與光學(xué)超分辨率圖案化相關(guān)的方法和組合物的制作方法【專利摘要】本公開提供了用于在基板上生成分子的超分辨率圖案的方法。在一個(gè)方面，本文公開了一種方法，其包括使多個(gè)瞬時(shí)結(jié)合的核酸探針與其各自靶標(biāo)接觸，其中所述靶標(biāo)被固定在基板上，檢測基板的衍射受限區(qū)域內(nèi)的選擇區(qū)域或選擇區(qū)域集合中的結(jié)合事件，和照射基板的衍射受限區(qū)域，其中所述探針包含光交聯(lián)劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述光交聯(lián)劑是3?氰基乙烯基咔唑?！緦＠f明】與光學(xué)超分辨率圖案化相關(guān)的方法和組合物[0001]相關(guān)申請(qǐng)[0002]本申請(qǐng)要求2013年12月15日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/916259(其各自的完整內(nèi)容通過引用并入本文）的權(quán)益。[0003]聯(lián)邦資助的研究[0004]本發(fā)明是在美國國立衛(wèi)生研究院授予的撥款號(hào)1DP20D007292-01下的政府支持的情況下進(jìn)行的。政府在本發(fā)明中具有某些權(quán)利。[0005]背景[0006]現(xiàn)代分子生物學(xué)的標(biāo)志是在分子尺度上操作和觀察生物系統(tǒng)的能力。操作和觀察的精度經(jīng)常決定可W獲得的知識(shí)的清晰度、質(zhì)量和置信度。打破光的衍射限制的超分辨率成像方法已經(jīng)允許研究人員"看到先前看不見的東西"，并在深得多的水平獲得桐察力。[0007]概述[000引本發(fā)明提供了允許W納米精度光學(xué)操作分子的方法。迄今為止，標(biāo)記(和進(jìn)一步操作且由此研究）小規(guī)定的目標(biāo)區(qū)域(諸如5nmX5nm目標(biāo)區(qū)域）中的祀標(biāo)諸如祀蛋白質(zhì)、同時(shí)還不無差別標(biāo)記短距離(例如，l0nm)遠(yuǎn)的另一祀標(biāo)是有挑戰(zhàn)性的。本文提供了用于超分辨率標(biāo)記的方法，其設(shè)及超分辨的光學(xué)標(biāo)記和W納米精度擾動(dòng)分子祀標(biāo)。運(yùn)些方法允許研究人員"獲取先前不可接觸的東西"。該能力具有廣泛范圍的應(yīng)用，包括但不限于用于捕獲和鑒定細(xì)胞中在任意用戶指定的分子位置的蛋白質(zhì)祀標(biāo)的納米級(jí)單細(xì)胞空間蛋白質(zhì)組學(xué)，W及用于W納米精度活化/失活活神經(jīng)元上的用戶指定的位置的特定離子通道的納米級(jí)光遺傳學(xué)。[0009]本公開提供了用于就目標(biāo)分子或功能而言在兩個(gè)或=個(gè)維度圖案化基板的方法和組合物。本文提供的方法采用了具有化學(xué)(其允許與祀標(biāo)瞬時(shí)結(jié)合相互作用（例如，參與與探針的序列特異性結(jié)合相互作用的表面綴合的核酸））的探針，和光交聯(lián)劑和/或光可裂解的接頭。該方法進(jìn)一步包括檢測結(jié)合事件，隨后在特定條件下（例如，僅當(dāng)單一期望的結(jié)合事件發(fā)生時(shí)）照射基板。該過程在本文被稱為反饋過程(或系統(tǒng)），因?yàn)槠錇闆Q定并控制照射事件的時(shí)機(jī)的結(jié)合事件本身的發(fā)生。[0010]在一個(gè)方面，本文公開了運(yùn)樣的方法，其包括使多個(gè)瞬時(shí)結(jié)合的核酸探針與其各自祀標(biāo)接觸，其中所述祀標(biāo)被固定在基板上，檢測基板的衍射受限區(qū)域內(nèi)的選擇區(qū)域或選擇區(qū)域集合中的結(jié)合事件，和照射基板的衍射受限區(qū)域，其中所述探針包含光交聯(lián)劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述光交聯(lián)劑是3-氯基乙締基巧挫。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述基板的衍射受限區(qū)域用366皿至405皿光照射少于1秒或少于0.5秒。所述探針可W是序列和長度足W實(shí)現(xiàn)瞬時(shí)結(jié)合至祀標(biāo)的探針。本文提供了探針序列基序的實(shí)例。[0011]在另一個(gè)方面，本文公開了運(yùn)樣的方法，其包括使多個(gè)瞬時(shí)結(jié)合的核酸探針與其各自祀標(biāo)接觸，其中所述祀標(biāo)被固定在基板上，檢測基板的衍射受限區(qū)域內(nèi)的選擇區(qū)域中的結(jié)合事件，和照射基板的衍射受限區(qū)域，其中所述探針具有發(fā)夾二級(jí)結(jié)構(gòu)，且沿著其長度具有光可裂解的接頭或間隔區(qū)(使得所述接頭或間隔區(qū)的斷裂將誘導(dǎo)鏈中的共價(jià)斷裂）。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述光可裂解的接頭包含1-(2-硝基苯基）乙基。在一些實(shí)施方案中，所述基板的衍射受限區(qū)域用具有等于或小于405皿的波長的光照射，任選少于1秒或少于0.5秒。所述探針可W包含立足點(diǎn)（即，在結(jié)合至祀標(biāo)前是單鏈且由其結(jié)合至祀標(biāo)的核巧酸序列）。所述立足點(diǎn)可W具有類似于標(biāo)準(zhǔn)"用于納米級(jí)形勢中的成像的點(diǎn)積聚（PointsAc州mulationforImaginginNanoscaleTopogra地y,PAINT)"探針的特征的特征，包括特定結(jié)合能量(當(dāng)結(jié)合至祀標(biāo)時(shí)），其進(jìn)而取決于序列和長度。[0012]在前述方面，如果選擇區(qū)域中的結(jié)合事件是整個(gè)衍射受限區(qū)域中的唯一結(jié)合事件，則發(fā)生照射步驟。在運(yùn)方面，如果結(jié)合事件觸發(fā)照射步驟(或事件），則其可W在本文被稱為"唯一"結(jié)合事件W意指，其為衍射受限區(qū)域中的唯一結(jié)合事件。如果與選擇區(qū)域中的結(jié)合事件同時(shí)檢測其它結(jié)合事件，則不發(fā)生照射。W該方式，探針僅附接至衍射受限區(qū)域內(nèi)的選擇區(qū)域，而不附接至其它區(qū)域。[0013]在一些情況下，所述探針和祀標(biāo)之間的結(jié)合的瞬時(shí)性質(zhì)決定待使用的光交聯(lián)劑和光可裂解的接頭的性質(zhì)。所述光交聯(lián)劑和光可裂解的接頭通?？蒞用短激光脈沖持續(xù)時(shí)間W~lW/cm2(或更小）至千瓦/cm2范圍內(nèi)的功率密度進(jìn)行活化，其進(jìn)而意味著它們可W在非常短的時(shí)間段內(nèi)用通常用于生物成像應(yīng)用諸如隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微鏡(STORM)超分辨率成像的標(biāo)準(zhǔn)且廉價(jià)的激光器進(jìn)行活化。運(yùn)是重要的，因?yàn)樗鎏结樅挽霕?biāo)之間的結(jié)合僅發(fā)生短時(shí)間段，并且可W希望避免所圖案化的基板或先前圖案化的探針或其載荷的照射損傷。如本文所使用，所述光交聯(lián)劑和光可裂解的接頭的活化意欲分別形成共價(jià)加合物和鍵的裂解。[0014]待圖案化的基板的選擇區(qū)域可W比所述衍射受限區(qū)域更小。待圖案化的基板的選擇區(qū)域可W具有(或可W不具有)運(yùn)樣的特征或區(qū)域，其局部具有比其對(duì)應(yīng)的衍射受限區(qū)域的面積(或體積)更小的面積(或體積）。在一些實(shí)施方案中，待圖案化的選擇區(qū)域不比衍射受限區(qū)域更小，并且相反，其可W含有比直接衍射受限區(qū)域更小的特征(其可W連接或可W不連接）?；诳蒞使用超分辨率顯微鏡觀察探針的精度和準(zhǔn)確度確定探針是否位于任意二維或=維選擇區(qū)域(其可W在本文被稱為模版）。因此，可W使用大小尺度低于衍射限值的具有幾何定義特征的圖案化模板。[0015]應(yīng)當(dāng)理解的是，照射步驟在檢測到期望的結(jié)合事件之后不久發(fā)生。檢測和照射之間的時(shí)間可W是毫秒的量級(jí)。所述方法可W是自動(dòng)化的，并且可W采用CCD或EMCCD相機(jī)來檢測衍射受限區(qū)域內(nèi)的結(jié)合事件。所述方法還可W采用激光點(diǎn)照射器或數(shù)字微鏡裝置(DMD)陣列。如果使用DMD陣列，則可W監(jiān)測且同時(shí)或并行圖案化多個(gè)衍射受限區(qū)域。[0016]在一些實(shí)施方案中，所述探針進(jìn)一步包含巧光團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，所述巧光團(tuán)是ATT0655、Alexa647或其它亮巧光團(tuán)。如本文所使用，"亮巧光團(tuán)"是指發(fā)射足夠數(shù)目的光子、使得CCD或EMCCD相機(jī)能夠檢測單一結(jié)合事件的巧光團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，所述巧光團(tuán)是釋放至少或約1〇4-1〇6個(gè)光子的巧光團(tuán)。在一些實(shí)施方案中，Trolox、b-琉基乙醇(BME)、k半脫氨酸甲醋化-切S-ME)、環(huán)辛四締(COT)、沒食子酸正丙醋、1，4-二氮雜雙環(huán)[2.2.2]辛燒(DABC0)或琉基乙胺(MEA)和其它試劑可染料的氧化還原永久光漂白率存在于成像緩沖液中（例如，通過清除反應(yīng)性氧種類(R0S)如單線態(tài)氧），因此增加染料光子輸出和定位精度）。通常，所使用的巧光團(tuán)的激發(fā)和發(fā)射波長在用于活化光交聯(lián)劑或光可裂解的接頭的波長范圍之外。在一些實(shí)施方案中，所述探針進(jìn)一步包含官能團(tuán)或部分。在一些實(shí)施方案中，所述官能團(tuán)或部分是化學(xué)柄(chemicalhandle)。在一些實(shí)施方案中，所述官能團(tuán)或部分是生物素、抗生物素蛋白或納米顆粒。在一些實(shí)施方案中，所述官能團(tuán)或部分是烘控或疊氮化物(例如，用于"點(diǎn)擊化學(xué)"）。在一些實(shí)施方案中，所述官能團(tuán)或部分用于將載荷附接至基板。所述載荷可W是通常用于半導(dǎo)體工業(yè)中的光刻中的化學(xué)化合物。運(yùn)樣的化學(xué)化合物的實(shí)例是PDMS或PMMA。[0017]在一些實(shí)施方案中，所述基板的選擇區(qū)域是所述基板的選擇面積或選擇體積。所述選擇區(qū)域可W是最終用戶預(yù)定的區(qū)域或圖案(例如，最終用戶希望將具體目標(biāo)載荷沉積于其中或其上的區(qū)域）。所述區(qū)域可W是面積或體積。所述圖案可W是二維的或=維的。在后一種情況下，所述基板可W是小室(cell)或其它=維部分。[0018]在一些情況下，所述衍射受限區(qū)域包含在其整個(gè)面積或體積相對(duì)均勻結(jié)合的多個(gè)祀標(biāo)。W該方式，基板可W制備成包含結(jié)合至其表面中的一個(gè)或多個(gè)和其體積中的一個(gè)或多個(gè)的祀標(biāo)，并且可W處理W生成如本文提供的超分辨率圖案。結(jié)合至基板的祀標(biāo)可W是彼此相同的或者它們可W是不同的。如果不同，則可W存在附接至基板的2-1000個(gè)祀標(biāo)群體。任何給定的衍射受限區(qū)域可W包含1-1000個(gè)祀標(biāo)群體。在一些情況下，所述祀標(biāo)可W提供為結(jié)合至具有催化特性的膠體金顆粒(例如5nmAu納米顆粒)或氧化鐵納米顆粒的寡核巧酸。[0019]在一些實(shí)施方案中，其中去除結(jié)合至基板的選擇區(qū)域之外的祀標(biāo)的探針(例如，在與其各自祀標(biāo)解離之后洗掉）。[0020]上述方法可W用于生成目標(biāo)部分的圖案，例如通過在結(jié)合至祀標(biāo)之前或之后將目標(biāo)部分綴合至探針。如本文所述，所述圖案可W具有超分辨率維度（即，小于光學(xué)檢測系統(tǒng)的分辨率限值的維度）。例如，所述圖案可W具有維度小于衍射受限分辨率的特征或組分(并且因此位于衍射受限區(qū)域內(nèi)，其可W-維是例如幾百納米）。[0021]本發(fā)明的運(yùn)些和其它方面和實(shí)施方案將描述于本文中且被認(rèn)為是本公開的部分。[0022]附圖簡述[0023]圖1舉例說明本公開的包括使用探針的光交聯(lián)和探針的經(jīng)由光裂解的動(dòng)力學(xué)俘獲的各個(gè)方面和實(shí)施方案。[0024]圖2舉例說明超分辨率標(biāo)記(操作-PAINT)。[0025]圖3A-F舉例說明DNA-PAINT概念和高空間分辨率成像。（A-E)修改自Rust等人1。[0026]圖4A-C舉例說明（A)操作-PAINT機(jī)制，（B)光交聯(lián)基質(zhì)，和(C)CNVK光交聯(lián)批量實(shí)驗(yàn)。[0027]圖5舉例說明使用矩形DNA折權(quán)結(jié)構(gòu)為操作-PAINT設(shè)基準(zhǔn)。[0028]圖6A和B舉例說明（A)操作-PAINT自動(dòng)獲取、處理和驅(qū)動(dòng)軟件，和(B)通過DMD陣列的活化激光空間控制。[0029]圖7舉例說明光裂解。[0030]圖8舉例說明3DDNA-PAINT超分辨率成像口9'創(chuàng)。[0031]圖9A-E舉例說明細(xì)胞中的操作-PAINTd(A，B)細(xì)胞祀標(biāo)的2D(A)和3D(B)DNA-PAINT成像的初步工作n23;(C，D)3D操作-PAINT原位展示。（C)使用3D-操作-PAINT用獨(dú)特的DNA分子修飾3D納米結(jié)構(gòu)（固定在細(xì)胞表面上）的指定頂點(diǎn)。（D)使用旋轉(zhuǎn)盤共聚焦系統(tǒng)在整個(gè)全細(xì)胞體積用3D-操作-PAINT位點(diǎn)特異性修飾微注射的3D納米結(jié)構(gòu)?