一種豬天然免疫蛋白lgp2的突變體及制備與用圖
【專利摘要】本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，公開了一種豬天然免疫分子LGP2的突變體蛋白LGP2S169A及其制備和應(yīng)用。LGP2S169A突變體蛋白序列為SEQ ID No.4中氨基酸所示。所述構(gòu)建含有SEQ ID No.4中氨基酸序列的LGP2S169A的質(zhì)粒所表達(dá)的蛋白具有良好的抗口蹄疫病毒的作用,為制備抗口蹄疫病毒藥物或佐劑提供了新的靶點(diǎn)和理論支持。
【專利說明】
一種豬天然免疫蛋白LGP2的突變體及制備與用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種蛋白突變體及其制備方法和用途，確切講本發(fā)明涉及一種豬LGP2突變體，以及這種突變體的制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]口蹄疫病毒(foot and mouth disease virus，F(xiàn)MDV)屬于微 RNA 病毒科(Picornaviridae) 口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)，核酸類型為單鏈正股RNA，包含七個(gè)血清型，各型之間無交叉保護(hù)反應(yīng)?？谔阋呤怯蒄MDV感染偶蹄類動物(豬、牛、羊、駱駝等)引起的急性、熱性和接觸性的一類傳染病。該病的發(fā)病率高、傳染迅速、危害嚴(yán)重，是世界動物衛(wèi)生組織(OIE)規(guī)定的A類烈性動物傳染病，我國列為一類動物傳染病。撲殺是口蹄疫疫情控制的主要手段，因此該病的爆發(fā)和流行對全球養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的危害，我國作為一個(gè)養(yǎng)殖業(yè)大國，也深受口蹄疫的危害。如何有效地控制、預(yù)防和治療口蹄疫是當(dāng)前科研工作者的一個(gè)重要使命和責(zé)任。由于口蹄疫血清較多，型間無交叉保護(hù)，這給以疫苗免疫為主的控制措施帶來了巨大的挑戰(zhàn)。而制備用于治療口蹄疫的藥物、制備用于預(yù)防或治療口蹄疫的疫苗是本領(lǐng)域關(guān)注的一個(gè)重點(diǎn)方向。
[0003]模式識別受體(Pattern Recognit1n Receptors，PRRs)是機(jī)體抵抗病原微生物感染的第一道防線，是啟動機(jī)體先天性免疫反應(yīng)的重要組成部分。病原微生物感染細(xì)胞后，PRRs通過識別病原的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns ,PAMPs)，促進(jìn)下游干擾素和細(xì)胞因子的分泌，激活一些抗菌或抗病毒蛋白的表達(dá)，啟動先天性免疫應(yīng)答。PAMPs為病原微生物所特有，是病原微生物(及其產(chǎn)物)共有的一些非特異性和高度保守的分子結(jié)構(gòu)，可被非特異性免疫細(xì)胞所識別。因此，對模式識別受體介導(dǎo)抗病毒作用的研究，對了解機(jī)體發(fā)揮先天性免疫抵抗各類病原微生物具有重要意義。
[0004]迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的模式識別受體有四類:TLRs(Toll_like receptors) ,RLRs(Retinoic acid-1nducible gene I(RIG-1 )-1 ike helicases receptors , RIG-1-1ikereceptors)，NLRs(N0D_like receptors)和CLRs(C_type lectin receptors)。這些分子分工明確，相互協(xié)調(diào)，調(diào)控機(jī)體免疫反應(yīng)，發(fā)揮抗感染作用。RIG-1樣受體為模式識別受體中的一類分子，該家族成員至今發(fā)現(xiàn)有RIG-1、MDA5和LGP2三種分子。RIG-1樣受體通過RLR級聯(lián)信號誘導(dǎo)I型干擾素和炎癥因子的產(chǎn)生，在抗病毒天然免疫中起著非常重要的作用。
