人骨肉瘤u2?os細(xì)胞特異性結(jié)合多肽及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了人骨肉瘤U2?OS細(xì)胞特異性結(jié)合多肽及其應(yīng)用，人骨肉瘤U2?OS細(xì)胞特異性結(jié)合多肽的核心序列為APWTEAYWWHLP。本發(fā)明的多肽，可以特異性結(jié)合人骨肉瘤U2?OS細(xì)胞。將該多肽與對人骨肉瘤有治療作用的活性分子、負(fù)載對人骨肉瘤有治療作用的活性分子的載體或標(biāo)記分子偶聯(lián)后，同樣可以特異性結(jié)合人骨肉瘤U2?OS細(xì)胞，可以實(shí)現(xiàn)人骨肉瘤的靶向治療，或人骨肉瘤的快速準(zhǔn)確診斷。
【專利說明】
人骨肉瘤U2-0S細(xì)胞特異性結(jié)合多肽及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及一種靶向多肽及其應(yīng)用，特別涉及一種人骨肉瘤U2-0S細(xì)胞特異性結(jié) 合多肽及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨肉瘤是一種好發(fā)于青少年的常見惡性骨腫瘤，目前主流的治療手段是術(shù)前大劑 量化療+根治性切除+術(shù)后繼續(xù)大劑量化療。常規(guī)的化療藥物由于沒有靶向性，在殺死腫瘤 細(xì)胞的同時(shí)也導(dǎo)致大量的正常細(xì)胞受損，對患者具有較大的毒副作用。然而對于骨肉瘤現(xiàn) 行治療方案不敏感的患者，其診斷和治療仍無靶向適體（"誘館"或"化學(xué)抗體"）應(yīng)用于臨 床。因此，篩選與骨肉瘤細(xì)胞特異性結(jié)合的先導(dǎo)物質(zhì)，通過與藥物偶聯(lián)等方式，使藥物在體 內(nèi)具備定向識別并結(jié)合骨肉瘤細(xì)胞的活性，從而減輕或避免腫瘤藥物的非選擇殺傷特性， 降低藥物的毒副作用，進(jìn)而提高療效并減輕患者病痛。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供一種人骨肉瘤U2-0S細(xì)胞特異性結(jié)合多肽及其應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是： 一種人骨肉瘤U2-0S細(xì)胞特異性結(jié)合多肽，其核心序列為APWTEAYWWHLP。
[0005] 進(jìn)一步的，多肽的C端或N端獨(dú)立連接有不超過3個(gè)氨基酸。
[0006] -種治療人骨肉瘤的靶向藥物，由對人骨肉瘤具有治療作用的活性分子和與其相 偶聯(lián)的靶向分子組成，靶向分子為上述的多肽。
[0007] -種治療人骨肉瘤的負(fù)載型靶向藥物，載體上負(fù)載有對人骨肉瘤具有治療作用的 活性分子，靶向分子為上述的多肽。
[0008] -種用于人骨肉瘤診斷的試劑，由標(biāo)志物和與其偶聯(lián)的靶向分子組成，靶向分子 為上述的多肽。
[0009] 本發(fā)明的有益效果是： 本發(fā)明的多肽，可以特異性結(jié)合人骨肉瘤U2-0S細(xì)胞。將該多肽與對人骨肉瘤有治療作 用的活性分子、負(fù)載對人骨肉瘤有治療作用的活性分子的載體或標(biāo)記分子偶聯(lián)后，同樣可 以特異性結(jié)合人骨肉瘤U2-0S細(xì)胞，可以實(shí)現(xiàn)人骨肉瘤的靶向治療，或人骨肉瘤的快速準(zhǔn)確 診斷。
【附圖說明】
[0010] 圖1是四輪差減篩選噬菌體文庫的富集率趨勢圖； 圖2是為部分噬菌體單克隆涂板結(jié)果； 圖3是各個(gè)噬菌體單克隆的富集率； 圖4是酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)的鑒定結(jié)果； 圖5是多肽親和力實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 與U2-0S細(xì)胞有特異結(jié)合活性多肽篩選 使用藍(lán)白篩選方式篩選與U2-0S細(xì)胞有特異結(jié)合活性的多肽，方法如下： 培養(yǎng)靶細(xì)胞人骨肉瘤U2-0S細(xì)胞和吸附細(xì)胞人成骨細(xì)胞hFOBl. 19至對數(shù)成長期，將噬 菌體文庫分別與空培養(yǎng)瓶、hFOBl. 19共培養(yǎng)lh以除去非特異性結(jié)合靶細(xì)胞的部分噬菌體， 將上清培養(yǎng)液即不與培養(yǎng)瓶、hFOBl. 19結(jié)合的噬菌體加入至U2-0S細(xì)胞中孵育lh，0.1%TBST 洗滌10次，酸性洗脫產(chǎn)物即為所得噬菌體。將第一輪所得噬菌體擴(kuò)增后投入第二輪篩選，共 重復(fù)四輪篩選過程，將每一輪得到的噬菌體進(jìn)行涂板以計(jì)數(shù)和隨機(jī)挑選藍(lán)斑測序。隨著篩 選次數(shù)的增加，噬菌體可見明顯的富集，初步說明篩選得到了與U2-0S細(xì)胞特異性結(jié)合的陽 性噬菌體克隆。
[0012] 圖1為四輪差減篩選噬菌體文庫的富集率趨勢圖。
