存在，而在未感染的對照中沒有檢測到（圖 4D)。使用兩種不同的祀標(biāo)基因，清楚地檢測到在培養(yǎng)樣本中的結(jié)核分枝桿菌的存在，并且 可W與大腸桿菌區(qū)別（圖6G)。最后，在感染的培養(yǎng)介質(zhì)中檢測到甲型流感H1N1病毒，然而未 感染的介質(zhì)沒有提供任何陽性信號（圖細(xì))。綜上，證實SDG其本身作為通用的綜合方法能夠 在實地使用，不需要實驗室加工樣本或復(fù)雜的設(shè)備，并且適合于很多應(yīng)用。
[0111]
[0112] 實地即用P0C基因組測定的特征在于，始終提取固定量核酸的取樣過程，快速且敏 感的等溫擴增方法W及無需設(shè)備讀出。在本文中，我們描述了單滴基因組學(xué)（圖1)測定，其 整合了所有W上特征，是用于檢測來自不同界的多種致病性和非致病性物種的DNA和RNA的 通用的、實質(zhì)上無需設(shè)備的、低成本的方法。
[0113] 提供了始終W固定量取樣核酸解決方案是意義重大的事件，因為投入材料的量能 夠顯著影響下游加工的性能。為實現(xiàn)運一點，我們使用裂解緩沖液改進(jìn)了已經(jīng)建立的方法， 所述裂解緩沖液由促溶鹽(chaotropic salt)例如鹽酸脈組成。脈鹽使蛋白質(zhì)變性，并且滅 活核酸酶，因此保存核酸的完整性。連同洗涂劑，例如化iton-X，破壞細(xì)胞膜W提高裂解。運 之后移除不溶的細(xì)胞碎片，并且最后提取和純化核酸。在實驗室設(shè)置中，使用離屯、分離很容 易移除細(xì)胞碎片。不幸地，在實地離屯、機是不容易獲得的。最便宜且最簡單的解決方案是過 濾未加工的裂解物。我們還試圖使用最低限度的設(shè)備實現(xiàn)運一目標(biāo)，我們決定使用普通的 過濾移液器頭作為工具用W清除未加工的裂解物(圖2)。
[0114] 然后使用SPRI技術(shù)提取核酸i9，SPRI技術(shù)是最適于用于P0C應(yīng)用，因為其實質(zhì)上無 需設(shè)備；僅需要磁體。此外，DNA產(chǎn)量可W通過簡單地調(diào)整對固定的樣本投入給予的SPRI顆 粒的量而被精確的控制。本方法另外的優(yōu)勢是其相對低的成本。對于所使用的SPRI珠的量， 我們的方法僅花費幾分，并且對整體測定成本的貢獻(xiàn)是無關(guān)緊要的。使用我們獨特組合的 裂解緩沖液和SPRI技術(shù)，我們始終實現(xiàn)了來自植物葉組織的DNA 3-5ngAiL和RNA 30-4化g/ yL的產(chǎn)量（圖2B和C)。運種精確的水平是重要的，因為在實地情況中，沒有簡單的無需設(shè)備 的定量核酸的方式。對于實踐目的，運個濃度的DNA對于下游RPA擴增也是最優(yōu)的，并且不干 擾讀出測定。
[0115] RPA是相對新的等溫核酸擴增方法4。其從TwistDX商業(yè)可獲得，具有可能地單細(xì)胞 水平檢測和高達(dá)5重RPA反應(yīng)。相比其他等溫方法選擇RPA的另一個重要因素是其試劑盒是 W冷凍干燥的顆粒銷售的，并且在室溫穩(wěn)定，對于在地理位置偏遠(yuǎn)的地區(qū)中應(yīng)用是十分有 用的特征。我們開發(fā)的RPA測定已經(jīng)被設(shè)計用于敏感的和快速的（30-40分鐘)檢測植物、動 物和人樣本中的致病性或非致病性DNA。
[0116] RPA試劑盒的唯一供應(yīng)商TwistDX，目前銷售一種便攜式裝置，其具有加熱器和巧 光計的功能。雖然，運可能提供一種可能的P0C解決方案，但用W購買裝置和具有特殊化學(xué) 修飾的引物的初始投資可能對實際實施構(gòu)成限制。此外，用于實際情況中的任何種類的設(shè) 備將暴露于不利氣候條件，其將嚴(yán)重限制儀器的使用壽命，包括極熱和極冷、濕度、灰塵、雨 等。為解決運個問題，我們開發(fā)了一種讀出方法，其能夠在幾乎沒有成本且沒有設(shè)備下快速 評估RPA擴增。我們的讀出方法是絮凝測定，其利用高度DNA結(jié)合能力的SPRI珠（圖3)。據(jù)我 們所知，運是首次使用已經(jīng)描述的磁性SPRI顆粒作為讀出方法。絮凝測定對P0C應(yīng)用是首要 有利的，因為它是簡單的，并且不需要復(fù)雜的儀器，并且在試驗需要簡單的離散(是/否）結(jié) 果的應(yīng)用中是有用的。最近，已經(jīng)描述了使用用于比色生物傳感的納米金顆粒的多種示 例2^3。雖然顯示是十分敏感的，但除非W高濃度使用，顏色的轉(zhuǎn)變是相對微小的，并且許多 組使用光譜測定驗證聚集。相反的，我們的絮凝測定具有更好的視覺對比。運可能由于對比 納米尺寸的金顆粒，顆粒（1皿)的尺寸更大。如具有增加的DM負(fù)載的顆粒絮凝物，它們形成 更大的實體，迅速的沉淀至管底，因此導(dǎo)致溶液的澄清。另一方面，游離的顆粒緩慢地沉淀， 導(dǎo)致渾濁的溶液。