[0005]為了更好地控制口蹄疫的流行和傳播，除了深入探索FMDV遺傳變異與血清型分布的規(guī)律外，同時(shí)還需要研究宿主細(xì)胞蛋白與FMDV的關(guān)系。因?yàn)镕MDV在感染過程中為了便于自身的復(fù)制，經(jīng)常會修飾或者改變一些宿主蛋白的結(jié)構(gòu)與功能，使得這些宿主蛋白能夠有利于病毒自身的復(fù)制。病毒篡奪細(xì)胞功能為其服務(wù)是病毒在進(jìn)化過程中形成的保持自身繁衍的一種重要手段和機(jī)制，因此研究清楚哪些宿主細(xì)胞在病毒復(fù)制過程中被其利用，以及其利用的具體機(jī)制有哪些，這將有利于開發(fā)一些抑制病毒復(fù)制的佐劑或藥物。通過阻斷病毒與宿主蛋白結(jié)合的靶向位點(diǎn)，使其不能夠利用這些蛋白，從而抑制病毒的復(fù)制。
[0006]LGP2被報(bào)道在體外具有負(fù)調(diào)節(jié)RIG-1和MDA5的作用(Takeshi Saito et al.2006，PNAS)。但Takashi Satoh報(bào)道LGP2基因敲除型小鼠極易被EMCV等病毒感染，而野生型小鼠的感染率明顯偏低，但這一點(diǎn)在針對口蹄疫病毒方面的表現(xiàn)卻并不清楚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明目的在于提供一種豬LGP2突變體蛋白，以及這種蛋白的制備及在制備抗口蹄疫病毒感染的藥物或疫苗中的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明的豬天然免疫蛋白LGP2的突變體其氨基酸序列為SEQID N0.4。
[0009]本發(fā)明的氨基酸序列為SEQID N0.4的豬天然免疫蛋白LGP2的突變體的制備方法是:首先以豬的cDNA為模板，用引物首先構(gòu)建表達(dá)豬LGP2的真核表達(dá)質(zhì)粒，再以豬LGP2的真核表達(dá)質(zhì)粒為模板，用引物SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6進(jìn)行突變PCR，得到目標(biāo)產(chǎn)物。
[0010]本發(fā)明的豬天然免疫蛋白LGP2的突變體可在用于制備抗口蹄疫病毒感染的藥物或疫苗中應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)突變本發(fā)明的突變體與豬天然免疫蛋白LGP2相比能更顯著的抑制口蹄疫病毒復(fù)制，表現(xiàn)出其在制備抗口蹄疫病毒感染的藥物或疫苗中的應(yīng)用的可能。
【附圖說明】
[0012]圖1為LGP2全基因的PCR圖。附圖標(biāo)記說明:泳道M:DNA Marker 5000;泳道IPCR擴(kuò)增核酸片段。
[0013]圖2為構(gòu)建LGP2真核表達(dá)質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果。泳道M:DNA Marker 5000;泳道I酶切后核酸片段。
[0014]圖3為構(gòu)建LGP2S169A突變PCR結(jié)果電泳圖。附圖標(biāo)記說明:泳道M:DNA Marker5000;泳道IPCR擴(kuò)增的突變質(zhì)粒核酸片段。
[0015]圖4為構(gòu)建LGP2S169A真核表達(dá)質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果。泳道M:DNA Marker 5000;泳道I酶切后核酸片段。
[0016]圖5為口蹄疫病毒感染PK-15細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)口蹄疫病毒的mRNA表達(dá)水平結(jié)果。口蹄疫病毒感染?1(-15細(xì)胞后0、2、4、8、12和24小時(shí)口蹄疫病毒1111?嫩的相對表達(dá)水平。
[0017]圖6為口蹄疫病毒感染PK-15細(xì)胞不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞中LGP2基因mRNA表達(dá)水平qPCR檢測結(jié)果?？谔阋卟《靖腥綪K-15細(xì)胞后0、2、4、8、12和24小時(shí)細(xì)胞LGP2基因mRNA的相對表達(dá)水平。結(jié)果表明口蹄疫病毒感染可以上調(diào)細(xì)胞中LGP2 mRNA的表達(dá)水平。
