基于雜交瘤技術(shù)和高通量測(cè)序的抗體發(fā)現(xiàn)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種產(chǎn)生結(jié)合至少一種靶抗原的重組抗體的方法，以及由其產(chǎn)生的重組抗體。本發(fā)明的產(chǎn)生抗體的方法將優(yōu)化的高通量抗體測(cè)序方法和雜交瘤抗體篩選技術(shù)相結(jié)合，與傳統(tǒng)的雜交瘤單克隆抗體技術(shù)相比，擴(kuò)大了候選抗體基因的選擇范圍，提高了抗體結(jié)構(gòu)優(yōu)化的效率，增加了獲取功能性抗體的可能性。
【專利說(shuō)明】
基于雜交瘤技術(shù)和高通量測(cè)序的抗體發(fā)現(xiàn)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及一種基于雜交瘤技術(shù)和高通量測(cè)序 產(chǎn)生結(jié)合至少一種靶抗原的重組抗體的方法，以及由該方法所獲得的重組抗體。
【背景技術(shù)】
[0002] 雜交瘤技術(shù)是最常用的抗體挖掘技術(shù)，但是其步驟繁瑣，并且得到單克隆細(xì)胞所 需要的亞克隆過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)、成本高。
[0003] 近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)越來(lái)越多地應(yīng)用于免疫抗體可變區(qū)基因譜的表征分析， 以及抗原特異性抗體的發(fā)現(xiàn)。該方法通過(guò)對(duì)免疫前、后免疫球蛋白基因的高通量測(cè)序，獲得 免疫動(dòng)物的抗體可變區(qū)基因譜。在免疫后顯著富集的抗體基因被認(rèn)為可能與特異性抗原相 關(guān)，選取抗體可變區(qū)基因譜中的高豐度的重鏈和輕鏈基因在體外配對(duì)重組表達(dá)抗體。相比 較抗體基因隨機(jī)配對(duì)表達(dá)，采用高豐度基因配對(duì)可以提高產(chǎn)生功能抗體的效率，減少配對(duì) 的盲目性。此外，還可產(chǎn)生大量的候選序列用于抗體配對(duì)表達(dá)和功能驗(yàn)證，擴(kuò)展功能抗體篩 選池的規(guī)模。相對(duì)于傳統(tǒng)的雜交瘤以及噬菌體展示技術(shù)，該技術(shù)規(guī)避這兩種技術(shù)的局限性， 包括僅適用于鼠和兔等有限的物種，原核表達(dá)系統(tǒng)中的密碼子選擇，后續(xù)需要進(jìn)行人源化 等技術(shù)難點(diǎn)。同時(shí)，抗體組測(cè)序方法可以加速獲取雜交瘤抗體基因的進(jìn)程。無(wú)需得到最終的 單克隆，在寡克隆階段即可收集并測(cè)序;非單克隆序列由二代測(cè)序結(jié)果進(jìn)行校正。相比于傳 統(tǒng)的一代測(cè)序檢測(cè)單/寡克隆抗體信息，可以通過(guò)PCR添加細(xì)胞index序列后，混合用二代測(cè) 序進(jìn)行雜交瘤抗體基因測(cè)序，提高通量，降低成本。
[0004] 然而，此技術(shù)的缺陷在于：1)無(wú)法獲取天然抗體配對(duì)信息；2)單純依靠基因豐度配 對(duì)導(dǎo)致基因配對(duì)方法單一，配對(duì)成功率低，后續(xù)基因合成和配對(duì)篩選工作量大。
[0005] 近年來(lái)，通過(guò)蛋白質(zhì)組技術(shù)分析抗體可變區(qū)多肽的豐度，結(jié)合高通量測(cè)序獲取抗 體基因的序列的方法，已經(jīng)應(yīng)用于抗體生產(chǎn)。采用特異性標(biāo)記分離抗體生產(chǎn)細(xì)胞，通過(guò)高通 量單細(xì)胞抗體測(cè)序技術(shù)可以獲得天然重鏈和輕鏈配對(duì)信息。但是單細(xì)胞抗體測(cè)序和蛋白質(zhì) 組分析對(duì)于生物信息分析方法與實(shí)驗(yàn)條件都有很高的要求，這無(wú)疑增加了抗體發(fā)掘的難 度。此外，抗體可變區(qū)基因譜的獲取也存在一些技術(shù)難度。抗體序列特異性引物的覆蓋度和 引物擴(kuò)增效率不一，導(dǎo)致抗體可變區(qū)基因譜缺失抗體基因信息或者信息存在偏向性，獲得 的高豐度序列不具備抗原特異性;RACE方法建庫(kù)可以克服偏向性，但是擴(kuò)增片段較長(zhǎng)難以 測(cè)通，有可能缺失部分抗體序列信息。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 針對(duì)現(xiàn)有雜交瘤技術(shù)耗時(shí)長(zhǎng)，抗體細(xì)胞系篩選范圍小，難以獲取高親和力單克隆 抗體的缺陷，以及抗體測(cè)序技術(shù)存在的建庫(kù)偏向性以及配對(duì)盲目性等缺陷，本發(fā)明將優(yōu)化 的高通量抗體測(cè)序方法和雜交瘤抗體篩選技術(shù)相結(jié)合，與傳統(tǒng)的雜交瘤單克隆抗體技術(shù)相 比，擴(kuò)大了候選抗體基因的選擇范圍，提高了抗體結(jié)構(gòu)優(yōu)化的效率，增加了獲取功能性抗體 的可能性。
[0007] 本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的：
[0008] 第一方面，本發(fā)明提供了產(chǎn)生結(jié)合至少一種靶抗原的重組抗體的方法，其包括：
[0009] (1)用所述至少一種靶抗原免疫宿主受試者；