[0117] 通過提高緩沖液pH，顆粒凝集還是可逆的（圖3D)，因此進(jìn)一步支持DNA介導(dǎo)的絮 凝，因為按照定義，絮凝是膠體的一種可逆的非共價聚集24。在更高的抑，DNA帶更多的負(fù)電， 因此越可能排斥其他DNAW及來自顆粒的表面涂布的簇酸。還可W利用運種抑依賴性，調(diào)整 測定對DNA濃度的敏感性。在運個報告中，我們利用運個特征區(qū)別外源的大腸桿菌DNA和存 在于RPA酶溶液中的污染物大腸桿菌DNA，其可能由于商業(yè)可獲得的酶是使用重組技術(shù)從大 腸桿菌培養(yǎng)中生產(chǎn)的（圖6B)。通過調(diào)整抑W控制絮凝，我們能夠解釋(account for)背景擴 增的水平，并且因此檢測由外源的大腸桿菌DM引起的額外的擴增。雖然運是一種簡單的解 決方案，運種方法的缺點是缺乏敏感性和視覺對比。由于絮凝的可能性依賴于高分子量DNA 的存在量，使用過量投入的DNA的測定過載能夠?qū)е录俚木奂蚣訇栃?。然而，由于我們?取過程的精確，我們有效地避免了運種情況(圖2)。
[0118] 最后，通過成功檢測直接來自多種宿主標(biāo)本的多種病原體，證實了 SDG的應(yīng)用的廣 泛范圍（圖6)。例如，我們檢測了植物中的真菌、細(xì)菌和病毒;在牛細(xì)胞中的瘤疹病毒DNA; HIV前病毒DNA、人組織中的追原蟲，甲型流感H1N1病毒W(wǎng)及滲有大腸桿菌的水。本文顯示的 多類實例證實在偏遠(yuǎn)地區(qū)用于其他在實地測試應(yīng)用的廣泛的可能性和多功能性。
[0119] 綜上，單滴基因組學(xué)測定是綜合的、實地即用的、通用的、無需設(shè)備、多類的DNA和 RNA檢測策略，具有在農(nóng)業(yè)、人健康和一般的生物安全的多種應(yīng)用。
[0120] 在其目前的形式中，SDG準(zhǔn)備好用于實地評估。
[0121] 夫1
[0122]
[0123] 實施例2
[0124] 使用DM介導(dǎo)的橋接絮凝進(jìn)行基因座特異性的DM甲基化快速的、低資源評估
[0125] 將DNA甲基化生物標(biāo)記物引入臨床的挑戰(zhàn)在于缺乏簡單的方法，由于大多數(shù)已經(jīng) 開發(fā)的測定用于研究目的。本文中我們描述了一種高度改進(jìn)的，與DNA介導(dǎo)的絮凝測定相結(jié) 合的甲基蛋白結(jié)構(gòu)域(MBD)富集過程，其用于W納克量的投入，快速而高度嚴(yán)格的、裸眼二 元評估高度甲基化基因座特異性區(qū)域。我們的方法的低資源需求使得在臨床基于DNA甲基 化的診斷的廣泛適用，并且可W用于小規(guī)模研究。
[01%] 材料和方法
[0127] DNA樣本制備
[0128] 使用RE化I-g叫tra化St迷你型試劑盒（Qiagen)產(chǎn)生全基因組擴增(WGA)DNA，并 且使用DNeasy血液和組織試劑盒（Qiagen)純化。然后使用SssI甲基轉(zhuǎn)移酶處理一份WGA DNA過夜，并且純化W產(chǎn)生高度甲基化的基因組DNA。細(xì)胞系衍生DNA也使用DNeasy血液和組 織試劑盒純化。細(xì)胞系購自ATCC并且根據(jù)制造商的推薦培養(yǎng)。
[0129] 使用改進(jìn)的SPRI過程28純化來自前列腺癌患者的全血DNA。簡要地，使用抓TA保存 的全血60化與10化的蛋白酶K溶液(New England Biolabs，肥B)、60化的裂解緩沖液（3M鹽 酸脈，2%化iton X)和化L的RNA酶A溶液(4mg/mL)在室溫解育10分鐘。然后10化的涂布簇基 的磁珠 （Thermo Fisher)和240化結(jié)合緩沖液（lOOmM Tris-HC1，2.5M NaCl，20%w/v PEG8000，pH 8.0)添加到裂解的血液中。在室溫解育10分鐘后，使用磁體收集DNA結(jié)合磁珠， 并且使用洗涂溶液(400mM鹽酸脈，70 %乙醇)洗涂一次，使用70 %乙醇洗涂兩次，最后W30y L的水洗脫。兩種血液樣本均在收集的24小時內(nèi)加工。人類血液樣本經(jīng)當(dāng)?shù)貍惱砦瘑T會授予 批準(zhǔn)使用。