[0018]圖7為口蹄疫病毒感染對LGP2蛋白表達(dá)水平的降解Westernblot檢測結(jié)果。未感染組為轉(zhuǎn)染Myc-LGP2質(zhì)粒未感染口蹄疫病毒的PK-15細(xì)胞中Myc-LGP2蛋白水平，感染組為轉(zhuǎn)染Myc-LGP2質(zhì)粒后感染口蹄疫病毒的PK-15細(xì)胞中Myc-LGP2的蛋白水平;結(jié)果表明口蹄疫病毒感染可以減少LGP2的蛋白表達(dá)水平。
[0019]圖8為口蹄疫病毒感染與不感染的PK-15細(xì)胞中Myc_LGP2的mRNA表達(dá)水平qPCR的結(jié)果圖。未感染組指轉(zhuǎn)染2yg Myc-LGP2質(zhì)粒不感染口蹄疫病毒細(xì)胞中Myc-LGP2的蛋白表達(dá)量，感染組為轉(zhuǎn)染2yg Myc-LGP2質(zhì)粒感染口蹄疫病毒細(xì)胞中Myc_LGP2的蛋白表達(dá)量。結(jié)果表明口蹄疫病毒感染不降解LGP2的mRNA。
[0020]圖9為過表達(dá)LGP2蛋白對口蹄疫病毒復(fù)制影響的qPCR檢測結(jié)果。柱狀圖為PK-15細(xì)胞轉(zhuǎn)染Myc-LGP2質(zhì)粒O、1、2和3yg質(zhì)粒后接種口蹄疫病毒12小時(shí)口蹄疫病毒mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果表明隨著Myc-LGP2表達(dá)量的增加，口蹄疫病毒的mRNA水平顯著下降，病毒復(fù)制被顯著抑制。
[0021 ]圖10為過表達(dá)LGP2蛋白對口蹄疫病毒復(fù)制影響的病毒滴度檢測結(jié)果。結(jié)果表明隨著Myc-LGP2表達(dá)量的增加，口蹄疫病毒的滴度顯著下降，病毒復(fù)制被顯著抑制。
[0022]圖11為過表達(dá)LGP2蛋白對口蹄疫病毒復(fù)制影響的western blot檢測結(jié)果。4個(gè)泳道分別為轉(zhuǎn)染Myc-LGP2質(zhì)粒O、1、2和3yg質(zhì)粒后接種口蹄疫病毒12小時(shí)LGP2及口蹄疫病毒蛋白的表達(dá)水平，β-Actin為內(nèi)參。結(jié)果表明隨著Myc-LGP2表達(dá)量的增加，口蹄疫病毒的蛋白表達(dá)水平顯著下降，病毒復(fù)制被顯著抑制。
[0023]圖12為口蹄疫病毒各個(gè)病毒蛋白對LGP2蛋白表達(dá)的影響Westernblot檢測結(jié)果。各泳道代表空載體及口蹄疫病毒各個(gè)蛋白的表達(dá)質(zhì)粒與Myc-LGP2質(zhì)粒共表達(dá)后LGP2的蛋白表達(dá)量水平，結(jié)果表明口蹄疫病毒2B蛋白可以減少LGP2蛋白的表達(dá)。
[0024]圖13為口蹄疫病毒2B蛋白對LGP2各區(qū)段及不同突變體的降解情況分析Westernblot檢測結(jié)果。各個(gè)泳道分別指不轉(zhuǎn)染2B和轉(zhuǎn)染2B質(zhì)粒情況下LGP2及其突變體蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明LGP2-K654E、LGP2-T167A/S169A及LGP2-Δ-483-681突變體不能夠被2B降解。
[0025]圖14為過表達(dá)LGP2各個(gè)突變體對口蹄疫病毒復(fù)制的影響qPCR檢測結(jié)果。將空載體或各個(gè)LGP2突變體轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞后，接種口蹄疫病毒，感染12小時(shí)后檢測病毒mRNA水平，結(jié)果表明LGP2S169A過表達(dá)可以抑制口蹄疫病毒mRNA的表達(dá)水平，抑制病毒復(fù)制。
[0026]圖15為過表達(dá)LGP2S169A2對口蹄疫病毒復(fù)制的影響Western blot檢測結(jié)果。Mock為未感染口蹄疫病毒的PK-15細(xì)胞，后四個(gè)泳道分別指過表達(dá)0yg、0.5yg、lyg和2ygLGP2S169A質(zhì)粒的PK-15細(xì)胞。結(jié)果為轉(zhuǎn)染質(zhì)粒24小時(shí)后感染口蹄疫病毒12小時(shí)病毒蛋白的western blot檢測結(jié)果。結(jié)果顯示LGP2S169A2對口蹄疫病毒的復(fù)制具有劑量依賴性。