[0010] (2)使用經(jīng)免疫的宿主受試者的脾臟細(xì)胞，制備雜交瘤細(xì)胞系，并獲取特異性結(jié)合 所述至少一種祀抗原的雜交瘤抗體基因信息；
[0011] (3)使用免疫后的宿主受試者的淋巴細(xì)胞，進(jìn)行免疫球蛋白基因可變區(qū)的高通量 測(cè)序，獲取針對(duì)所述至少一種靶抗原的抗體可變區(qū)基因譜；
[0012] (4)選取雜交瘤抗體重鏈基因作為第一候選配對(duì)基因，并與從抗體可變區(qū)基因譜 中選擇的輕鏈基因作為第二候選配對(duì)基因進(jìn)行配對(duì)，以產(chǎn)生候選重組抗體。
[0013] 在具體實(shí)施方案中，步驟(2)中，所制備的雜交瘤細(xì)胞系能夠產(chǎn)生與所述靶抗原具 有高親和力的單克隆抗體，優(yōu)選為與靶抗原的結(jié)合常數(shù)不高于10- 9Μ的單克隆抗體。
[0014] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述雜交瘤抗體基因信息包含抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基 因 ?目息。
[0015] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過(guò)以下獲取雜交瘤抗體基因信息：
[0016] 以雜交瘤細(xì)胞總mRNA為模板，Oligo dT為引物，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成CDNA第一鏈，再以 cDNA第一鏈為模板，以混合的特異性引物擴(kuò)增抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因，測(cè)序分 析得到雜交瘤基因序列，將雜交瘤基因序列進(jìn)行IgBlast分析，排除來(lái)源于構(gòu)成雜交瘤的融 合伴侶瘤自身的抗體基因和無(wú)義基因，得到候選重鏈和輕鏈可變區(qū)基因。
[0017] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟(3)中，所述抗體可變區(qū)基因譜包含抗體的重鏈和輕鏈 可變區(qū)基因信息；
[0018] 優(yōu)選地，所述基因信息是通過(guò)高通量DNA測(cè)序確定的；
[00?9]進(jìn)一步優(yōu)選地，所述高通量DNA測(cè)序包括在測(cè)序反應(yīng)的同時(shí)進(jìn)行合成、連接或者雜 交；以及單分子DNA測(cè)序、多聚合酶群落測(cè)序、納米孔測(cè)序或其組合；
[0020] 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述高通量測(cè)序通過(guò)以下實(shí)施：
[0021] 以細(xì)胞總mRNA為模板，使用SMARTer RACE技術(shù)合成第一鏈cDNA;設(shè)計(jì)上游引物，并 根據(jù)抗體恒定區(qū)序列保守區(qū)設(shè)計(jì)下游引物，以擴(kuò)增抗體序列可變區(qū)。
[0022] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，步驟(4)中，從抗體可變區(qū)基因譜中選取包含高豐度CDR3或 者包含與所述高豐度CDR3高度相似的CDR3的輕鏈基因作為第二候選配對(duì)基因。發(fā)明人發(fā) 現(xiàn)，具有高相似度CDR3的輕鏈基因可以與同一條重鏈基因配對(duì)產(chǎn)生功能抗體。
[0023] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在從抗體可變區(qū)基因譜中選定第二候選配對(duì)基因的CDR3 的情況下，通過(guò)以下方法獲得第二候選配對(duì)基因的抗體可變區(qū)：
[0024] 從包含所選定CDR3的抗體基因片段的測(cè)序結(jié)果中，依次選取最高豐度的CDR2和 CDR1片段信息，然后挑選最高豐度的包含選定CDR2和CDR1片段信息的可變區(qū)全長(zhǎng)序列，作 為第二候選配對(duì)基因的抗體可變區(qū)序列。
[0025] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述方法還包括用所述至少一種靶抗原對(duì)所得抗體進(jìn)行鑒 定的步驟，由此產(chǎn)生結(jié)合所述至少一種靶抗原的重組抗體。
[0026] 在具體實(shí)施方案中，所述鑒定步驟包括體外表達(dá)所得抗體的scFv或Fab片段或 IgG，將所得scFv、Fab片段或IgG與祀抗原進(jìn)行結(jié)合力測(cè)試；
[0027] 優(yōu)選地，所述體外表達(dá)方法包含但是不限于:通過(guò)原核細(xì)胞、噬菌體展示方法或酵 母系統(tǒng)表達(dá)scFv或者Fab片段，或者通過(guò)哺乳細(xì)胞外源基因表達(dá)Fab或者IgG;
[0028] 優(yōu)選地，所述測(cè)試方法包括但不限于ELISA和/或SPR。
[0029]在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)"高親和力"是指抗體親和力常數(shù)不高于10-9Μ。
[0030] 在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)"高豐度"是指在抗體可變區(qū)基因譜中的豐度高于1%。
[0031] 在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語(yǔ)"高度相似"是指在氨基酸水平上與待比較的對(duì)象具有 高于80 %的序列同一性。