[0130] 為產(chǎn)生與MDB富集相匹配的DNA片段大小，使用Msel和MluCI限制性酶(肥B)。簡要 地，在37°C，在10化的反應(yīng)中，使用1個單位的每種酶消化50ng的DNA 30分鐘。在消化之后， 使用化L的反應(yīng)物用于各M抓富集。
[0131] M抓富集
[0132] 使用化imark甲基化DNA富集試劑盒(肥B)，對推薦的說明書進(jìn)行主要的改進(jìn)。簡要 地，MDB2a-Fc蛋白與10化的蛋白質(zhì)A磁珠在室溫解育15分鐘。然后在化C1改進(jìn)為300mM 濃度的lx M抓緩沖液中，每個50化的富集反應(yīng)使用0.扣L的MBD/磁珠混合物。在冰上使DNA 與MBD/磁珠反應(yīng)15分鐘。然后使用化Cl改進(jìn)為300mM的lx M抓緩沖液洗涂S次，每次5分鐘， 用W移除過量的弱結(jié)合的DNA。然后使用化L的2.5M NaCl溶液將富集的DNA洗脫。最后，根據(jù) 制造商推薦，使用Agencourt AMPure XP SPRI磁珠 (Beckman Coulter)純化富集的DNA，并 且W化L的水洗脫。然后將化L純化的DNA用于每個RPA反應(yīng)。
[0133] RPA 擴增
[0134] 使用具有對推薦的方法進(jìn)行一些改進(jìn)的TwistAmp基礎(chǔ)試劑盒(TwistDx)進(jìn)行RPA 反應(yīng)。簡要地，在添加有7mM MgOAc的每個12.5化的反應(yīng)中使用500nM的引物。在快速的20分 鐘的RPA擴增之后，3化在凝膠上進(jìn)行電泳用W驗證擴增。剩下的經(jīng)SPRI清除，進(jìn)行去除RPA 反應(yīng)成分，RPA反應(yīng)成分能夠干擾下游絮凝測定。然后將純化的擴增子W9.化L的水洗脫。
[0135] 絮凝測定
[0136] 為進(jìn)行絮凝測定，3化純化的RPA擴增子與化L Agencoud AMPure XP SPRI磁珠在 室溫解育5分鐘。然后使用磁體捕獲珠，并且移除上清液。然后立即添加20化的絮凝緩沖液 (200mM醋酸緩沖液抑4.4)，并且允許在磁體上解育額外的分鐘。最后，從磁體上移除管，并 且通過輕彈管的側(cè)壁攬拌。陽性測試導(dǎo)致DNA/珠的絮凝沉淀，然而陰性測試中珠很容易再 分散至溶液中。
[0137] DNA的表觀遺傳改變是可能的疾病生物標(biāo)記物28dDNA表觀遺傳改變的一種形式是 胞喀晚/鳥嚷嶺二核巧酸(CpG)中的胞喀晚的甲基化(5mC)，特別是在調(diào)節(jié)細(xì)胞過程功能的 啟動區(qū)的CpG島（CGI)。然而，大多數(shù)方法通過DNA的亞硫酸氨鹽轉(zhuǎn)化之后一些形式的測 序3^4檢測DNA的甲基化。為避免有關(guān)亞硫酸氨鹽轉(zhuǎn)化方法的難題，在很多最近的DNA甲基化 研究中，已經(jīng)采納使用針對5-甲基胞喀晚產(chǎn)生的甲基結(jié)合結(jié)構(gòu)域(MDB)蛋白或抗體的親和 捕獲方法，其通常結(jié)合二代測序(NGS)35'36。雖然運些方法用于研究是杰出的，但仍然缺乏用 于常規(guī)診斷的檢測基因特異性甲基化的更簡單并且更方便的方法。盡管已經(jīng)開發(fā)了使用基 于親和性的方法的多種策略34^*^^滿足臨床需求，同時避免亞硫酸氨鹽處理，但所有方法仍 然需要一些形式的光學(xué)讀出方法W評估差異甲基化區(qū)域(DMR)。
[0138] M抓富集方法的有用特征是在合適的鹽濃度下酶接近(almost)二元的特異性35'36， 即，MDB捕獲甲基化的DNA或者不捕獲。運種二元特征在顯著變化的情況中是有用的，例如， 在臨床中預(yù)測疾病結(jié)果的高差異甲基化區(qū)域化DMR)。因此，反應(yīng)運些數(shù)字型是/不是的生物 標(biāo)記物的讀出方法是有用的。一種可能的二元讀出方法是DNA聚合物介導(dǎo)的橋接絮凝測定。 典型地，絮凝在不同的相之間突然地發(fā)生4i^7，MDB富集測定與基于絮凝的讀出結(jié)合可W產(chǎn) 生用W評估HDMR的快速、低資源的方法。