【具體實(shí)施方式】
[0027]本發(fā)明以下結(jié)合所提供【具體實(shí)施方式】進(jìn)行詳細(xì)解說。
[0028]實(shí)施例1抗病毒質(zhì)粒的構(gòu)建
(I)豬源細(xì)胞總RNA的提取
取豬腎上皮細(xì)胞(PK-15)培養(yǎng)于35mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長滿后，棄去上清，用PBS清洗細(xì)胞3遍。
[0029]加入ImLTRIzoI進(jìn)行裂解(吹打懸浮細(xì)胞)，室溫靜置5分鐘。
[0030]加入250 yL氯仿，劇烈震蕩，4°C放置lOmin，萃取抽提RNA。
[0031]40C 12000 rpm離心15分鐘；吸取450 yL上清，移入新的離心管中，并加入等體積異丙醇。-20 °C沉淀20分鐘。
[0032]40C 12000 rpm離心10分鐘；棄去上清，加入ImL 75%乙醇，輕輕顛倒搖晃3次。洗去鹽粒子等雜質(zhì)。
[0033]40C 10000 rpm離心5分鐘；棄去上清，室溫晾干(20分鐘)，揮發(fā)掉乙醇。加入25yLDEPC水，溶解RNA ο -80 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0034](2)反轉(zhuǎn)錄獲得豬LGP2總cDNA 采用invitrogen公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒，按照試劑盒的說明操作進(jìn)行cDNA合成。具體步驟如下:
配制反應(yīng)體系(總20 yL體系):
5XFirst Buffer4 uL
0.1M dTT2 UL
10 mM each dNTPsI uL
6nt Random PrimersI uL
oligo-dT Primers0.5 uL
M-MLV transcriptaseI uL
RRI0.5 uL
H2O6 uL
RNA4 uL
反應(yīng)程序:25 °C 10分鐘;37 °C 60分鐘;75 °C 10分鐘。
[0035](3)豬LGP2⑶S編碼核苷酸序列片段的擴(kuò)增
參照GenBank提供的豬LGP2序列，設(shè)計(jì)表達(dá)引物擴(kuò)增⑶S表達(dá)區(qū)。以上步驟得到的cDNA為模板，用引物進(jìn)行擴(kuò)增，所用的上游引物為SEQ ID N0.7(引入XhoI酶切位點(diǎn):“TATCTCGAGTTATGGAGCTGCGAC” )，下游引物為SEQ ID N0.8，(引入HindIII酶切位點(diǎn):“ACAAAGCTTGTCCAGGGAGAGGTC")。擴(kuò)增獲得CDS表達(dá)區(qū)段如圖1所示。以合成的cDNA為模板，按照如下體系進(jìn)行擴(kuò)增獲得CDS片段(總50 UL體系):
1X PCR Buffer5 yL
2.5 mM each dNTPs5 yL
上游引物SEQ ID N0.7I yL
下游引物SEQ ID N0.8I yL
LA Taq酶I yL
H2O33 yL
cDNA模板4 IiL
反應(yīng)程序:95 °C預(yù)變性5分鐘;95 °C變性40秒，57 V退火30秒，72 °C延伸2分30秒，32個(gè)循環(huán);72 °C延伸1分鐘，4 °C保存。
[0036]進(jìn)行核酸電泳，利用promega公司的DNA純化回收試劑盒純化回收LGP2擴(kuò)增片段。
[0037](4)LGP2真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
將上步回收的片段以及PCDNA3.1分別利用XhoI和HindIII核酸內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切反應(yīng);雙酶切體系如下:
10 X M Buffer2 yL
XhoI0.5 yL
HindIII0.5 yL
DNA0.5 yg
H2O補(bǔ)至總體積20 yL
