磷酸肌酸鈉的藥物組合物及其在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了磷酸肌酸鈉的藥物組合物及其在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用，本發(fā)明提供的磷酸肌酸鈉的藥物組合物中含有磷酸肌酸鈉和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物化合物(Ⅰ)，磷酸肌酸鈉、化合物(Ⅰ)單獨(dú)作用時(shí)，對(duì)肺癌具有抑制作用；磷酸肌酸鈉和化合物(Ⅰ)聯(lián)合作用時(shí)，對(duì)肺癌的抑制效果進(jìn)一步提高，可以開發(fā)成治療肺癌的藥物，與現(xiàn)有技術(shù)相比具有突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步。
【專利說明】
磯酸肌酸納的藥物組合物及其在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，設(shè)及憐酸肌酸鋼的新用途，具體設(shè)及憐酸肌酸鋼的藥 物組合物及其在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 憐酸肌酸鋼是臨床常用的屯、肌保護(hù)劑、運(yùn)動(dòng)員運(yùn)補(bǔ)劑。憐酸肌酸廣泛地分布于身 體各組織，90%在肌肉組織中，憐酸肌酸是用來維持ATP水平的。憐酸肌酸通過開放合成通 路和減少分解作用，保護(hù)肌纖維膜免受缺血損害并維持細(xì)胞的核著酸儲(chǔ)油。臨床用于屯、麻 搏癥的屯、臟保護(hù)及屯、肌代謝窘迫的其他狀況。適用于屯、肌缺血、肥厚、屯、梗及屯、衰的治療 (輔助治療）。亦可用作各種屯、臟手術(shù)。
[0003] 迄今為止，尚未見憐酸肌酸鋼及其藥物組合物與肺癌的相關(guān)性報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種憐酸肌酸鋼的藥物組合物，該藥物組合物中含有憐酸 肌酸鋼和一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，憐酸肌酸鋼和該天然產(chǎn)物可W協(xié)同治療肺癌。
[0005] 本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得W實(shí)現(xiàn)的：
[0006] -種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物(I)，
[0007]
[000引一種憐酸肌酸鋼的藥物組合物，包括憐酸肌酸鋼、如權(quán)利要求1所述的化合物（I) 和藥學(xué)上可W接受的載體，制備成需要的劑型。
[0009] 進(jìn)一步地，藥學(xué)上可W接受的載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、 崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載體或潤(rùn)滑劑。
[0010] 進(jìn)一步地，所述劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、 膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。
[0011] 上述化合物（I)的制備方法，包含W下操作步驟：（a)將杜仲葉粉碎，用65~85%乙 醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油酸、乙酸乙醋和水飽和的正下醇萃 取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物；（b)步驟(a)中正下醇萃取物 用大孔樹脂除雜，先用6%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用70%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，收集70%洗 脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（C)步驟(b)中70%乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分 離，依次用體積比為50:1、25:1、15:1和5:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；（d)步 驟山）中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為10:1、5:1和2:1的二氯甲燒-甲醇梯 度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百 分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化 合物(I)。