[0139] 橋接絮凝過程的關(guān)鍵特征是區(qū)別長的和短的DNA聚合物片段，運是實現(xiàn)測定的關(guān) 鍵所在。因為橋接絮凝裸眼很容易看見，相比傳統(tǒng)的方法，其是十分吸引人的低資源評估系 統(tǒng)，并且更適合于低成本常規(guī)臨床使用。與其它基于納米顆粒的方法21^4不同，基于納米顆 粒的方法顏色轉(zhuǎn)變通常是微小的，并且需要光譜測定驗證，在絮凝測定中溶液從渾濁到澄 清的轉(zhuǎn)變具有更好的視覺對比，并且很容易通過裸眼評估，而不需要額外的設(shè)備。
[0140] 結(jié)果和討論
[0141] 本文中，我們描述了一種使用MBDW選擇性富集甲基化DNA的新的方法（圖7)，隨后 通過粗略的等溫重組酶聚合酶擴增（RPA)4產(chǎn)生大量的皿MR特異性DNA聚合物。最后，通過 DNA介導(dǎo)的橋接絮凝測定，W裸眼評估擴增的HDMR的存在。僅需要納克量的初始基因組材 料，并且在目前的條件下，測定對10%的甲基化變化是敏感的。測定在兩小時內(nèi)完成，并且 僅需要最低限度的設(shè)備：移液器、加熱器和磁體。最后，對一組細(xì)胞和全血衍生DNA應(yīng)用測 定，用W測試S種可能的癌癥相關(guān)的HDMR的存在。我們相信方法的速度、簡易、和低資源需 求可W拓寬在臨床中基于DNA甲基化的應(yīng)用。
[0142] 為了解所述方法（圖7)，我們首先酶促片段化50ng的基因組DNA(曲NA)，用于M抓富 集。我們選擇酶促片段化投入DNA，因為其是已經(jīng)建立的且粗略的分子技術(shù)，僅需要加熱器， 不同于通過聲波降解法的物理剪切，所述聲波降解法耗時且需要專用設(shè)備。選擇Msel和 MluCI限制性酶(分別識別序列:TTAA和AATT)的組合，因為它們在人基因組中頻繁地剪切產(chǎn) 生與M抓富集相匹配的片段(平均12加 P)，同時避免了CGI的過度片段化，典型地在CGI中發(fā) 現(xiàn)HDMR。接下來，使MBD偶聯(lián)磁珠，隨后并入相對高的鹽(300mM)緩沖液中選擇HDMR36，在進(jìn)行 結(jié)合和洗涂步驟時，在冰上(4°C)進(jìn)行W便于快速且高嚴(yán)格度富集。使用針對與ESR1基因啟 動子有關(guān)的GGI(在乳腺癌中已知的HDMR)的引物27,我們首先使用5ng的全基因組擴增(WGA) DM作為未甲基化對照，對比在體外甲基化的5ng WGA DNA作為甲基化對照，測試了M抓富集 步驟。如隨后的富集DNA的RPA擴增所指示，在冰上進(jìn)行全部MBD測定(結(jié)合和洗涂），其僅導(dǎo) 致甲基化DNA的高度特異性富集，在約30分鐘內(nèi)性能損失最低（圖8A)。運在速度和特異性方 面均顯著的提高，超過W前描述的過程36'38，W前描述的過程需要不同的MDB酶的組合和/或 在4°C過夜解育W使用低的投入實現(xiàn)高度嚴(yán)格度。此外，運里使用粗略和快速的等溫擴增進(jìn) 一步簡化和加速了測定。
[0143] 由于裸眼評估可W用于二元診斷結(jié)果，例如MBD富集的HDMR，我們使用絮凝測定評 估擴增。由于僅需要最低限度的設(shè)備用于評估，絮凝測定也可W適于低資源的環(huán)境。在RPA 擴增感興趣的HDMR后，如概念所證明的，我們使用涂布簇基的固相可逆固定化(SPRI)28磁珠 用于DNA純化，W使DNA沉淀在珠的表面。然后替代洗脫結(jié)合的DNA，引入低抑緩沖液，只有在 大量具有足夠長度的RPA擴增子存在時才觸發(fā)絮凝，其反過來代表M抓富集的HDMR的存在。 如果擴增沒有發(fā)生，表明缺乏甲基化，1皿的珠很容易分散在溶液中。據(jù)我們所知，運是首次 將橋接絮凝測定用于基于MBD/RPA的方法。
[0144] 相信我們現(xiàn)在可高嚴(yán)格度快速地檢測HDMR，我們將注意轉(zhuǎn)移到測定的檢測極 限，特別是（1)需要產(chǎn)生足夠的RPA擴增子W觸發(fā)絮凝的最低投入和(2)甲基化DNA的最低可 檢測的量。為此，我們加工了5ng的gDNA滴定至不同水平的甲基化（100 %、50 %、10 %和 0%)。我們通過凝膠電泳可視化和使用絮凝測定，從低至10%的總DNA投入被甲基化，能夠 粗略地檢測到存在的甲基化DNA(圖2B)。運也表明了可檢測到的信號需要最低0.5ng(l〇% 甲基化樣本）的初始甲基化DM。考慮到運些數(shù)據(jù)，我們相信我們的方法對于W納克范圍 (regime)的高度甲基化DNA是特異的且敏感的。