反應(yīng)程序:37°C 2小時(shí)。
[0038]進(jìn)行核酸電泳，利用promega公司的DNA純化回收試劑盒純化回收酶切產(chǎn)物。將純化回收產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)，反應(yīng)體系及程序如下:
10 X Ligase BufferI uL
T4 DNA LigaseI uL
酶切純化質(zhì)粒片段2 yL
酶切純化LGP2片段6 yL
16 0C過夜連接。
[0039]將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH_5a大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行重組質(zhì)粒的克隆擴(kuò)增。具體步驟如下:
將感受態(tài)細(xì)胞與連接產(chǎn)物混合，冰上放置20分鐘，42 0C水浴熱激90秒，冰浴3分鐘，加入無抗性LB培養(yǎng)液，37°C，220 rpm搖菌40分鐘，利用涂菌棒將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌涂布在具有氨芐抗生素抗性的LB平板上，37 °C溫箱培養(yǎng)12h，觀察生長狀況。
[0040]挑取單克隆菌落，利用含有氨芐抗生素抗性的LB液體培養(yǎng)基搖菌12h，利用promega質(zhì)粒提取試劑盒提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切電泳鑒定。經(jīng)雙酶切鑒定為陽性后。送樣北京金唯智生物技術(shù)有限公司測序鑒定，分析測序結(jié)果表明其核苷酸序列為SEQ IDN0.1，氨基酸序列為SEQ ID從).2，系豬天然免疫蛋白11^2。
[0041 ] (5)LGP2突變體真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
以測序正確的LGP2真核表達(dá)質(zhì)粒為模板，利用Stratagene公司的PfuUltra II HS DNAPolymerase和突變引物進(jìn)行突變質(zhì)粒的擴(kuò)增，具體反應(yīng)體系和程序如下:
10XPfuUltra II react1n Buffer5 yL
10 mM each dNTPs2.5 yL
上游引物SEQ ID Ν0.5(10μΜ)I yL
下游引物SEQ ID Ν0.6(10μΜ)I yL
PfuUltra II HS DNA PolymeraseI yL
DNA template100 ng
H2O補(bǔ)至總體積50 yL
反應(yīng)程序:95°C，5分鐘；95°C 20秒，58°C 30秒，72°C 2分30秒，25個(gè)循環(huán);72°C 10分鐘;4°C保存。
[0042]1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，選取陽性產(chǎn)物，加入I yL的DpnI內(nèi)切酶，37°C酶切消化Ih轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，涂板抗性篩選，37 V過夜培養(yǎng)，挑取單克隆擴(kuò)大搖菌后，送樣北京金唯智生物技術(shù)有限公司測序鑒定，其核苷酸序列為SEQ ID N0.3，氨基酸序列為SEQ ID N0.4，以本發(fā)明的上游引物和下游引物中突出表示的G和C為人工引入的核苷酸突變位點(diǎn)，該位點(diǎn)的突變使得LGP2的169位氨基酸由絲氨酸變?yōu)楸彼?，命名為LGP2S169A。
[0043]為比較起見，本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中同時(shí)還構(gòu)建了其它不同位點(diǎn)突變的突變體，分別命名*:LGP2K654E、LGP2N4641、LGP2T167A/S169A、LGP2-A-1-175、LGP2-A-1-176-482、LGP2-Δ-483-681 和LGP2T167A，這些突變體命名中的:654、464、169/167、176-482、483-681 和 167分別為其突變位點(diǎn)位置。