；￤20nm的間隔標(biāo)記用DNA偶聯(lián)的抗體標(biāo)記的微管網(wǎng)絡(luò)的操作-PAINT。[0032]圖10舉例說明納米級(jí)單細(xì)胞空間蛋白質(zhì)組學(xué)。[0033]圖11舉例說明單離子通道操作。[OOW詳述[0035]超分辨率成像方法是本領(lǐng)域中已知的，且包括但不限于隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微術(shù)(STORM)U哺用于納米級(jí)形勢中的成像的點(diǎn)積聚(PAINT盧'S3。本文提供的超分辨率標(biāo)記方法部分基于運(yùn)樣的超分辨率成像方法（圖2A)。簡言之，在DNA-PAINT中，將樣品用短(8-至9-ntr對(duì)接鏈"（圖2A中的鏈a)修飾，并且溶液含有巧光團(tuán)（描述為星號(hào))標(biāo)記的"成像劑鏈"(a*)。成像劑鏈可W瞬時(shí)結(jié)合至對(duì)接鏈，在全內(nèi)反射(TIR)成像下使之明亮。成像劑鏈的重復(fù)、瞬時(shí)結(jié)合將對(duì)接鏈在亮和暗狀態(tài)之間隨機(jī)轉(zhuǎn)換，并且使得能夠通過一次相繼和精確定位一個(gè)對(duì)接鏈而將運(yùn)些鏈超分辨率成像。DNA-PAINT可用于W小于10-nm分辨率顯現(xiàn)固定細(xì)胞中的蛋白質(zhì)也已經(jīng)獲得高密度、超分辨率圖像，其設(shè)及DNA納米結(jié)構(gòu)上隔開僅5nm的對(duì)接鏈(圖2A，右側(cè)）。[0036]為了實(shí)現(xiàn)超分辨率標(biāo)記（圖2B)，例如用光交聯(lián)劑和綴合柄（圖2B中的b區(qū)段)修飾成像劑鏈。當(dāng)成像劑鏈存在于DNA-PAINT下的期望位置(即，結(jié)合至目標(biāo)區(qū)域中的對(duì)接鏈[用框描繪];圖2B中的情況(2))時(shí)，將成像劑鏈光交聯(lián)至對(duì)接鏈，然后用綴合柄修飾目標(biāo)區(qū)域中的對(duì)接鏈。然而，當(dāng)成像劑鏈位于目標(biāo)區(qū)域之外（圖2B中的情況(1))時(shí)，不會(huì)觸發(fā)交聯(lián)。該過程在本公開中被稱為"操作-PAINT"。運(yùn)些方法可W在核納米結(jié)構(gòu)、細(xì)胞和組織，包括固定的細(xì)胞和組織，和活細(xì)胞和細(xì)胞膜的背景下實(shí)施。[0037]操作-PAINT提供了廣泛實(shí)施平臺(tái)W實(shí)現(xiàn)細(xì)胞中的分子祀標(biāo)的納米級(jí)標(biāo)記和操作。操作-PAINT可W用于納米級(jí)單細(xì)胞空間蛋白質(zhì)組學(xué)，其中可W在用戶指定的位置特異性捕獲和標(biāo)記特定蛋白質(zhì)及其相關(guān)的伴侶（圖2C，頂部）。運(yùn)些蛋白質(zhì)然后可W使用單一蛋白質(zhì)指紋分析方法進(jìn)行鑒定（圖2C，底部），由此變性和拉伸各蛋白質(zhì)，用DNA對(duì)接鏈標(biāo)記特定氨基酸(例如，賴氨酸），并且超分辨率DNA-PAINT將生成光學(xué)幾何信號(hào)用于蛋白質(zhì)鑒定。操作-PAINT也可W用于納米級(jí)光遺傳學(xué)，其中分子擾動(dòng)劑(例如，阻斷離子通道的lumitoxin)將遞送至神經(jīng)元上的用戶指定的離子通道，由此使得能夠W納米精度特異性光學(xué)活化/失活離子通道（圖2D)。操作-PAINT也可用于位點(diǎn)特異性祀標(biāo)標(biāo)記和純化、擾動(dòng)和位點(diǎn)特異性祀標(biāo)上的載荷，等。[0038]本公開提供了整合的超分辨率顯現(xiàn)和標(biāo)記方法。該方法基于短寡核巧酸的瞬時(shí)結(jié)合的超分辨率顯現(xiàn)，和運(yùn)些寡核巧酸的實(shí)時(shí)位點(diǎn)特異性活化而用于化學(xué)修飾。先前已經(jīng)用超高空間分辨率(<5nm)和超高多路功率（多達(dá)10種顏色)表明使用DNA-PAINT3的超分辨率成像本公開通過整合實(shí)時(shí)顯現(xiàn)和活化而延伸了運(yùn)樣的方法。活化步驟經(jīng)由光反應(yīng)性化學(xué)實(shí)現(xiàn)，包括使用包含光裂解和光交聯(lián)的堿基的短寡核巧酸。[0039]因此，如從上述將理解，在某些超分辨率成像方法中，探針，瞬時(shí)、而不是穩(wěn)定，結(jié)合至其祀標(biāo)。如果基板(或階段)在圖像獲取過程中移動(dòng)，則可W連續(xù)地(例如，使用時(shí)間推移技術(shù))或串聯(lián)地（用例如隨后的比對(duì)和重疊），任選地用漂移校正，獲取圖像。用于漂移校正的方法是本領(lǐng)域中已知的。所得圖像然后可W用于定義探針結(jié)合，因此定位位置。[0040]探針結(jié)合的瞬時(shí)性質(zhì)允許最終用戶辨別更多祀位置，包括位于給定光學(xué)檢測系統(tǒng)的分辨率限值內(nèi)的特別重要的祀位置。因此，使用常規(guī)的穩(wěn)定結(jié)合探針，彼此分開小于所使用的光學(xué)檢測系統(tǒng)的分辨率限值的兩個(gè)祀位置不會(huì)被辨別為兩個(gè)分開的位置。然而，如果使用瞬時(shí)結(jié)合探針，有更大可能性的是，在任何給定時(shí)間，兩個(gè)祀位置之一將不會(huì)被其相應(yīng)的探針結(jié)合。僅當(dāng)單一祀位置結(jié)合至其相應(yīng)的探針時(shí)，然后才可W獲得圖像，并且運(yùn)些圖像的編譯將使兩個(gè)祀位置呈現(xiàn)為分開的位置。[0041]本發(fā)明采用超分辨率成像技術(shù)，并且在其上構(gòu)建W便W超分辨率水平圖案化基板。W超分辨率維度圖案化基板的能力具有各種應(yīng)用，包括光刻。此外，由于可W用多種載荷負(fù)載各探針，所W本發(fā)明也促進(jìn)各種載荷的圖案化。[0042]探針[0043]待用于本發(fā)明的方法中的探針可W是能夠結(jié)合至目標(biāo)祀標(biāo)的任何部分。在一些情況下，所述探針可W特異性結(jié)合至祀標(biāo)（即，其對(duì)于一種祀標(biāo)具有較高的親和力或有效唯一親和力）。[0044]所述祀標(biāo)可W是核酸、蛋白質(zhì)和其它生物和非生物實(shí)體。在一些實(shí)施方案中，所述祀標(biāo)(或?qū)游稽c(diǎn)）可W在基板上彼此的200nm內(nèi)。所述探針可W是核酸(例如，諸如寡核巧酸且包括適配子）、蛋白質(zhì)(例如，諸如抗體或抗體片段)等。在某些實(shí)施方案中，所述祀標(biāo)和探針是核酸，并且更具體是寡核巧酸。[0045]在重要實(shí)施方案中，所述探針是在室溫瞬時(shí)結(jié)合至其祀標(biāo)的核酸。在一些實(shí)施方案中，所述探針長度為7-12個(gè)核巧酸。在一些實(shí)施方案中，所述探針長度為約9個(gè)核巧酸。在一些實(shí)施方案中，所述探針被巧光標(biāo)記。當(dāng)使用該長度的寡核巧酸時(shí)，所述寡核巧酸及其祀標(biāo)之間的結(jié)合強(qiáng)度降低，因此它們比結(jié)合至其祀標(biāo)的更長寡核巧酸更可能解離。在室溫，長度為約8個(gè)或約9個(gè)核巧酸的寡核巧酸和祀?yún)^(qū)域與彼此僅瞬時(shí)結(jié)合。如本領(lǐng)域中將理解，在較高溫度，寡核巧酸和祀?yún)^(qū)域的長度將通常增加，W實(shí)現(xiàn)相同的結(jié)合/解離動(dòng)力學(xué)。運(yùn)樣的長度可W范圍為，但不限于，約5個(gè)核巧酸至30個(gè)核巧酸，或約7個(gè)核巧酸至約25個(gè)核巧酸，或約9個(gè)核巧酸至約21個(gè)核巧酸。所述探針可W在本文被稱為成像劑鏈，且所述祀標(biāo)可W是對(duì)接鏈或可W綴合至對(duì)接鏈，所述對(duì)接鏈與成像劑鏈互補(bǔ)。因此，所述祀標(biāo)可W是對(duì)接鏈，或者其可W是已經(jīng)修飾W包含對(duì)接鏈的另一種目標(biāo)試劑。[0046]所述探針和祀標(biāo)可W基于它們的相互作用的結(jié)合能來設(shè)計(jì)。因此，在一些情況下，所述探針和祀標(biāo)之間的結(jié)合相互作用可W被定義為在25°C具有約-6.92kcal/mol的AG的結(jié)合能。ah(洽）可W是約-58kcal/摩爾，且AS(賭）可W為約-0.171kcalAK?mol)。運(yùn)些結(jié)合能假定包含約50mM至約1M化Cl的結(jié)合環(huán)境(例如，雜交環(huán)境）。如果在較高溫度(例如，體溫)發(fā)生結(jié)合，則結(jié)合能AG(在37°C)為約-4.8化cal/mol。因此，所述探針和祀標(biāo)可W被設(shè)計(jì)成實(shí)現(xiàn)在運(yùn)些量或約運(yùn)些量的結(jié)合能。[0047]應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步理解的是，所述探針可W包含核酸或由核酸組成，并且所述祀標(biāo)可W包含核酸或由核酸組成。例如，所述探針可W是核酸和另一部分諸如蛋白質(zhì)的綴合物。在核酸中促進(jìn)基板上的相互作用和固定化?；蛘撸绻鎏结樖蔷哂谢瘜W(xué)柄的核酸，則可W在固定化后使用運(yùn)樣的化學(xué)柄，W便在基板上的特定區(qū)域附接另一部分，諸如例如蛋白質(zhì)。[0048]所述探針將如本文所述用例如官能團(tuán)或部分進(jìn)一步修飾。所述官能團(tuán)或部分的性質(zhì)將取決于具體應(yīng)用。實(shí)例包括結(jié)合伴侶諸如生物素和抗生物素蛋白，納米顆?；蛭⒘?，其它形式的載荷，和化學(xué)基團(tuán)諸如烘控或疊氮化物等。[0049]圖案化方法[0050]本公開的各個(gè)方面將超分辨率成像方法，諸如隨機(jī)光學(xué)重構(gòu)顯微術(shù)(STORM)W和用于納米級(jí)形勢中的成像的點(diǎn)積聚（PointsAccumulationforImaginginNanoscaleTopogra曲y，PAINT)[2'33轉(zhuǎn)化為高通量光刻工具，其允許W可W光學(xué)分辨它們的相同分辨率圖案化分子。[0051]光交聯(lián)方法[0052]在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了用于交聯(lián)PAINT探針的方法、產(chǎn)品和裝置。在一些實(shí)施方案中，將所述探針光交聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，將運(yùn)樣的探針交聯(lián)，包括光交聯(lián)，至結(jié)合伴侶諸如互補(bǔ)結(jié)合伴侶。[0053]在一些實(shí)施方案中，所述探針包含交聯(lián)劑諸如光交聯(lián)劑。所述交聯(lián)劑，包括光交聯(lián)劑，可W位于探針的末端(例如，5'末端或3'末端），或者它可W在內(nèi)部位置。在一些實(shí)施方案中，所述交聯(lián)劑，包括光交聯(lián)劑，可W位于探針的中屯、附近或探針的中屯、(例如，相對(duì)于其長度）。所述探針可W包含一種或多種交聯(lián)劑。[0054]在一些實(shí)施方案中，所述交聯(lián)劑是光交聯(lián)劑。可W根據(jù)本公開使用的光交聯(lián)劑的實(shí)例是3-氯基乙締基巧挫。其它交聯(lián)劑，包括光交聯(lián)劑（例如，肉桂酸醋，面化堿諸如5-漠加，補(bǔ)骨脂素），是本領(lǐng)域中已知的，并且可W在其它實(shí)施方案中與本公開放在一起。[0055]一個(gè)方面組合超分辨率成像技術(shù)諸如PAINT[2'33與交聯(lián)技術(shù)，諸如與3-氯基乙締基巧挫核巧(?Vk)化學(xué)物的光化學(xué)交聯(lián)該組合然后進(jìn)一步與光源組合，所述光源諸如例如激光點(diǎn)照射器諸如例如在>20化操作的照射器W，或具有例如約103至106個(gè)單獨(dú)可編程鏡子(用于大規(guī)模并行點(diǎn)照射)的數(shù)字微鏡顯示器(DMD)陣列通過整合運(yùn)些要素，生成快速基于激光的反饋系統(tǒng)，其利用CCD相機(jī)輸入永久固定(?Vk)-標(biāo)記的探針諸如PAINT探針，其為二維表面上或S維體積中被隨機(jī)相繼吸附/添加（RSA)放置的瞬時(shí)占據(jù)對(duì)接位占[U-13]V林〇[0056]對(duì)接位置通常存在于圖案化基板的面積或體積內(nèi)，其在可用用于巧光團(tuán)定位的CCD相機(jī)觀察的全內(nèi)反射巧光(TIR巧消散場內(nèi)。[0化7]。典型"的CCD相機(jī)視場(F0V)為約>50皿2(例如，用AndoriXon897EMCCD相機(jī)[14]，其具有512X512個(gè)像素的陣列），并且可W使用>4兆像素（2048X2048像素陣列）〇1^曰-Flash4.0V2ScientificCMOSCCD[i5]合理地?cái)U(kuò)大至>150皿2至>200皿2面積。然而，運(yùn)些F0V可W使用一些現(xiàn)有技術(shù)擴(kuò)大，所述技術(shù)包括用于光響應(yīng)非均勻性（Photo-ResponseNon-Uniformity，PRNU)的校準(zhǔn)和校正慣例，其允許使用較低物鏡（即，每衍射受限面積的較少像素及提高CCD相機(jī)探測器量子效率和像素密度。運(yùn)些應(yīng)當(dāng)為針對(duì)高分辨率單分子定位和圖案化縮放可工作探測器F0V提供了重要的機(jī)會(huì)。[0058]關(guān)于=維體積中的圖案化的事情，沿著可W圖案化的焦平面的Z-軸的程度（即，可及的"場深度"）和對(duì)于圖案化可實(shí)現(xiàn)的分辨率，取決于各種=維超分辨率方法可W如何好地分辨巧光目標(biāo)。