[0145] 最近描述了在磁共振中，使用DNA誘導(dǎo)轉(zhuǎn)變的忍片上MBD/RPA方法W。雖然快速且有 用，但所述方法需要輔助設(shè)備W評估RPA擴增子的存在。相反，在相似的時間段和使用更少 的初始材料，通過我們的方法使用裸眼很容易進(jìn)行結(jié)果的評估。此外，我們還證實了我們的 方法從納克量的DNA投入當(dāng)中檢測低水平(10%)甲基化的能力，雖然運種方法是定性的。
[0146] 最后，為證實對更復(fù)雜的生物樣本的應(yīng)用，除了對一組人癌癥細(xì)胞系的ESR1W外， 我們延伸我們的測定用W評估兩種額外的可能的生物標(biāo)記物GSTP149-5哺NPY52^ 54的甲基化 狀態(tài)（圖9A-C)。為控制嚴(yán)格度，同時還測定了未甲基化的WGA DNA與細(xì)胞系衍生的DNA。正如 所預(yù)期的，對于所有S種生物標(biāo)記物測定，在未甲基化的對照中檢測到可忽略的RPA擴增， 因此驗證了測定的嚴(yán)格度。正如所預(yù)期的，我們成功地描述了全部巧巾細(xì)胞系樣本ESRUNPY 和GSTP1的甲基化狀態(tài)。此外，本文顯示的數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)55'56-致，因此強調(diào)了我們的方法的準(zhǔn) 確度。最后，我們對獲得自患有高轉(zhuǎn)移性前列腺癌的男性的全血衍生曲NA的兩個樣本、W及 一個來自25例正常女性的樣本的集合應(yīng)用測定（圖3D)。對于兩個前列腺癌樣本（PC1和 PC2)，基于存在絮凝，檢測到高度甲基化的GSTP1，但是沒有檢測到ESR1和NPY。對于正常DNA 樣本的集合(NB)，如絮凝測定所指示的，所有S種生物標(biāo)記物是甲基化的。雖然正常DNA樣 本的甲基化譜是意料之外的，進(jìn)一步的研究超出了本報告的范圍。然而該數(shù)據(jù)強調(diào)了選擇 合適的樣本來源對于特異性甲基化生物標(biāo)記物的重要性。盡管如此，本文的結(jié)果證實了我 們的測定使用典型地體液(例如全血)用于常規(guī)診斷中的可行性。
[0147] 綜上，我們首次描述了基于M抓的快速方法，其用于從納克量的投入嚴(yán)格富集甲基 化DM。將其與RPA結(jié)合，我們能夠?qū)崿F(xiàn)從至少10%甲基化的樣本敏感的檢測。然后使用簡單 的絮凝測定，通過裸眼評估陽性MBD/RPA結(jié)果，并且還首次證實了甲基化檢測的經(jīng)典膠體化 學(xué)現(xiàn)象。運種方法還延伸到細(xì)胞系和全血衍生的樣本，W證實其作為診斷工具的可行性。最 后，使用絮凝測定評估陽性MBD/RPA結(jié)果使得無標(biāo)記方法用于低資源應(yīng)用成為可能，運可W 使常規(guī)診斷和小規(guī)模DNA甲基化研究受益。
[014引實施例3
[0149] 在前列腺癌中檢測尿TMPRSS2:ERG融合
[0150] TMPRSS2-ERG基因融合是前列腺癌主要的分子亞型。大量證據(jù)表明TMPRSS2-ERG融 合介導(dǎo)了腫瘤侵襲，與前列腺上皮內(nèi)瘤(PIN)、前列腺癌的前期病變和前列腺癌本身之間的 組織學(xué)區(qū)別定義相一致。因此，確定本文公開的"單滴"核酸檢測系統(tǒng)是否能夠W適用于照 護(hù)點診斷的方式檢測TMPRSS2-ERG基因融合是有價值的。
[0151] 使用列于表2中的引物，基本上W上述的條件下進(jìn)行等溫重組酶聚合酶擴增。隨后 在基本上W上述的條件下，在包括緩沖液的絮凝中，使用SPRI顆粒檢測擴增子。
[0152] 如在圖10中所示的，RT-RPA之后對Du化P RNA擴增子進(jìn)行DNA測序。使用SPRI磁珠 純化提取的Du化P RNA的RT-RPA擴增子，并測序，其驗證了祀標(biāo)TMPRSS2:ERG區(qū)域的擴增。圖 11顯示從10例轉(zhuǎn)移性去勢抵抗性前列腺癌患者和健康患者的尿液標(biāo)本提取的RNA進(jìn)行的 RT-PCR。通過瓊脂糖凝膠電泳可視化RT-PCR擴增子驗證了絮凝測定對相同患者群的篩選結(jié) 果（圖11c)。在圖12中，比較在全尿和尿沉渣中RNA的穩(wěn)定性，證實了在標(biāo)本收集后0、2和12 小時之時提取患者全尿和尿沉渣RNA的RT-RPA。
[0153] 綜上，運些數(shù)據(jù)顯示本文公開的"單滴基因組學(xué)"概念是理想地適合于快速且有效 檢測包含TMPRSS2-ERG基因融合的核酸，所述TMPRSS2-ERG基因融合作為可能存在前列腺癌 細(xì)胞的診斷指標(biāo)。