[0044]實(shí)施例2抗病毒蛋白的篩選和應(yīng)用
(I)口蹄疫病毒的擴(kuò)增
將BHK細(xì)胞(倉鼠腎細(xì)胞)鋪到T25細(xì)胞中，待形成單層細(xì)胞后，棄去細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌3遍，然后接種IMOI 口蹄疫病毒，吸附I個(gè)小時(shí)，中途每隔20分鐘搖晃一次以保證病毒吸附均勻。吸附結(jié)束后，棄去病毒上清，PBS洗滌一遍吸取未吸附病毒，加入2.5 mL細(xì)胞培養(yǎng)維持液(含0.5%血清的MEM培養(yǎng)液)。觀察病變，待細(xì)胞完全脫落收集細(xì)胞及上清，反復(fù)凍融三次，離心過濾收集病毒液，凍存_80°C備用。通過上述擴(kuò)增方法對0/BY/CHA/2010與Asial/HN/2006毒株分別進(jìn)行了擴(kuò)增。
[0045](2)LGP2抑制口蹄疫病毒復(fù)制的研究
將6 X 15個(gè)PK-15細(xì)胞鋪制于6孔板的單個(gè)孔內(nèi)，共鋪4個(gè)皿。待細(xì)胞長至70%-80%融合度的時(shí)候，利用脂質(zhì)體試劑分別轉(zhuǎn)染Myc-LGP2質(zhì)粒O、1、2和3yg質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，接種IMOI 口蹄疫病毒，接種I小時(shí)后換為維持液培養(yǎng)。感染12小時(shí)后收集細(xì)胞，提取RNA進(jìn)行口蹄疫病毒mRNA水平檢測，比較不同組間病毒mRNA水平差異。按照上述方法同樣制備4皿樣品，提取蛋白利用western blot進(jìn)行病毒蛋白表達(dá)檢測。同時(shí)收集細(xì)胞上清，通過TCIDsq測定，進(jìn)行病毒滴度分析。
[0046](3)病毒RNA含量的檢測
取制備好的細(xì)胞總RNA(內(nèi)含口蹄疫病毒RNA，本研究分別使用0/BY/CHA/2010與Asial/HN/2006毒株進(jìn)行了實(shí)驗(yàn))，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，利用Takara公司的SYBR Premix Ex 試劑盒，按照如下體系和程序進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測:
2X SYBR Premix Ex Taq10 UL
上游引物SEQIDN0.9(5，-CACTGGTGACAGGCTAAGG-3’)(10yM) 0.4 yL下游引物 SEQIDN0.10(5，-CCCTTCTCAGATTCCGAGT-3’)(10yM) 0.4 yLH2O8.2 yL
cDNA模板I μ?
反應(yīng)程序:95°C，3分鐘;95°C 10秒，60。。34秒，40個(gè)循環(huán);Melt Curve;25°C保存。
[0047](4)病毒蛋白含量的檢測
感染病毒的PK-15細(xì)胞蛋白樣品的制備:將感染FMDV細(xì)胞的培養(yǎng)上清液輕輕棄去，用預(yù)冷PBS漂洗兩次待收取的細(xì)胞樣品，取適量預(yù)冷的PBS覆蓋細(xì)胞，利用細(xì)胞鏟刮下細(xì)胞，移入離心管中，4000 rpm離心5分鐘，棄上清，保留細(xì)胞沉淀，即為收獲的細(xì)胞樣品(均在冰上操作)。此時(shí)可直接進(jìn)行樣品裂解，或?qū)⒓?xì)胞樣品放置在-70°C低溫保存。根據(jù)收集細(xì)胞沉淀的多少加入適量的細(xì)胞裂解液，并快速反復(fù)吹打重懸細(xì)胞樣品，冰上裂解5分鐘，超聲波瞬時(shí)破碎(冰上操作，超聲2?3次)，4°C 13000rpm離心lOmin，棄去底部沉淀，取上清于另一預(yù)冷離心管中保存。另取2yL收取的上清蛋白用BCA法測定蛋白濃度。剩余樣品蛋白上清加入5XSDS PAGE buffer，沸水煮沸變性分鐘，4°C 13000rpm離心5min，取適量上清進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳，參見:圖7和圖11，圖12、圖13、和圖15。圖7為口蹄疫病毒感染對LGP2蛋白表達(dá)水平的降解Western blot檢測結(jié)果。