為此，通過將RafaelPiestun的雙螺旋點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（Double-HelicalPointSpread化nction，DH-PSF)[n]應(yīng)用于S維超分辨率成像技術(shù)諸如STORM(或STORM的蛋白質(zhì)變體，光活化的定位顯微術(shù)(PALM)W4iMoerner等人能夠沿著X-、廠和Z-軸經(jīng)>2皿場深度對(duì)單一巧光分子表明各向同性>10皿至>200皿分辨率W'W，并且還提取>10度的標(biāo)準(zhǔn)偏差內(nèi)的(Z，0，(1))染料取向參數(shù)。運(yùn)對(duì)于像散性和多平面[23'W方法實(shí)現(xiàn)的巧光染料定位分別超過>600nm場深度和皿場深度，并且通常經(jīng)短或長場深度范圍超過任一方法的3-空間分辨率因此，運(yùn)些方法可W用于本公開的方法中。[0059]本公開的某些方法使用CCD相機(jī)輸入W引導(dǎo)激光反饋系統(tǒng)，W"冷凍"隨機(jī)巧光探針結(jié)合相互作用，由此允許最終用戶通過附接至巧光團(tuán)的分子或顆粒的任意復(fù)雜圖案的構(gòu)建而走到賭梯度。使用巧光探針定位的該反饋方案，隨機(jī)閃爍激光W原位鎖定探針將引起潛在探針對(duì)接位點(diǎn)的集合的統(tǒng)一且隨機(jī)的圖案化。[0060](?Vk)[4^73核巧可W并入PAINT[2'33探針序列，優(yōu)先在給定探針的中屯、附近，W盡可能提高熱力學(xué)穩(wěn)定性。優(yōu)選地，喀晚堿基(最佳為胸腺喀晚、尿喀晚或甲基胞喀晚乍為探針上的（?k)插入立即上游的核巧酸的Watson-化ick互補(bǔ)物而存在于修飾探針的對(duì)接位點(diǎn)上。[0061](?Vk)交聯(lián)反應(yīng)對(duì)于側(cè)接插入位點(diǎn)的最近核巧酸是敏感的[4'7^。在W下核巧酸背景下，[0062](5'-...X(?Vk)-Y...-3'）[0063](3'-...X'----Z-Y'...-5'）.[0064]X'是與(?k)基團(tuán)共價(jià)交聯(lián)的喀晚基團(tuán)，Z核巧位于(?Vk)雙鏈體插入的相對(duì)側(cè)，但不直接參與交聯(lián)反應(yīng)，而Y/Y'Watson-化ick堿基對(duì)經(jīng)由與(?k)/Z假-堿基對(duì)的堆積相互作用影響交聯(lián)反應(yīng)。如果X'=T或U(運(yùn)對(duì)于喀晚堿基交聯(lián)祀標(biāo)是最佳選擇），則Z和Y的選擇可W具有較少影響[4'7^。甲基化的胞喀晚可W充當(dāng)類似有效的交聯(lián)祀標(biāo)(即，X'=Cm)W。[0065]對(duì)于特定X'=T實(shí)例W下雜交的寡核巧酸的配對(duì)在使用基于UVL邸燈的光源用>1.5W/cm2的功率密度W>366nm照射<1秒之后得到>50%光交聯(lián)得率^'7]:[0066]5'-TGCA?\TCGT-3'[0067]3'-ACGT--GAGCA-5'。[0068]因此，探針可W包含W下序列或由W下序列組成：[0069]5'-TGCA?\TCGT-3'[0070]且對(duì)應(yīng)祀標(biāo)可W包含W下序列或由W下序列組成：[0071]3'-ACGT-GAGCA-5\[0072]運(yùn)樣的探針-祀標(biāo)對(duì)的能量近似值如下：[0073]AH(0.01M至1MNaCl)::-49.4kcal/mol,[0074]AS(1MNaCl):：-0.134kcal/(K*mol),[0075]AG(1MNaCl，25°C)::-9.57kcal/mol，且[0076]AG(1MNaCl，37°C)::-7.96kcal/mol。[0077]在一些實(shí)施方案中，為了使探針更適合于PAINT，可W通過操作溶液的一價(jià)離子濃度而改變AG值。例如，可W降低化C1一價(jià)離子的濃度W降低該序列的熱穩(wěn)定性，或者可替代地，可W增加NaCl濃度W補(bǔ)償由于引入(?Vk)基團(tuán)導(dǎo)致的不穩(wěn)定影響。[0078]經(jīng)由1-(2-硝基苯基)乙基光裂解的動(dòng)力學(xué)俘獲[0079]本公開的其它方面是本文描述的光交聯(lián)實(shí)施方案的變型。在一個(gè)運(yùn)樣的變型中，將光可裂解間隔區(qū)諸如1-(2-硝基苯基）乙基光可裂解間隔區(qū)商購自Ambergen)插入PAINT[2'33探針的發(fā)夾變體中。運(yùn)允許使用基于激光的反饋系統(tǒng)W便在所需位置和/或在所需時(shí)間原位動(dòng)力學(xué)俘獲隨機(jī)PAINT探針結(jié)合相互作用。光可裂解間隔基化學(xué)物是與3-氯基乙締基巧挫(?Vk)W-叫I多飾核巧的快速且直接光交聯(lián)的替代方案。[0080]可W用于該實(shí)施方案中的核酸的實(shí)例如下：[0081]5'-/5ATT0655N/TAGATGTATGGTCTG/iSpPC/CCGGACTTTTTTTTCAATGTATTTTTTTTGTCCGGCAGACCATACATCTATCTTCATTA-3'(沈QIDNO:1)[0082]其中75ATT0655N/"被定義為寡核巧酸上的共價(jià)綴合的ATT0655染料的位置的指示符，且ViSpPC/"被定義為使用例如1-(2-硝基苯基）乙基化學(xué)物的光可裂解間隔區(qū)的位置的指示符UU。該探針具有74個(gè)核巧酸的長度，并且包含長度為9個(gè)核巧酸的立足點(diǎn)(粗體序列）。[0083]本公開的方面和實(shí)施方案在圖1中舉例說明，其在下面更詳細(xì)描述。如圖中所示，本文提供的方法可用于在基板上W預(yù)定的（和潛在任意的）圖案放置特定目標(biāo)化學(xué)柄(在圖底部通過5角星表示）。該圖頂部舉例說明其內(nèi)任意圖案W粗"彎曲矩形"表示的衍射受限區(qū)域。圖中舉例說明的過程的最終結(jié)果是使用目標(biāo)部分生成預(yù)定圖案，如右上框中所示。[0084]中間小圖舉例說明可W如何使用光交聯(lián)來實(shí)現(xiàn)圖案。左小圖舉例說明基板上存在祀標(biāo)。在該情況下，所述祀標(biāo)是單鏈核酸。作為一個(gè)實(shí)例，單鏈核酸可W存在于沿著面積相對(duì)均勻分布的5nm膠態(tài)金顆粒上。所述探針還是具有一端的巧光團(tuán)且另一端的化學(xué)柄的單鏈核酸。應(yīng)當(dāng)理解的是，化學(xué)柄僅僅代表任何目標(biāo)官能團(tuán)或部分。所述探針進(jìn)一步包含3-氯基乙締基巧挫的形式的光交聯(lián)劑。所述光交聯(lián)劑作為寡核巧酸探針的修飾核巧的部分存在。當(dāng)探針結(jié)合至其祀標(biāo)(在核酸祀標(biāo)和探針的情況下通常通過Watson-Crick雜交），革己標(biāo)的位置作為從探針上的巧光團(tuán)發(fā)射的結(jié)果是顯而易見的。如果祀標(biāo)位于預(yù)定目標(biāo)區(qū)域(在圖中被稱為"模版"）中，且重要地，如果其在當(dāng)時(shí)是唯一檢測的結(jié)合事件，則整個(gè)區(qū)域?qū)⒈徽丈洌瑢?dǎo)致僅在目標(biāo)區(qū)域形成祀標(biāo)和探針之間的共價(jià)鍵。在舉例說明的實(shí)例中，生成3-氯基乙締基巧挫及其對(duì)接位點(diǎn)（胞喀晚堿基的形式)之間的共價(jià)光加合物。因此，經(jīng)由運(yùn)樣的共價(jià)鍵結(jié)合固定探針，如同其載荷一樣。照射也用于光漂白巧光團(tuán)，或者可替代地更接近于巧光團(tuán)的波長的照射可用于完成運(yùn)一點(diǎn)，使得該過程可W重復(fù)多次W便將額外探針固定于目標(biāo)區(qū)域中，而不受先前固定的探針的干擾。在該具體情況下，可W通過用366-405nm的波長照射少于1秒或少于0.5秒來實(shí)現(xiàn)光交聯(lián)。應(yīng)當(dāng)理解的是，僅當(dāng)在衍射受限區(qū)域中檢測到單一結(jié)合事件時(shí)才發(fā)生照射，并且結(jié)合事件存在于目標(biāo)區(qū)域中。如果在目標(biāo)區(qū)域之外檢測到結(jié)合事件，則不發(fā)生照射。在模板面積(或體積)之外結(jié)合至祀標(biāo)的任何探針僅瞬時(shí)結(jié)合，因此可W容易地經(jīng)由一次或多次洗涂去除。[0085]應(yīng)當(dāng)理解的是，可W使用其它光交聯(lián)劑和其它巧光團(tuán)，只要可W相對(duì)快速地活化光交聯(lián)劑(并且因此具有相對(duì)少的能量），并且巧光團(tuán)能夠發(fā)射足夠數(shù)目的光子，足W在相對(duì)短的時(shí)間段內(nèi)被檢測。因此應(yīng)當(dāng)理解的是，探針結(jié)合的動(dòng)力學(xué)，探針結(jié)合的檢測(作為巧光團(tuán)發(fā)射的結(jié)果），和光交聯(lián)劑活化都是相互關(guān)聯(lián)的。[0086]探針和祀標(biāo)也可W被設(shè)計(jì)為包括特定序列模式，W增強(qiáng)它們的結(jié)合和隨后的共價(jià)相互作用，如本文所述。[0087]底部小圖舉例說明可W如何使用光裂解來實(shí)現(xiàn)模式。再次，與中間小圖類似，左小圖舉例說明基板上存在祀標(biāo)。如舉例說明，所述祀標(biāo)具有兩個(gè)區(qū)域(核巧酸序列）。運(yùn)些區(qū)域之一與探針上化學(xué)柄(本文被稱為立足點(diǎn)）附近的特定區(qū)域(核巧酸序列)互補(bǔ)。另一區(qū)域與發(fā)夾探針上的另一特定區(qū)域互補(bǔ)。還舉例說明發(fā)夾探針在其未結(jié)合和結(jié)合狀態(tài)的結(jié)構(gòu)。所述發(fā)夾探針包括在一端的化學(xué)柄，在另一端的巧光團(tuán)，和在內(nèi)部位置的光可裂解的接頭。當(dāng)結(jié)合至基板上的其祀標(biāo)(通過通常從立足點(diǎn)與祀標(biāo)的相互作用進(jìn)行的過程)時(shí)，祀標(biāo)的位置由從巧光團(tuán)的巧光發(fā)射表示。如果祀標(biāo)在預(yù)定目標(biāo)區(qū)域(模版）中，且如果在衍射受限區(qū)域中沒有檢測到其它結(jié)合事件，則整個(gè)區(qū)域?qū)⒈徽丈?，?dǎo)致發(fā)夾環(huán)的裂解和包含巧光團(tuán)的探針區(qū)域的釋放。在該情況下，經(jīng)由小于或等于405nm的照射，1-(2-硝基苯基）乙基接頭的閃光光裂解，生成熱穩(wěn)定的18聚體雙鏈體。如舉例說明，探針區(qū)域的釋放在所得相對(duì)固定的探針上生成單鏈區(qū)域。如圖中舉例說明，裂解之后，固定的探針可W具有"無癒痕5'憐酸醋"(例如，如果使用1-(2-硝基苯基）乙基接頭，如圖中舉例說明），意欲可W在連接反應(yīng)中使用運(yùn)樣的末端，例如，沒有進(jìn)一步修飾。[0088]設(shè)計(jì)立足點(diǎn)序列和長度，使得所述立足點(diǎn)的結(jié)合能足夠強(qiáng)，足W開始探針雜交至祀標(biāo)的過程，但不穩(wěn)定，足W仍然瞬時(shí)結(jié)合(從而實(shí)現(xiàn)超分辨率成像，因此如本文提供的模式化）。在一些情況下，立足點(diǎn)區(qū)域因此可W長度為約9個(gè)核巧酸或更少。[0089]應(yīng)當(dāng)理解的是，可W使用其它光可裂解的接頭和其它巧光團(tuán)，只要可W相對(duì)快速地活化光可裂解的接頭(并且因此W~IW/cm2至千瓦/cm2的功率密度用短持續(xù)時(shí)間激光脈沖），并且巧光團(tuán)能夠發(fā)射足夠數(shù)目的光子，足W在相對(duì)短的時(shí)間段內(nèi)被檢測。因此應(yīng)當(dāng)理解的是，探針結(jié)合的動(dòng)力學(xué)，探針結(jié)合的檢測(作為巧光團(tuán)發(fā)射的結(jié)果），和光可裂解的接頭活化都是相互關(guān)聯(lián)的。[0090]因此，如在本公開的背景下將理解，結(jié)合事件的期望性取決于衍射受限區(qū)域中的其位置(例如，（X，y)或(x，y，z))及其獨(dú)特性。[0091]本文提供的方法允許最終用戶替代選擇區(qū)域上的化學(xué)柄或標(biāo)志物。一旦在選擇區(qū)域中且僅在選擇區(qū)域中檢測到結(jié)合事件，則可W照射整個(gè)衍射受限區(qū)域，由此將探針固定至選擇區(qū)域。所述化學(xué)柄或標(biāo)志物可W是或可W用于附接例如納米顆粒(對(duì)于拉曼光譜)或珠粒(對(duì)于力光譜)或巧光顆粒(對(duì)于FACS)。[0092]等待(x，y)或(x，y，z)中的一些期望位置的探針結(jié)合事件、檢查探針是否僅在衍射受限區(qū)域中、然后是否如此、決定用激光將其共價(jià)附接至基板(在其結(jié)合位置)的能力，允許最終用戶在低于衍射限制的特定位點(diǎn)標(biāo)記部分。作為非限制性實(shí)例，所述標(biāo)記可W是可檢測標(biāo)記，或者它們可W是親和標(biāo)記。在光刻背景下，可W期望W模擬標(biāo)準(zhǔn)光刻技術(shù)(其改變衍射受限區(qū)域中的化學(xué)組成)的方式將大量標(biāo)記置于衍射受限區(qū)域中。[0093]在一些實(shí)施方案中，可W使用超快皮秒至飛秒激光脈沖W非常高功率密度(例如，使用〔〇116'6]11：'31'；[:3日郵11；['6畑日1116160]1叫1：抑11系統(tǒng)）[36]代替1]￥或近1]￥光（例如，405nm光）。運(yùn)允許使用"紅偏移"光（例如，吸收兩個(gè)810nm光子，至第一階近似，類似于W兩倍能量吸收一個(gè)405nm光子）。較長波長可W意指較少的對(duì)樣品的損傷，或背景巧光，并且還可W在例如組織或3D聚合物網(wǎng)絡(luò)中提供較深的穿透。[0094]用于本公開的方法中的蛋白質(zhì)的實(shí)例包括，但不限于，抗體(例如，單克隆單體）、抗原結(jié)合抗體片段(例如，化b片段）、受體、膚和膚適配子。[0095]如本文所使用，"抗體"包括全長抗體及其任何抗原結(jié)合片段(例如，"抗原結(jié)合部分"）或單鏈。術(shù)語"抗體"包括，但不限于，包含通過二硫鍵相互連接的至少兩條重化)鏈和兩條輕化)鏈的糖蛋白，或其抗原結(jié)合部分?？贵w可W是多克隆的或單克隆的；異種的、同種異體的或同基因的;或其修飾形式(例如人源化的、嵌合的）。