[0013] 與人骨肉瘤U2-0S細(xì)胞特異性結(jié)合的噬菌體文庫測序 隨機(jī)挑選實(shí)施例中第二輪、第三輪及第四輪篩選中的大量藍(lán)斑，接種于過夜培養(yǎng)的 ER2738菌液中，37°C恒溫?fù)u床過夜后進(jìn)行DNA測序。測序結(jié)果如表1所示。
[0014] 表1、噬菌體文庫測序結(jié)果
測序結(jié)果顯示，插入了多肽序列APWTEAYWWHLP的噬菌體單克隆重復(fù)率較高，說明該序 列與U2-0S特異性結(jié)合活性較高。
[0015] 噬菌體單克隆富集率實(shí)驗(yàn) 將插入了多肽序列APWTEAYWWHLP的噬菌體單克隆接種至ER2738菌液中進(jìn)行擴(kuò)增，用每 一個(gè)擴(kuò)增后的噬菌體單克隆代替噬菌體文庫，重復(fù)實(shí)施例1中的噬菌體篩選流程，藍(lán)白斑計(jì) 數(shù)法計(jì)算每個(gè)噬菌體單克隆的富集率，驗(yàn)證其結(jié)合U2-0S細(xì)胞的特異性。結(jié)果顯示，插入了 多肽序列APWTEAYWWHLP的單克隆噬菌體得到了高度富集，說明插入了本序列的噬菌體單克 隆與U2-0S細(xì)胞特異性結(jié)合活性較高。
[0016] 圖2為部分噬菌體單克隆涂板結(jié)果，圖3為各個(gè)噬菌體單克隆的富集率。
[0017] 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA) 測序結(jié)果顯示，四輪篩選中共有9個(gè)噬菌體單克隆有重復(fù)，擴(kuò)增其中6個(gè)重復(fù)率較高的 噬菌體，按照常規(guī)操作進(jìn)行ELISA鑒定。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)的鑒定結(jié)果如圖4所示。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示其中有3個(gè)噬菌體單克隆與U2-0S結(jié)合活性較高，序列APWTEAYWWHLP與U2-0S 的結(jié)合活性最強(qiáng)。
[0018] 多肽親和力實(shí)驗(yàn) 合成異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的多肽APWTEAYWWHLP(FITC)(本發(fā)明多肽)和隨機(jī)多 肽HGVAELVKSSTAK(FITC)，在12孔板上培養(yǎng)U2-0S細(xì)胞至對數(shù)生長期后分別與本發(fā)明多肽 和隨機(jī)多肽4°C共培養(yǎng)4小時(shí)，PBS沖洗三次后胰酶消化，收集細(xì)胞后流式細(xì)胞儀檢測熒光 值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。結(jié)果顯示本發(fā)明多肽熒光值較高，說明本序列多肽具有U2-0S細(xì)胞 特異性結(jié)合活性。
[0019] 根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)，可以預(yù)見，多肽的C端或N端獨(dú)立連接有不超過3個(gè)氨基酸時(shí)，并不 會顯著改變多肽的特異結(jié)合性，因此，本發(fā)明的多肽APWTEAYWWHLP的C端或N端獨(dú)立連接有 不超過3個(gè)氨基酸時(shí)，并不會影響其功能。
[0020] 當(dāng)本發(fā)明多肽與對人骨肉瘤具有治療作用的活性分子偶聯(lián)后，可以賦予活性分子 靶向性，得到用于治療人骨肉瘤的靶向藥物。
[0021] 類似的，將本發(fā)明多肽與藥物載體偶聯(lián)后，可賦予載體靶向性，可得到治療人骨肉 瘤的負(fù)載型靶向藥物。
[0022] 或?qū)⒈景l(fā)明多肽與標(biāo)志物，如熒光試劑、放射性標(biāo)記等偶聯(lián)后，可以得到用于人骨 肉瘤診斷的試劑。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種多肽，其核心序列為apwteaywwhlp。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其特征在于：多肽的C端或N端獨(dú)立連接有不超過3個(gè)氨 基酸。3. -種治療人骨肉瘤的靶向藥物，由對人骨肉瘤具有治療作用的活性分子和與其相偶 聯(lián)的靶向分子組成，其特征在于:靶向分子為權(quán)利要求1或2所述的多肽。4. 一種治療人骨肉瘤的負(fù)載型靶向藥物，載體上負(fù)載有對人骨肉瘤具有治療作用的活 性分子，其特征在于:載體上偶聯(lián)有權(quán)利要求1或2所述的多肽。5. -種用于人骨肉瘤診斷的試劑，由標(biāo)志物和與其偶聯(lián)的靶向分子組成，其特征在于： 靶向分子為權(quán)利要求1或2所述的多肽。
【文檔編號】G01N33/574GK106084009SQ201610489250
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月24日
【發(fā)明人】張余, 楊軒, 李梅, 夏虹
【申請人】廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院