未感染組為轉(zhuǎn)染Myc_LGP2質(zhì)粒未感染口蹄疫病毒的PK-15細(xì)胞中Myc-LGP2蛋白水平，感染組為轉(zhuǎn)染Myc-LGP2質(zhì)粒后感染口蹄疫病毒的PK-15細(xì)胞中Myc-LGP2的蛋白水平。圖11為過表達(dá)LGP2蛋白對口蹄疫病毒復(fù)制影響的western blot檢測結(jié)果。4個(gè)泳道分別為轉(zhuǎn)染Myc-LGP2質(zhì)粒O、1、2和3yg質(zhì)粒后接種口蹄疫病毒12小時(shí)LGP2及口蹄疫病毒蛋白的表達(dá)水平，β-Actin為內(nèi)參。圖12為口蹄疫病毒各個(gè)病毒蛋白對LGP2蛋白表達(dá)的影響Western blot檢測結(jié)果。各泳道代表空載體及口蹄疫病毒各個(gè)蛋白的表達(dá)質(zhì)粒與Myc-LGP2質(zhì)粒共表達(dá)后LGP2的蛋白表達(dá)量水平。圖13為口蹄疫病毒2B蛋白對LGP2各區(qū)段及不同突變體的降解情況分析Western blot檢測結(jié)果。各個(gè)泳道分別指不轉(zhuǎn)染2B和轉(zhuǎn)染2B質(zhì)粒情況下LGP2及其突變體蛋白的表達(dá)情況。
[0048]SDS-PAGE凝膠電泳及其電泳圖蛋白轉(zhuǎn)印:SDS-PAGE凝膠及電泳緩沖液均按照分子克隆實(shí)驗(yàn)指南配制。每個(gè)蛋白樣品上樣量為40yg，同時(shí)單獨(dú)選孔加入預(yù)染蛋白marker作為指示。蛋白樣品在濃縮膠時(shí)，調(diào)用80V電壓；待蛋白樣品進(jìn)入分離膠后，調(diào)取電壓至120V，直至電泳結(jié)束。轉(zhuǎn)印前，根據(jù)SDS-PAGE凝膠的大小剪取合適的硝酸纖維素膜(NC膜)，并在轉(zhuǎn)印緩沖液中浸泡10分鐘左右，同時(shí)剪取6層濾紙浸泡在轉(zhuǎn)印液中數(shù)分鐘。按照“膜正膠負(fù)”順序放置蛋白膠:負(fù)極-海綿-3層濾紙-凝膠-NC膜-3層濾紙-海綿-正極，安裝好“轉(zhuǎn)印夾心三明治”后，將其放置到全濕轉(zhuǎn)印槽內(nèi)，加入足夠轉(zhuǎn)印緩沖液，接通電源(恒流240mA或恒壓65V轉(zhuǎn)印2?3 h)，轉(zhuǎn)印槽外部用冰袋輔助降溫。待轉(zhuǎn)印結(jié)束后，5%的TBST-脫脂乳封閉NC膜，室溫作用2?3h，棄去封閉液，TBST(pH7.6)緩沖液漂洗3次，洗去殘留脫脂乳封閉液，隨后進(jìn)行抗體孵育?？贵w反應(yīng):加入TBST稀釋一抗，4°C輕搖振蕩過夜(或室溫4?6h)，一抗回收利用。TBST輕輕漂洗3次后，再用TBST洗2?3次，每次漂洗1min。漂洗完畢后，加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫作用2 h，作用完畢用TBST輕輕漂洗3次，再用TBST漂洗3次，每次lOmin。漂洗結(jié)束后，進(jìn)行顯色反應(yīng)。暗室中利用ECL顯色試劑盒進(jìn)行顯色。取試劑盒中A液與B液等量混合，然后輕輕均勻地淋濕NC膜，作用I?2min后，將作用的膜放置在x光曝光夾內(nèi)，在上方放置X光膠片進(jìn)行曝光。曝光完成的膠片首先放入顯影液中進(jìn)行顯影，待所需蛋白條帶顯示后，用自來水輕輕漂洗膠片，然后將膠片放入定影液中進(jìn)行定影2?3min。定影結(jié)束后，將膠片放入自來水漂洗、進(jìn)一步晚干、待晚干后標(biāo)記蛋白Marker，掃描I父片保存結(jié)果。
[0049](5)病毒滴度測定
病毒感染:將鋪好的單層細(xì)胞，用PBS洗3遍細(xì)胞，接種IMOI FMDV，37°C吸附I h，每20min輕輕搖晃一次，保證病毒吸附均勻。吸附I h后，吸去上清，用PBS輕輕洗板I次。加入含有1% FBS的正常培養(yǎng)液培養(yǎng)。在不同時(shí)間點(diǎn)收取樣品，進(jìn)行RNA提取或制備western樣品O