[0012] 進(jìn)一步地，化合物(I)的制備方法中，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
[0013] 上述化合物(I)在制備治療肺癌的藥物中的應(yīng)用。
[0014] 上述憐酸肌酸鋼的藥物組合物在制備治療肺癌的藥物中的應(yīng)用。
[001引本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：
[0016] 本發(fā)明提供的憐酸肌酸鋼的藥物組合物中含有憐酸肌酸鋼和一種結(jié)構(gòu)新穎的天 然產(chǎn)物，憐酸肌酸鋼和該天然產(chǎn)物單獨(dú)作用時(shí)，對(duì)肺癌具有治療作用；二者聯(lián)合作用時(shí)，對(duì) 肺癌的治療效果進(jìn)一步提高，可W開發(fā)成治療肺癌的藥物。
【具體實(shí)施方式】
[0017] 下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不W此限定本發(fā)明保護(hù)范 圍。
[0018] 實(shí)施例1:化合物(I)分離制備及結(jié)構(gòu)確證
[0019] 分離方法：（a)將杜仲葉（3kg)粉碎，用75%乙醇熱回流提取(2化X3次），合并提取 液，濃縮至無醇味（化），依次用石油酸(化X3次）、乙酸乙醋（化X3次）和水飽和的正下醇 (化X3次）萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物；（b)步驟(a)中 正下醇萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用6%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用70%乙醇洗脫8個(gè) 柱體積，收集70 %洗脫液，減壓濃縮得70 %乙醇洗脫濃縮物；（C)步驟(b)中70 %乙醇洗脫濃 縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為50:1(8個(gè)柱體積）、25:1(8個(gè)柱體積）、15:1(8個(gè)柱體 積)和5:1(10個(gè)柱體積）的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；（d)步驟(C)中組分4用正 相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為10:1(8個(gè)柱體積）、5:1(10個(gè)柱體積)和2:1(5個(gè)柱體 積)的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反 相硅膠分離，用體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個(gè)柱體積洗脫液， 洗脫液減壓濃縮得到化合物(IKHPLC歸一化純度大于98% )。
[0020] 結(jié)構(gòu)確證:皿斗51-15顯示[1+化]+為111八455.2045，結(jié)合核磁特征可得分子式為 C2姐32〇7，不飽和度為9。核磁共振氨譜數(shù)據(jù)SH(ppm，CDCb，500MHz): H-la(1.27，m)，H-lb (1.51，m)，H-2a(1.81，m)，H-2b(1.93，m)，H-3(5.91，br，s)，H-5(3.02，d，J=1.3Hz)，H-6 (6.83，d，J=1.3Hz)，H-9(2.36，m，2H)，H-12a(6.29，d，J = 9.6Hz)，H-12b(6.56，d，J = 9.6Hz)，H-13(1.88，s)，H-14(0.99，s)，H-15(1.56，s)，H-3，（5.14，q，J=6.3Hz)，H-4' (1.32，d J = 6.3Hz)，H-5a'（6.33，dj= 12.3Hz)，H-化'（6.62，dj = 12.3Hz)，4-AcO( 1.96， s)，3'-Ac0(l. 99，s);核磁共振碳譜數(shù)據(jù) Sc(ppm，CDCl3,125MHz) :31.8(C 出，1-C)，22.8(C 出， 2-C)，73.6(CH，3-C)，83.0(C，4-C)，47.9(CH，5-C)，153.2(CH，6-C)，133.2(C，7-C),194.6 (C，8-C)，46.4(Ol2,9-C)，39.4(C，10-C)，142.3(C，ll-C)，116.6(ai2，12-C)，22.7(ai3，13- C)，18.3(Ol3，14-C)，18.9(ai3，15-C)，167.8(C，r-C)，138.6(C，2'-C)，65.1(CH，3'-C)， 19.3(CH3,4'-C)，127.2(CH2,5'-C)，169.9(C，4-Ac0)，21.5(Ol3,4-Ac0)，170.4(C，3'-Ac0)， 22.4(C出，3'-Ac0)。