[0032] 第二方面，本發(fā)明提供了一種根據(jù)上述第一方面所述的方法制得的重組抗體。
[0033] 在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，發(fā)明人獲得了特異性靶向ΗΑ的功能性重組抗 體，所述重組抗體的重鏈可變區(qū)包括如SEQ ID Ν0:40，42和50所示的⑶R3，并且所述重組抗 體的輕鏈可變區(qū)包括如SEQ ID N0:20,53,68和103所示的CDR3。
[0034] 在本發(fā)明的另一個(gè)具體實(shí)施方案中，發(fā)明人獲得了特異性靶向PD-L1的功能性重 組抗體，所述重組抗體的重鏈可變區(qū)包括如SEQ ID N0:84所示的⑶R3，并且所述重組抗體 的輕鏈可變區(qū)包括如SEQ ID N0:23,89和105所示的CDR3。
[0035] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：
[0036] 本發(fā)明結(jié)合雜交瘤技術(shù)與抗體測(cè)序技術(shù)，通過(guò)特定的選擇方式，將從雜交瘤中獲 取的抗體重鏈基因和抗體可變區(qū)基因譜中獲取的輕鏈基因配對(duì)表達(dá)，獲取功能性抗體。所 采用的優(yōu)化的抗體文庫(kù)制備流程，可以完整地獲取免疫受試者的抗體可變區(qū)基因譜，實(shí)驗(yàn) 結(jié)果具有很高的重復(fù)性;所采用的優(yōu)化的生物信息學(xué)分析方法可以快速地獲取CDR3的豐度 信息和準(zhǔn)確的抗體基因可變區(qū)全長(zhǎng)信息。相比較雜交瘤技術(shù)和單純依靠抗體基因豐度選擇 配對(duì)候選序列的方法，本發(fā)明的抗體發(fā)現(xiàn)方法可以提高候選配對(duì)基因的選擇范圍，克服配 對(duì)盲目性的問(wèn)題，提高成功配對(duì)獲得功能性抗體的效率。
【附圖說(shuō)明】
[0037]圖1顯示本發(fā)明的產(chǎn)生重組抗體的方法的流程圖。
[0038]圖2顯示實(shí)施例2中擴(kuò)增的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中， VH表示重鏈可變區(qū)，VL表示輕鏈可變區(qū)，Μ表示D2000marker(Takara)。
[0039]圖3顯示實(shí)施例2所制備重鏈和輕鏈可變區(qū)測(cè)序文庫(kù)的Bioanalyzer鑒定結(jié)果。 [0040]圖4顯示樣品GW02-5的骨髓和脾臟組織之間⑶RH3豐度的相關(guān)性。
[00411圖5顯示樣品GW02-5的骨髓和脾臟組織之間⑶RL3豐度的相關(guān)性。
[0042]圖6顯示樣品GW02-3的各個(gè)脾臟組織重復(fù)之間⑶RH3豐度的相關(guān)性。
[0043]圖7顯示樣品GW02-3的各個(gè)脾臟組織重復(fù)之間⑶RL3豐度的相關(guān)性。
[0044]圖8顯示樣品GW02-5的各個(gè)脾臟組織重復(fù)之間⑶RH3豐度的相關(guān)性。
[0045]圖9顯示樣品GW02-5的各個(gè)脾臟組織重復(fù)之間⑶RL3豐度的相關(guān)性。
[0046]圖10顯示GW01抗原多肽與配對(duì)抗體之間的親和力分析；圖內(nèi)數(shù)值表示0D490nm波 長(zhǎng)吸收值;圖內(nèi)錐形基部實(shí)線表示雜交瘤抗體天然配對(duì)。
[0047]圖11顯示GW02抗原多肽與配對(duì)抗體之間的親和力分析；圖內(nèi)數(shù)值表示0D490nm波 長(zhǎng)吸收值;圖內(nèi)錐形基部實(shí)線表示雜交瘤抗體天然配對(duì)。
[0048] 圖12為顯示GW01抗原和GW02抗原的抗體配對(duì)效率的結(jié)果示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0049] 為便于理解本發(fā)明，以下通過(guò)列舉具體實(shí)施方案及具體實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明 本發(fā)明的技術(shù)方案。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明了，所列舉的具體實(shí)施方案和實(shí)施例僅僅是幫 助理解本發(fā)明，不應(yīng)被視為對(duì)本發(fā)明的具體限制。
[0050] 例如，在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明采用如下程序：
[0051] 1)采用標(biāo)準(zhǔn)免疫程序在第0天和第21天兩次免疫小鼠，取免疫前小鼠血清作為陰 性對(duì)照;初次免疫后第35天取血檢測(cè)血清滴度，對(duì)血清滴度達(dá)到融合要求的小鼠加強(qiáng)免疫， 初次免疫后第38天進(jìn)行細(xì)胞融合制備雜交瘤。融合后10-14天左右，取雜交瘤上清進(jìn)行克 隆檢測(cè)，分離亞克隆，篩選親和力最高的亞克隆。
[0052] 2)以雜交瘤細(xì)胞的mRNA為模板，Oligo dT為引物，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，再以 cDNA第一鏈為模板，使用重鏈和輕鏈簡(jiǎn)并引物PCR擴(kuò)增VH和VL基因 （Ti 1 ler等人，2009)，所 用引物序列見(jiàn)以下表1。采用標(biāo)準(zhǔn)PCR程序擴(kuò)增雜交瘤抗體序列可變區(qū)，PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序， 將抗體基因進(jìn)行IgBlast分析，剔除假基因以及提前中止的基因。