[0096]如本文所使用，抗體的"抗原結(jié)合部分"是指保留特異性地結(jié)合至抗原的能力的抗體的一個(gè)或多個(gè)片段?？贵w的抗原結(jié)合功能可W由全長抗體的片段進(jìn)行。術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"內(nèi)涵蓋的結(jié)合片段的實(shí)例包括（i)Fab片段，由VH、VL、化和CHI結(jié)構(gòu)域組成的單價(jià)片段；（ii)F(ab'）2片段，包含通過二硫鍵在較鏈區(qū)連接的兩個(gè)化b片段的二價(jià)片段；（iii)由VH和CH1結(jié)構(gòu)域組成的Fd片段；（iv)由抗體的單一臂的VH和化結(jié)構(gòu)域組成的Fv片段，（V)dAb片段(Wardetal.，化ture341:544546，1989)，其由￥始吉構(gòu)域組成；和（￥1)分離的互補(bǔ)性決定區(qū)（CDR)或(vii)兩個(gè)或更多個(gè)分離的CDR的組合，其可W任選地通過合成接頭接合。而且，盡管Fv片段的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域VH和化由分開的基因編碼，但可W使用重組方法通過合成接頭將它們接合，所述接頭能夠使其成為單一蛋白質(zhì)鏈，其中VH和化區(qū)域配對(duì)W形成單價(jià)分子（被稱為單鏈Fv(scFv);參見，例如，Bird等人Science242:423426,1988;andHustonetal.Proc.化tl.Acad.Sci.USA85:5879-5883,1988)。運(yùn)樣的單鏈抗體也意欲涵蓋于術(shù)語抗體的"抗原結(jié)合部分"中?？蒞使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)獲得運(yùn)些抗體片段，并且篩選片段用于W與完整抗體相同的方式應(yīng)用。[0097]如本文所使用，"受體"是指結(jié)合至配體的源自細(xì)胞的分子(例如，蛋白質(zhì)），諸如，例如，膚或小分子(例如低分子量《900道爾頓)有機(jī)或無機(jī)化合物）。[009引如本文所使用，"膚適配子"是指可變膚序列插入恒定支架蛋白質(zhì)的分子(參見，例如，Baines1C,等人.DrugDiscov.Today11:3:34-341,2006))。[0099]如本文所使用，"核酸適配子"是指可W形成能夠特異性結(jié)合蛋白質(zhì)或其它細(xì)胞祀標(biāo)的二級(jí)和S級(jí)結(jié)構(gòu)的小RNA或DNA分子(參見，例如，NiX，等人.CurrMed化em.l8(27):4206-4214,2011)。[0100]可W用于本文描述的方法中的巧光標(biāo)記包括咕噸衍生物(例如巧光素、羅丹明、俄勒岡綠、伊紅和德克薩斯紅）、花青衍生物(例如花青、嗎I噪幾花青（indocarbo巧anine)、氧代幾花青（oxacarbocyanine)、硫雜幾花青（thiacarbo巧anine)和部花青）、糞衍生物（例如丹橫酷和普羅丹衍生物）、香豆素衍生物、嗯二挫衍生物(例如化晚基嗯挫、硝基苯嗯二挫和苯并嗯二挫）、巧衍生物（例如級(jí)聯(lián)藍(lán)）、嗯嗦衍生物（例如尼羅紅、尼羅藍(lán)、甲酪紫和嗯嗦170)、叮晚衍生物(例如原黃素、叮晚澄和叮晚黃）、芳基次甲基衍生物(例如金胺、結(jié)晶紫和孔雀綠）、和四化咯衍生物（例如化吩、獻(xiàn)菁和膽紅素）。在某些實(shí)施方案中，所述巧光團(tuán)是ATT0655或Alexa647或其它亮巧光團(tuán)（例如，發(fā)射至少104-106個(gè)光子的巧光團(tuán)）。[0101]在某些實(shí)施方案中，所述巧光團(tuán)是能夠被可逆或永久光漂白的巧光團(tuán)。[0102]下面將更詳細(xì)地描述各個(gè)方面和實(shí)施方案及其各種應(yīng)用。[0103]通過DNA-PAINT的超分辨率成像[0104]遠(yuǎn)場巧光顯微鏡近年來已經(jīng)看到真正復(fù)興，因?yàn)槌霈F(xiàn)了繞過經(jīng)典衍射限制的方法，即，超分辨率顯微術(shù)ns-W。超分辨率顯微術(shù)依賴于運(yùn)樣的事實(shí)，分子在有巧光和無巧光狀態(tài)之間'轉(zhuǎn)換'，W獲得亞衍射圖像分辨率。用于納米級(jí)形勢中的成像的點(diǎn)積聚(PAINT)W是用于隨機(jī)超分辨率成像的易于實(shí)施的方法，其中使用與樣品瞬時(shí)相互作用的擴(kuò)散分子進(jìn)行成像。一種實(shí)施PAINT的方式被稱為DNA-PAINT3,其中短巧光標(biāo)記的寡核巧酸('成像劑'鏈)與互補(bǔ)'對(duì)接'鏈的重復(fù)、瞬時(shí)結(jié)合將分子從暗狀態(tài)轉(zhuǎn)換至亮狀態(tài)(圖3A，3B)。當(dāng)成像劑鏈未被結(jié)合時(shí)，僅從樣品觀察到背景巧光；在成像劑鏈結(jié)合之后，使用全內(nèi)反射(TIR)或高度傾斜且層疊的光學(xué)片化ILO)43^照射檢測其巧光發(fā)射。該整合能夠W高度可調(diào)節(jié)的有巧光和無巧光時(shí)間（通過成像劑鏈結(jié)合強(qiáng)度和濃度設(shè)置)實(shí)現(xiàn)特定的模塊化的超分辨率成像。最近，DNA-PAINT的分辨率增加至體外合成DNA結(jié)構(gòu)的~10皿橫向成像分辨率(圖3C-3E)。使用先進(jìn)的漂移校正算法和仔細(xì)優(yōu)化的成像條件，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了高密度、超分辨率DNA-PAINT圖像，其中對(duì)接位點(diǎn)隔開僅~5nm(圖3F)。也已經(jīng)表明了合成納米結(jié)構(gòu)和固定細(xì)胞38的3D成像。[0105]2D中的操作-PAINT[0106]DNA-PAINT與光化學(xué)過程偶聯(lián)W永久固定瞬時(shí)結(jié)合的成像劑鏈，W實(shí)現(xiàn)具有納米級(jí)精度的可編程和位點(diǎn)特異性標(biāo)記。該方案的一種簡單的實(shí)施方式(圖4A)設(shè)及首先將綴合柄(例如生物素或另一單鏈DNA結(jié)構(gòu)域)和光交聯(lián)劑附接至成像劑鏈，然后當(dāng)成像劑鏈結(jié)合至目標(biāo)區(qū)域中的祀標(biāo)上的對(duì)接鏈時(shí)，觸發(fā)成像劑和對(duì)接鏈之間的快速光交聯(lián)反應(yīng)。該位置中的祀標(biāo)然后連接至綴合柄，并且可W進(jìn)一步操作或分析。當(dāng)對(duì)接鏈位于目標(biāo)區(qū)域的外側(cè)時(shí)，不會(huì)觸發(fā)交聯(lián)。[0107]在合成DNA納米結(jié)構(gòu)平臺(tái)上的超分辨率DNA探針捕獲。[010引光反應(yīng)性核堿基類似物3-氯基乙締基巧挫(?K心'45]可W用作光交聯(lián)劑（圖4B)。在含有g(shù)nvk的DNA雙鏈體中，UV光(350-405nm)可W誘導(dǎo)和相反鏈上的胸腺喀晚(T)或胞喀晚(C)之間的快速交聯(lián)，由此形成兩條鏈之間的共價(jià)連接。當(dāng)照射的強(qiáng)度足夠高時(shí)，光交聯(lián)可W在一秒內(nèi)進(jìn)行完全。如圖4C中所示，在1秒的365nm光暴露內(nèi)實(shí)現(xiàn)10-nt寡核巧酸和含有?^的互補(bǔ)寡核巧酸之間的有效交聯(lián)(>90%)。[0109]該系統(tǒng)可W使用矩形的DNA折權(quán)納米結(jié)構(gòu)進(jìn)行基準(zhǔn)化，所述矩形的DNA折權(quán)納米結(jié)構(gòu)充當(dāng)先前超分辨率成像方法中的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)品。32可W如下所述進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。[0110]矩形的DNA折權(quán)納米結(jié)構(gòu)W3X420nm柵格顯示12個(gè)對(duì)接鏈。為了表明超分辨的標(biāo)記，含有?Vk的成像劑鏈共價(jià)標(biāo)記至僅在4個(gè)角的對(duì)接鏈。具體地，所有對(duì)接鏈都含有相同的9-nt序列a，而巧光標(biāo)記的成像劑鏈含有兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：序列"a*"(基本上與V'互補(bǔ)，但含有?^修飾)和序列"b"。對(duì)于初始表征，每個(gè)視場僅分析一個(gè)DNA折權(quán)納米結(jié)構(gòu)。如圖5中所圖示舉例說明，該實(shí)驗(yàn)含有4個(gè)階段。（1)在定位階段，使用標(biāo)準(zhǔn)DNA-PAINT監(jiān)測成像劑鏈與DNA折權(quán)納米結(jié)構(gòu)上的對(duì)接鏈的結(jié)合。成像~10分鐘之后，可W確定并存儲(chǔ)DNA折權(quán)納米結(jié)構(gòu)上的所有12個(gè)對(duì)接鏈的位置。（2)在R0I選擇階段中，用戶指定待在下一步驟中修飾的對(duì)接位點(diǎn)（即，在R0I中，目標(biāo)區(qū)域）（表示為圓形）。（3)在標(biāo)記階段中，無論何時(shí)成像劑鏈結(jié)合所研究的DNA折權(quán)納米結(jié)構(gòu)上的對(duì)接鏈，將通過實(shí)時(shí)軟件程序迅速確定其定位，W決定其是否在角上。如果它是，則該軟件將觸發(fā)UV源的打開W誘導(dǎo)成像劑鏈和對(duì)接鏈之間的交聯(lián)。接下來，將遞送強(qiáng)激光脈沖W漂白交聯(lián)的成像劑鏈上的巧光團(tuán)。將重復(fù)該過程，直到所有4個(gè)角都被成像劑鏈標(biāo)記。（4)在分析階段中，洗掉初始成像劑鏈，并且添加具有序列"b*"的二級(jí)成像劑鏈。第二成像劑鏈將用于標(biāo)準(zhǔn)DNA-PAINT中W顯現(xiàn)交聯(lián)的初始成像劑鏈的位置。DNA折權(quán)納米結(jié)構(gòu)的僅4個(gè)角被預(yù)期'亮起來'。[0111]軟件。該方法將通常使用軟件進(jìn)行，所述軟件允許成像劑鏈的實(shí)時(shí)檢測、定位、選擇和交聯(lián)。合適的軟件滿足兩個(gè)要求。第一個(gè)要求是DNA-PAINT超分辨率圖像的實(shí)時(shí)檢測和處理。瞬時(shí)DNA-PAINT結(jié)合事件在定位階段過程中進(jìn)行檢測和定位。作為該處理慣例的部分校正隨著時(shí)間的任何階段漂移W確保高分辨率成像和祀向。第二個(gè)要求是基于上述信息的實(shí)時(shí)選擇和反饋。運(yùn)對(duì)于確保成像劑鏈結(jié)合至其各自對(duì)接鏈的短時(shí)間段過程中的成像劑鏈的交聯(lián)是必需的。該結(jié)合事件的瞬時(shí)性質(zhì)要求順利整合和實(shí)時(shí)進(jìn)行整個(gè)過程。應(yīng)當(dāng)盡可能減少由軟件計(jì)算循環(huán)引入的延遲W短于平均結(jié)合事件的持續(xù)時(shí)間（0.5-2秒），W確保成功的交聯(lián)。[0112]能夠快速且準(zhǔn)確檢測和定位且實(shí)現(xiàn)最小的定位誤差的算法是已知的hW。運(yùn)樣的算法提供了與要求高的超分辨率需求相容的理論上最佳的擬合精確度，并且還有效地使用GPU計(jì)算W加速處理速度W允許實(shí)時(shí)成像處理。漂移校正將基于追蹤由金納米顆粒和?？谠O(shè)計(jì)的核酸納米顆粒制成的漂移標(biāo)志物。兩種方法的組合允許快速且精確的漂移校正，使得能夠高要求的超分辨率成像。在其中在光譜分開通道中實(shí)時(shí)監(jiān)測新活化的祀標(biāo)的情況下，也可W實(shí)施實(shí)時(shí)報(bào)道。然后可W將處理的定位匯集并擅染成超分辨的圖像，用于最終用戶實(shí)時(shí)查看和分析并決定祀標(biāo)選擇用于后一活化步驟。該軟件還包括常規(guī)的從擅染圖像選擇目標(biāo)區(qū)域(R0I)。[0113]硬件。為了提供指定結(jié)合寡核巧酸的實(shí)時(shí)位點(diǎn)特異性活化，使用具有快速轉(zhuǎn)換和照射面積控制的UV激光。激光轉(zhuǎn)換可W用具有<30ms轉(zhuǎn)換延遲的聲光可調(diào)諧濾光片(A0TF)快口來實(shí)施。激光照射可W用不受控制的全平面照射來實(shí)現(xiàn)。該方法在W期望圖案產(chǎn)生局部(巧皿)位點(diǎn)特異性標(biāo)記或擾動(dòng)中是有效的。作為一個(gè)實(shí)例，可W使用配備具有小于30ms轉(zhuǎn)換的A0TF快口的NikonTi顯微鏡系統(tǒng)。先前已經(jīng)報(bào)道了與Nikon顯微鏡系統(tǒng)整合的成功嘗試[8]。[0114]為了實(shí)現(xiàn)更高效的大視場位點(diǎn)特異性圖案化，使用數(shù)字微鏡裝置(DMD)陣列W便在整場實(shí)現(xiàn)UV激光照射的并行轉(zhuǎn)換，如上所述。運(yùn)樣的DMD陣列裝置提供了用于分割整個(gè)照射場的大像素陣列；定制控制在各像素是可能的，允許各像素進(jìn)行ON或OFF轉(zhuǎn)換。運(yùn)允許獨(dú)立控制各微陣列像素，同時(shí)在較大面積實(shí)現(xiàn)類似有效的操作和擾動(dòng)。作為一個(gè)實(shí)例，可W使用AndorMOSAIC數(shù)字轉(zhuǎn)換平臺(tái)，因?yàn)槠涮峁┝嗽诖?M像素陣列的基于像素的定制控制，并得到亞毫秒轉(zhuǎn)換延遲。[0115]替代固定化學(xué)。已經(jīng)顯示光可裂解的接頭鄰硝基芐基和其許多衍生物與生物系統(tǒng)具有優(yōu)異的相容性，運(yùn)是由于來自反應(yīng)物和產(chǎn)物的毒性最小。運(yùn)些化合物已經(jīng)用于各種各樣的生物應(yīng)用中47'17'^。接頭的一些變體甚至可^用高強(qiáng)度可見光經(jīng)由二光子效應(yīng)裂解因此消除潛在誘變的UV照射。