紅外波譜中的1757cm-i與1648cm-i吸收帶表明結(jié)構(gòu)中存在幾基與雙鍵片 段。"C-NIR、DEPT和HSQ幻普中顯示有24個(gè)碳信號(hào)，包括六個(gè)甲基(兩個(gè)乙酷甲基），五個(gè)亞甲 基(兩個(gè)締控碳），四個(gè)次甲基(兩個(gè)連氧碳和一個(gè)締控碳），W及九個(gè)季碳（四個(gè)幾基碳，Ξ 個(gè)締控碳和一個(gè)連氧季碳上功能結(jié)構(gòu)再結(jié)合不飽和數(shù)表明該化合物為雙環(huán)結(jié)構(gòu)。iH- 醒R譜結(jié)合HSQC譜顯示四個(gè)甲基質(zhì)子信號(hào)δκ 1.88(3H，s)、0.99(3H，s)、1.56(3H，s)、1.32 (3H，d，J = 6.3Hz)，兩個(gè)乙酷基甲基質(zhì)子信號(hào)δHl.96(3H，s)與1.99(3H，s)，兩對(duì)端締控質(zhì) 子信號(hào)δκ 6.33(lH，d，J=12.3Hz)與6.62(lH，d，J=12.3Hz)、6.29(lH，d，J = 9.細(xì)z)與6.56 αH，d，J = 9.6Hz)，兩個(gè)連氧次甲基質(zhì)子信號(hào)δH5.91(lH，br，s)與5.14αH，q，J = 6.3Hz)， 一個(gè)締屬次甲基質(zhì)子信號(hào)Sh 6.83αH，d，J=1.3化）；W上NMR數(shù)據(jù)可W確認(rèn)該化合物為闊 巷菊酬衍生物。HMBC譜中H-12/C-11、H-13/C-11、H-14/C-10、H-15/C-4的相關(guān)信號(hào)可W歸屬 為闊巷菊酬上的片段，C-3位質(zhì)子信號(hào)移向低場(chǎng)說明C-3^基被醋化，而通過HMB村普中的H- 3/C-r 相關(guān)信號(hào)得到進(jìn)一步確認(rèn)。HMBC譜中H-3 VAcO-3 7C-2 7C-4 '、H-4 7C-3 ' W 及H-5 7 C-27C-1'的相關(guān)信號(hào)可W確認(rèn)結(jié)構(gòu)中存在3'-乙酷基-2'-締-下酷氧基邊鏈結(jié)構(gòu)。歷B村普 中，4-AcO/C-4的相關(guān)性表明C-4位連有另一個(gè)乙酷氧基。NOESY譜中He-1/H-14，He-1/H-3，H- 3/H-15W及H-14/H-15相關(guān)信號(hào)表明H-3、H-14和H-15在闊巷菊酬骨架的同偵U，此外Ηα-1/Η- 5相關(guān)信號(hào)暗示H-5在H-3、H-14和H-15的異側(cè)。該化合物的相對(duì)構(gòu)型進(jìn)一步通過X-單晶衍射 確認(rèn)，C-3位的絕對(duì)構(gòu)型通過酸解反應(yīng)與Mosher法可W確認(rèn)為R構(gòu)型。綜合氨譜、碳譜、HMBC 譜和N0ESY譜，W及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如下所示，立體構(gòu)型 進(jìn)一步通過ECD試驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基本一致。
[0021 ]該化合物化學(xué)式及碳原子編號(hào)如下：
[0022]
[0023] 實(shí)施例2:藥理作用
[0024] 本實(shí)施例使用右蔽皮下接種肺癌瘤株細(xì)胞建立lewis肺癌小鼠模型，測(cè)定各組的 抑瘤率和Bcl-2及Bax表達(dá)水平，觀察藥物上調(diào)Bax、下調(diào)Bd-2的表達(dá)、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞調(diào)亡來 抑制腫瘤生長(zhǎng)的抗腫瘤作用。
[002引1、材料與方法
[0026] 1.1 動(dòng)物
[0027] C57化/6純系小鼠，雄性6~8周，（20±2)g，北京維通利華公司動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中屯、。
[002引1.2試劑與樣品
[0029] 憐酸肌酸鋼購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。化合物（I)自制，制備方法見實(shí)施例1。 兔抗鼠 Bax單克隆抗體、兔抗鼠 Bd-2單克隆抗體(SANTACRUZ公司）、二步法免疫組化檢測(cè)試 劑盒，DAB顯示劑(北京中杉金橋公司）。瘤株Lewis肺癌，Lewis肺癌荷瘤鼠由中科院腫瘤研 究所提供并傳代保種;Lewis肺癌維持在巧7BL/6小鼠體內(nèi)，每2周傳代1次。