[0053]表 1
[0054]
[0055] 3)采用Trizol裂解脾臟和骨髓細(xì)胞并提取RNA，使用SMARTer RACE(Clontech)技 術(shù)合成第一鏈cDNA;設(shè)計(jì)上游引物并根據(jù)抗體恒定區(qū)序列保守區(qū)設(shè)計(jì)下游引物，擴(kuò)增抗體 序列可變區(qū)。以cDNA鏈5'末端共有一段序列設(shè)計(jì)正向通用引物，并在正向通用引物5'末端 連接Illunina MiSeq正向測(cè)序接頭。根據(jù)小鼠恒定區(qū)保守序列反向引物，并在引物3端附加 Illumina MiSeq反向測(cè)序接頭。引物序列信息見(jiàn)表2。
[0056] 表2
[0057]
[0058]
[0059] 擴(kuò)增重鏈和輕鏈序列可變區(qū)，采用Illumina Miseq 2X250測(cè)序，整理數(shù)據(jù)后進(jìn)行 IgBlas分析，獲取互補(bǔ)決定區(qū)3(complementary determining region 3，CDR3)的氨基酸序 列，根據(jù)序列的豐度排名，挑選包含高豐度CDR3或者包含與所述高豐度CDR3高度相似的 CDR3的抗體輕鏈基因作為輕鏈候選配對(duì)基因（即，本文中所述"第二候選配對(duì)基因"）；選取 雜交瘤重鏈基因作為重鏈候選配對(duì)基因（即，本文中所述"第一候選配對(duì)基因"）；將所選擇 的重鏈候選配對(duì)基因與輕鏈候選配對(duì)基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中配對(duì)表達(dá)，測(cè)試配對(duì)抗體與特 異抗原的親合力。
[0060] 實(shí)施例1雜交瘤抗體序列的分離和鑒定 [0061 ]采用如下程序：
[0062] (1)擴(kuò)大培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞，使其在融合時(shí)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。融合當(dāng)天，收集細(xì)胞，計(jì) 數(shù)，備用。
[0063] (2)取血清滴度達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的血凝集素 HA抗原多肽(下文以代號(hào)GW01表示)和免疫檢 查點(diǎn)ro-Ll抗原多肽(下文以代號(hào)GW-02表示)各2只免疫小鼠制備雜交瘤，分別命名為6101_ 1，GW01 -3和GW0 2-3，GW0 2-5。摘除小鼠眼球采血，并分離血清作為抗體檢測(cè)時(shí)的陽(yáng)性對(duì)照血 清。拉頸處死小鼠，無(wú)菌取小鼠脾臟，分離脾細(xì)胞并裂解紅細(xì)胞，得到純凈的B淋巴細(xì)胞。細(xì) 胞融合將骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞以適當(dāng)?shù)谋壤旌希谌诤蟿┳饔孟率箖煞N細(xì)胞融合。融 合后的細(xì)胞用HAT培養(yǎng)基重懸后，分裝含有巨噬細(xì)胞的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。置37°(：，5^^0 2培 養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。融合后的細(xì)胞用HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)2周后用換HT培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2周，然后換 R1640完全培養(yǎng)基。
[0064] (3)融合后10-14天左右，取雜交瘤上清進(jìn)行第一次克隆檢測(cè)，孔中換新鮮培養(yǎng)基。 繼續(xù)培養(yǎng)3天，取雜交瘤上清進(jìn)行第二次克隆檢測(cè)，孔中換新鮮培養(yǎng)基。將陽(yáng)性克隆擴(kuò)大培 養(yǎng)至48孔板。同時(shí)將陽(yáng)性克隆進(jìn)行克隆化，即將陽(yáng)性克隆進(jìn)行稀釋，按每孔1個(gè)細(xì)胞接種一 塊96孔板，200ul/孔。繼續(xù)培養(yǎng)3天，取雜交瘤上清進(jìn)行第三次克隆檢測(cè)，同時(shí)擴(kuò)大培養(yǎng)陽(yáng)性 克隆。凍存陽(yáng)性克隆細(xì)胞株，同時(shí)收集上清進(jìn)行亞型鑒定。