[0154] 表2:寡核巧酸序列
[0155]
[0156] 實施例4
[0157] 滾環(huán)擴增產(chǎn)生的擴增子用于單滴基因組學(xué)
[0158] 滾環(huán)擴增(RCA)是一種快速的等溫核酸擴增，該方法已經(jīng)被廣泛地用于檢測疾病 生物標(biāo)記物5^9。由于RCA產(chǎn)生長的（千堿基）的DNA聚合物，其可能用于需要足夠的合適長度 的DNA的DNA介導(dǎo)的橋接絮凝讀出。DNA介導(dǎo)的橋接絮凝讀出測定的優(yōu)勢在于結(jié)果可W在現(xiàn) 場使用裸眼評估，并且因此對于低資源設(shè)置的應(yīng)用是有用的。在本研究中，我們證實了RCA 擴增和橋接絮凝讀出的組合用于快速、低資源檢測農(nóng)業(yè)上重要的病原體下香假單胞菌 (PSY)的可行性。
[0159] 材料和方法
[0160] 環(huán)探針設(shè)計
[0161] 從國家生物技術(shù)信息中屯、(NCBI)GenBank獲得下香假單胞菌(Psy)基因組序列。進(jìn) 行生物信息學(xué)分析，并且鑒定候選祀標(biāo)Psy序列。候選序列經(jīng)BLAST捜索鑒定在其他生物中 同源的DNA片段。應(yīng)特別注意尋找在Psy基因組中存在但在其他生物不存在的序列。選擇在 數(shù)據(jù)庫中任何可提供的序列中顯示不具有同源性的片段?；趩我恍蛄校b定CViPII切口 位點，并設(shè)計了單鏈環(huán)探針，其是具有6 4 n t的序列5 ' - TGGTCTTAAAAACTCTTTCGTTGTCATTGGGATAGGCGATTCTAAATTTCTCAACGAAATCTGG-3 ' r切日 PSr;SEQ ID N0:28)。
[0162] 在含有IX CircLigase II反應(yīng)緩沖液（33mM Tris-乙酸鹽(pH 7.5)，66mM乙酸鐘 和0.5mM DTT)、2.5mM MnCl2和IM甜菜堿的20山反應(yīng)中，通過使lOpmol的單鏈環(huán)探針與抓的 CircLigase iKEpicen化e)混合而制備環(huán)探針。反應(yīng)物在60°C解育16小時，隨后在80°C進(jìn) 行 10分鐘W失活CircLigase II。
[0163] 消化基因組DM
[0164] 在含有IX CutSmad緩沖液(50mM乙酸鐘，20mM Tris-乙酸鹽，10mM乙酸儀aOOiig/ ml BSA)的20山反應(yīng)中，使用抓的CViPII切口酶(肥B)消化50ng的Psy基因組DNA和植物基因 組DNA。消化首先在37 °C解育90分鐘，隨后在65 °C進(jìn)行20分鐘的變性步驟。
[01化]滾環(huán)擴增(RCA)
[0166] 在含有在IX Phi29緩沖液(50mM Tris-HCl，10mM MgCl2，10mM(NH4)2S〇4,4mM DTT) 中的抓Klenow片段（3'一5'exo)(肥B)、抓的曲i29DNA聚合酶(肥B)和125nM的每種dNTP的 20山反應(yīng)中，使lOOnM的環(huán)探針與25化g的切口酶消化的基因組DNA混合。反應(yīng)混合物在37°C 解育30分鐘。在棚酸鋼緩沖液中，使用1.5%的瓊脂糖凝膠通過凝膠電泳分析產(chǎn)物。由于線 性RCA的性質(zhì)，如通過凝膠電泳所指示的，預(yù)期的產(chǎn)物大小范圍從少至25個堿基至超出10個 堿基。
[0167] 絮凝測定
[016引在室溫下，5化的RCA反應(yīng)與10化的Agencourt Ampure XP SPRI珠解育5分鐘，W使 RCA產(chǎn)物結(jié)合到磁珠表面。然后使用磁體分離負(fù)載DNA的珠，并且使用70%乙醇洗涂1次，然 后允許風(fēng)干1分鐘。在珠中添加30化的絮凝緩沖液（lOOmM醋酸緩沖液，pH 4.4)，解育另外1 分鐘之后通過輕彈管的側(cè)壁攬拌。
[01~]結(jié)果和討論
[0170] 為了解應(yīng)用，我們首先將PSY基因組DNA(曲NA)滲入到5ng的宿主植物曲NA背景中 (擬南芥，圖13)。正如所預(yù)期的，通過梯度/拖尾譜（laddering/smearing profile)所指示 的，僅在存在PSY(1-10%)中產(chǎn)生高分子量產(chǎn)物，但是在植物DNA(0%)中沒有，運指示RCA測 定的特異性。因此，僅當(dāng)RCA成功時，出現(xiàn)DNA介導(dǎo)的絮凝(1-10%滲入樣本），因此證實RCA產(chǎn) 生的產(chǎn)物的絮凝讀出的可行性。