[0030] 1.3小鼠分組及模型制備
[0031 ] C57化/6小鼠隨機(jī)分組，每組12只，分別為模型對(duì)照組(NS組）、憐酸肌酸鋼組、化合 物（I)組、憐酸肌酸鋼與化合物（I)組合物組。每只小鼠右蔽皮下接種肺癌瘤株細(xì)胞，建立 lewis肺癌小鼠模型，從接種腫瘤次日開始，分別腹腔注射給藥。生理鹽水(NS)組:0.9%生 理鹽水0.2mL，連續(xù)lOd;憐酸肌酸鋼組:40mg/(kg · d)，連續(xù)給藥lOd;化合物（I)組:40mg/ (kg · d)，連續(xù)給藥lOd;憐酸肌酸鋼與化合物（I)組合物組：40mg/(kg · d)憐酸肌酸鋼+ 40mg/化g · d)化合物（I)，連續(xù)給藥lOd。末次給藥后2地，小鼠稱重，處死。
[0032] 1.5瘤重測(cè)定實(shí)驗(yàn)
[0033] 末次給藥后24h將小鼠稱重，斷頸處死，剝?nèi)×鰤K稱重。
[0034] 抑瘤率（％ )=(模型組平均瘤重-治療組平均瘤重)/模型組平均瘤重X 100%。
[0(X3日]1.化ewis肺癌Bd-2、Bax表達(dá)變化的測(cè)定實(shí)驗(yàn)
[0036] 免疫組化法測(cè)定Bcl-2、Bax表達(dá)。瘤塊W石蠟包埋制成4μπι厚的切片，脫蠟、水化 后，3 %Η202滅活內(nèi)源性過氧化物酶，高壓抗原修復(fù)，后續(xù)步驟按照二步法免疫組化檢測(cè)試 劑盒說明書操作。陰性對(duì)照^0.01111〇1/1?85(抑=7.4)代替一抗。在光學(xué)顯微鏡下觀察鹽水 對(duì)照組和各給藥實(shí)驗(yàn)組樣本的免疫組化切片。
[0037] 結(jié)果判定:每張切片在5~10個(gè)高倍視野下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100~200 個(gè)細(xì)胞，共1000個(gè)細(xì)胞，計(jì)算每張切片陽性細(xì)胞數(shù)所占比例。Bcl-2在胞漿出現(xiàn)棟黃色染色 為陽性染色。Bax在胞漿和(或)胞膜出現(xiàn)棟黃色染色為陽性染色。
[003引1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
[0039] 數(shù)據(jù)均Wx±s表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，單因素方差分析。
[0040] 2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0041 ] 2.1對(duì)Lewis肺癌模型小鼠實(shí)體瘤的影響
[0042] 與模型對(duì)照組比較，憐酸肌酸鋼與化合物（I)組合物組瘤重明顯減小(P<0.01)， 抑瘤率明顯增加(P<〇.01);與模型對(duì)照組比較，憐酸肌酸鋼組、化合物（I)組瘤重減小(P< 0.05)，抑瘤率增加(P<0.05)。結(jié)果見表1。
[0043] 2.2對(duì)Lewis肺癌模型小鼠 Bd-2及Bax表達(dá)的影響
[0044] 與模型對(duì)照組比較，憐酸肌酸鋼與化合物（I)組合物組Be 1 -2表達(dá)明顯降低（P < 0.01 )，Bax表達(dá)明顯升高(P < 0.01);與模型對(duì)照組比較，憐酸肌酸鋼組、化合物（I)組Be 1 -2 表達(dá)降低(P<〇.〇5)，Bax表達(dá)升高(P<0.05)。結(jié)果見表1。
[0045] 表1對(duì)小鼠體內(nèi)Lewis肺癌生長(zhǎng)及Bd-2、Bax表達(dá)水平的影響(x±s，n = 10)
[0046]
[0047] 肺癌的發(fā)生是一個(gè)設(shè)及多因素多階段的復(fù)雜過程，近年來研究表明，肺癌的發(fā)生 可能是由于細(xì)胞調(diào)亡與增殖失衡造成的。細(xì)胞調(diào)亡是細(xì)胞自身的一種主動(dòng)的、生理性死亡 機(jī)制，細(xì)胞調(diào)亡過程受促調(diào)亡因子和調(diào)亡抑制因子的共同調(diào)節(jié)。其中Bcl-2和Bax屬于Bcl-2 同一家族，與人類多種腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系的基因。Bcl-2是從人類濾泡型非霍奇金B(yǎng)細(xì) 胞淋己瘤克隆到的原癌基因，其通過穩(wěn)定線粒體膜的功能，阻止線粒體釋放化spase、調(diào)亡 誘導(dǎo)因子和細(xì)胞色素 C等作用抑制細(xì)胞調(diào)亡。Bcl-2通過抑制細(xì)胞調(diào)亡而參與腫瘤的發(fā)生。 Bax基因具有括抗Bcl-2的作用，是促調(diào)亡基因。當(dāng)Bax蛋白大量表達(dá)，并與Bd-2蛋白形成異 源二聚體時(shí)加速細(xì)胞死亡，Bcl-2和Bax的表達(dá)程度對(duì)決定細(xì)胞接受調(diào)亡信號(hào)后存活與否起 關(guān)鍵作用。目前，多數(shù)研究表明，Bcl-2與Bax的表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)，Bcl-2過量表達(dá)，細(xì)胞存 活;Bax蛋白過量表達(dá)，細(xì)胞死亡。