已經(jīng)開發(fā)了方案W通過使用光可裂解的接頭、而不是光交聯(lián)劑來實(shí)現(xiàn)成像劑鏈的光誘導(dǎo)的固定（圖7)。此處，成像劑鏈假定為發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并在環(huán)中含有光可裂解的位點(diǎn)。當(dāng)莖-環(huán)是完整的時(shí)，成像劑鏈可W經(jīng)由短（~8-nt)立足點(diǎn)結(jié)合（圖7)、隨后等能鏈置換僅與對(duì)接鏈瞬時(shí)相互作用。當(dāng)裂解環(huán)中的光可裂解的接頭時(shí)，鏈置換可W導(dǎo)致發(fā)夾的一個(gè)臂的不可逆解離。盡管在最終產(chǎn)品中成像劑鏈沒有共價(jià)連接至對(duì)接鏈，但其仍然穩(wěn)定地雜交至對(duì)接鏈。[0116]動(dòng)力學(xué)。DNA寡核巧酸結(jié)合時(shí)間可W在寬范圍（O.l-lOs)內(nèi)靈活地調(diào)諧，具有約0.5-2S的典型值。當(dāng)前的成像率通常為每帖100ms。基于當(dāng)前的軟件處理速度的估計(jì)顯示可W在100ms內(nèi)實(shí)現(xiàn)有效的擬合和處理，且可W在30ms內(nèi)實(shí)現(xiàn)硬件通信和活化。WlW/cm2UV激光功率，交聯(lián)需要少于Is來完成。加在一起，運(yùn)保證了化學(xué)活化將在結(jié)合事件發(fā)生之后<300ms的延遲內(nèi)開始；因此，對(duì)于具有約2s的結(jié)合時(shí)間的寡核巧酸，運(yùn)提供了足夠的時(shí)間（〉Is)用于交聯(lián)發(fā)生。[0117]特異性。通過確保結(jié)合事件在時(shí)間上彼此分離而保證修飾的特異性，使得因?yàn)閮纱芜B續(xù)結(jié)合而不發(fā)生錯(cuò)誤活化?？蒞如下實(shí)現(xiàn)特異性。DNA-PAINT結(jié)合亮?xí)r間（ON-時(shí)間）和暗時(shí)間（OFF-時(shí)間）均可W獨(dú)立且W寬動(dòng)態(tài)范圍進(jìn)行調(diào)諧。結(jié)合0N/0F即寸間比可W被調(diào)諧至足夠低，使得在各衍射受限區(qū)域中，閃爍的可能性低（<1/1〇)。運(yùn)保證了活化的>90%正確性。在已經(jīng)發(fā)生錯(cuò)誤檢測和活化的事件中，我們可W利用光交聯(lián)化學(xué)的可逆性，并且使用類似的方法用于在312nmUV照射下分離寡核巧酸W。[011引3D中的操作-PAINT[0119]提出了在S維空間中的兩次操作-PAINT實(shí)施。一種適合于接近于表面的應(yīng)用，而另一種適用于更深的3D穿透諸如全細(xì)胞或甚至組織應(yīng)用。對(duì)于接近于蓋玻璃表面的操作-PAINT的應(yīng)用，將使用基于像散性的3D超分辨率成像組合高度傾斜且層疊的光學(xué)片化IL0照明。運(yùn)允許亞衍射檢測和隨后的操作-PAINT修飾用于~1WI1場深度應(yīng)用。在基于像散性的單分子成像中，當(dāng)失焦成像時(shí)，成像路徑中使用的圓柱形透鏡將分子的球形點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)(PSFr轉(zhuǎn)化"為楠圓形PSF(圖8A)。[0120]楠圓形PSF的程度和取向取決于來自當(dāng)前焦點(diǎn)成像平面的點(diǎn)源的位移和方向，并且用于W亞衍射精確度確定其Z位置（圖8B)?；谙裆⑿缘?D操作-PAINT的實(shí)施如下：由于檢測和驅(qū)動(dòng)（即，使用UV脈沖固定DNA鏈用于交聯(lián))依賴于僅單一探針結(jié)合且在衍射受限體素中被檢測(基于單分子的3D超分辨率顯微術(shù)的先決條件）的事實(shí)，可W使用3DDNA-PAINT技術(shù)[32'39]W便W目前在x、y中~5nm精確度和在Z中~lOnm將分子定位于該體素（~200x200x1000皿)中，確定結(jié)合是否發(fā)生于指定的5x5xlOnm體素中，并且如果結(jié)合發(fā)生，則W3D中的高精確度固定探針。亞衍射大小的3DDNA多面體結(jié)構(gòu)可W用作對(duì)照，其中結(jié)構(gòu)的所有頂點(diǎn)都攜帶相同的DNA-PAINT對(duì)接位點(diǎn)（圖8C)。表面固定之后，獲取3DDNA-PAINT圖像?？蒞定義四面體的頂點(diǎn)用于操作-PAINT修飾。本文描述的軟件可W容易地延伸用于實(shí)時(shí)3D檢測和驅(qū)動(dòng)。[0121]對(duì)于更深的3D成像，TIRF或HILO照射不太適合于3DDNA-PAINT(和因此操作-PAINT),運(yùn)是由于來自游離擴(kuò)散成像劑鏈的增加平面外巧光，其惡化了有效定位單分子所必需的高信噪檢測比。為了克服該限制，旋轉(zhuǎn)盤共聚焦激光顯微術(shù)用于深穿透3D操作-PAINT，允許我們?cè)趲资畟€(gè)微米(即，通過全細(xì)胞和潛在組織或小生物體)獲得亞衍射位點(diǎn)特異性3D標(biāo)記。對(duì)于遠(yuǎn)高于蓋玻璃表面的結(jié)構(gòu)的成像，已經(jīng)廣泛使用了共焦顯微鏡，因?yàn)槠涔鈱W(xué)切片能力得到具有良好信噪比的圖像。近來，當(dāng)使用自發(fā)閃爍巧光分子時(shí)，使用旋轉(zhuǎn)盤系統(tǒng)用于單分子超分辨率成像W。鑒于DNA-PAINT探針自主閃爍(無需光轉(zhuǎn)換）的事實(shí)，旋轉(zhuǎn)盤共聚焦的3D切片能力應(yīng)當(dāng)適用于本文提供的方法。實(shí)際地說，可W-次在~1WI1厚的Z-切片中使用旋轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡進(jìn)行深度穿透3D操作-PAINT成像和標(biāo)記。將通過如上所述的光學(xué)像散性成像獲得亞衍射超分辨率能力。[0122]細(xì)胞中的操作-PAINT[0123]進(jìn)行兩項(xiàng)并發(fā)細(xì)胞研究。在第一項(xiàng)研究中，將納米級(jí)DNA探針附接至DM折權(quán)納米結(jié)構(gòu)，所述DNA折權(quán)納米結(jié)構(gòu)被錯(cuò)定至固定細(xì)胞的表面或注射入細(xì)胞中且存在于細(xì)胞質(zhì)或核中。在第二項(xiàng)研究中，操作-PAINT用于直接標(biāo)記固定細(xì)胞中的蛋白質(zhì)祀標(biāo)(例如，W20nm的周期性間隔標(biāo)記微管網(wǎng)絡(luò)）。[0124]DNA-PAINT細(xì)胞成像。已經(jīng)表明使用DNA-PAINT的細(xì)胞結(jié)構(gòu)的超分辨率成像[32]。此夕h已經(jīng)使用DNA綴合的抗體成像固定化La細(xì)胞中的細(xì)胞骨架微管網(wǎng)絡(luò)（圖8a)。此外，光學(xué)像散性[22'W用于獲得固定化La細(xì)胞內(nèi)的微管網(wǎng)絡(luò)的3D超分辨率圖像(圖9B;其中顏色指示高度）。[0125]附接至細(xì)胞表面或顯微注射入細(xì)胞的DM結(jié)構(gòu)上的操作-PAINT。為了評(píng)估操作-PAINT在細(xì)胞環(huán)境的背景下的表現(xiàn)，對(duì)附接至細(xì)胞表面的DNA四面體上的單個(gè)指定點(diǎn)進(jìn)行高精度DNA寡核巧酸修飾。經(jīng)由使用預(yù)組裝的抗體DNA折權(quán)綴合物免疫標(biāo)記過表達(dá)的表面受體(諸如EGFR)實(shí)現(xiàn)將DNA納米結(jié)構(gòu)錯(cuò)定至細(xì)胞表面（圖9C)。細(xì)胞錯(cuò)定之后，使用超分辨率DNA-PAINT成像解析四面體結(jié)構(gòu)的四個(gè)角。此處，類似于先前的體外實(shí)驗(yàn)，使用含有兩個(gè)序列結(jié)構(gòu)域的巧光標(biāo)記的成像劑鏈進(jìn)行DNA-PAINT成像。第一結(jié)構(gòu)域是與四面體結(jié)構(gòu)上的對(duì)接鏈互補(bǔ)的序列，且含有?^修飾。第二結(jié)構(gòu)域是獨(dú)特的綴合柄，其在四面體結(jié)構(gòu)的操作-PAINT納米修飾之后可得，其用于通過第二輪的DNA-PAINT表征性能。接下來，如本文所述的軟件和硬件組件，進(jìn)行3D-操作-PAINTW便將成像劑鏈特異性附接至3D納米結(jié)構(gòu)的單一、指定的頂點(diǎn)。使用第二輪的DNA-PAINT評(píng)估細(xì)胞表面上的納米結(jié)構(gòu)修飾的性能。該實(shí)驗(yàn)得到關(guān)于影響細(xì)胞性能的參數(shù)的信息。[0126]進(jìn)行下一實(shí)驗(yàn)W表明修飾固定細(xì)胞內(nèi)的納米結(jié)構(gòu)的能力（圖9D)。將DNA四面體納米顯微注射入固定細(xì)胞的核和細(xì)胞質(zhì)中。使用DNA-PAINT顯現(xiàn)納米結(jié)構(gòu)，并且使用操作-PAINT修飾特定的頂點(diǎn)。該實(shí)驗(yàn)促進(jìn)校準(zhǔn)和減輕與獲得自細(xì)胞表面的參考結(jié)果的偏差(如果有的話）。[0127]標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的操作-PAINT。在進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)中，操作-PAINT用于實(shí)現(xiàn)固定細(xì)胞中的蛋白質(zhì)的位點(diǎn)特異性標(biāo)記。在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，周期性標(biāo)記微管網(wǎng)絡(luò)。通過使用具有DNA鏈的微管祀向的抗體綴合物將DNA鏈錯(cuò)定于整個(gè)微管網(wǎng)絡(luò)上。獲取微管網(wǎng)絡(luò)的DNA-PAINT圖像之后，進(jìn)行操作-PAINT，W便W用戶指定的圖案，例如，W周期性的20nm間隔，永久固定DNA探針（圖9E)。其后，通過DNA-PAINT成像圖案化微管結(jié)構(gòu)W評(píng)估蛋白質(zhì)修飾的性能。運(yùn)些細(xì)胞實(shí)驗(yàn)允許進(jìn)一步優(yōu)化參與細(xì)胞操作-PAINT的某些參數(shù)，包括選擇具有低非特異性結(jié)合的成像劑序列，激光功率，和最佳交聯(lián)所需的時(shí)間。在又另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中，DNA-PAINT用于W周期性圖案(例如，20nm柵格)標(biāo)記細(xì)胞表面蛋白質(zhì)簇。[0128]在一些情況下，用納米抗體替代全規(guī)?？贵w，特別是當(dāng)期望高密度成像時(shí)。在一些情況下，設(shè)計(jì)成像劑和對(duì)接鏈被，使得在^^1(交聯(lián)實(shí)施中，T或C存在于對(duì)接鏈DNA中的-1位置。預(yù)期運(yùn)盡可能減少非特異性交聯(lián)。此外，為了消除可W導(dǎo)致含有?^的成像劑鏈與細(xì)胞自身的核酸的不期望的交聯(lián)的序列相似性，將針對(duì)細(xì)胞的基因組內(nèi)容物篩選含有的成像劑鏈序列。[0129]應(yīng)用[0130]本文提供的方法可W用于在單細(xì)胞水平分析蛋白質(zhì)特異性相互作用。與使用限于遺傳可及的細(xì)胞隔室的小分子試劑的工程改造的基因標(biāo)簽的先前方法(例如，APEX)W^36]相比，具有實(shí)時(shí)光學(xué)反饋的本文提供的方法允許任意標(biāo)記和擾動(dòng)圖案，其具有并入基于來自實(shí)時(shí)超分辨率成像數(shù)據(jù)的信息的最終用戶的決定的潛能。此外，該新方法可W在單細(xì)胞水平上進(jìn)行，為最終用戶提供細(xì)胞特異性蛋白質(zhì)組學(xué)信息和細(xì)胞行為的隨機(jī)波動(dòng)的前所未有的知識(shí)。[0131]本文提供的方法也可W用于納米級(jí)光遺傳學(xué)中，包括在空間時(shí)間受控的單離子通道操作中。在研究神經(jīng)元激發(fā)和活動(dòng)水平的離子通道效應(yīng)的先前方法已經(jīng)被限制為僅基于批次的轉(zhuǎn)換，運(yùn)是由于缺乏可超分辨率精度檢測和擾動(dòng)離子通道行為的操作工具。使用分子擾動(dòng)劑諸如lumitoxin[W，本文提供的方法提供了整合的工具集，其允許運(yùn)些離子通道的超分辨率和分子特異性的顯現(xiàn)和操作。運(yùn)將促進(jìn)鑒定和描繪致密簇中各單離子通道的作用，并且使得能夠進(jìn)一步研究其成簇排列的作用。[0132]下面將更詳細(xì)地描述運(yùn)些應(yīng)用。[0133]實(shí)現(xiàn)納米級(jí)單細(xì)胞空間蛋白質(zhì)組學(xué)的操作-PAINT[0134]本實(shí)施例描述了用于納米級(jí)單細(xì)胞空間蛋白質(zhì)組學(xué)的第一種方法。該方法特異性地捕獲和鑒定細(xì)胞中的用戶指定的位置的特定蛋白質(zhì)及其相關(guān)伴侶。特異性捕獲和鑒定特定蛋白質(zhì)祀標(biāo)及其相關(guān)伴侶的能力使得能夠W位點(diǎn)特異性的方式詳細(xì)理解來自單細(xì)胞的蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。[0135]已經(jīng)傳統(tǒng)上使用基于質(zhì)譜(MS)的蛋白質(zhì)組學(xué)解決描繪細(xì)胞中的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，其被限制為可高得率和純度分離的細(xì)胞隔室。然而，許多細(xì)胞蛋白質(zhì)相互作用難W純化，并且作為結(jié)果，某些蛋白質(zhì)的"相互作用組"無法使用現(xiàn)有技術(shù)方法進(jìn)行探索。更近的技術(shù)使得能夠使用工程改造的抗壞血酸過氧化物酶(APEX)作圖活細(xì)胞中的特異性蛋白質(zhì)相互作用組W-W。