[0065] (4)將鑒定過(guò)的具有高親和力的23個(gè)GW01和18個(gè)GW02單克隆雜交瘤細(xì)胞系復(fù)蘇 后，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)至1 X 107個(gè)細(xì)胞，用1'1^2〇1(1]1￥；[1：1'(^611公司）提取總1?嫩，按廠家說(shuō)明書(shū)進(jìn) 行。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScriptIII(Life Technologies)將2yg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第1 鏈，按廠家說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。使用通用型引物克隆抗體重、輕鏈可變區(qū)基因，通用型引物見(jiàn)上文 表1;以輕鏈可變區(qū)基因克隆為例，等量混合輕鏈引物，取2μ1混合引物，2μ1 cDNA為模板， pfu酶(GENEWIZ)制備反應(yīng)體系，反應(yīng)程序是預(yù)變性98°CC 30s后，進(jìn)行98°CC 8秒，58°CC 15 秒，72°CC 30秒共30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增程序，然后72°CC保溫2分鐘。采用BciVI去除無(wú)功能的輕 鏈基因，酶切體系如下:BciVI，ΙμL，PCR產(chǎn)物lyg，10倍緩沖液5μ1然后補(bǔ)水至50μ1，37°CC酶 切過(guò)夜，電泳回收并純化400bp左右的片段，并將其克隆至T載體，測(cè)序鑒定輕鏈序列。采用 相似步驟，采用重鏈引物PCR擴(kuò)增重鏈可變區(qū)基因。瓊脂糖凝膠電泳分離PCR產(chǎn)物，回收純化 400bp-500bpPCR產(chǎn)物，并將其克隆至測(cè)序載體以進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)得的序列輸入MGT數(shù)據(jù)庫(kù) 進(jìn)行分析，排除來(lái)源于構(gòu)成雜交瘤的融合伴侶瘤自身的抗體基因和無(wú)義基因，得到重鏈和 輕鏈基因的可變區(qū)。
[0066] 實(shí)施例2抗體測(cè)序文庫(kù)的制備及抗體序列的分析
[0067] 分別采用實(shí)施例1制備雜交瘤余下的脾臟組織以及來(lái)自同一只免疫小鼠的骨髓細(xì) 胞，進(jìn)行抗體測(cè)序文庫(kù)的制備。
[0068] 具體地，將所述脾臟組織在液氮中研磨，提取總RNA，具體提取程序按提取試劑的 廠家說(shuō)明書(shū)進(jìn)行;從同一只經(jīng)免疫的小鼠中采集脛骨和股骨除去肌肉和脂肪組織，用注射 器將Trizol注入骨內(nèi)清洗出骨髓并收集在離心管當(dāng)中，提取總RNA，具體提取程序按提取試 劑的廠家說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
[0069] 采用抗體可變區(qū)上游引物和重鏈和輕鏈可變區(qū)下游引物，以樣品5 ' RACE產(chǎn)物為模 板，分別擴(kuò)增重鏈和輕鏈可變區(qū)，制備重鏈和輕鏈可變區(qū)的測(cè)序文庫(kù)。
[0070] PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序分別見(jiàn)以下表3和表4。
[0071] 表3
[0072]
[0076] 在擴(kuò)增產(chǎn)物末端通過(guò)PCR的方法添加 Barcode，用于區(qū)分不同樣品的測(cè)序結(jié)果。PCR 擴(kuò)增體系和擴(kuò)增程序分別見(jiàn)以下表5和表6。
[0077] 表 5
[0078]
[0079] 表 6
[0080]
[0081 ] 擴(kuò)增產(chǎn)物的純化：在PCR產(chǎn)物中加入0.8倍體積的AMPure Beads，混勻室溫靜置 5min;瞬時(shí)離心后置于磁力架上5分鐘；棄上清液，加70 %無(wú)水乙醇洗兩遍后小心棄去殘余 乙醇，室溫放置10分鐘待乙醇揮發(fā)完全。加入30μ1 10mM Tris(pH8.0)混勻beads，室溫靜 置5分鐘，洗脫DNA并轉(zhuǎn)移至新管中。
[0082]由上述PCR擴(kuò)增所得重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果如圖2所示。 [0083] 此外，使用Agilent 2100Bioanalyzer分析系統(tǒng)檢測(cè)文庫(kù)插入片段大小及含量，所 得重鏈和輕鏈可變區(qū)文庫(kù)的Bioanalyzer鑒定結(jié)果如圖3所示。
[0084] 使用Illumina MiSeq 2X250(GENEWIZ)進(jìn)行高通量測(cè)序。對(duì)重鏈和輕鏈可變區(qū)文 庫(kù)的每一個(gè)設(shè)定適量的測(cè)序數(shù)，數(shù)據(jù)產(chǎn)生后，去除掉不完全序列，將完整的包含CDR3的R2序 列進(jìn)行IgBlast比對(duì)，產(chǎn)生⑶R3區(qū)氨基酸序列信息庫(kù)。由于⑶R3序列是不同抗體基因接近唯 一的標(biāo)示符，可以依據(jù)獲得的CDR3序列的數(shù)量評(píng)估其在抗體可變區(qū)基因譜中的豐度。以樣 品GW02-5為例，比較來(lái)自于脾臟和骨髓的抗體可變區(qū)基因譜(見(jiàn)圖4-5,表7-8)，結(jié)果表明兩 種組織中⑶RH3或⑶RL3豐度的相關(guān)性相近，R 2值分別為0.69和0.71;其中排名位于抗體可 變區(qū)基因譜前十位的高豐度CDR3的相關(guān)性較低，這意味著在強(qiáng)化免疫條件下，高通量測(cè)序 結(jié)果可以反映骨髓與脾臟組織中抗體細(xì)胞種類和數(shù)量的差異。
[0085] 表 7
[0086]
[0087]
[0088]
[0089]
[0090]