[0048] 結(jié)果表明，憐酸肌酸鋼、化合物（I)單獨(dú)作用時(shí)，對(duì)肺癌具有抑制作用;憐酸肌酸鋼 和化合物(I)聯(lián)合作用時(shí)，對(duì)肺癌的抑制效果進(jìn)一步提高，可W開發(fā)成治療肺癌的藥物。
[0049] 上述實(shí)施例的作用在于說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不W此限定本發(fā)明的保護(hù) 范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可W對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換， 而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物（I)，2. -種憐酸肌酸鋼的藥物組合物，其特征在于:包括憐酸肌酸鋼、如權(quán)利要求1所述的 化合物(I)和藥學(xué)上可W接受的載體，制備成需要的劑型。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的憐酸肌酸鋼的藥物組合物，其特征在于:藥學(xué)上可W接受的載 體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤(rùn)劑、崩解劑、吸收促進(jìn)劑、表面活性劑、吸附載 體或潤(rùn)滑劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的憐酸肌酸鋼的藥物組合物，其特征在于:所述劑型包括片劑、 膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射 劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。5. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含W下操作步驟：（a)將杜 仲葉粉碎，用65~85%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油酸、乙酸乙 醋和水飽和的正下醇萃取，分別得到石油酸萃取物、乙酸乙醋萃取物和正下醇萃取物；（b) 步驟(a)中正下醇萃取物用大孔樹脂除雜，先用6%乙醇洗脫8個(gè)柱體積，再用70%乙醇洗脫 8個(gè)柱體積，收集70%洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫濃縮物；（C)步驟(b)中70 %乙醇洗 脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為50:1、25:1、15:1和5:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗 脫得到4個(gè)組分；（d)步驟(C)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為10:1、5:1和 2:1的二氯甲燒-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反 相硅膠分離，用體積百分濃度為75 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~14個(gè)柱體積洗脫液， 洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為AB-8型 大孔吸附樹脂。7. 權(quán)利要求1所述的化合物（I)在制備治療肺癌的藥物中的應(yīng)用。8. 權(quán)利要求2~4任一所述的憐酸肌酸鋼的藥物組合物在制備治療肺癌的藥物中的應(yīng) 用。
【文檔編號(hào)】C07C69/73GK106083590SQ201610378383
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年5月31日
【發(fā)明人】黃芳
【申請(qǐng)人】黃芳