[0050]病毒效價(jià)的測定:提前18?24小時(shí)將BHK-21細(xì)胞接種96孔板。在細(xì)胞形成單層細(xì)胞后，用PBS洗3遍BHK-21細(xì)胞，接種病毒(10—1?10—1())，另設(shè)兩列陰性對照孔。感染孔，每孔加入10ul病毒濾液或倍比稀釋病毒稀釋液，370C吸附I h，每20min輕輕搖晃一次，保證病毒吸附均勻。吸附I h后，吸去上清，用PBS輕輕洗板I次。加入病毒維持液。待48h后，每12h觀察一次細(xì)胞病變情況，72h后記錄病變孔數(shù)，計(jì)算TCID5q，平行測定三次，取平均值為最終病毒滴度。
[0051 ] (6)LGP2抗病毒突變體的篩選
圖13實(shí)驗(yàn)通過口蹄疫病毒2B蛋白對各個(gè)LGP2突變體的降解作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)口蹄疫病毒2B蛋白不能夠降解LGP2T167A/S169A突變體。因此進(jìn)一步?jīng)Q定篩選可以抑制FMDV復(fù)制的LGP2突變體蛋白。鋪制PK-15細(xì)胞，待細(xì)胞長至約70%后，分別單獨(dú)轉(zhuǎn)染空載體、LGP2(野生型標(biāo)記為LGP2-WT)及LGP2各個(gè)突變體，轉(zhuǎn)染24h后，接種FMDV( IMOI)。感染12h后，提取總RNA，測定每組樣本中病毒RNA的含量。結(jié)果表明，LGP2T167A/S169A可以顯著由于LGP2，能夠更好的抑制FMDV的復(fù)制，通過進(jìn)一步構(gòu)建LGP2T167A和LGP2S169A突變體，研究發(fā)現(xiàn)LGP2S169A是能夠抑制FMDV最高效的LGP2突變體蛋白。見圖14，結(jié)果表明LGP2-WT、0^21!67厶/5169厶、0^2-厶176-482、0^21!67厶和0^25169厶均可以抑制卩]\0^復(fù)制，但LGP2S169A可以發(fā)揮最優(yōu)抗病毒效果。
[0052]這些結(jié)果表明，LGP2S169A突變體能夠顯著的抑制FMDV的復(fù)制，具有顯著的抗FMDV的作用。進(jìn)一步進(jìn)行劑量依賴實(shí)驗(yàn)(圖15)，將6 X 15個(gè)PK-15細(xì)胞鋪制于6孔板的單個(gè)孔內(nèi)，共鋪4個(gè)皿。待細(xì)胞長至70%-80%融合度的時(shí)候，利用脂質(zhì)體試劑分別轉(zhuǎn)染LGP2S169A質(zhì)粒0、
1、2和3yg質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后，接種IMOI 口蹄疫病毒，接種I小時(shí)后換為維持液培養(yǎng)。感染12小時(shí)后收集細(xì)胞，提取蛋白進(jìn)行口蹄疫病毒蛋白表達(dá)水平檢測，結(jié)果表明LGP2S169A突變體能夠顯著的抑制口蹄疫病毒的復(fù)制。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種豬天然免疫蛋白LGP2的突變體，其特征在于突變體的氨基酸序列為SEQ IDN0.4。2.權(quán)利要求1所述的豬天然免疫蛋白LGP2的突變體的制備方法，其特征在于:首先以豬的cDNA為模板，用引物首先構(gòu)建表達(dá)豬LGP2的真核表達(dá)質(zhì)粒，再以豬LGP2的真核表達(dá)質(zhì)粒為模板，用引物SEQ ID N0.5和SEQ ID N0.6進(jìn)行突變PCR，得到目標(biāo)產(chǎn)物。3.權(quán)利要求1所述的豬天然免疫蛋白LGP2的突變體在用于制備抗口蹄疫病毒感染的藥物或疫苗中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/79GK106084032SQ201610385207
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年6月3日 公開號201610385207.4, CN 106084032 A, CN 106084032A, CN 201610385207, CN-A-106084032, CN106084032 A, CN106084032A, CN201610385207, CN201610385207.4
【發(fā)明人】朱紫祥, 鄭海學(xué), 曹偉軍, 楊帆, 杜曉莉, 毛箬青, 李丹, 田宏, 張克山, 劉湘濤
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所