然而，基于APEX-蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)作圖獲得自來自大細(xì)胞群體、而不是來自單細(xì)胞的平均蛋白質(zhì)相互作用。進(jìn)一步，也已經(jīng)假設(shè)某些蛋白質(zhì)具有完全不同的相互作用蛋白質(zhì)伴侶，運(yùn)取決于它們的細(xì)胞功能，并且運(yùn)些相互作用無法使用基于APEX-生物化學(xué)表征進(jìn)行作圖。重要的是，用于基于遺傳標(biāo)簽(諸如APEX)的位置特異性標(biāo)記的方法限于遺傳可及的位置，并且無法實(shí)現(xiàn)任意用戶指定的位置選擇。相反，操作-PAINT使得用戶能夠在任意用戶指定的位置"抓住"蛋白質(zhì)。[0136]納米級(jí)空間標(biāo)記和捕獲。圖10A提供了運(yùn)些方法的設(shè)計(jì)。在步驟1中，固定細(xì)胞，并且用綴合至對(duì)接鏈(序列a)的抗體標(biāo)記祀蛋白質(zhì)。在步驟2中，W~5nm的分辨率進(jìn)行DNA-PAINT超分辨率成像（圖3F)。運(yùn)允許W亞衍射分辨率空間鑒定祀蛋白質(zhì)的位置。在步驟3中，使用操作-PAINT,將使用攜帶綴合柄(序列b)的成像劑鏈修飾R0I中的對(duì)接鏈(框）。在步驟4中，裂解細(xì)胞，并且使用與綴合柄b互補(bǔ)的鏈(b*)將內(nèi)容物捕獲于成像室中，其允許分離目標(biāo)蛋白質(zhì)復(fù)合物。然后使用如下所述的單一蛋白質(zhì)光學(xué)指紋分析法鑒定復(fù)合物中的蛋白質(zhì)?？蒞W2D和3D實(shí)施進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。[0137]經(jīng)由超分辨率指紋分析的單一蛋白質(zhì)鑒定。通過將DNA(用化學(xué)標(biāo)簽修飾）附接至特定氨基酸殘基（例如，用NHS-醋化學(xué)附接至賴氨酸)和WDNA-PAINT超分辨率(2nm定位精確度)成像來實(shí)現(xiàn)"蛋白質(zhì)指紋分析"。圖10B提供了運(yùn)些方法的設(shè)計(jì)。在步驟1中，使用化學(xué)劑諸如SDS變性和拉伸從先前方法(上文)捕獲的蛋白質(zhì)復(fù)合物。用另一種標(biāo)簽特異性標(biāo)記膚鏈中的所有賴氨酸殘基，所述另一種標(biāo)簽包含DNA-PAINT柄，并且在該情況下包含點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)（諸如TC0)?？蒞使用其它綴合方式代替點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)基團(tuán)。在步驟2中，將具有額外的點(diǎn)擊化學(xué)錯(cuò)的拉伸膚鏈固定在用反作用點(diǎn)擊化學(xué)基團(tuán)（諸如TZ)完全修飾的表面上。在步驟3中，用新標(biāo)記的DNA-PAINT柄的超分辨率DNA-PAINT成像用于顯示所有賴氨酸殘基的位置，具有<2nm定位精確度。拉伸膚鏈中的所有鑒定的賴氨酸殘基的集合提供了膚序列中的賴氨酸分布的條形碼樣代表。特異性標(biāo)記的殘基的組合多樣性允許獨(dú)特鑒定蛋白質(zhì)(文庫大小〉1〇7)。在步驟4中，將該條形碼信息與來自全基因組測序的所有基因鑒定的蛋白質(zhì)編碼序列的文庫進(jìn)行比較和匹配，然后確定目前蛋白質(zhì)的身份。[0138]用該方法，來自相同蛋白質(zhì)復(fù)合物的蛋白質(zhì)將是彼此接近的，并且可W與來自不同復(fù)合物的那些分開。也可W鑒定大蛋白質(zhì)復(fù)合物內(nèi)的各單一組分，并且將其與其基因序列直接匹配，而無需蛋白質(zhì)組分的任何先前知識(shí)，并且不使用預(yù)先存在的針對(duì)各組分的抗體?？蒞用交換-PAINT進(jìn)行多輪殘基特異性的條形碼成像便進(jìn)一步鑒定具有類似條形碼的蛋白質(zhì)，或研究特定特征，諸如憐酸化和翻譯后修飾圖案。[0139]應(yīng)用于馬達(dá)蛋白質(zhì)。先前工作已經(jīng)確定，馬達(dá)蛋白質(zhì)諸如肌球蛋白、驅(qū)動(dòng)蛋白和動(dòng)力蛋白具有完全不同的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，運(yùn)取決于它們與之相關(guān)的細(xì)胞載荷及其在細(xì)胞環(huán)境內(nèi)的位置(例如，甚至當(dāng)與相同載荷相關(guān)時(shí)。對(duì)于運(yùn)些馬達(dá)蛋白質(zhì)的大部分現(xiàn)有蛋白質(zhì)相互作用作圖研究來自大量生物化學(xué)和一些單分子分析數(shù)據(jù)使用本文所述的技術(shù)，獨(dú)特的DNA柄可W附接至蛋白質(zhì)祀標(biāo)W促進(jìn)單細(xì)胞內(nèi)的不同細(xì)胞位置中存在的單獨(dú)馬達(dá)蛋白質(zhì)復(fù)合物的拉下和蛋白質(zhì)概況分析。一種合適的復(fù)合物是驅(qū)動(dòng)蛋白-1馬達(dá)蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)相互作用組，因?yàn)槭褂闷渌惹跋到y(tǒng)對(duì)其進(jìn)行廣泛研究，并且可W將結(jié)果與先前作為驗(yàn)證獲得的結(jié)果進(jìn)行比較。[0140]首先，固定哺乳動(dòng)物細(xì)胞，并且經(jīng)由預(yù)組裝的驅(qū)動(dòng)蛋白-1抗體-DNA綴合物將DNA錯(cuò)寡核巧酸附接至驅(qū)動(dòng)蛋白-1馬達(dá)蛋白質(zhì)。然后進(jìn)行DNA-PAINT超分辨率成像，W對(duì)細(xì)胞內(nèi)的所有驅(qū)動(dòng)蛋白-1馬達(dá)蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位進(jìn)行作圖。進(jìn)一步，該實(shí)驗(yàn)可用于研究驅(qū)動(dòng)蛋白-1相互作用組與不同形式的細(xì)胞載荷(例如，mRNA、脂質(zhì)、線粒體等）的相互作用。運(yùn)可W通過進(jìn)行多路DNA-PAINT成像和僅選擇與特定載荷類型共定位的那些驅(qū)動(dòng)蛋白-1蛋白質(zhì)來實(shí)現(xiàn)，并且存在于微管上，后一特征表明在活性細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的過程中的驅(qū)動(dòng)蛋白-1。然后，如前所述，使用用光交聯(lián)或光裂解DNA堿基修飾的DNA，將獨(dú)特DNA柄附接至目標(biāo)特定驅(qū)動(dòng)蛋白-1蛋白質(zhì)復(fù)合物，并且可W通過遵循上述方法來檢查其蛋白質(zhì)相互作用組。通過理解驅(qū)動(dòng)蛋白-1相互作用組中對(duì)于不同細(xì)胞位置中的相同載荷或?qū)τ谙嗤?xì)胞位置中的不同載荷的變化，將可能理解某些驅(qū)動(dòng)蛋白-1適配子蛋白質(zhì)諸如JIPl、Miro、Milton、FMRP等的特定生物功能KW。類似技術(shù)可W用于驅(qū)動(dòng)蛋白超家族的其它成員或其它分子馬達(dá)(諸如肌球蛋白和動(dòng)力蛋白）。[0141]在拉伸的膚鏈的各賴氨酸殘基上標(biāo)記DNA-PAINT柄?？蒞用NHS醋化學(xué)實(shí)現(xiàn)賴氨酸特異性修飾。在一些情況下，特別是當(dāng)潛在的擁擠性是問題時(shí)，NHS基團(tuán)和DNA-PAINT柄之間可W包括長接頭。新近數(shù)據(jù)顯示，長度為約lOnm的接頭不會(huì)犧牲定位精確度(數(shù)據(jù)未顯示）。[0142]可W如下進(jìn)行由賴氨酸殘基的可變定位編碼的可能文庫大小的估計(jì)。假設(shè)典型的蛋白質(zhì)編碼膚鏈具有300個(gè)殘基。本文所述的成像能力允許向下定位至化m精確度(數(shù)據(jù)未顯示），其等于~10個(gè)膚鍵。將整個(gè)膚鏈分為10個(gè)膚鍵部分(300/10)導(dǎo)致產(chǎn)生約30個(gè)部分。如果賴氨酸存在，則各部分被指定為1，或者如果不存在賴氨酸，則各部分被指定為0。運(yùn)樣的0或1指定，得到2^(或109)種不同的可能性。然而，在實(shí)踐中，蛋白質(zhì)編碼序列中的賴氨酸分布為約7%，運(yùn)意味著蛋白質(zhì)內(nèi)將平均存在21個(gè)賴氨酸殘基，運(yùn)得到（30,21)=1.4義107種可能性。人基因組中的基因的目前估計(jì)數(shù)目低于100,000,運(yùn)完全低于此處允許的文庫大小。[0143]在兩種蛋白質(zhì)具有相似或相同的賴氨酸信號(hào)的事件中，可W用不同的殘基特異性的化學(xué)物，諸如例如半脫氨酸或精氨酸，經(jīng)由交換-PAINT進(jìn)行額外的篩選為了成像多輪不同的氨基酸信號(hào)，在DNA-PAINT寡核巧酸之前放置光可裂解的接頭，使得成像之后，可W通過UV光照射去除標(biāo)記寡核巧酸。鑒于在膚鏈上允許的緊密空間，運(yùn)允許化學(xué)修飾第二個(gè)氨基酸。[0144]不完全拉伸的膚序列可W潛在提供錯(cuò)誤信號(hào)(諸如在鏈的中間的丟失區(qū)段），并且可W導(dǎo)致不正確的蛋白質(zhì)身份分配。為了解決該問題，可W將氨基酸信號(hào)首先局部匹配，然后全局組裝。該方法既是計(jì)算更有效的（與整個(gè)序列匹配相比），其又提供錯(cuò)誤拉伸序列的更多誤差耐受性。[0145]可W在整合的微流體裝置中實(shí)現(xiàn)整個(gè)操作-PAINT和蛋白質(zhì)條形碼平臺(tái)。本發(fā)明考慮整合流平臺(tái)，其為蛋白質(zhì)條形碼分析提供足夠的支持。[0146]實(shí)現(xiàn)納米級(jí)光遺傳學(xué)的操作-PAINT[0147]光遺傳學(xué)工具已經(jīng)證明在神經(jīng)科學(xué)中具有很大效用。運(yùn)些分析技術(shù)通過遞送外源離子通道、隨后照射和離子轉(zhuǎn)運(yùn)而引起細(xì)胞中的電壓變化WW。作為結(jié)果，它們不能用于分析內(nèi)源離子通道對(duì)神經(jīng)計(jì)算的影響。同時(shí)，越來越理解，內(nèi)源離子通道的確切身份和分布對(duì)于神經(jīng)計(jì)算是重要的。例如，樹突鐘通道可W精確雕刻神經(jīng)活動(dòng)傳播入神經(jīng)元的不同隔室，并且在癒痛中，該興奮性控制可W被破壞，引起過度興奮WU。在神經(jīng)元的某些子集中，如在軸突小丘，相對(duì)少量鋼通道的作用可W控制神經(jīng)元是否生成和傳播操作電位因此，控制離子通道的小集合的能力在神經(jīng)元如何整合來自上游神經(jīng)元的神經(jīng)輸入W生成尖峰、然后將其傳輸至下游神經(jīng)元的研究中可具有很大效用。甚至單獨(dú)離子通道或單獨(dú)離子通道的集合的驅(qū)動(dòng)或阻斷可具有很大效用。事實(shí)上，理論研究已經(jīng)表明，由于單離子通道的閃爍影響導(dǎo)致的離散通道噪音，可對(duì)于內(nèi)嗅皮層的某些星狀神經(jīng)元中的慢闊值附近振蕩（slowperi-thresholdoscillations)是關(guān)鍵的[63]。不考慮單獨(dú)離子通道的隨機(jī)口控的模型比考慮的模型表現(xiàn)出更貧乏的神經(jīng)動(dòng)力學(xué)W3。另一個(gè)理論研究已經(jīng)暗示，如果離子通道在特定大小的簇中操作，或者如果離子通道被認(rèn)為概率性閃爍打開或關(guān)閉的離散實(shí)體(與僅被認(rèn)為具有聚集動(dòng)力學(xué)的協(xié)調(diào)群體相反），則離子通道噪音可W優(yōu)化神經(jīng)元將輸入編碼成尖峰的能力WS3。沒有先前的技術(shù)允許W時(shí)間精度阻斷或驅(qū)動(dòng)單獨(dú)離子通道，因此離子通道口控的隨機(jī)性質(zhì)可能如何有助于神經(jīng)動(dòng)力學(xué)的模型仍然未被探索。實(shí)驗(yàn)性研究已經(jīng)局限于通道的小子集，諸如巧通道，其中納米域的成像已經(jīng)變得可能，表明在離子通道功率附近，大濃度的巧可W瞬時(shí)發(fā)生WW，并且通道成簇可W增強(qiáng)該過程事實(shí)上，巧通道可W在突觸連接競爭稀少"槽(slots)"，運(yùn)意味著特定巧通道的身份可W在個(gè)體水平是重要的然而，除了巧通道的該特定情況W外，沒有研究單獨(dú)通道或小簇的通用方式已經(jīng)變得顯而易見。[0148]本公開考慮使用操作-PAINTW首次實(shí)現(xiàn)納米級(jí)光遺傳學(xué)（即，W納米精度在用戶指定的位置精確控制單獨(dú)離子通道的活性的能力）。納米光遺傳學(xué)將允許W好得多的精度擾動(dòng)和分析神經(jīng)元功能，并且將有助于廣泛地實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元功能的真正的分子、而不是細(xì)胞、的理解。[0149]細(xì)胞膜和內(nèi)部膜中的離子通道和受體經(jīng)常WlOOnm的平均直徑分布于離散簇中。運(yùn)些簇隨機(jī)分布于整個(gè)細(xì)胞膜，并且已知運(yùn)些簇各自含有幾個(gè)至幾百個(gè)單獨(dú)離子通道W3。因此，為了描繪單離子通道的貢獻(xiàn)，需要能夠W納米精度W時(shí)間精確和可逆的方式活化或失活單獨(dú)離子通道的技術(shù)。[0150]近來，開發(fā)了新穎的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)（lumitoxin),其能夠通過完全遺傳編碼和通過光活化而調(diào)節(jié)內(nèi)源離子通道W3"Lumitoxin是包含兩個(gè)功能元件膚神經(jīng)毒素和光受體L0V2-J的融合蛋白質(zhì)，并且其充當(dāng)目標(biāo)蛋白質(zhì)配體和膜之間的系鏈。在PC12細(xì)胞和Kv通道上使用lumitoxin和藍(lán)色(455nm)光，顯示大多數(shù)離子通道在黑暗狀態(tài)下被失活，并且在暴露于藍(lán)光幾秒內(nèi)被活化。