[0171] 最后，為模擬實際農(nóng)業(yè)應(yīng)用，我們收集了表現(xiàn)不同程度感染表型的宿主植物葉 (S1-5,圖14)。使用RCA和絮凝讀出，我們在早至S1檢測到PSY的存在，S1代表感染的癥狀前 水平。健康的化)和沒有模板的(NoT)對照沒有擴增，且因此沒有看見絮凝，運指示方法的特 異性。
[0172] 綜上，DNA介導(dǎo)的橋接絮凝讀出與RCA產(chǎn)生產(chǎn)物相匹配，并且可用于快速的、敏感 的、化資源檢測病原體序列。將絮凝測定用于RCA產(chǎn)生的產(chǎn)物的應(yīng)用被證實成功地檢測了感 染的宿主植物葉中的PSY。
[0173] 貫穿本說明書，目的在于描述本發(fā)明優(yōu)選的實施方案，不在于將本發(fā)明限制在任 一個實施方案或具體的特征的集合。在不背離本發(fā)明的情況下，可W對描述和示例的實施 方案進(jìn)行各種改變和修改。
[0174] 本說明書中所提及的每個公開的專利和科學(xué)文獻(xiàn)、計算機程序和算法通過引用^ 其整體并入。
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【主權(quán)項】
1. 一種檢測核酸的方法，所述方法包括使分離的核酸與顆粒結(jié)合的步驟，其中所述分 離的核酸與所述顆粒能夠形成可以通過視覺觀察檢測的復(fù)合物。2. -種用于檢測核酸的試劑盒，所述試劑盒包含能夠與分離的核酸形成復(fù)合物的顆 粒，所述復(fù)合物能夠通過視覺觀察被檢測到。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其進(jìn)一步包含以下的一種或多種：用于核酸序列擴增 的酶;一種或多種用于核酸序列擴增的引物;磁體;一種或多種用于核酸提取的試劑;過濾 器;和/或一種或多種反應(yīng)容器。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法或者權(quán)利要求2或權(quán)利要求3所述的試劑盒，其中所述復(fù) 合物是通過核酸與顆粒絮凝形成的。5. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的方法或試劑盒，其中與在沒有或相對低的量或濃度 的核酸中觀察到的絮凝相比，通過沒有或相對減少的絮凝指示核酸的存在或相對量。6. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的方法或試劑盒，其中所述顆粒是順磁性顆粒。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法或試劑盒，其中所述順磁性顆粒是SPRI顆粒。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法或試劑盒，其中在絮凝緩沖液中發(fā)生絮凝。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法或試劑盒，其中所述絮凝緩沖液是pH(i)低于7; (ii)約pH 3·6-5·5;或者（iii)約pH 4.4。10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法或試劑盒，其中所述絮凝緩沖液的pH是絮凝后半定量滴 定的。11. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的方法或試劑盒，其進(jìn)一步包含著色劑，用以促進(jìn)、 幫助或提高核酸:顆粒復(fù)合物的視覺檢測。12. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的方法或試劑盒，其中所述核酸是靶標(biāo)核酸通過核 酸序列擴增產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物。13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法或試劑盒，其中通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)進(jìn)行核酸序 列擴增。14. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法或試劑盒，其中通過等溫核酸序列擴增進(jìn)行核酸序列 擴增。15. 根據(jù)權(quán)利要求14所述的方法或試劑盒，其中等溫核酸序列擴增是重組酶聚合酶擴 增(RPA)或滾環(huán)擴增(RCA)。16. 根據(jù)權(quán)利要求12至15任一項所述的方法或試劑盒，其中所述擴增產(chǎn)物擴增自靶標(biāo) 核酸，所述靶標(biāo)核酸通過以下連續(xù)步驟獲得：（a)包含靶標(biāo)核酸的核酸樣本的重力過濾；（b) 使靶標(biāo)核酸與顆粒結(jié)合;和(c)從顆粒洗脫靶標(biāo)核酸。17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法或試劑盒，其中在步驟(b)和步驟(c)中靶標(biāo)核酸的體 積是約5至10yL。18. 根據(jù)前述權(quán)利要求任一項所述的方法或試劑盒，其用于檢測致病性或非致病性生 物。19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法或試劑盒，其中所述致病性生物是植物病原體。20. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法或試劑盒，其中所述致病性生物是人或其它動物的病 原體。21. 根據(jù)權(quán)利要求1至20任一項所述的方法或試劑盒，其用于檢測一種或多種與疾病或 病癥有關(guān)的生物標(biāo)記物。22. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法或試劑盒，其中所述一種或多種生物標(biāo)記物包含腫瘤 抗原或標(biāo)記物和/或腫瘤抑制基因。23. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)記物包括核苷酸序列多 態(tài)性。24. 根據(jù)權(quán)利要求23所述的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)記物包括一種或體細(xì)胞 突變和/或單核苷酸多態(tài)性(SNP)。25. 根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述一種或多種生物標(biāo)記物是表觀遺傳事件或 與表觀遺傳事件有關(guān)。26. 根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其中所述表觀遺傳事件包括DNA甲基化和/或DNA羥甲 基化事件。27. 根據(jù)權(quán)利要求21或權(quán)利要求22所述的方法或試劑盒，其中所述疾病或病癥包括癌 癥、腫瘤、淋巴瘤、白血病和其它惡性腫瘤，感染性疾病，炎癥性疾病，自體免疫性疾病，呼吸 道疾病，胃腸疾病，神經(jīng)疾病，生殖系統(tǒng)疾病和/或精神疾病。28. 根據(jù)權(quán)利要求1至20任一項所述的方法或試劑盒，其中所述方法用于檢測環(huán)境樣本 或來源中的核酸。29. 根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法或試劑盒，其中所述環(huán)境樣本或來源是水、空氣和/或 土壤樣本。30. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法或試劑盒，其中所述水樣本是廢水和/或污水。31. 根據(jù)權(quán)利要求30所述的方法或試劑盒，其中所述廢水或污水是排水、雨水、礦業(yè)或 工業(yè)廢水。32. 根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法或試劑盒，其中所述水樣本是飲用水、游泳池水、河水、 溪水、湖水、池水或海水。33. 根據(jù)權(quán)利要求1至20任一項所述的方法，其中所述方法用于檢測食品、飲料或其它 消費品樣本中的核酸。
【文檔編號】C12Q1/68GK106062210SQ201480070522
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2014年12月23日
【發(fā)明人】M·特勞, E·威, J·R·博泰拉
【申請人】昆士蘭大學(xué)