[0091] 此外，還比較了各個(gè)重復(fù)間的CDRH3和CDRL3氨基酸序列豐度的相關(guān)性（見(jiàn)圖6-圖 9)，結(jié)果顯示各個(gè)重復(fù)間的CDRH3和CDRL3序列豐度具有很高的相關(guān)性，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)體系是穩(wěn) 定的。
[0092] 實(shí)施例3雜交瘤和抗體可變區(qū)基因譜序列的比較以及候選配對(duì)序列的選擇
[0093] 總計(jì)分析了 18個(gè)GW02和23個(gè)GW01單克隆雜交瘤細(xì)胞系，提交雜交瘤抗體基因可變 區(qū)進(jìn)行IgBlast，確定⑶R3H和⑶R3L片段信息。將⑶R3H和⑶R3L與對(duì)應(yīng)的抗體可變區(qū)基因譜 比較，大部分雜交瘤⑶R3H和⑶R3L都包含在抗體可變區(qū)基因譜當(dāng)中，而且部分⑶R3對(duì)應(yīng)的 測(cè)序條數(shù)超過(guò)測(cè)序總條數(shù)的1%，屬于高豐度CDR3。高豐度CDR3的數(shù)目以及雜交瘤CDR3在抗 體可變區(qū)基因譜中的比例見(jiàn)以下表9。
[0094] 表 9
[0095]
[0096] 表9中，CDR3>1% :超過(guò)抗體測(cè)序條數(shù)1%的雜交瘤⑶R3的數(shù)量;CDR3數(shù)量:選取的 雜交瘤CDR3數(shù)量；％總測(cè)序條數(shù):雜交瘤CDR3在抗體測(cè)序條數(shù)中的比例。
[0097] 進(jìn)一步的分析表明，雜交瘤天然配對(duì)⑶R3H和⑶R3L在抗體庫(kù)中的豐度并不均一。 部分0)1?3!1和0)1?31^的豐度相近，例如樣品6101-3-11/6101-3-30)1?3!1了1^0￥的豐度為 9.58%，配對(duì)CDR3L WQGTHFPWT的豐度為5.57% ;部分配對(duì)的豐度差別較大，以樣品GW02-5 為例，GW02-5-191 和GW02-5-231 的CDR3H ARAYGDYGFIY和ASLLDF，它們的豐度分別為6 · 78 % 和3.02 % ;但是配對(duì)CDR3L FQGSLAPST和LQYDEIPYT的豐度分別為0.22 %和0.23 % ;此外， GW02-5-5/5-24/5-43和GW02-5-10的CDR3L WQGTHFPWT和QQYNSYPLT的豐度分別8·64%和 7.21 %，配對(duì)CDR3H的豐度為0.58 %和接近為0。而且WQGTHFPWT和QQYNSYPLT在兩個(gè)抗原GW-01和GW-02中都以高豐度存在。由此我們推測(cè)抗體基因可能具有多種配對(duì)形式，包含高豐度 CDR3的抗體基因，或者包含高豐度和低豐度CDR3抗體基因間都可能配對(duì)形成功能性抗體。 以下表10-表13為各個(gè)雜交瘤序列在抗體庫(kù)中的豐度分析結(jié)果。
[0098]表1〇
[0100]
[0101]表11
[0109]
[0110] 上述表格中，VH:重鏈可變區(qū);VL:輕鏈可變區(qū)。
[0111] 針對(duì)兩個(gè)抗原選取6條雜交瘤抗體重鏈基因，與抗體可變區(qū)基因譜中包含高豐度 CDR3的輕鏈基因以及天然配對(duì)的雜交瘤抗體輕鏈基因在體外配對(duì)表達(dá)。選擇的雜交瘤重鏈 基因 CDR3都同時(shí)存在于抗體可變區(qū)基因譜當(dāng)中，而且其中三條CDR3，TRGDY， ARS⑶AYYFAWFAY和ARGGGA在抗體可變區(qū)基因譜當(dāng)中的排名分別為第1，2和10位;其余三條 CDR3屬于低豐度CDR3。其對(duì)應(yīng)的抗體天然配對(duì)輕鏈中的2條包含高豐度CDR3其余4條包含低 豐度。選取的包含高豐度CDR3的輕鏈候選配對(duì)基因在至少一個(gè)免疫受體抗體可變區(qū)基因譜 中排名位于前十位。
[0112] GW01和GW02候選⑶R3H和⑶R3L配對(duì)基因信息分別見(jiàn)以下表14和表15。表14
[0116]
[0117] 候選配對(duì)基因全長(zhǎng)信息來(lái)源于雜交瘤基因測(cè)序，或者通過(guò)抗體可變區(qū)全長(zhǎng)序列挑 選方法獲取，例如輕鏈基因可變區(qū)K10和K11，首先在基因可變區(qū)測(cè)序結(jié)果中確定候選CDR3 序列，繼爾依次挑選最高豐度⑶R2和⑶R1序列，以此確定⑶R1，CDR2和⑶R3的序列信息，然 后從測(cè)序結(jié)果中獲取包含確定CDR1，CDR2和CDR3的最高豐度片段，獲取抗體可變區(qū)全長(zhǎng)氨 基酸序列和核苷酸序列信息。在體外從頭合成抗體基因并配對(duì)表達(dá)。
[0118] 比較了候選配對(duì)輕鏈基因的CDR3區(qū)序列，在部分基因具有較高的相似性，例如K5， K8，K9，K10之間的相似性達(dá)到78%-89%，它們有可能是在抗體形成過(guò)程中形成的超變異 體，在抗體可變區(qū)基因譜中的富集可能意味著他們與特異性抗原相關(guān)。
[0119] 實(shí)施例4GW01和GW02配對(duì)抗體的體外表達(dá)