全細(xì)胞膜片錯(cuò)記錄用于確定離子通道的活性。與藍(lán)光組合的Lumitoxin能夠控制離散離子通道簇，但不能調(diào)節(jié)單離子通道，因?yàn)樗{(lán)色激光源不能破壞衍射屏障（~200nm)。[0151]在本公開中，lumitoxin用于控制首先體外、然后活哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的單獨(dú)離子通道的活性。先前的工作已經(jīng)顯示成功純化和重構(gòu)脂質(zhì)體中的活性離子通道（TREK-1和TRPV3)且使用膜片錯(cuò)記錄測量活性47。將在合成脂質(zhì)體系統(tǒng)中進(jìn)行納米級(jí)單離子通道操作的實(shí)驗(yàn)（圖11A)。具體地，首先如先前所述連同蛋白質(zhì)標(biāo)簽(諸如SNAP)純化運(yùn)些離子通道，并且將DNA錯(cuò)寡核巧酸(經(jīng)由06-芐基鳥嚷嶺）附接至單獨(dú)離子通道。作為下一步驟，在脂質(zhì)小滴中重構(gòu)純化蛋白質(zhì)與DNA寡核巧酸，并且DNA-PAINT超分辨率成像用于理解每個(gè)蛋白質(zhì)-脂質(zhì)體的離子通道的確切位置和拷貝數(shù)然后，使用操作-PAINT,將偶聯(lián)至lumitoxin的DNA寡核巧酸置于單獨(dú)目標(biāo)離子通道上。選擇性沉默單獨(dú)離子通道或測量單獨(dú)離子通道的活性(使用技術(shù)諸如單分子膜片錯(cuò)FRET顯微術(shù)nu)之前和之后的膜片錯(cuò)測量用于分析單獨(dú)離子通道的活性。[0152]也可W分析活細(xì)胞中的簇內(nèi)的單一離子通道的貢獻(xiàn)。在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，可W使用操作-PAINT活化用戶指定的通道W便向其遞送lumitoxin載荷（圖11B)。首先，使用基于DNA-PAINT的超分辨率成像(分辨率~5nm)確定簇內(nèi)的單一離子通道的精確位置。然后，使用現(xiàn)有的膜片錯(cuò)記錄或單分子膜片錯(cuò)FRET顯微術(shù)，記錄整個(gè)離子通道簇的活性W-W。在此之后，鑒定目標(biāo)單離子通道，并且使用操作-PAINT將偶聯(lián)至lumitoxin的DNA寡核巧酸置于該離子通道附近W失活該通道。下一步驟設(shè)及記錄離子通道簇的活性（同時(shí)用藍(lán)光失活祀向的離子通道)且將運(yùn)樣的活性與先前的記錄進(jìn)行比較。[0153]-種補(bǔ)充方法是驅(qū)動(dòng)單一用戶指定的離子通道(圖11C)。首先，使用其中表達(dá)具有蛋白質(zhì)標(biāo)簽的目標(biāo)離子通道的細(xì)胞，將DNA對(duì)接鏈附接至運(yùn)樣的離子通道（與圖11B中類似）。然后，將DNA-lumitoxin附接至所述柄，使得每一離子通道具有蛋白質(zhì)標(biāo)簽對(duì)。偶聯(lián)至DNA-lumitoxin之后，使得所述通道失活，除非用藍(lán)光活化?，F(xiàn)在，通過采用如圖11C中所述的方案，可W從單一離子通道選擇性去除lumitoxin，并且測量所述簇的活性W測定單一離子通道的貢獻(xiàn)。具體地，在步驟1中，操作-PAINT用于將（3*-4*)鏈綴合至連接至選擇的待活化的離子通道的鏈。在步驟2中，引入活化劑發(fā)夾;運(yùn)將通過由"立足點(diǎn)"區(qū)段4起始的立足點(diǎn)介導(dǎo)的鏈置換反應(yīng)僅特異性置換來自用步驟1中的鏈修飾的離子通道的DNA-lumitoxin。W該方式，將僅失活該具體離子通道。[0154]本文所述的納米級(jí)光遺傳學(xué)工具可用于例如研究離子通道的納米級(jí)空間調(diào)節(jié)對(duì)于精確信號(hào)整合和傳播的作用，W及離散離子通道噪音的微妙作用。[0155]參考文獻(xiàn)[0156][l]Rust,M.J.,Bates,M.,Zhuan邑，X.Stochasticopticalreconstructionmicroscopy(STORM)providessub-diffraction-1imitimageresolution.NatureMethods3(10),pp.793-795(2006).[0157][2]Sharonov,A.,Hochstrasser,R.M.Wide-fieldsubdiffractionimagingbyaccumulatedbindingofdiffusingprobes.PNAS103(50),pp.18911-18916(2006).[015引[3]Jungmann,R.,Steinhauer,C.,Scheible,M.,Kuzyk,A.,Tinnefeld,P.,Simmel,F.C.Single-moleculekineticsandsuper-resolutionmicroscopybyfluorescenceimagingoftransientbindingonDNAorigami.NanoLetters10，pp4756-4761(2010).[01日9][4]Yoshimura，Y.，F(xiàn)ujimoto，K.Ultrafastreversiblephoto-cross-linkingreaction:towardinsituDNAmanipulation.OrganicLetters10，pp.3227-3230(2008).[0160][5]Fujimoto,K.,Konishi-Hiratsuka,K.,Sakamoto,T.,Yoshimura,Y.Site-specificphotochemical民NAediting.ChemicalCommunications46，pp.7545-7547(2010).[0161][6]Shigeno，A.，Sakamoto，T.，Yoshimura，Y.，F(xiàn)ujimotoK.Quickregulationofm民NAfunctionsbyafewsecondsofphotoirradiation.Organic&BiomolecularQiemistryl0，pp?7820-7825(20l2)?[0162][7]Fujimo，K.，Konishi"Hiratsuka，K.，Sakamoto，T.Quick,Selectiveandreversiblephotocross1inkingReactionbetween5-methylcytosineand3-cy過novinylc過rb過zoleinDNAdoublestr過nd.Intern過tion過1JournalofMolecularSciences14(3),pp.5765-5774(2013).[0163][8]Levskaya，A.，Weiner，0.D.，Lim，W.A.，Voigt，C.A.Spatiotemporalcontrolofcellsignallingusingalight-switchableproteininteraction.Nature461，pp.997-1001(2009).[0164][10]TexasInstruments(TI)(Posted:Aug.2012,Rev.Sept.2012)?('DLP9500:DLP?0.951080p2xLVDSTypeADMD.，'Retrieved(April20th，2013)from:<http:/7WWW.ti.com/lit/ds/dlps025a/dlps025a.pdf〉.[0165][lljHinrichsen'E.L.，F(xiàn)eder,J.，Ji0SS貧ng，T.Geometryofrandomsequentialadsorption.JournalofStatisticalPhysics44(5|6),pp.793-827(1986).[0166][12]Cadilhe，A.，Araujo，N.A.M.，Privman，V.民andomsequentialadsorption:fromcontinuumtolatticeandpre-patter打edsubstrates.JournalofPhysics:CondensedMatter19,065124(2007).[0167][13]Torquato，S.，Uche，0.U.，Stillinger，F(xiàn).H.民andomsequentialadditionofhardspheresinhighEuclideandimensions.<arXiv:cond-mat/0608402>[0168][14]AndorTechnology(Andor)/'iXonEMCCDCameraSeriesRetrieved(November23^"^,2013)from:<http://www.andor.com/scientific-cameras/ixon-emccd-camer過-series〉.[0169][15]HamamatsuCorporation?"DigitalCMOScamera-〇RCA-Flash4?0V2Cl1440-22CU?，'Retrieved(November23rd,2013)from:<ht化：//www.hamamatsu.com/化/en/community/life_science_camera/product/search/Cl1440-22CU/index.html>.[0170][16]Pertsinidis，A.，Zhang，Y.，Chu，S.，Subnanometresingle-moleculelocalization,registrationanddistancemeasurements.Nature466，pp.647-651(2010).[0171][17]Piestun,民.，Schechner，Y.Y.，Shamir，J.Propagation-invariantwavefieldswithfiniteenergy.JournaloftheOpticalSocietyofAmericaA17,pp.294-303(2000).[0172][18]Betzig，E.，Patterson，G.H.'Sougrat，R.，Lindwasser，0.W.，01enych，S.，Bonifacino，J.S.，Davidson，M.W.，Lippincott-Schwartz，J.，Hess,H.F.Imagingintracellularfluorescentproteinsatnanometerresolution.Science313，pp.1642-1645(2006)?[0173][19]Pavani，S.R.P.'Thompson，M.A.，Biteen,J.S.'Lord's.J.，Liu，N.，Twieg,民.K.，Piestun,民.，Moerner，W.E.Three-dimensionalsingle-moleculefluorescenceimagingbeyondthediffractionlimitusingadouble-helixpointspreadfunction.PNAS106,pp.2995-2999(2009).[0174][20]Lee，H?D?，Sahl，S.J.，Lew,M.D.，Moerner，W.E.Thedouble-helixmicroscopesuper-resolvesextendedbiologicalstructuresbylocalizingsingleblinkingmoleculesinthreedimensionswithNanoscaleprecision.AppliedPhysicsLetters100(15),153701(2012).[0175][21]Backlund，M.P.，Lew，M.D.，Backer，A.S.，Sahl，S.J.，Grover，G.'Agrawal，A.，Piestun，民.，Moerner，W.E.Simultaneous，accuratemeasurementofthe3Dpositionandorientationofsinglemolecules.PNAS109,pp.19087-19092(2012).[0176][22]Huang，B.，Wang，W.，Bates，M.，Zhuang，X.Three-dimensionalsuper?resolutionbystochasticopticalreconstructionmicroscopy.Science319(5864)，pp.810-813(2008).[0177][23]Ram，S.，Qiao，J.，F(xiàn)*rabhat，P.，Ward，E.S.，0ber，R.J.Anovelapproachtodeterminingthethree-dimensionallocationofmicroscopicobjectswithapplicationsto3Dparticletracking.Proc.SPIE6443(2007).[017引[24]Juette，M.F.，Gould，T.J.，Lessard，M.D.'Mlodzianoski，M.J.'Nagpure,B.S.，Bennett，B.T.，Hess，S.T.，Bewersdorf，J.Three-dimensionalsub-100nmresolutionfluorescencemicroscopyofthicksamples.NatureMethods5(6)，pp.527-529(2008).[0179][25]Pavani，S.民.P.，Piestun,民.Threedimensionaltrackingoffluorescentmicroparticlesusingaphoton-limiteddouble-helixresponsesystem.OpticsExpress16(26),pp.22048-22057(2008).[0180][26]Middendo^f，C.V.，Egner.，A.，Geisler，C.，Hell，S.W.，Schonle，A.Isotropic3Dnanoscopybasedonsingleemitterswitching.OpticsExpressl6(25),pp.20774-20788(2008).[0181][27]Badieirostami,M.,Lew,M.D.,Thompson,M.A.,Moerner,W.E.Three-dimensionallocalizationprecisionofthedouble-helixpointspreadfunctionversusastigmatismandbiplane.AppliedPhysicsLetters97,161103(2010).