[0120] 將候選重鏈和輕鏈的可變區(qū)通過(guò)搭橋PCR的方法構(gòu)建表達(dá)框，表達(dá)框包括啟動(dòng)子， 可變區(qū)和人抗體恒定區(qū)。將包含重鏈和輕鏈表達(dá)框的質(zhì)粒配對(duì)轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞，進(jìn)行體外表 達(dá)和抗體功能分析。收集293FT細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度接種48孔板至1.2Χ10 5/孔;37°C，5% C02孵箱培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞密度長(zhǎng)至60-80%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將0.25以8重鏈和0.75以 8輕鏈質(zhì)粒 在室溫孵育5分鐘，然后與轉(zhuǎn)染試劑混勻后在室溫孵育20min形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將轉(zhuǎn)染復(fù)合 物加入細(xì)胞孔，輕輕混勻。37°C，5%C0 2孵箱培養(yǎng)72小時(shí)。收集上清用ELISA檢測(cè)活性。首先 將抗人18〇$(：)與檢測(cè)抗原分別用?!19.6碳酸包被液稀釋成1(^8/1111，96孔酶標(biāo)板每孔包 被100μ1，4Γ，過(guò)夜;或者37°C，2小時(shí);然后用4%脫脂奶粉-PBS封閉，300μ1/孔，37°C處理1 ~2小時(shí)。丟棄酶標(biāo)孔內(nèi)液體，用TOST洗三遍后加入轉(zhuǎn)染48小時(shí)培養(yǎng)上清100μΙ/孔，37 °C處 理1小時(shí)，設(shè)定培養(yǎng)基和對(duì)照。丟棄酶標(biāo)孔內(nèi)液體，用PBST洗三遍，分別加入HRP羊抗人 186$(3)，1 :2000;與冊(cè)?羊抗人186，1:5000;10(^1/孔，37°(：處理11^。棄酶標(biāo)孔內(nèi)液體，用 PBST洗五遍，加入(PD顯色液，100μΙ/孔，避光顯色;酶標(biāo)儀讀取0D490波長(zhǎng)吸收值。
[0121] 抗原GW01和GW02的配對(duì)抗體親和力分析結(jié)果分別如圖10和11所示，抗原GW01和 GW02的抗體配對(duì)效率分析結(jié)果分別如圖12所示。
[0122] 結(jié)果顯示，源于兩個(gè)免疫宿主受試者的44個(gè)重鏈/輕鏈配對(duì)當(dāng)中，獲得7個(gè)具有親 和力的抗體，其中有3個(gè)是雜交瘤抗體基因天然配對(duì);其余4個(gè)是雜交瘤重鏈基因與包含高 豐度⑶R3輕鏈的重組配對(duì)，重鏈基因 GW02-5-H2與3條輕鏈Κ5，Κ9和ΚΙ 1配對(duì)都形成具有親和 力的抗體，其中QQYNSYPLT(K5)在兩種靶抗原免疫宿主受試者的可變區(qū)基因譜當(dāng)中都屬于 高豐度CDR3L，它與QQYNSYPFT(K9)CDR3的相似度為89%，基因可變區(qū)的相似度為84%，意味 著具有高相似度CDR3的輕鏈基因可能與同一個(gè)重鏈配對(duì)，形成功能抗體。也意味著可以采 用配對(duì)抗體CDR3區(qū)相似度高的序列形成一個(gè)小型文庫(kù)，直接為抗體的親和力成熟提供優(yōu)化 的選擇。
[0123] 6個(gè)雜交瘤天然配對(duì)中的3個(gè)如預(yù)期產(chǎn)生了有親和力的抗體，說(shuō)明雜交瘤抗體序列 的鑒定是準(zhǔn)確的，體外配對(duì)表達(dá)和Elisa實(shí)驗(yàn)方法也是有效的。
[0124] 以上這些結(jié)果說(shuō)明，結(jié)合雜交瘤抗體技術(shù)與高通量抗體測(cè)序技術(shù)，選取雜交瘤重 鏈基因與從抗體可變區(qū)基因譜中高豐度CDR3輕鏈基因配對(duì)表達(dá)，可以擴(kuò)大配對(duì)候選基因的 選擇范圍，提高抗體結(jié)構(gòu)優(yōu)化的效率，增加了獲取功能性抗體的可能性。雜交瘤重鏈GW02-5H2可以與多個(gè)高豐度輕鏈配對(duì)產(chǎn)生親和力抗體，說(shuō)明某些重鏈基因也具有較好的配對(duì)特 性，可能與多個(gè)具有高相似度CDR3的輕鏈基因配對(duì)產(chǎn)生功能性抗體。
[0125]
【申請(qǐng)人】聲明，本發(fā)明通過(guò)上述實(shí)施例來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的產(chǎn)品、詳細(xì)制備工藝及其用 途，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)制備工藝和用途，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì) 制備工藝和用途才能實(shí)施。所屬技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對(duì)本發(fā)明的任何改進(jìn)，對(duì)本 發(fā)明產(chǎn)品各原料的等效替換及輔助成分的添加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù) 范圍和公開(kāi)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種產(chǎn)生結(jié)合至少一種靶抗原的重組抗體的方法，其包括： (1) 用所述至少一種靶抗原免疫宿主受試者； (2) 使用經(jīng)免疫的宿主受試者的脾臟細(xì)胞，制備雜交瘤細(xì)胞系，并獲取特異性結(jié)合所述 至少一種靶抗原的雜交瘤抗體基因信息； (3) 使用免疫后的宿主受試者的淋巴細(xì)胞，進(jìn)行免疫球蛋白基因可變區(qū)的高通量測(cè)序， 獲取針對(duì)所述至少一種靶抗原的抗體可變區(qū)基因譜； (4) 選取雜交瘤抗體重鏈基因作為第一候選配對(duì)基因，并與從抗體可變區(qū)基因譜中選 