[0182][28]Szilard，L.O打thedecreaseofentropyinathermodynamicsystembytheinterventionofintelligentbeings.ZeitschriftfurPhysik53,pp.840-856(1929).[0183][29]Toyabe，S.，Sagawa，T.，Ueda，M.，Muneyuki，E.，Sano，M.Experimentaldemonstrationofinformation-to-energyconversionandvalidationofthegeneralizedJarzynskiequality.NaturePhysics6，pp.988-992(2010).[0184][30]Vaughan，J?C?，Jia，S?，ZhuangX?Ultrabrightphotoactivatablefluorophorescreatedbyreductivecaging.NatureMethods9,pp.1181-1184(2012).[0185][31]01ejnik，J?，Sonar，S?，Krzymafiskai-Olejnik，E?，RothschiId，K.J.Photocleavablebiotinderivatives:aversatileapproachfortheisolationofbiomolecules.PNAS92(16),pp.7590-7594(1995).[0186][32]Jungmann，R.;Avendano，M.S?;Woehrstein，J.B?;Dai，M.;Shih，W.M.;Yin，P.Nat.Me化ods2014,11,313-318.[0187][33]Manfrinato，V.R.;Wen,J.;Zhang，L.;Yang，Y.;Hobbs，R.G.;Baker，B.;Su,D.;Zakharov，D.;Zaluzec，N.J.;Miller，D.J.;Stach，E.A.;Berggren，K.K.NanoLett.2014,14,4406-4412.[018引[34]Ma:rtel1，J?D?;Deerinck，T?J?;Sancak，Y?;Poulos，T?L?;Mootha，V?K?;Sosinsky,G.E.;Ellisman,M.H.;Ting,A.Y.Nat.Biotechnol.2012,30,1143-1148.[0189][35]加ee，H.W.;Zou，P.;Udeshi，N.D.;Ma^ell，J.D.;Moo化a，V.K.;Carr，S.A.;Ting,A.Y.Science2013,339,1328-1331.[0190][36]Hung，V.;Zou，P.;加ee，H.W.;Udeshi，N.D.;Cracan，V.;Svinkina，T.;Carr,S.A.;Mootha，V.K.;Ting，A.Y.Mol.Cell2014,55,332-341.[0191][37]Schmidt，D?;Ti1化erg，P?W?;Chen，F(xiàn)?;Boyden，E?S?NatCommun2014，5，3019.[0192][38]GrotjohannT,TestaI,LeuteneggerM,BockH,UrbanNT,Lavoie-CardinalF，WilligKI，EggelingCJakobsS，HellSW.NaUire.2011Sepll;478(7368):204-8.[0193][39]Iinuma,民.；Ke，Y.;Jungmann,民.；Schlichthaerle，T.;Woehrstein，J.B.;Yin，P.Science2014,344,65-69.[0194][40]Hell，S.W.Science2007,316,1153-1158?[0195][41]Hell，S.W.Nat.Me化ods2009,6,24-32.[0196][42]Huang，B.;Babcock，H.;Zhuang，X.Cell2010,143,1047-1058.[0197][43]Hell，S.W.;WichmannJ.0ptLett1994,19,780-782.[0198][44]Tokunaga，M.;Imamoto，N.;Sakata-Sogawa，K?Nat.Methods2008，5，159-161.[0199][45]Vieregg，J.民.；Nelson，H.M.;Stoltz，B.M.;Pierce,N.A.J.Am.Qiem.Soc.2013,135,9691-9699.[0200][46]SmithCS,JosephN,RiegerB'LidkeKA.NatureMethods2010,7,373-375.[0201][47]Ellis-Davies，G.C.Nat.Me化ods2007,4,619-628.[0202][48]Agasti，S.S.;Kohler，R.H.;Liong，M.;Peterson，V.M.;Lee，H.;Weissleder,R.Small2013,9,222-227.[0203][49]Lusic，H.;Uprety，R.;Deiters,A.Org丄ett.2010,12,916-919.[0204][50]Uno,S.N.;Kamiya,M.;化shihara,T.;Sugawara,K.;Okabe,K.sl'arhan'M.C.;sF'unatsu,!'.;Okada,Y.;Tobi1:a,S.;化ano,Y.NatQiem2014,6,681-689.[0205][51]Kao,H.P.；Verkman,A.S.Biophys.J.1994,67,1291-1300.[0206][52]Bullock,S.L.Biochem.Soc.Trans.2011,39,1161-1165.[0207][53]vandenBe;rg,R.;Hoogenraad,C.C.Adv.Exp.Med.Biol.2012,970,173-196.[020引[54]Holt，C.E.;Bullock，S丄.Science2009,326,1212-1216.[0209][55]Belyy,V.；Yildiz,A.FEBSLett.2014,588,3520-3525.[0^0][56]Ishii,Y.;Ishijima,A.;Yanagida,T.lYendsBiotechnol.2001,19,211-216.[0^1][57]DeLaCruz,E.M.;Holzbaur，E丄.J.Cell.Sci.2014,127,2997-2998.[0^2][58]化le，R.D.Cell2003,112,467-480.[0213][59化irokawa'N.;Noda，Y.;Tanaka，Y.;Niwa，S.化t.Rev.Mol.CellBiol.2009,10,682-696.[0^4][60]Be;rnstein,J.G.;Boyden,E.S.lYendsCo即.Sci.(Regul.Ed.)2011,15,592-600.[0215][61]Bernard,C.；Anderson,A.；Becker,A.；Poolos,N.P.；Beck,H.；Johnston,D.Science2004,305,532-535.[0^6][62]Kole,M.H.；IIschner,S.U.；Kampa,B.M.；Wi11iams,S.R.；Ruben,P.C.；Sl:ua;rt,G.J.Nat.化urosci.2008,11,178-186.[0217][63]Dorval，A.D.;怖ite，J.A.J.化urosci.2005,25,10025-10028.[021引[64]White，J.A.;Klink，R.;Alonso,A.;Kay,A.R.J.Neuro地ysiol.1998,80,262-269.[0^9][65]Schneidman,E.；Freedman,B.；Segev,I.NeuralComput1998,10,1679-1703.[0220][66]Tadross，M.R.;Tsien，R.W.;Yue，D.T.Proc.rfetl.Acad.Sci.U.S.A.2013，110,15794-15799.[0221][67]auiai，J.W.;Jung,P.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2003,100,506-510.[0222][68]Cao,Y.Q.;Pie化as-Renteria'E.S.;Smith,G.B.;畑en,G.;化rata,N.C.;Tsien,R.W.Neuron2004,43,387-400.[0223][69]Ianoul,A.；Street,!.；Grant,D.；Pezacki,J.；Taylor,R.S.；Johnston,L.J.Bio地ys.J.2004,87,3525-3535.[0224][70]&rohawn,S.G.;Su,Z.;MacKinnon,R.P;roc.化tl.Acad.Sci.U.S.A.2014,111,3614-3619.[02巧][71]Sasmal，D.K.;Lu，H.P.J.Am.Chem.Soc.2014,136,12998-13005.[0226][72]Borisenko,V.;Lougheed,T.;Hesse,J.;Fureder-Kitzmuller,E.;Fertig,N.;Be虹ends,J.C.;Woolley,G.A.;Schutz,G.J.Biophys.J.2003,84,612-622.[0227][73]Gonzalez,J.E.;0ades,K.;Leychkis,Y.;Harootunian,A.;Negulescu,P.A.DrugDiscov.Today1999,4,431-439.【主權(quán)項(xiàng)】1.一種方法，其包括使多個(gè)瞬時(shí)結(jié)合的核酸探針與其各自靶標(biāo)接觸，其中所述靶標(biāo)被固定在基板上，和檢測探針與所述基板的衍射受限區(qū)域內(nèi)的所述基板的選擇區(qū)域中且僅在其中的靶標(biāo)的結(jié)合，然后照射所述基板的衍射受限區(qū)域以便將所述探針固定至所述基板的選擇區(qū)域，其中所述探針包含光交聯(lián)劑和熒光團(tuán)。2.權(quán)利要求1的方法，其中所述熒光團(tuán)發(fā)射至少104_106個(gè)光子，任選地其中所述熒光團(tuán)是ATT0655。3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述探針進(jìn)一步包含官能團(tuán)或部分。4.權(quán)利要求4的方法，其中所述官能團(tuán)或部分是化學(xué)柄。5.權(quán)利要求4的方法，其中所述官能團(tuán)或部分是生物素、抗生物素蛋白或納米顆粒。6.權(quán)利要求4的方法，其中所述官能團(tuán)或部分是炔烴或疊氮化物。7.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述基板的選擇區(qū)域用366nm至405nm光照射少于1秒或少于0.5秒。8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述基板的選擇區(qū)域是所述基板的選擇面積或選擇體積。9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述光交聯(lián)劑是3-氰基乙烯基咔唑。10.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法是自動(dòng)化的。11.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中使用CCD或EMCCD相機(jī)檢測所述探針與所述靶標(biāo)的結(jié)合。12.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中使用激光點(diǎn)照射器或DMD陣列照射所述衍射受限區(qū)域。13.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述瞬時(shí)結(jié)合的核酸探針長度為8或9個(gè)核苷酸。14.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述靶標(biāo)是或綴合至具有長度為約8或9個(gè)核苷酸的長度的核酸。15.-種方法，其包括使多個(gè)瞬時(shí)結(jié)合的核酸探針與其各自靶標(biāo)接觸，其中所述靶標(biāo)被固定在基板上，和檢測探針與所述基板的衍射受限區(qū)域內(nèi)的所述基板的選擇區(qū)域中且僅在其中的靶標(biāo)的結(jié)合，然后照射所述基板的衍射受限區(qū)域，其中所述探針是包含光可裂解的接頭和熒光團(tuán)的發(fā)夾探針。16.權(quán)利要求15的方法，其中所述熒光團(tuán)發(fā)射至少104-106個(gè)光子，任選地其中所述熒光團(tuán)是ATT0655。17.權(quán)利要求15或16的方法，其中所述探針進(jìn)一步包含官能團(tuán)或部分。18.權(quán)利要求17的方法，其中所述官能團(tuán)或部分是化學(xué)柄。19.權(quán)利要求17的方法，其中所述官能團(tuán)或部分是生物素、抗生物素蛋白或納米顆粒。20.權(quán)利要求17的方法，其中所述官能團(tuán)或部分是炔烴。21.權(quán)利要求15-20中任一項(xiàng)的方法，其中所述基板的選擇區(qū)域用具有等于或小于4Ο5nm的波長的光照射少于1秒或少于0.5秒。22.權(quán)利要求15-20中任一項(xiàng)的方法，其中所述基板的選擇區(qū)域是所述基板的選擇面積或選擇體積。23.權(quán)利要求15-22中任一項(xiàng)的方法，其中所述光可裂解的接頭包含1-(2-硝基苯基）乙基。24.權(quán)利要求15-23中任一項(xiàng)的方法，其中所述方法是自動(dòng)化的。25.權(quán)利要求15-24中任一項(xiàng)的方法，其中使用CCD相機(jī)檢測所述探針與所述靶標(biāo)的結(jié)合。26.權(quán)利要求15-25中任一項(xiàng)的方法，其中使用激光點(diǎn)照射器或DMD陣列照射所述衍射受限區(qū)域?！疚臋n編號(hào)】C12Q1/68GK106062211SQ201480075402【公開日】2016年10月26日【申請(qǐng)日】2014年12月15日【發(fā)明人】R·巴里什,尹鵬【申請(qǐng)人】哈佛學(xué)院院長等