擇的輕鏈基因作為第二候選配對(duì)基因進(jìn)行配對(duì)，以產(chǎn)生候選重組抗體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，步驟(2)中，所制備的雜交瘤細(xì)胞系產(chǎn)生與所述靶 抗原具有高親和力的單克隆抗體； 優(yōu)選地，所述雜交瘤抗體基因信息包含抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因信息； 優(yōu)選地，通過(guò)以下獲取雜交瘤抗體基因信息： 以雜交瘤細(xì)胞總mRNA為模板，01 igo dT為引物，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，再以cDNA第 一鏈為模板，以混合的特異性引物擴(kuò)增抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因，測(cè)序分析得到 雜交瘤基因序列，將雜交瘤基因序列進(jìn)行IgBlast分析，排除來(lái)源于構(gòu)成雜交瘤的融合伴侶 瘤自身的抗體基因和無(wú)義基因，得到候選重鏈和輕鏈可變區(qū)基因。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中，步驟(3)中，所述抗體可變區(qū)基因譜包含抗體 的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因信息； 優(yōu)選地，所述基因信息是通過(guò)高通量DNA測(cè)序確定的； 進(jìn)一步優(yōu)選地，所述高通量DNA測(cè)序包括在測(cè)序反應(yīng)的同時(shí)進(jìn)行合成、連接或者雜交； 以及單分子DNA測(cè)序、多聚合酶群落測(cè)序、納米孔測(cè)序或其組合； 優(yōu)選地，所述高通量測(cè)序通過(guò)以下實(shí)施： 以細(xì)胞總mRNA為模板，使用SMARTer RACE技術(shù)合成第一鏈cDNA;設(shè)計(jì)上游引物，并根據(jù) 抗體恒定區(qū)序列保守區(qū)設(shè)計(jì)下游引物，以擴(kuò)增抗體序列可變區(qū)。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的方法，其中，步驟(4)中，從抗體可變區(qū)基因譜中選取 包含高豐度CDR3或者包含與所述高豐度CDR3高度相似的CDR3的輕鏈基因作為第二候選配 對(duì)基因。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其中，在從抗體可變區(qū)基因譜中選定第二候選 配對(duì)基因的CDR3的情況下，通過(guò)以下方法獲得第二候選配對(duì)基因的抗體可變區(qū)： 從包含所選定CDR3的抗體基因片段的測(cè)序結(jié)果中，依次選取最高豐度的CDR2和CDR1片 段信息，然后挑選最高豐度的包含選定CDR2和CDR1片段信息的可變區(qū)全長(zhǎng)序列，作為第二 候選配對(duì)基因的抗體可變區(qū)序列。6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的方法，其中，還包括用所述至少一種靶抗原對(duì)所得抗 體進(jìn)行鑒定的步驟。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，所述鑒定步驟包括體外表達(dá)所得抗體的scFv或Fab片段 或IgG，將所得scFv、Fab片段或IgG與祀抗原進(jìn)行結(jié)合力測(cè)試； 優(yōu)選地，所述體外表達(dá)方法包含但是不限于:通過(guò)原核細(xì)胞、噬菌體展示方法或酵母系 統(tǒng)表達(dá)scFv或者Fab片段，或者通過(guò)哺乳細(xì)胞外源基因表達(dá)Fab或者IgG; 優(yōu)選地，所述測(cè)試方法包括但不限于ELISA和/或SPR。8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的方法制得的重組抗體。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組抗體，其為特異性靶向HA的重組抗體，所述重組抗體的重 鏈可變區(qū)包括如SEQ ID NO:40,42和50所示的⑶R3,并且所述重組抗體的輕鏈可變區(qū)包括 如SEQ ID 從)：20,53,68和103所示的〇)1?3。10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組抗體，其為特異性靶向ro-Li的重組抗體，所述重組抗體 的重鏈可變區(qū)包括如SEQ ID NO:84所示的⑶R3,并且所述重組抗體的輕鏈可變區(qū)包括如 SEQ ID 從)：23,89和105所示的〇)1?3。
【文檔編號(hào)】C07K16/28GK106065031SQ201610023897
【公開(kāi)日】2016年11月2日
【申請(qǐng)日】2016年1月14日 公開(kāi)號(hào)201610023897.9, CN 106065031 A, CN 106065031A, CN 201610023897, CN-A-106065031, CN106065031 A, CN106065031A, CN201610023897, CN201610023897.9
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